（动物营养与饲料科学专业论文）低能离子诱变选育植物乳杆菌高产cla菌株的研究.pdf

r。 国家自然科学基金( 3 0 871812 ) 项目 资助 t h ep r o je c tw a sf i n a n c e db yn a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c e f o u n d a t i o no fc h i n a ( 3 0 871812 ) 0 _ 捅要 本研究以一株产共轭亚油酸( c o n j u g a t e d l i n o l e i ca c i d , c l a ) 的植物乳杆菌为 出发菌株，以1 0k e y 氮离子对出发菌进行多次诱变选育，以期得到一株高产c l a 的诱变菌株，并且对该诱变菌株适宜产c l a 的条件进行了研究，同时为了比较出发 菌株和诱变菌株在分子水平的差异，利用3 0 条随机引物对出发菌株和诱变菌株进 行了r a p d l e 较分析，并且应用s d s p a g e 技术作为研究出发菌株和诱变菌株遗传突 变分析的辅助手段。主要研究结果如下： 1 在注入能量为1 0k e v ，剂量为o ( 对照卜1 2 0 2 6 x1 0 1 3i o n s c m 2 条件下对出发菌 株a n c l a 0 2 进行诱变，结果表明：存活曲线与文献报道的“马鞍型”曲线基 本符合。注入诱变高产c l a 菌株的适宜剂量为6 0 x 2 6 1 0 1 3n + e m 2 。筛选获得 的诱变菌株a n c l a 0 2 的c l a 产量为1 0 6 6 7 1 x g m l ，比出发菌株提高了1 5 倍。 诱变菌株经5 代培养，产c l a 性能稳定。 2 对诱变菌株适宜产c l a 条件进行了初步研究，得到植物乳杆菌的最适产c l a 条件 为：亚油酸为诱导物，并且亚油酸添加量为0 1 ，菌株的接种量为4 ，初始p h 为6 5 ，在3 7 条件下发酵培养2 4 d , 时，可使c l a 产量达到最大。 3 将出发菌株和诱变菌体进行全细胞蛋白电泳，比较出发菌株和诱变菌株菌体内 蛋白质表达的差异，结果显示：出发菌株和诱变菌株在全细胞蛋白的表达上无 差异。 4 本试验共选用了3 0 条随机引物，用他们对出发菌株和诱变菌株进行扩增，结果 表明：低能离子注入引起了植物乳杆菌d n a 的突变，在3 0 条随机引物中，有4 条引物在两池间有扩增产物，其中有两条在两池间表现出多态性，多态性扩增 的引物频率为6 6 7 ，且多态性稳定，重复性较好 关键词：乳酸菌离子注入c l ar a p ds d s - p a g e t a b s t r a c t t h i st e s tt a k e sac l a - p r o d u c i n gl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m 嬲o r i g i n a ls t r a i n , a n d s t u d i e st h ec l a - p r o d u c i n gc o n d i t i o n so fs u c hs t r a i n ，t h e nm u t a g e n e s i ss e l e c t i v e d e v e l o p m e n ti sc o n d u c t e dt ot h eo r i g i n a ls t r a i nw i t h10k e vn i t r o g e ni o nf o rs e v e r a l t i m e s ，h o p i n gt og e tah i g h - p r o d u c t i v i t yc l as t r a i n ，a tt h es a m et i m e ，i no r d e rt o c o m p a r et h ed i f f e r e n c e sb e t w e e no r i g i n a ls t r a i na n dm u t a t i o ns t r a i ni nm o l e c d e ，i t f u r t h e rs t u d i e st h ed a m a g e so fi o ni m p l a n t a t i o nt og e n e t i cm a t e r i a lo fm i c r o o r g a n i s m s t h r o u g hm i c r o o r g a n i s m sd n aa n dp r o t e i nv a r i a t i o nd e t e c t i o n 、析t l lr a p da n a l y s i s t e c h n o l o g ya n ds d s - p a g e t h em a j o rr e s e a r c ho u t c o m ei sa sf o l l o w s ： 1 n + i m p l a n t i n gi sm a d et ol a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mo r i g i n a ls t r a i na n c l a o i ，w h e n t h ei m p l a n t i n gv o l u m ei s1 0k e v , d o s a z ei s0 ( c o m p a r a t i v e ) 1 2 0 x 2 6 x 1 0 i o n s c m z ， a n dm u t a g e n e s i si sc o n d u c t e dt oo r i g i n a ls t r a i n , s u r v i v a lc u r v ei sp r i m a r i l yi n c o n f o r m i t yw i m “s a d d l e s h a p e d c u r v ea sr e p o r t e di nl i t e r a t u r e 田1 eb e s ti m p l a n t e d e n e r g yi sa c h i e v e dw h e ni m p l a n t i n gv o l u m ei s6 0 x 2 6 x10 1 3n + c m 2 a f t e rr e p e a t e d m u t a g e n e s i s ，t h ec l ap r o d u c t i v i t yo fm u t a t i o nh i g h - y i e l d i n gs t r a i na n c l a 0 2r i s e s f r o m4 3 4 4 p g m lo fo r i g i n a ls t r a i nt o10 6 6 7 i t g m l ，a f t e rt h em u t a n ts t r a i ni s c u l t i v a t e df o r5g e n e r a t i o n s ，t h ec l ap r o d u c t i v i t yt e n d st ob es t a b l e 2 t h r o u g hp r e l i m i n a r ys t u d i e so nc o n d i t i o n so fo r i g i l l a l s t r a i nt op r o d u c ec 地i t a c q u i r e dt h em o s ts u i t a b l ec o n d i t i o n sf o rl a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u mt op r o d u c ec l a ：t a k e l i n o l e i ca c i d 嬲i n d u c e r , a n dv o l u m eo fa d d i t i o ni s0 1 ，i n o c u l u ms i z ei s4 ，p h v a l u ei s6 5 ，i ti sf e r m e n t e d2 4h o u r sa t3 7 3 t h eo r i g i n a ls t r a i na n dm u t a n ts t r a i na r et e s t e di nw h o l e - c e l lp r o t e i ne l e c t r o p h o r e s i s ， a n dp r o t e i ne x p r e s s i o nd i f f e r e n c eb e t w e e nt h eo r i g i n a ls t r a i na n dm u t a n ts t r a i ni s s t u d i e d t h eo r i g i n a ls t r a i na n dm u t a n ts t r a i na r et e s t e dt h r o u g hs d s p a g em e t h o d a n dt h eo u t c o m ei n d i c a t e st h a tt h e r ei sn od i f f e r e n c eb e t w e e nt h eo r i g i n a ls t r a i na n d m u t a n ts t r a i ni nw h o l e - c e l lp r o t e i ne x p r e s s i o n 4 i no r d e rt oc o m p a r ed i f f e r e n c e sa tt h e m o l e c u l a rl e v e lb e t w e e nt h eo r i g i n a ls t r a i na n d t h em u t a n ts t r a i n ，3 0p i e c e so fr a n d o mp r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oc l a r i f yt h eg e n e t i c b a c k g r o u n db yr a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ( r a p d ) b yr a p da n a l y s i s ， t h ed n am u t a n ts t r a i ni sc h a n g g e d ，o f2p r i m e r sw h o s ea m p l i f i c a t i o np r o d u c t ss h o w e d p o l y m o r p h i cc h a r a c t e r w e r es e l e c t e df r o m3 0p r i m e r s ，w h i c hc 锄b eu s e dt od i s c e r n t h em u t a n ts t r a i n t h ep r i m e rr a t eo fp o l y m o r p h i s ma m p l i f i c a t i o np r o d u c t i o ni s6 6 7 ， a n dt h ep o l y m o r p h i s m i ss t a b l ew i t hf i n er e p e a t a b i l i t y k e yw o r d s ：l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u ； i o ni m p l a n t a t i o n ；c l a ；r a p d ；s d s - p a g e i i 目录 摘要i a b s t r a c t 00 “0 i i 综j 丕1 1 低能离子束生物学研究进展1 1 1 低能离子束生物学发展l 1 2 低能离子注入对生物诱变的基本原理l 1 3 利用离子束生物技术创造生物体新种质的技术研究3 2 共轭亚油酸的概述3 2 1 共轭亚油酸的来源及结构3 2 2 共轭亚油酸的生理功能4 2 3 共轭亚油酸的合成5 2 4 共轭亚油酸在养猪生产中的作用7 3r a p d 技术及应用i oobom 8 3 1r a p d 技术的原理8 3 2r a p d 技术的特点9 3 3r a p d 技术的应用1 0 弓i 言1 1 l 材料和方法1 2 1 1 材料1 2 1 1 1 菌株1 2 1 1 2 培养基0 0 oo0 b g 1 2 1 2 仪器和试剂1 2 1 2 1 试剂和溶液1 3 1 2 2 溶液的配制1 3 1 2 3 主要仪器1 3 1 3 试验方法1 4 1 3 1 离子注入筛选诱变菌株1 4 1 3 1 1 制备植物乳杆菌菌体悬浮液1 4 1 3 1 2 测定菌体浓度1 4 1 3 1 3 测定植物乳杆菌生长曲线1 4 1 3 1 4 发酵液中共轭亚油酸含量测定方法1 5 1 3 1 5 离子注入方法及参数的确定1 5 1 3 1 6 诱变菌株的初筛1 6 1 3 1 7 诱变菌株的复筛1 6 1 3 1 8 真空处理后植物乳杆菌存活率的测定1 6 1 3 1 9 离子注入后植物乳杆菌存活率的测定1 6 1 3 1 1 0 离子注入后植物乳杆菌突变率的测定1 6 1 3 2 诱变菌株的菌学特征1 7 1 3 2 1 菌株的形态特征1 7 1 3 2 2 诱变菌株生长曲线绘制1 7 1 3 2 3 诱变菌株遗传稳定性的检测o ooog q 1 7 1 3 3 高产共轭亚油酸诱变菌株的发酵条件优化1 7 1 3 4 植物乳杆菌出发菌株和突变菌株的s d s - p a g e 分析1 8 1 3 4 1 菌体全细胞蛋白的提取方法1 8 1 3 4 2 电泳1 8 1 3 5 植物乳杆菌出发菌株和诱变菌株的r a p d 分析i o 0 1 8 1 3 5 1 出发菌株和诱变菌株d n a 的提取1 8 1 3 5 2r a p d 的引物和程序1 8 2 结果与分析2 0 2 1 离子注入筛选诱变菌株g oio 2 0 2 1 1 靶室真空处理时间对菌株存活率的影响2 0 2 1 2n + 注入剂量对菌株存活率的影响2 0 2 1 3n + 注入剂量对菌株突变率的影响2 1 2 1 4 高产c l a 诱变菌株的筛选2 2 2 2 出发菌株和诱变菌株的形态特征比较2 2 2 3 出发菌株和诱变菌株生长曲线的比较2 3 2 4 诱变菌株产c l a 稳定性的研究2 4 2 5 高产共轭亚油酸植物乳杆菌发酵条件的优化2 4 2 5 1 不同的诱导物对c l a 产量的影响2 4 2 5 2 亚油酸的添加量对c l a 产量的影响2 5 2 5 3 接种量对c l a 产量的影响2 5 2 5 4p h 对c l a 产量的影响o o6 qo io o 2 6 2 5 5 发酵时间对c l a 产量的影响2 6 2 6 植物乳杆菌出发菌株和诱变菌株的s d s - p a g e 分析2 7 2 7 植物乳杆菌出发菌株和诱变菌株的r a p d 分析2 7 2 2 7 1 出发菌株和诱变菌株d n a 提取2 7 2 7 2r a p d 引物的筛选2 9 2 7 3 出发菌株和诱变菌株多态性的比较分析3 0 3 讨论3 2 3 1 离子注入剂量对植物乳杆菌存活率和突变率的影响3 2 3 2 不同发酵条件对植物乳杆菌产c l a 的影响3 2 3 1 1 亚油酸浓度对c l a 产量的影响3 3 3 1 2 接种量对c l a 产量的影响3 3 3 1 3p h 对c l a 产量的影响3 3 3 1 4 发酵时间对c l a 产量的影响3 4 3 3s d s - p a g e 方法分析出发菌株和诱变菌株3 4 3 4r a p d 分析出发菌株和诱变菌株3 4 结论3 7 参考文献3 8 致谢4 5 作者简介4 6 插图和附表清单 图1c l a 紫外吸收标准曲线1 5 表lp c r 反应体系1 9 图2 1 不同真空时间对菌株存活率的影响2 0 图2 - 2n + 注入剂量对菌株存活率的影响2 1 表2 - 1n + 注入剂量对菌株突变率的影响2 1 图2 3n + 注入剂量对菌株突变率的影响2 2 图2 - 4 植物乳杆菌出发菌株和变异菌株c l a 产量的比较2 2 图2 - 5 诱变前后菌体细胞形态比较0 oo 2 3 图2 - 6 诱变前后菌株生长曲线的比较2 3 图2 - 7 诱变株传代流程示意图2 4 表2 - 2 诱变菌株a n c l a 0 2 产c l a 性能遗传稳定性2 4 图2 - 8 不同的诱导物对c l a 产量的影响o oooob io o 2 5 图2 - 9l a 添加量对c l a 产量的影响2 5 图2 - 1 0 接种量对c l a 产量的影响2 6 图2 一1 1p h 对c l a 产量的影响2 6 图2 - 1 2 发酵时间对c l a 产量的影响2 7 图2 - 1 3 出发菌株和诱变菌株s d s - p a g e 2 7 图2 - 1 4 改良c t a b 法制备的出发菌株和诱变菌株的基因组d n a 2 8 表2 - 3 植物乳杆菌基因组d n a 的光密度测定结果2 8 图2 - 1 5 植物乳杆菌基因组d n a 的紫外光谱2 9 表2 - 4 随机引物筛选结果统计表2 9 图2 - 1 6 引物s 2 3 在出发菌株和诱变菌株中扩增的r a p d 图谱3 0 图2 1 7 引物$ 3 1 在出发菌株和诱变菌株中扩增的r a p d 图谱3 1 4 文献综述 1 低能离子束生物学研究进展 1 1 低能离子束生物学发展 离子注入改良生物技术是- i 1 将离子注入这种传统物理方法应用于生物改良 而发展起来的新兴交叉学科，并且是由我国学者首创发明的高新技术，经过了2 0 多年的发展逐步形成了一门新兴学科一离子束生物工程学。 中国科学院等离子体物理所余增亮1 9 8 6 年发现氮离子注入水稻种子诱发变 异【l 】证实了质量( 粒子) 沉积效应的存在，因此开辟了生物体与低能粒子相互作用 这一新的研究方向。随后，余增亮便提出了低能离子注入生物材料后会因为质量沉 积、能量沉积、电荷交换而引起生物学效应的“三因子”假说，从此引起了国内外 的一些学者对这一具有我国独立知识产权并且涉及到生物学和物理学交叉领域的 学科的关注 2 , 3 1 。 离子束技术经过近2 0 多年的发展，不管是从理论上还是在实际应用中，早已 在诱变育种、创造生物体新品种的实用技术中取得了较多的发展，从而为生物的遗 传改良另辟了新的途径。 目前，这项由我国学者发现和挖掘的低能离子束生物技术，它的学术地位已经 得到肯定。在通过介导作用促进异源遗传物质在生物种群间发生重组方面，通过 诱变作用产生出生物体遗传性变异群体方面，低能离子束生物技术即有新颖性又 有实用价值。经过2 0 多年的研究和探索，作为- i - j 新兴的交叉学科，低能离子束 生物工程渐渐显现出其应有的技术特色，它的技术的实用性和遗传改良的普遍性 也已被大量的试验结果证实了。 1 2 低能离子注入对生物诱变的基本原理 离子束生物技术的主导思想是借助于低能离子注入技术使生物体的特征发生 本质的变化，从而对生物体进行遗传改良，离子生物技术是将能量为几万到几十万 伏的离子束射入生物体内，在离子束的质量、能量和电荷这“三因子”作用下， 基因发生了突变，然后从这些发生变异的种子中选育优良变异种质，进而培育成为 新品种。 低能离子一般指能量低于m e v 级的荷能粒子。离子注入生物体后，一部分离子 的能量转变成了靶原子的能量，然后引起所谓的称为“离子溅射”的表面二次离 子发射。由于电荷交换，或是入射的离子能量转移给了靶原子中的电子，引起入 射离子径迹上靶原子电离，接着产生瞬时电荷积累，并在库仑力作用下，生物碎 片或分子被抛射出来，这称为“电子溅射”，离子束的溅射就像一把手术刀，可 以对生物体表面进行层层剥离，随后的离子就能够穿行较长的距离，落在预定的 位置上f 4 1 。 低能离子与生物物质之间的相互作用一般被分为质量沉积，能量沉积，动能 传递和电荷交换四个原初反应过程【5 埘。所以，质量、能量、电荷就成为了离子束 生物技术作用的核心，能量沉积效应 9 - 1 0 】、质量沉积效应【1 1 13 1 、电荷交换效应【1 2 】 就是离子束生物技术目前的主要理论依据。 能量沉积是注入的离子与生物大分子发生一系列碰撞并逐渐失去能量。而生 物大分子逐渐获得能量进而发生原子被击出位、生物大分子留下缺陷或是断键的 过程；质量沉积是指生物大分子与注入的离子形成了新型分子；动量传递在分子 中会产生级联损伤；电荷交换可以引起电子在生物分子中转移而造成损伤，然后使 生物体产生死亡、染色体重复、易位、倒位、自由基间接损伤或使碱基缺失、d n a 分子断裂等多种生物学效应。 注入低能离子与生物体相互作用的过程大约持续1 0 d 9 - 1 0 以6 s 左右，外部所注 入的低能离子作用于生物靶分子，发生级联碰撞、溅射和原子碰撞，当内部能量聚 集到一定程度时就急剧释放，然后形成一个相对电离密度很高的电离峰。假如此时 电离峰正好停留在生物体中的遗传物质时，便会引起遗传物质d n a 的断裂，会造成 染色体的易位、倒位、重复和缺失等从而引起染色体结构的变异；此时质量的沉 积则使d n a 一部分被取代或补充，便会使d n a 的修复作用得到抑制。因此，注入的低 能离子与生物体的作用是双重的、局部的和不易修复的。 生物诱变中应用离子注入在损伤较轻的情况下能够获得宽突变谱和高突变率， 并且注入离子射程的集束性、方向性和可控性等特点，使得定向诱变成为可能，并 且能够对细胞进行精加工，且效果显著优于激光束、电子束，离子束并不伤害临近 未被照射的细胞或组织，因为它对细胞的作用属于动量交换的冷加工过程，而激光 束和电子束由于产生热效应则会对细胞的加工有不良的影响。 离子注入引起d n a 分子双链断裂破坏了分子完整性，是生物机体最关键的损 伤，在辐射生物学中，生物体终点与d n a 损伤直接关联。低能离子注入对d n a 的 损伤是也诱变改良的重要基础。要使d n a 分子瓦解则必须断裂其双螺旋间的氢 键，因为双螺旋d n a 分子在生理温度下是非常稳定的，当荷能离子注入有效位置 时就会与d n a 靶分子、原子发生碰撞，便会使d n a 分子、原子移位、重排，双螺 旋也会造成d n a 单链、双链断裂、解旋和交联【l 制。 组成d n a 的碱基序列发生了改变是d n a 突变的分子基础。离子束技术是一种 集质量沉积、能量传递、动量传递、电荷交换于一体的技术，当离子束与生物靶 2 分子女i j d n a 作用时，使d n a 产生单双链断裂，基团的脱落、释磷、释碱基，注入 的离子与由其产生的移位基团或原子还可能嵌入d n a 分子中，致使d n a 分子发生 各种各样的碱基修饰或损伤【1 5 , 1 6 , 1 7 】。 1 3 利用离子束生物技术创造生物体新种质的用技术研究 1 3 1 氐能离子束技术在植物改良上的应用 在植物上，几年内经离子注入获得了数千份有价值的育种材料。诱变选育的 优良品种如皖麦3 2 、皖粳已被大面积推广【1 8 】。利用离子注入技术还创造了水稻、 玉米、小麦、南瓜、油菜、西瓜、紫花苜蓿等新种质【1 9 ，2 0 ，2 1 , 2 2 ，2 3 1 。此外，离子束 技术在花卉【2 4 l 、烟草【2 5 】、甜菜【2 6 1 、莲藕2 7 1 和板栗【2 8 】等作物上也获得了较好的效 应。 研究证实，生物体被低能重离子被注入后，化学效应、物理效应和生物效应 的也会伴随产生，会使得生物体发生相应的变异，这也为生物遗传育种家提供了 许多的突变性材料。 1 9 9 4 年以来，利用低能离子注入生物技术已培育出l0 0 0 多份农作物新种质， 另外，有1 1 个农作物新品种已经通过安徽省和山东省农作物品种审定委员会的审 定，得到了一批像对显性矮秆水稻、同源四倍体多胚苗水稻、生玉米、高蛋白小 麦、高光效水稻等育种材料，也因此带来了显著的经济效益和社会效益。 1 3 1 低能离子束技术在工业微生物改良上的应用 低能离子束技术在微生物上应用起步虽晚，成果仍然显著，中国科学院等离 子体物理研究所先后改良了利复霉素、v c 、柠檬酸、花生四烯酸生产菌种。诱变 筛选后的利复霉素发酵水平提高4 0 ，2 0 吨罐化学效价达6 3 0 0 单位 2 9 1 ：经离子束辐 照发酵水平提高较多的另一品种是花生四烯酸生产菌，其产酸量最终提高至细胞 干重的4 5 【3 0 】。黄文彩等( 1 9 9 4 ) 通过旷注入，筛选到2 株效价高、性能稳定的链 霉菌菌株，已投入大规模工业生产i 3 1 1 。浙江农科院对糖化酶产生菌进行离子注入， 经筛选其发酵产酶活力从l 万单位提高到2 万单位，最高可达2 6 万单位p 引，已投入 生产。 在生物工程方面，由于离子束被应用于介导外源基因的转移，从而开辟了一 种新的基因转移方法。以此为基础发展起来的离子束介导遗传转化技术也在水稻、 棉花、小麦等植物上取得成功【3 3 , 3 4 , 3 5 ，3 6 1 。在克服远缘杂交的困难方面，离子注 入技术也取得了不错的成果。 2 共轭亚油酸的概述 2 1 共轭亚油酸的来源及结构 上世纪8 0 年代，研究人员在调查汉堡包在烹饪过程中是否会产生致癌物质时， 偶然发烤牛肉中含有一些表现为抗癌变的物质。研究人员随后在反刍动物乳品及 其脂肪中分离得到了同类物质。因为此种物质碳链骨架和亚油酸相同，只是两个 双键间间隔一个单键，故确定为共轭亚油酸。自从c l a 抗癌作用被发现后，人们 越来越关注c l a ，欧洲还成立了专门研究c l a 的机构【3 7 。 动物性与植物性食品是c l a 的主要食品来源，且在肉制品和乳脂中较多，主 要原因是因为反刍动物瘤胃中微生物具有将亚油酸生物氢化成c l a 的功能。 j a h r e i s 等( 1 9 9 9 ) 研究认为，在母羊奶中含有丰富的c l a ，非反刍动物乳中含量极 低【3 引。主要原因是反刍动物肠道中厌氧的溶纤维丁酸弧菌产生的亚油酸异构酶能 使亚油酸转化成主要以顺一9 ，反一1 1 异构体形式存在的c l a 3 9 】。 共轭亚油酸是必需脂肪酸亚油酸的位置和立体异构体的混合物，是一组天然 存在的含共轭双键的十八碳脂肪酸。c l a 的双键位置可以在碳链的位置1 1 。1 3 ； 1 0 ，1 2 ；9 ，1 1 ；8 ，1 0 等位置。其主要位置异构一般有4 种：8 ，1 0 一、9 ，l l 一、1 0 ， 1 2 一和l l ，1 3 一，但由于共轭双键两端的碳原子都具有反式( t r a n s ) 和顺式( c i s ) 两种几何构型，再加上每种位置异构又具有4 种几何异构体，因此c l a 共有1 6 种同分异构体。含量最多的两种异构体是t r a n s 1 0 c i s 一1 2 和c i s - 9 t r a n s 一1 l ， 因为生物体内的亚油酸异构酶专一地转化亚油酸生成c i s - 9 t r a n s - 1 1 异构体，因 此具有生物活性的异构体是c i s - 9 t r a n s - 1 卜c l a 4 0 】。 2 2 共轭亚油酸的生理功能 2 2 1c l a 的免疫作用 c l a 能够增强有丝分裂诱导的淋巴细胞增殖，进而增强巨噬细胞的吞噬活性 和淋巴细胞的杀细胞活性，并且既可诱导迟发性变态反应又能促使淋巴细胞的胚 样化，因此，c l a 能够参与免疫系统调节，减少免疫调节代谢的副作用【4 1 1 。 c l a 可以增加抗体的合成。有学者做过研究，给兔子连续饲喂含c l a ( 0 、 0 5 、1 0 ) 的同粮，其肠系膜淋巴结、脾细胞、血清中i g g 、i g m 、i g a 呈剂 量依赖上升趋势，单其中的i g e 却明显下降i 4 2 1 。 研究显示，饲料添加c l a 的猪c d 8 + 水平高于对照组； c is - 9 ，t r a n s - 11 - c l a 能增强小鼠腹腔巨噬细胞杀伤肿瘤细胞的能力，且在有效剂量范围内杀伤能力随 c l a 的剂量升高呈正相关。所以，c l a 可能是通过影响p g e 2 的合成进而起到增强 细胞免疫功能，起到预防某些传染病的作用 4 3 】。 2 2 2c l a 的抗癌作用 很多动物试验都发现c l a 可以有效地增强人类的免疫系统和抑制肿瘤的产 生，c l a 也是目前知道的具有明显抗癌作用的一种脂肪酸。i p 和t h o m p s o n t ( 1 9 9 4 ) m j 研究发现c l a 可以使癌变的导管泡状表皮显著萎缩，抑制其不断增殖，降低 其增殖活性，原因可能是c l a 能够抑制其上皮组织的增生和提高其周围细胞的休眠 比例。 4 h a 等( 1 9 9 0 ) k 匕较分析了亚油酸与共轭亚油酸对由苯芘诱导的小鼠胃癌生长模 型，研究发现c l a 显著降低了肿瘤的发生率和降低发生肿瘤个体的肿瘤细胞增殖 的速度，抗癌作用非常明显【4 5 1 。另有报道指出，日粮中c l a 的抗癌有效剂量范围 0 卜1 5 ，继续增加c l a 剂量，其抗癌作用未见明显提蒯4 6 | 。 虽然人们对c l a 抗癌作用研究十分广泛，但对它的抗癌机理仍然并不十分明 确，有学者在综述中提出其多种假设机理：( 1 ) 抗氧化机理；( 2 ) 抑制核苷和蛋白 质合成；( 3 ) 抑制d n a 加合物形成；( 4 ) 强氧化剂去除细胞毒素机制；( 5 ) 降低细胞 增殖活力；( 6 ) 抑制致癌因子活性等。 2 2 3c l a 的对机体脂肪作用 c l a 对体脂肪的调控是通过调整脂肪酸组成来实现的。c l a 在食物中添加剂 量不同，对动物的降脂效果也不同。o s t r o w s k a 等( 1 9 9 9 ) 4 7 】用育肥期母猪的试验证 实，猪的背部脂肪厚度随c l a 添加量的提高呈线性下降，而胴体瘦肉和水分含量 则呈线性升高。在c l a 添加量最高组，背部脂肪厚度降低2 5 ，胴体脂肪含量 降低了2 0 。y a n a g i t a 等( 2 0 0 5 ) 报道，为达到削弱由c l a 引发的脂肪肝副作用， 可以补饲c l a 的同时补饲0 5 - - 十二碳六烯酸( d o c o s a h e x a e n o i ca c i d ，d h a ) 可以削弱c 5 7 b l 6 n 鼠肝中脂肪酸的合成而不影响正常脂肪细胞量【4 引。 c l a 降脂机理存在几种假说：一是抑制脂肪细胞前体增殖：二是抑制脂肪代 谢酶活性及其基因的表达；三是加快脂肪氧化分解；四是降低脂蛋白脂酶活性， 从而降低血浆甘油三酯浓度等。但是c l a 对脂质代谢的调节机理目前尚处于研究 之中。有学者认为尽管有些文献说c l a 可减少身体重量，但对人体和动物体成分还 不很明确，因此不能说c l a 是否真具有抑制脂肪作用。 2 2 4c l a 的其他功能 除了以上的作用外，c l a 还具有其他的一些功能，例如c l a 能改善骨组织代谢， 增加骨骼形成速率，对骨质蔬松症，风湿性关节炎也有一定的缓解作用，同时具 有预防动脉粥样硬化作用。 2 3c l a 的合成 2 3 1 c l a 的化学合成方法 c l a 目前采用较多的生产方法是用亚油酸通过强碱异构化处理，也可通过热 异构化处理以及部分加氢等化学异构法获得c l a 的混合物，可以实现大批量生产， 是 4 9 1 。但化学异构法需要在高温、碱性和一定压力下进行，产生的异构体组成过 于复杂，有生理活性的异构体含量太少，不利于产品的开发应用。 2 3 2 微生物转化合成共轭亚油酸 自1 9 7 8 年研究学者发现煮过的牛肉含有抗突变生物活性物质共轭亚油酸后， 人们一直在寻找可以大量廉价制取c l a 的可靠方法，生物合成法具有选择性合成 c l a 和易于实验室操作等优点，近年越来越受到关注。由于微生物发酵法转化产 生c l a ，反应条件温和，并可大量形成具有生理活性的c 9 ，t l1 - c l a ，t l o ，c 1 2 一c l a ， 且异构体组成比较单一，与天然食物中c l a 异构体组成非常相似。 2 3 2 1 瘤胃微生物合成共轭亚油酸 c l a 的微生物生产主要以细菌为主。早期研究较多地c l a 生产菌是瘤胃细菌 5 0 5 1 , 5 2 】，如费氏丙酸杆菌( p r o p i n i b a c t e r i u m f r e u d e n r e i c h i i ) 能够以牛奶为培 养基将游离亚油酸转化为c l a i s 2 j 。 k e p l e r d s j 等( 1 9 8 7 ) 认为，存在于反刍动物瘤胃内微生物丁弧酸菌 ( b u t y r i v i b r i of i b r i s o v e n t s ) 对亚油酸进行生物转换作用可以生成c l a 。 b e n j a m i n 5 4 】等( 2 0 0 1 ) 发现，丁弧酸菌分泌了异构化酶，在酶的作用下，一部分c l a 被动物吸收进入体内各组织，另外一部分在瘤胃中被氢化为反式油酸，反式油酸被 进一步氢化形成硬脂酸。吸收进入体内的反式油酸在肝脏和乳腺细胞中被- 9 - 脱氢酶脱氢生成c 9 ，t 1 1 一c l a 。t l 卜油酸成为c 9 ，t l i - c l a 被认为是牛奶里c l a 形 成的主要途径 瘤胃中有多种微生物能产生c l a 。k i m ( 2 0 0 2 ) s 5 】从饲喂谷物的奶牛瘤胃中取 样，然后用胰蛋白胨和乳酸盐富集培养，分离到能产生t r a n s - l o ，c j r l 2 一c l a 的 巨型球菌，菌体与亚油酸反应2 m i n ，c l a 达到了最高值，经1 6 s r r n a 序列分析表 明该菌是埃氏巨型球菌( m e g a s p h a e r ae l s d e n i i ) 。 2 3 2 2 乳酸菌合成共轭亚油酸 近年来研究报道较多的生产菌c l a 的菌是乳酸菌。1 9 9 9 年，l i n 等对嗜酸乳 杆菌( l a ct o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s ) 、德氏乳酸乳杆菌( l a ct o b a c i l l u s d e l b r u e c k i is u b s pl a c t i c ) 、乳酸乳球菌( l a c t o c o c c u sl a c t i ss u b s pl a c t i c ) 、 保加利亚德氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s d e l b r u e c k i is u b s pb u l g a r i c u s ) 和嗜 热链球菌( s t r e p t o c o c c u sl a c t e st h e r m o p h i l u 由等6 种细菌进行研究时发现，在 含有亚油酸的脱脂乳中添加n a c l 、乳糖和果糖培养2 4h 以后，嗜酸乳杆菌的c l a 产量最高p 圳 乳酸菌含有亚油酸异构酶是能够合成c l a 的主要原因，亚油酸的异构酶是膜 蛋白结合酶，能够以细胞形式，也能够以分离出的膜形式反应，且亚油酸异构酶 把亚油酸转化为c 9 ，tl1 - c l a 的作用位点是在脂肪酸的c1 2 双键上而不是c 9 双键 上。得到的c l a 可以直接从细胞培养液中提取。 杜波( 2 0 0 7 ) 5 7 】成功从青贮饲料中分离产c l a 的植物乳杆菌a n c l a o i ，并且探 索出其产共轭亚油酸的最优条件为：亚油酸与发酵液的最适体积比例为0 0 7 5 ， 反应温度3 5 ，初始p h 值7 0 ，培养时2 8 h ，在优化工艺条件下，发酵液中共轭 亚油酸含量可达4 7 0 3 u g m l 。 6 p a r i z a ( 2 0 0 0 ) 5 8 j 从饲喂亚油酸的老鼠肠道菌群中筛选到株能将亚油酸异构 化成c 括9 ，t r a n s 1 1 - c l a 的罗伊氏乳杆菌( l a c t o b a c i l l u sr e u t e r i ) ，并且不生成 t r a n s 1 0 ，c s 1 2 ，c s 1 0 ，t r a n s 1 2 c l a ，酶与底物的最适反应温度4 8 、时间3 h 、 p h 8 5 。 张中义【5 州( 2 0 0 4 ) 等从泡菜中筛选的一株植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) z s 2 0 5 8 ，并具有较高转化能力。在3 7 c ，l a 质量浓度为1 2 0 4m g m l 的条件下培养2 4h ，可以将l1 6 的l a 转化为c 9