（动物学专业论文）两种甲壳动物感光器及其感光器中g蛋白的研究.pdf

学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表 或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作 了明确说明并表示谢意。 作者签名：趋日期 学位论文使用授权声明 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要汇编出 版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名 们望 日期：理! 生堕 导师签名：差! 磊花尘 日期：一立! ! 乡2 ， 薄上学位论文 两种罕壳动物爨光器及其感光器中g 置自舶研究 两种甲壳动物感光器及其感光器中g 蛋白的研究 摘要 在动物的光电信号传导过程中，g 蛋白起着重要作用。g 蛋白参与动物的 光电转导已在多种脊椎动物中得到证实，g q 一蛋白参与无脊椎动物的光感觉过 程也在许多高等的无脊椎动物中被证明。有关无脊椎动物感光器结构与功能的 研究，主要集中在果蝇等，而以甲壳动物为对象的研究则很少。 对于甲壳动物感光器的研究主要集中在电生理、超微结构等方面，对其生 化机理的研究甚少。有关甲壳动物感光器中的g 蛋白的研究不多，g q 蛋白是 否在甲壳动物的感光器中普遍存在或还有其他形式，g 蛋白在其感光器光信号 传导途径中的作用和功能的研究等都尚未见有报道。日本沼虾和红螯螯虾，同 属甲壳纲十足目长尾亚目，是目前我国主要的具有增养殖前景约淡水经济虾 类。为此，本研究以两种甲壳动物日本沼虾和红螯螯虾为对象，采用光镜、 电镜、生物化学、免疫细胞化学和免疫电镜等方法研究其感光器及感光器中g 蛋自的类型、存在形式、含量、定位及作用，并将g 蛋白存在形式、含量、定 位与不同感光传导途径的相关性进行了研究，目的是探讨不同光刺激引起的光 信号转导过程中g 蛋白的作用，为进步从细胞和分子水平探讨动物的感光机 理提供理论依据。 一红螯螯虾光感受器的形态和超微结构 应用光镜和电镜对红螯螫虾的光感受器的形态和超微结构进行了研究。扫 描电镜观察显示红螯螯虾的复眼为半球形，复眼除背丽有一拇指状的区域无小 眼外，其余部分都由小眼组成；小眼多为正方形，面积约为3 7 2 3 5 u m 2 ，复眼 表面积约为2 1 0 4 4 m m 2 。光镜观察显示红螫螯虾复眼的每个小艰从远端到近端 分别由角膜、4 个角膜生成细胞、4 个晶锥细胞组成的晶锥及小网膜细胞构成。 透射电镜观察显示红螯螫虾小跟的感光系统出1 1 个小网膜细胞组成，其中4 个 小网膜细胞位于晶锥之下，构成了感光部分的远端，7 个小网膜细胞构成感光 系统的近端主体，上下两部分有重叠。两部分的小网膜细胞在结构上有明显差 异，上部的4 个小网膜细胞的胞质比较致密，但是细胞器种类及数量较下部的 小网膜细胞少。红蝥螯虾的感光系统有两种类型的感光细胞可能具有不同的 l 博士学位论文两种甲壳动物感光器及其感光器中g 蛋白的研究 生理功能。 二光适应与暗适应对红螯螯虾光感受器超微结构的影响 用透射电镜对光适应和暗适应时的红螯螫虾光感受器的超微结构进行了研 究比较。结果显示：光适应时感杆束的直径较小，组成近远端感杆束的微纤毛 排列零乱；小网膜细胞中的多囊体体积增大，膜下储泡囊体积减小，板膜体、 线粒体等细胞器数量较少，色素颗粒分布于整个小网膜细胞。暗适应时，感杆 束的直径较大，组成感杼束的微纤毛排列整齐，膜下储泡囊体积增大，多囊体 体积减小，板膜体、线粒体等细胞器数量较多。色素颗粒仅分布于小网膜细胞 的远端和近端。 三红螯螯虾幼体复眼的形态和超微结构 应用电镜技术对红螫螯虾幼体复眼的形态和超微结构进行了研究。扫描电 镜结果表明：刚离开母体的仔虾( 体长约l c m ) 复眼和小眼的形态已接近成体， 小跟的平均表面积由1 5 e r a 仔虾的9 0 6 士2 9 6 l l m 2 增长为3 e r a 仔虾的9 6 7 士5 3 3u m 2 和1 6 e r a 成体的3 7 2 4 士2 3 0 _ 3u n l 2 ；小眼个数也从体长1 5 c m 仔虾的1 0 0 1 个增加 到3 c m 仔虾的1 2 3 8 个和1 6 e r a 成体的5 6 5 2 个，红蝥螯虾复眼的增大是由于小 眼面积的增加和小眼数目的增多而引起的。透射电镜结果表明：幼体小眼的基 本组成结构也已具备。每个小跟从远端到近端分别由角膜、角膜生成细胞、4 个晶锥细胞组成的晶锥及小网膜细胞构成。小眼的感光系统由1 1 个小网膜细 胞组成，且与成体一样，1 1 个小网膜细胞已经分化成4 + 7 两层，其中4 个小网 膜细胞构成了感光部分的远端，7 个小网膜细胞构成感光系统的近端主体，远 端和近端的小网膜细胞在结构上也有明显差异。随着发育，幼体小网膜细胞内 的色素颗粒、细胞器种类和数量、组成感杆束的微纤毛数量、感杆束的直径和 间距等均有逐渐增加的趋势，表明复眼的感光结构是逐渐完善的。 四红螯螯虾感光器中g q 蛋白的鉴定及光波对其含量的影响 以红螯螯虾的复眼为实验材料，提取其视网膜可溶性和膜结合蛋白质，用 s d s p a g e 和免疫印迹法进行g 蛋白的分离和鉴定：并在经光适应、暗适应及 2 博上学位论文两种甲壳动物感光器及其感光器中g 蛋白的砑 究 红、绿、蓝、黄四种不同波长光照处理后，对其感光器中g 蛋白质分别进行 s d s p a g e 分析。结果表明红蝥螯虾感光器中有g q 蛋白存在，且g q 蛋白a 亚 基( 4 2 k d a ) 有可溶性和膜结合两种形式。在不同光照条件下感光器中可溶性 和膜结合g qa 亚基的含量有差异。在f 光和黄光光照下可溶性g qa 亚基含量 最高，分别占总蛋白的7 7 1 和7 3 2 ，在暗适应和绿光下最低，仅有6 9 4 和5 7 4 ；而膜结合g qo 亚基的含量则相反，在暗适应和绿光光照下最高，可 达到总蛋白的1 0 2 5 和1 3 9 4 ，在日光和黄光下最低，只有9 ，4 4 ：f 1 39 7 6 。 以上结果表明红螯螯虾感光器中o q 蛋白的激活与光照刺激的波长有关，其感 光器对不同波长光刺激的敏感度有差别。 五红螯螯虾感光器g q 蛋白c t 亚基的亚细胞定位及不同波长光照的影响 和用免疫细胞化学的方法和电镜技术观察红螯螯虾感光器中g q 蛋自n 亚 基的亚细胞定位，结果表明：g qa 以膜结合形式定位于感杆束和以可溶性形式 定位于细胞质中，g qa 定位的变化依赖于不同的光照条件。在暗适应后，g q o 主要分布于感杆束，细胞质中很少，感杆束与细胞质中胶体金颗粒的密度比为 1 4 4 ：t ：0 0 7 4 ；在( 日) 光适应后，密度比减少为0 6 1 + 0 0 2 1 ：在不同波长的光照 处理后，g qo 定位有差异，感杆束与细胞质中胶体金颗粒的密度比由高至低， 依次为：绿光( 1 6 4 士0 0 4 6 ) 、红光( 1 _ 2 8 ：t ：0 0 3 6 ) 、蓝光( 1 1 6 ：t ：0 1 1 1 ) 和黄光 ( o 9 6 士o 0 9 9 ) 。光调节的g q 8 转位可能控制了髓被视紫红质激活的g q 蛋白的 数量。我们的研究表明光波可影响感光细胞中膜结合和可溶性g q a 的比例，而 这一结果可能是由被光激活的视紫红质的数量来控制的。 六红螯螯虾幼体感光器中g q 蛋白n 亚基含量的分析 本实验以不同生长期红螯螯虾幼体( 体长分别为1c t l l ，2 c m ，3 c m ，1 0 c m 和i ic m 左右) 的感光器为材料，提取其感光器总蛋白质，用s d s - - p a g e 分离，发现 在4 2 k d a 处均有明显条带，表明红螯螯虾幼体约感光器中均有g 峰蛋白a 亚基 存在。经g e l p r oi m a g e r 软件分析得到其占总蛋白的平均百分含量分别 为：l c m ( 5 4 3 ) ；2 c m ( 5 ，6 8 ) ；3 c m ( 5 8 i ) ；1 0 c m ( 6 7 9 ) ；l l c m ( 7 0 7 ) 。表明红 螯螫虾感光器中g qo 在幼体的不同生长时期相对含量有所变化。经统计分析， 博士学位论文两种甲壳动物感光嚣及其感光器中g 噩白的研究 除体长l c m 与体长2 c m 、2 e m 与3 c m 的g q 蛋白旺亚基含量差异不显著外，l c m 与3 c m 的含量差异显著( p o 叭) ，其余各组幼体间含量差异极显著( p 3 c m ( 5 6 8 ) l o o m ( 6 7 9 ) 1 l c m ( 7 。0 7 ) t h e r e w a ss i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t b e t w e e nl c ma n d3 c m ( p 证实了过氧化酶和酪氨酸酶存在于次缓溶酶体板 膜体中。 博士学位论文 两种甲壳动物感光器及其感光嚣中g 蛋白的研究 十钙离子浓度对复眼结构的影响 钙离子在无脊椎动物感光过程中的许多方面起着重要的作用，它在光感受 器中参与刺激反应与调节光适应( n a g y c ta 1 ，1 9 8 3 ；n a g y , 】9 9 0 & 19 9 1 ) 。c a + 浓 度可影响光感受器的光敏感性( 袁维佳等，1 9 9 8 ；b a u m a n n ，2 0 0 0 ) ，c a 2 + 浓度高， 则敏感性下降，c a 2 + 浓度低则敏感性上井。缅舱内歼c a 2 + 浓度静不同也可能 影响光感受器的结构特征。对中华绒螯蟹和鲎的研究发现，培育在低c a 2 + 浓度 的生理溶液中时，处于暗适应的光感受器显示出暗适应时的显著特征，郎感杆 束的直径和膜下储泡囊的体积增大，胞饮泡数量下降，色素颗粒分布在细胞的 远端。而培育在高c r + 浓度的生理溶液中时，随着细胞外c a “浓度升高，处于 瞎适应状态趵光感受器显示出光适应时的显著特征，即感杆束的直径急剧缩 小，微纤毛膨大且排列较零乱，感杆柬周围胞质增厚，胞饮泡增加，膜下储泡 囊急剧减小，同时细胞质中出现大量色素颗粒，细胞内的膜下储泡囊和线粒体 等结构是细胞中钙离子的储存部位，光适应时，它们向细胞质释放c a 2 + 以提高 胞质中c 矿浓度，从而降低光敏感性，表现为膜下储泡囊和线粒体直径的减少： 暗适应时，则吸收。储存c a 2 + ，膜下储泡囊体积增大，细胞内c a 2 + 浓度降低， 从而增强光敏感性。 博士学位论文两种甲壳动物感光器及箕感光器中g 蛋白的研究 第二节动物感光器中的g 蛋自及其偶联的光信号转导的 研究进展 g 蛋白又称g t p 结合蛋白，位于细胞膜内侧，在许多细胞信号转导过程中 起着重要的作用。r o d b e l l 等在8 0 年代初注意到跨膜信号转换需要g t p 的存在； 以后g i l m a n 等证明了缺少g 蛋白是小鼠 淋巴瘤细胞株s 1 9 c y c 突变体激素受体 与腺苷酸环化酶联系中断的原因，并于1 9 8 0 年分离纯化了g 蛋白的种g s ； 两人因此共同获得了1 9 9 4 年的诺贝尔医学生理学奖。已经发现g 蛋白偶联信 号传导系统是一类重要的细胞跨膜信号传导途径，其在高等动物、简单真核生 物、昆虫及植物中普遍存在( 孙大业等，1 9 9 9 ；张德昌，1 9 9 2 ) 。g 蛋白作为第 一个已被鉴定的中间受体分子，能够介导多种激素、神经递质等信号分子的跨 膜转导，继而引发胞内一系列的生理、生化效应，包括细胞的代谢、分泌、生 长、增殖、分化、畸变、病变、死亡等基本生命过程，对g 蛋白结构与功能的 系统研究还可为医学上新药剂的合成及创制等提供理论基础。 动物感光器是将光信号转化为电信号的一种特殊神经元。光子被一个视紫 红质吸收后引发了一系列的化学反应，从而导致感光器细胞膜电压的改变。这 种膜电压改变的机制在脊椎动物和无脊椎动物中是不同的( n a g y ，1 9 9 i ) ，很 多研究表明，在动物的光电信号传导过程中，g 蛋白同样起着重要作用。目前 对g 蛋白的结构和功能的不断研究己成为生命科学领域的研究热点( 高本波等， 2 0 0 0 ；陈巨莲等，2 0 0 1 ) 。 一g 蛋白的结构和种类 g 蛋白( g p r o t e i f f g t pb i n d i n gp r o t e i n ) 是指能与鸟嘌呤核苷酸结合，具有 水解g t p 生成o d d ，即具有g t p 酶( g t p a s e ) 活性的蛋白质。g 蛋白是一个 超级家族( g t p b i n d i n gp r o t e i ns u p e r f a m i l y ) 包括膜受体偶联的异源三聚体g 蛋白( h e t e r o t r i m e r i cg t pb i n d i n gp r o t e i n ) 和小0 蛋白( s m a l lg t p - b i n d i n g 口r o t e i n ) 。异源三聚体g 蛋白，分子量大( 1 0 0 k d a 左右) ，是受鸟嘌呤核苷酸调 控的超级家族的信号传导分子；而小g 蛋白，分子量小( 2 0 3 0 k d a ) ，为单体， 可能与细胞信号传导无直接联系( 孙大业等，1 9 9 9 ：陈巨莲等，2 0 0 1 ) 。本文 博士学位论文两种甲壳动物感光器及其感光器中g 蚤自曲研究 主要讨论与信号传递有关的异源三聚体g 蛋白。 1 g 蛋白的结构 一般把异源三聚体g 蛋自简称为g 蛋自。近几年，已用结晶分析法阐明了 g 蛋白的结构模型( 李卫等，1 9 9 9 ) 。提纯的g 蛋白在溶液中分子量约为1 0 0 k d 左右，在s d s p a g e 中可看出它由d 、0 、v 三种亚基组成。n 亚基单体分子 量为3 9 5 2 k d a ，b 和y 亚基分子量为3 5 3 7 k d a 和6 - 1 0 k d a ；不同的g 蛋白由 不同的基因编码( s c o t te ta 1 ，1 9 9 5 ) 。b 、y 亚基尽管是两个不同基因的产物， 但在自然状态下，b 与y 亚基以非共价键紧密结合，只有在变性条件下才能分 开( s i m o ne ta 1 ，1 9 9 1 ) 。ga 由g t p 酶区及螺旋区构成。g t p 酶区中含有个 g d p 结合部位，平时与g d p 结台，处于无活性状态。一旦受体与信号分子结 合，受体的构象则发生变化，促进了g 蛋白中的g d p 与g t p 的交换，g t p 与 ga 结合，从而导致g 与0v 亚基的解离。g 蛋自的g t p 结合形式是一种激 活态，它促使g 蛋白从受体上解离并激活效应器。g 蛋白在结构上没有跨膜蛋 白的特点，它们能够固定于细胞膜内侧，主要是通过对其亚基上氨基酸残基的 脂化修饰作用( p i l s n e re ta 1 ，1 9 9 3 ；周元国等。1 9 9 6 ) 。 2 g 蛋白的种类 g 蛋白根据种类不同结构稍有不同，但都是由三个亚基组成的多聚体n 亚基是功能基团，不同的a 亚基就构成不同的g 蛋白。b 、y 亚基虽然现在发 现也与g 蛋自功能有关，但在大多数g 蛋自它们是相同的。日静用分子克隆的 手段获得的g 蛋白，不但对其一般生理生化进行研究，而且还可以获得氨基酸 序列，现在已经把g 蛋白的结构、氨基酸序列及其进化相似性与功能等结合起 来作为分类的依据。到目前为止g 蛋白被分为四个类型( g s 、g i 、g q 、g ，) ， 已知哺乳类具有2 3 种不同的g 。亚基，至少5 种不同的g 日和8 种不同的g ， ( s i m o ne ta l ，1 9 9 1 ：孙大业等，1 9 9 9 ) 。 g s 型g 蛋白主要是激活型受体与腺苷酸环化酶( a c ) 之间的偶联蛋白，配 体与受体结合后可以通过g s 蛋白激活腺苷酸环化酶，而加速c a m p 的产生。g s 除了激活腺苷酸环化酶外，还可以激活钙通道，而对钠通道则有抑制作用。g s s 与g s 1 分别代表g s 的短式( 分子量4 4 2 k d a ) 与长式( 4 5 7 k d a ) ，它们是由 同前体m r n a 经不同剪切而成( 孙大业等，1 9 9 9 ) 。g i 型g 蛋白主要是抑制 博士学位论文 两种甲壳动物感光器及其感光器中g 蛋白的研究 腺苷酸环化酶( a c ) ，其中的g t ( t r a n s d u c i n ，转导素) ，是最早被认识的g 蛋白 ( w h e l l e r ，1 9 7 7 ) ，存在于视网膜细胞中，与视觉信号传递有关，其作用方式为 接受被光激活的视紫红质的信号，继丽激活视网膜感光细胞中特异的e g m p p d e ( 磷酸二酯酶) 。g q 型g 蛋白是最近发现的另一类与磷脂代谢有关的g 蛋白， 主要激活p l c 0 ( 磷脂酶c ) 它们的活性并不受细胞毒素的影晌。g 。，型的g 蛋白作用尚不明。 3 动物感光器中g 蛋白的种类和特性 大量研究证明g 蛋白广泛存在于动物的感光器中。脊椎动物感光器中的g t 是g 蛋白超级家族中了解最清楚的蛋白质之，相对而言，无脊椎动物感光器 中g 蛋白的种类和特性了解得还不清楚。通过测定章鱼感光器中光调节的g t p 酶活性，