（水产养殖专业论文）悬浮物对半滑舌鳎早期发育阶段毒性效应试验研究.pdf

上海海洋人学硕十学位论文 悬浮物对半滑舌鳎早期发育阶段毒性效应试验研究 摘要 近年来随着我国沿海经济的快速发展，海港、码头等海洋海岸工程项目越来 越多，由此引起的近岸悬浮物污染也越来越严重。水体中悬浮物的过量存在不仅 对水域的物理、化学环境产生影响，而且对海洋动物、尤其是逃逸能力弱的动物 及其幼体的摄食、生长、繁殖甚至存活产生严重影响。本论文以黄渤海区主要的 经济鱼类半滑舌鳎为材料，通过室内模拟实验系统，进行了悬浮物对其胚胎、 初孵仔鱼、浮游阶段和伏底阶段稚鱼以及幼鱼的毒性效应研究，以及对其幼鱼肝 脏溶菌酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶，鳃丝n a + 一k + a t p a s e 等四种免疫相关酶 活性的影响研究，主要结论如下： 1 悬浮物对半滑舌鳎胚胎孵化率和死亡率、初孵仔鱼畸形率影响显著，胚胎 孵化率随着悬浮物浓度的增加而降低，死亡率和初孵仔鱼畸形率则随着悬浮物浓 度的增加而升高。 2 悬浮物对半滑舌鳎胚胎的起始半致死浓度( 9 5 可信限) 为1 9 7 4 8m g l 一 ( 1 3 7 5 4 - 2 8 3 5 5m g l - i ) ，安全浓度( 旧为1 9 7 4 8m g l ；对初孵仔鱼的4 8 hl c s o 和9 6 hl c 5 0 ( 9 5 可信限) 分别为2 2 6 9m g l _ ( 2 0 4 6 - - 2 51 7m g l 叫) 和2 0 2 9 m g l 。( 18 2 3 - 2 2 5 9m g l 一) ，妃为2 0 2 9m g l 一；对浮游阶段稚鱼的4 8 hl c 5 0 和 9 6 hl c s o ( 9 5 可信限) 分别为5 8 8 2m g l 一( 5 1 8 7 “6 6 9m g l 。) 和4 8 8 7m g l d ( 4 2 8 6 - 5 5 7 2m g l 。) ，阳为4 8 8 7m g l 一；水温为2 3 c 时，对伏底阶段稚鱼的 4 8 hl c s o 和9 6 hl c s o ( 9 5 可信限) 分别为3 0 3 4 6m g 。l ( 2 7 6 9 8 - 3 3 2 4 8m g 。l 。) 和2 1 1 7 2m g l i ( 1 9 3 2 1 2 3 2 0 1m g l 。) ，s c 为2 1 1 7 2m g l ：对幼鱼的4 8 hl c s o 平口9 6 hl c 5 0 ( 9 5 可信限) 分另u 为4 7 2 0 2m g 。l 一( 3 7 9 6 2 - 5 8 6 9 2m g l 。) 年口4 0 3 6 3 n a g l 。( 3 2 6 0 2 - 4 9 9 7 2m g t l 一) ，职为4 0 3 6 3m g l 一；水温为2 6 。c 时，对伏底阶 段稚鱼的4 8 hl c s o 和9 6 hl c s o ( 9 5 可信限) 分别为 l6 8 4 0 m g l _ ( 1 5 4 3 4 1 8 3 7 3m g l - 1 ) 和1 6 5 7 1m g 。l 一( 1 5 2 2 7 1 8 0 3 4m g l u ) ，s c 为1 6 5 7 1 m g l ；对幼鱼的4 8 hl c 5 0 和9 6 hl c s o ( 9 5 可信限) 分别为2 9 6 2 6m g l 。 ( 2 3 3 5 。2 - 3 7 5 8 5m g l - i ) 和2 3 6 5 。lm g l 。( 1 8 1 1 8 - 3 0 8 7 3m g l q ) ，s c 为2 3 6 5 1 m g l 一。 3 通过急性毒性效应结果，比较得出悬浮物对半滑舌鳎幼体各阶段致死效应 i 上海海洋人学硕十学位论文 强弱为：初孵仔鱼 浮游阶段稚鱼 胚胎 伏底阶段稚鱼 幼鱼；水温 对悬浮物的致死效应影响明显，温度越高，悬浮物急性致死效应越强。 4 悬浮物对半滑舌鳎幼鱼肝脏溶菌酶、超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶以及鳃 丝n a + 一k + - a t p a s e 影响明显。悬浮物添加浓度为2 0 0 和4 0 0m g l 一时，幼鱼肝脏 l s z 、s o d 活力与对照组均有显著差异( k 0 0 5 ) ；悬浮物添加浓度为4 0 0m g l _ 时，其肝脏a k p 活力与对照组均有显著差异( 尸 e m b r y o p o s t - j u v e n i l e y o u n gf i s h ；w a t e r t e m p e r a t u r ea l s oh a v ei n f l u e n c eo nl e t h a le f f e c t so fs u s p e n d e ds u b s t a n c es i g n i f i c a n t l y , a n dt h eh i g h e ro ft h et e m p e r a t u r e ，t h eg r e a t e rl e t h a le f f e c t so fs u s p e n d e ds u b s t a n c e 4 t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h ee f f e c t so fs u s p e n d e ds u b s t a n c eo nt h ea c t i v i t i e so f l i v e rl s z ，s o da n da k p ，g i l ln a + 一l r a t p a s eo fy o u n gf i s ho ft o n g u es o l ew e r e s i g n i f i c a n t w h e nt h ea d d e dc o n c e n t r a t i o nw e r e2 0 0a n d4 0 0m g l ，b o t hl i v e rl s z a c t i v i t ya n ds o da c t i v i t yh a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ( 氏o 0 5 ) ； w h e nt h ea d d e dc o n c e n t r a t i o nw a s4 0 0m g 。l ，t h el i v e ra k pa c t i v i t yh a ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e sw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ( 氏0 0 5 ) ；d u r i n gt h el a t e rp e r i o do ft h ee x p e r i m e n t ， a l lt h eg i l ln a + 一k + - a t p a s ea c t i v i t i e so ft h ee x p e r i m e n t a lg r o u p sa l s oh a ds i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e sw i t ht h ec o n t r o lg r o u p ( 氏o 0 5 ) a tt h ee n do ft h ee x p e r i m e n t ，t h ea c t i v i t i e s o fa l lt h ee n z y m e si nt h ee x p e r i m e n t a lg r o u p sh a db e e ns u b j e c tt oi n h i b i tt os o m ee x t e n t ， a n dr e a c h e dt h e i ro w ns t a b l es t a t e f u r t h e r m o r e ，t h ee f f e c t so fs u s p e n d e ds u b s t a n c eo n t h ea c t i v i t i e so ft h i sf o u rk i n d so fe n z y m e sb e c a m em o r es i g n i f i c a n tw i t ht h ei n c r e a s eo f t h es u s p e n d e ds u b s t a n c ec o n c e n t r a t i o na n dt h ee f f e c tt i m e i v 上海海洋人学硕十学位论文 5 t h er e s u l t ss u g g e s tt h a tn a + - k + - a t p a s e 、l s za n ds o dc a nb eu s e da st h eb e t t e r d e t e c t i o ni n d e x e sw h e ns u s p e n d e ds u b s t a n c et a k es u b l e t h a le f f e c to nf i s h ，e s p e c i a l l yi n t h e i re a r l yd e v e l o p m e n t s t a g e k e yw o r d s c y n o g l o s s u ss e m i l a e v i s ，s u s p e n d e ds u b s t a n c e ，t o x i ce f f e c t ，i m m u n e r e l a t e de n z y m e s v 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位 论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除 文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集 体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我 对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：阂雩 日期：二d o 罗年台月 f 孑日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密 口 在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密 口 学位论文作者签名： 闭雾 日期：2 。7 年月l 了日 舯溯躲身j f 绥 醐”p 隔、 上海海洋人学顶十学位论文 己l害 ji口 水体中的悬浮物主要由泥沙、藻类、微生物以及动植物碎屑等组成。在重力 和动力作用下，悬浮物有的很快从水中沉淀出来，有的可悬浮几分钟到几天，有 的会保持无限期悬浮状态( 如胶体或胶体颗粒) 。其主要是由于风浪、洪水、底层石 砾挖掘及水利工程方面的挖掘而造成的。水体中悬浮物( 主要为有机质) 的存在直接 影响了水体透明度和溶解氧，使水质变差，影响了大型沉水植物生长及鱼类等水 生动物的生存，因此悬浮物的含量及组成形态是判断水质污染程度的标准之一。 从2 0 世纪5 0 年代开始，国外很多研究人员对悬浮物予以了高度的重视， 在国外的某些区域，无机悬浮物被认为是水域中最为普遍的污染，它主要通过增 加水体浑浊度所产生的一系列负效应及沉降后的掩埋作用对水体中各种生物类群 如浮游动植物、鱼类等进行行为、生理、生长、繁殖等方面的影响，从而影响整 个水生态系的种群动态及群落结构。其一，主要表现为对海洋动物呼吸器官产生 堵塞影响，从而致使其生理缺氧、甚至窒息死亡；其二，大颗粒悬浮物对底栖鱼 类、尤其是逃逸能力较弱的仔稚幼体以及定居性的贝类等的覆盖，会破坏其栖息 环境，导致减产或死亡，产生直接危害作用：第三，水体中高浓度悬浮物中的有 毒( 害) 物质，通过水生生物的新陈代谢，导致在生物体内的积累，从而对生物本身 及食物链上一级生物产生毒害作用：第四，水体中高浓度悬浮物可降低水体透光 性，影响浮游植物的光合作用，降低水生态系统的初级生产力，从而影响整个水 生态系统。 随着我国沿海经济的快速发展，海洋海岸工程项目越来越多，其施工过程中 不可避免地产生泥沙悬浮，造成附近水域悬浮物浓度大大升高，这势必会造成各 种各样的生态破环。然而研究人员虽然已经意识到水体中过量悬浮物的存在对海 洋生态环境及生物会造成很多负面影响，但是针对其进行系统、细致的研究工作 还较少，国内这方面的研究更少。 基于以上情况，本论文以黄渤海区主要的经济鱼类半滑舌鳎为材料，通 上海海洋人学硕十学位论文 过室内模拟实验，系统地进行了悬浮物对其胚胎、初孵仔鱼、浮游阶段和伏底阶 段稚鱼以及幼鱼的毒性效应研究：以及对其幼鱼肝脏溶菌酶、超氧化物歧化酶、 碱性磷酸酶，鳃丝n a + k + a t p a s e 等四种免疫相关酶活性的影响研究，旨在为海洋 海岸工程所引起的悬浮物污染对海洋生物的损害评估与环境影响评价提供参数与 依据。 2 上海海洋人学硕十学位论文 第一章文献综述 第一节悬浮物概述 悬浮物主要是指粒径大于0 4 5 肛m 悬浮在自然水体中的物质。悬浮物主要包 括两大类，即由浮游动植物、微生物和有机碎屑等组成的有机物和由无机碎屑、粘 土矿物、动物骨骼等组成的无机物，悬浮物的组分直接影响其在水体中的生态作 用。水体中高浓度悬浮物不但对水质理化环境产生重要影响，而且会影响水生生 物的呼吸和代谢，甚至会造成鱼类等水产动物的窒息死亡。 1 悬浮物的定义及组成 1 1 悬浮物的定义 海水中的悬浮物是指海水中包括胶粒在内的、分散度不同的各种悬浮颗粒物 质，其粒径差别很大，粒径范围从胶体( 0 2p m ) 变化至毫米级大小的浮游生物 介壳、粪粒及海洋雪花等f l 2 l ，作为研究对象，悬浮物并没有严格的统一定义，一 般说来它是指比溶解低分子更大的各种多分子或高分子实体，水质分析方法国家 标准把悬浮物定义为：“水样通过孔径为0 4 5 岬的滤膜，截流在滤膜上并于 1 0 3 1 0 5 烘干至恒重的固体物质”1 3 j ，通常认为 0 0 5 ) ；当悬浮物浓度为4 0 0m g l _ 时， 其胚胎孵化率和死亡率与对照组有显著差异( 尸 o 0 5 ) ；当悬浮物浓度8 0 0 m g l o 时，胚胎孵化率和死亡率与对照组有极显著差异( p 0 0 5 ) ；当 悬浮物浓度1 0 0m g l j 时，其畸形率与对照组有极显著差异( 尸 o 0 1 ) 。 表2 3悬浮物对半滑舌鳎胚胎孵化的毒性影响 t a b2 3 t o x i ce f f e c t so fs u s p e n d e ds u b s t a n c eo ne m b r y o sh a t c h 注：同一列数据上角不同上标小写字母表示有显著差异( 尸 0 0 5 ) ，不同上标人写字母 表示有极显菥差异( 尸 o 0 1 ) 2 2 悬浮物浓度与胚胎孵化率和初孵仔鱼畸形率之间的相关性分析 图2 1 、2 2 为悬浮物浓度与半滑舌鳎胚胎孵化率和初孵仔鱼畸形率之间相关 性的分析。通过o r i g i n7 5 专业函数绘图软件对其进行线性拟合，从图中可以看 出相关系数r 2 分别为0 9 9 2 9 和0 7 7 0 0 ，均表现出了较好的毒性效应相关性； 同时可以看出显著检验水平尸值分别为0 0 0 0 和0 0 0 4 ，均小于0 0 1 ，在0 0 1 水平上极显著相关，进一步说明悬浮物浓度对半滑舌鳎胚胎孵化率和初孵仔鱼畸 形率有显著影响效应。鱼类胚胎的孵化出膜主要靠两方面的作用，即胚体运动和 1 9 上海海洋人学硕十学位论文 孵化酶的作用【m i ，实验中胚胎孵化率降低可能是由于悬浮物的存在直接或间接地 破坏了孵化酶的作用机制或抑制了胚体的运动机制而造成的。在实验过程中，我 们发现虽然大部分胚胎能够在一定悬浮物浓度( 8 0 0m g l 一) 水体中继续发育，并 破膜而出，但初孵仔鱼活力差，畸形率高，且高浓度组( 1 6 0 0m g l 一) 中的初孵仔 鱼2 4 h 内就会全部死亡。 04 0 08 0 01 2 1 6 0 02 0 0 02 4 0 0 2 8 0 03 2 0 0 悬浮物浓度( m g l - 1 ) 图2 1悬浮物对胚胎孵化率的影响 f i g2 一l e f f e c t so fs u s p e n d e ds u b s t a n c e o ne m b r y o sh a t c h i n gr a t e 9 0 8 0 熏7 0 蘑6 0 婪5 0 善o 耋3 0 暴2 0 l o 0 4 0 08 0 01 2 0 01 6 0 02 0 0 02 4 0 02 8 0 03 2 0 1 ) 悬浮物浓度( m g l i ) 图2 2悬浮物对初孵仔鱼畸形率的影响 f i g2 - 2 e f f e c t so fs u s p e n d e ds u b s t a n c eo n n e w l y - h a t c h e dl a r v a e sd e f o r m i n g r a t e 2 3 悬浮物对半滑舌鳎胚胎的起始半致死浓度和安全浓度 如表2 4 所示，通过b l i s s 法计算得到，悬浮物对半滑舌鳎胚胎的起始半致 死浓度( 9 5 可信限) 为1 9 7 4 8m g l 1 ( 1 3 7 5 4 - 2 8 3 5 5m g l 1 ) ，安全浓度( s o 为 1 9 7 5m g l 1 。其结果远大于悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼的9 6 hl c 5 0 ( 见本章第二节 研究结果) 。这很可能与卵膜的保护作用有关，虽然初孵仔鱼内部组织器官和功能 要较胚胎时期完善，但在短时间内，卵膜的存在一定程度上阻止和减缓了悬浮物 颗粒通过绒毛膜进入胚胎的内部，从而减少了毒物的效应时间而减轻了毒害作用。 这与e r i c h s e n 研究苯酚对鱼类早期发育阶段毒性时发现的卵子对毒物的抗性超 过胚后阶段结论相致【嘶l 。 2 0 们旧 零一雅基鏊饕凌 上海海洋人学硕十学位论文 表2 4 悬浮物对半滑舌鳎胚胎的剂量一反应相关关系及毒性效应结果 t a b2 - 4t h ec o r r e l a t i o no fd o s e r e a c t i o na n dt o x i ce f f e c t so fs u s p e n d e ds u b s t a n c eo ne m b r y o 注：y 为概率单位：x 为浓度对数 第二节悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼的急性毒性效应 1 材料和方法 1 1 实验材料 实验用半滑舌鳎初孵仔鱼取自于海阳市黄海水产有限公司，为胚胎出膜后l h 内初孵仔鱼，挑选健康、活泼、大小一致的个体用于实验。 实验泥样和实验用海水同本章第一节1 1 1 2 实验方法 1 2 1 实验用泥样及海水主要理化成分含量的分析 同本章第一节1 2 1 1 2 2 悬浮物溶液的配制 同本章第一节1 2 2 1 2 3 悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼的急性毒性实验 实验参照国家标准水质物质对淡水鱼( 斑马鱼) 急性毒性测定方法 1 0 7 】进行， 悬浮物浓度梯度设置为5 0 、1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 、8 0 0 、1 6 0 0 、3 2 0 0m g l 一，每个梯度 均设置两个平行组，另外设置相应的对照组( 为砂滤海水，不加泥样) 。实验容器为 1 0 0 0m l 烧杯，加入各浓度梯度悬浮物溶液8 0 0m l ，水浴控温，充气泵充气， 每2 4 h 更换一次悬浮物溶液，每个烧杯加入初孵仔鱼2 0 尾，整个实验过程不投 饵。分别在实验后2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 、9 6 h 观察记录初孵仔鱼死亡情况及活动情况， 并及时清除死亡个体。实验重复一次。根据实验数据求出悬浮物对半滑舌鳎初孵 2 1 上海海洋人学硕七学位论文 仔鱼的4 8 h i , c s o 、9 6 h l c s o 和s c 。 死亡判定：用玻璃棒触动身体5 s ，无任何反应即视为死亡。 1 3 数据分析及处理 数据用s p s s l 3 0 软件进行单因素方差分析( o n e w a ya n o v a ) ，并用均值多 重比较分析法( l s d 法) 检验组内及组间的差异显著性。悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼 的4 8 hl c 5 0 、9 6 hl c s o ( 9 5 可信限) 运用b l i s s 法来计算，并通过公式s c = 【9 6 h l c 5 0 】o 1 【1 0 4 】计算悬浮物对初孵仔鱼的安全浓度。实验结果以m e a n s4 - s d ( n = 6 ) 计。 2 结果与讨论 2 1 悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼急性毒性效应影响 悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼急性毒性效应结果如表2 5 所示。随着悬浮物浓 度和效应时间的增加，初孵仔鱼死亡率明显增加。当悬浮物浓度1 6 0 0m g l 。 时，初孵仔鱼在2 4 h 内全部死亡，且各浓度组致死效应主要发生在2 4 h 内，2 4 h 后死亡率有大幅度下降，说明初孵仔鱼在悬浮物溶液中生活一段时间后，对该环 境产生了定的适应性。通过显著性分析，当悬浮物浓度为5 0m g l d 时，其9 6 h 死亡率与对照组有显著差异( 尸 o 0 5 ) ；当悬浮物浓度1 0 0m g l 。1 时，其9 6 h 死亡率与对照组有极显著差异( 尸 o 0 1 ) 。 实验过程中，各浓度组中初孵仔鱼的中毒症状基本相似，开始体表粘液分泌 增多，出现急躁不安，沿烧杯侧壁忽上忽下狂游或在水面原地转圈，并不时与烧 杯侧壁发生碰撞，一段时间后游动趋于缓慢，身体失去平衡，逐渐麻痹昏迷致死。 高浓度组中初孵仔鱼的中毒反应较为明显且迅速，短时间内就出现死亡；低浓度 组中毒反应则比较缓慢，要经过较长时间才会出现死亡。 上海海洋大学硕_ = = 学位论文 0 i 对月组1 4 1 4 17 4 6 l4 17 8 牡18 893 锄2 2 5 0 4 3 社l1 9 8 6 3 23 8i i4 4 * 21 41 37 4 蛄4 b 1 0 0 1 0 7 5 29 41 51 6 - 40 2 1 74 3 “3 6l 90 9 士4 2 0 0 2 7 8 7 “5 20 4 - 2 65 7鸽8 嘶6 36 i 士84 9 4 0 0 6 7 7 l 52 58 6b 瑚9 69 56 1 30 39 87 6 士2 1 2 8 0 09 12 2 x - 43 7 9 95 7 ：l 10 6l 砸0 0 虮0 01 0 0 0 0 士00 0 1 6 0 0 i 叽0 0 o 肿1 0 0 0 0 01 0 0 0 0 o 肿1 0 0o o 0 肿 北0 0 l 帆0 0 士0 肿1 0 0 0 0 01 0 00 0 = 0 脚1 0 00 0 如0 0 图2 - 3 描述了不同浓度悬浮物在不同时间段对半滑舌鳎初孵仔鱼死亡率的影 响。从图中可以看出，悬浮物浓度越大，初孵仔鱼死亡率越高：且随着时间的延 长，死亡率升高。 i 章6 0 甜 u 舞4 0 2 0羹耀 干攫。艘，霜 时间n ) 图2 - 3 不同时间段内不同浓度悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼死亡率的影响 f i 9 2 - 3e f f e c t o f s u s p e n d e ds u b s t a n c e o n n e w j y - h a t c h e d l a r v a e a b o u t m o r t a l i t yr a t e 2 3 茹黜越五墨糯墨笠 上海海洋人学硕士学位论文 2 2 悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼的半致死浓度( l c s o ) 幂1 安全浓度( s o 半致死浓度是指在生物急性毒性试验中，使受试生物半数死亡的毒物浓度， 用c 5 0 表示。通过计算半致死浓度可以比较不同生物以及同种生物不同发育阶段 对污染物毒性的敏感性，从而可以更直观的了解污染物的危害程度。 如表2 - 4 所示，通过b l i s s 法计算得到，悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼的4 8 h c 5 0 和9 6 hl c 5 0 ( 9 5 可信限) 分别为2 2 6 9n a g l _ ( 2 0 4 6 - - 2 5 1 7m g l 。1 ) 和 2 0 2 9m g l 叫( 1 8 2 3 2 2 5 9m g l 一) ，安全浓度( 为2 0 2 9m g l 一。其4 8 hl c 5 0 和 9 6 hl c 5 0 比较接近，说明实验后期初孵仔鱼对悬浮物表现出了一定的适应性；初 孵仔鱼9 6 hl c 5 0 远小于胚胎的起始半致死浓度( 见本章第一节研究结果) ，这可能 与卵膜的保护作用有关。 表2 - 6 悬浮物对半滑舌鳎初孵仔鱼的剂量一反应相关关系及毒性效应结果 t a b2 - 6t h ec o r r e l a t i o no f d o s e r e a c t i o na n dt o x i ce f f e c t so fs u s p e n d e ds u b s t a n c eo n n e w l y h a t c h e dl a r v a e 注：y 为概率单位：x 为浓度对数 2 3 悬浮物致死机理分析 通过受试动物反应症状和实验结果，结合实验条件可以推出初孵仔鱼的致死 效应可能由以下两方面原因引起。一方面悬浮物颗粒的存在改变了水体的光照条 件，从而引起某些水质环境条件的变化，而仔鱼的组织器官和生理机能此时正处 于发育和完善阶段，由于水质环境条件的改变极易造成其新陈代谢的紊乱而导致 其死亡；另一方面很有可能由于缺氧窒息导致死亡，虽然充气泵的连续充气使得 水体中的溶解氧处于较高而稳定的水平，但水体中微细悬浮物颗粒( 粒径3 8g m ) 的存在阻碍了初孵仔鱼的呼吸器官，通过镜检发现，死亡个体的鳃部不同程度地 分布有悬浮物颗粒，而悬浮物中的主要有毒成分含量( 表2 1 ) 远低于海洋沉积物质 量第一类标准，基本不会对受试动物产生毒害作用，这也就排除了其他毒物作用 的可能性。 2 4 上海海洋大学硕士学位论文 本章小结 1 悬浮物对半滑舌鳎胚胎的孵化时间影响不显著，主要集中在3 3 - 3 6h 之 间；对胚胎孵化率和死亡率、初孵仔鱼畸形率影响效应显著，胚胎孵化率随着悬 浮物浓度的增加而降低，死亡率和初孵仔鱼畸形率则随着悬浮物浓度的增加而升 高，当悬浮物浓度8 0 0m g l 一时，胚胎孵化率和死亡率与对照组有极显著差异 ( p 0 0 1 ) ，当悬浮物浓度1 0 0m g l - 。时，其初孵仔鱼畸形率与对照组有极显著 差异( 尸 0 0 5 ) ；悬浮物浓度1 6 0m g l _ 时，其9 6 h 死亡率与对 照组有极显著差异( p o 0 5 ) ，悬浮物浓度1 6 0 0 m g l 一时，其9 6 h 死亡率与对照组有显著差异( 尸 幼鱼( 4 5 同龄) 。即随着稚幼鱼的不断生长发育，其对悬浮物污染的耐受性越来 越强。 2 中毒症状基本相似，主要表现为鱼体粘液分泌增多，游动频率加快且无规 律，不时在水面逛游，经常与烧杯侧壁发生碰撞，一段时间后游动趋于缓慢，身 体渐渐失去平衡，沉入杯底而死亡。 3 致死效应主要发生在2 4 h 或4 8 h 内，之后死亡率有很大幅度的下降，表 明稚幼鱼在悬浮物溶液中生活一段时间后，对该环境产生了一定的适应性。 4 水温对悬浮物的致死效应影响明显。不管是稚鱼还是幼鱼，其在2 3 的 半致死浓度远大于2 6 ，表明温度越高，悬浮物致死效应越明显。 3 8 上海海洋人学硕十学位论文 第四章悬浮物对半滑舌鳎幼鱼免疫相关酶的影响 水体中高浓度的悬浮物能够导致半滑舌鳎等水生动物死亡，然而绝大多数受 悬浮物污染的水体其悬浮物浓度往往达不到足以引起水生动物急性中毒死亡的程 度，而水生动物长期生活在含低浓度悬浮物的水体中时，由于悬浮物长时间的作 用，也有可能会影响这些动物的生长、生理、行为等功能，进而威胁到水生动物 的安全。本章研究了悬浮物对半滑舌鳎幼鱼免疫相关酶的影响。 第一节悬浮物对半滑舌鳎幼鱼肝脏溶茵酶( l s z ) 活力的影响 1 材料和方法 1 1 实验材料 半滑舌鳎幼鱼于2 0 0 8 年5 月取自于海阳市黄海水产有限公司，体色正常， 健康活泼，全长( 8 0 94 - 0 4 6 ) c m ，体重( 4 9 84 - 0 6 4 ) g 。实验前于装有8 0l 海水的 水族箱( 6 0 c m 3 4 0 c m 3 x 4 0 c m 3 ) 中暂养2 周，连续充气，日换水率1 0 0 ，并投 喂“海力利海”牌半滑舌鳎专用配合饲料( 青岛金海力水产科技有限公司生产) ，日 投饵2 次( 9 ：0 0a m ，1 6 ：0 0p m ) ，投饵量为幼鱼体重的3 4 。 实验泥样采集于海阳沿海滩涂，带回实验室后在通风处摊开晒干，然后在烘 箱中6 0 条件下烘干至恒重，冷却并研磨成粉末状，过4 0 0 目筛绢，使其粒径 3 81 a m ，于干燥器中低温保存，其主要污染成分含量见表2 1 。 实验用水为即墨沿海自然海水，经砂滤处理，其理化指标如下：悬浮物浓度 为2 5 5m g l ，盐度为3 0 6 8 士0 1 6 ，p h 为8 1 54 - 0 0 4 ，温度为( 2 0 94 - 0 6 3 ) ， d o 为( 7 0 34 - 0 3 3 ) m g + l ，n i - 1 4 - n 为( o 0 8 54 - 0 0 0 9 ) g m o l l 一，n 0 2 一n 为( 0 1 5 54 - 0 0 2 7 ) p m o l l 一，n 0 3 - n 为( 8 5 64 - 0 6 0 5 ) l 上m o l l 。 1 2 实验设计 设置4 个实验组和1 个对照组，每组随机取健康活泼的半滑舌鳎幼鱼3 0 尾，分别养于5 个装有8 0l 海水的水族箱内，所有组的水温、投饵等养殖条件 3 9 上海海洋人学硕士学位论文 与暂养时相同，实验期间受试鱼死亡率低于1 0 。每天早晨8 ：4 0 将各水族箱水 体全部更新并向各实验组添加泥样悬浮物，添加浓度依次为5 0 、1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 m g l ，对照组不添加。实验期间各实验组泥样悬浮情况良好，箱底没有明显沉积。 于实验开始后每隔4 天分别从各箱中随机取出3 尾半滑舌鳎幼鱼，迅速取其肝 脏装入1 0m l 塑料离心管，做好标记放入一8 0 c 的冰箱中以备测定。 1 3 样品前处理和酶活力测定 1 3 1 样品前处理 取鱼肝脏称重，按肝重量：生理盐水体积= l ：1 9 进行冰浴匀浆，制成5 组 织匀浆，然后于4 条件下离一t 二, ( 1 0 0 0 0r m i n ，1 5m i n ) ，取中间较澄清液体用于溶 菌酶的活力测定。酶液置于4 冰箱中保存备用，8 h 内分析完毕。 i 3 2 酶活力测定 肝脏溶菌酶( l s z ) 活力的测定采用南京建成生物公司提供的检测试剂盒，运用 比浊法，活力单位为腭- m l ，相应操作参照说明书进行。 1 4 数据分析 数据用s p s s l 3 0 软件进行单因素方差分析( o n e - w a ya n o v a ) ，并用均值多 重比较分析法( l s d 法) 检验组内及组间的差异显著性。实验结果以m e a n s4 - s d ( 1 1 - 3 ) 计。 2 结果与讨论 2 1 悬浮物对半滑舌鳎幼鱼肝脏溶菌酶( l s z ) 活力的影响 l s z 是一种碱性蛋白，能水解革兰氏阳性细菌的细胞壁中黏酞乙酰基多糖使 之裂解并释放出来，形成一个水解酶体系，破坏和消除侵入体内的异物，从而担 负起机体的防御机能【8 9 】。鱼类l s z 是鱼体抵抗病原菌感染的重要非特异性因子之 上海海洋大学硕十学位论文 由表4 1 可以看出，0 和5 0m g l _ 悬浮物浓度添加组，其半滑舌鳎幼鱼肝 脏l s z 活力无明显变化；而1 0 0 、2 0 0 和4 0 0m g l 叫悬浮物浓度添加组l s z 活力 先升高后降低，1 0 0m g l 一悬浮物浓度添加组l s z 活力第1 5 d 达到最大值，2 0 0 和 4 0 0m g l _ 悬浮物浓度添加组l s z 活力第1 0 d 达到最大值，都呈现出倒“u ”型 变化趋势，后期相对趋于稳定( 图4 1 ) 。实验结束时，相对于对照组，除5 0m g - l q 悬浮物浓度添加组外，其余各浓度添加组l s z 活力都受到了不同程度的抑制。 4 8 4 2 皇3 6 j 、，3 0 - r 噢 n2 4 j 1 8 1 2 i o1 5 时间( d ) 图4 一l 各悬浮物浓度添加组半滑舌鳎幼鱼肝脏溶菌酶活力的变化趋势 f i g4 一l t h ec h a n g et r e n do fl s za c t i v i t i e si nl i v e ro fy o u n gf i s h 4 1 上海海洋大学硕士学位论文 出图4 2 可以看出，通过单因素方差分析，当悬浮物添加浓度为5 0 和1 0 0 m g l 。时，除第1 5 d1 0 0 m g 一浓度添加组半滑舌鳎幼鱼肝脏l s z 活力与对照组 有显著差异外( 产( o0 5 ) ，其余各实验组与对照组均无显著差异( 尸 00 5 ) ；当悬浮物 添加浓度为2 0 0 和4 0 0m gl 。1 时各实验组其肝脏l s z 活力与对照组均有显著 差异( p 00 5 ) 。1 0 0 、2 0 0 和4 0 0m gl 。浓度添加组l s z 活力先升高后降低，表 明在悬浮物效应初期，半滑舌鳎幼鱼受到了较强的应激，l s z 活力因此而升高， 随后幼鱼对悬浮物产生了一定的耐受性，其肝脏l s z 活力降低并趋于稳定。 i ；一 囤4 - 2 悬浮斩( 不同添加泉度) 时半滑舌鳎幼旦肝脏溶茴酶活力的影响 4 ：差月# 准* 堇表， 目亭 表 “目差异著f p 0 0 5 ) f i 9 4 - 2 t h ee f f e c t o fs u s p e n d e ds u b s t a n c eo nl s za c t i v i t i e s i n l i v e r o f y o u n g f i s h n o t e ：e r wr h br c 眦n ts o ；d l f h r n t l e t t e r s m 啪s i g n i f i m n t l yd i f f c r e n t h g r o u p s 22 不同悬浮物添加浓度与肝脏溶菌酶( l s z ) 活力之间的相关性比较 通过o r i g i n7 5 专业函数绘图软件对不同悬浮物添加浓度与l s z 活力之间的 相关性进行多项式拟合。从图4 - 3 可以看出相关系数r 2 太小依次为4 0 0 m g l o 添加组( r 2 卸7 5 6 4 ) 、2 0 0 m g 一添加组( 酽= 0 7 5 0 4 ) 、1 0 0 m g l 。添加组( r 2 = 0 6 0 0 9 ) 、 0m gl - 。添加组( 鲜= o4 8 4 0 ) 、5 0m g 一添加组( 一= 03 8 6 4 ) 。说明水体中悬浮物浓 度越高，对半滑舌鳎幼鱼肝脏l s z 活力影响效应越明显。 上海海洋大学硕士学位论文 船 p 毫3 2 白 02 4 r 蜒1 6 铸 j 8 0 y = 2 47 6 0 7 6 + 0 1 1 2 7 6 x 0 0 0 7 8 4 x 2 r 2 = o 4 8 4 0 ，；0 3 7 l 工，t。 i i 一十 05 ol o1 52 02 ， 时问( d ) 0i o1 52 02 5 时白j ( d ) b d 1 01 52 02 5 时问( d ) 4 0 a 01 01 52 02 5 时闻( d ) o51 01 52 0 2 5 时阃( d ) 图4 32 5 天不同悬浮物添加浓度与溶菌酶活力之间相关性的比较 c e a 一对照组；b - - 5 0m g - l i 添加组；c - - 1 0 0m g l 。添加组：d - - 2 0 0m g l i 添加组：e - - 4 0 0m g l 。添加组 f i g4 - 3 t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nd i f f e r e n ta d d i t i o n a lc o n c e n t r a t i o n sa n dl s za c t i v i t i e so n2 5 d a c o n t r o l ；b - - 5 0m g l a d d i n gg r o u p ；c 1 0 0r a g - l 。a d d i n gg r o u p ； d 一2 0 0m g - l a d d i n gg r o u p ；e - - 4 0 0m g - l ia d d i n gg r o u p 4 3 船 强 n 陆 8 o _【1u三0r蟮n-l 鸺 帕 弛 弘 8 o j拿0rf蜒nsl n 弛 n 佑 8 o 一乙#三长蟾n1 弛 m 怕 8 o 一j#幻rvr蜒nj 上海海洋人学硕十学位论文 第二节悬浮物对半滑舌鳎幼鱼肝脏超氧化物歧化酶( s o d ) 活力的影响 1 材料和方法 1 1 实验材料 同本章第一节1 1 1 2 实验设计 同本章第一节1 2 1 3 样品前处理和酶活力测定 1 3 1 样品前处理 取鱼肝脏经灭菌生理盐水润洗，用吸水纸吸去表面水分后称重，加入组织块 重9 倍体积的生理盐水中，冰浴匀浆后于4 c 条件下离- t 二, 0 0 0 0 0r m i n ，l5m i n ) ， 然后取上清再用生理盐水按l ：9 稀释成1 组织匀浆，待测。酶液置于4 。c 冰 箱中保存备用，8 h 内分析完毕。 1 3 2 酶活力测定 超氧化物歧化酶( s o d ) 活力和蛋白含量的测定均采用南京建成生物公司提供 的检测试剂盒，s o d 活力的测定采用黄嘌呤氧化酶法，活力单位定义为每m g 组 织蛋白在lm l 反应液中s o d 抑制率达5 0 时所对应的s o d 量为一个s o d 活 力单位( u m g p r o t ) ；蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，单位为m g m l 1 ，相应 操作参照说明书进行。 1 4 数据分析 同本章第一节1 4 2 结果与讨论 2 1 悬浮物对半滑舌鳎幼鱼肝脏超氧化物歧化酶( s o d ) 活力的影响 s o d 是生物体内一种重要的抗氧化酶，可以清除机体体内多余的自由基，使 自由基的产生与消除处于一个动态平衡中，从而免除自由基对生物分子的损伤， 4 4 上海海洋火学硕+ 学位论文 并对延缓衰老有重要意义【8 7 1 。近年来研究表明s o d 酶活性与生物的免疫水平密切 相关，可用它们的活性变化作为机体非特异性免疫指标，甚至定量指标【3 9 1 ，其活 力的变化反映了机体抵制自由基损伤的能力唧】。 表4 2 半滑舌鳎幼鱼肝脏超氧化物歧化酶活力测定结果( 平均值标准差) t a b4 - 2t h er e s u l t so fs o da c t i v i t i e si nl i v e ro fy o u n gf i s h ( m e a n s4 - s o ) 由表4 2 可以看出，5 0 和1 0 0m g l 一悬浮物浓度添加组，其半滑舌鳎幼鱼肝 脏s o d 活力相对于对照组略有上升；而2 0 0 和4 0 0m g l 一悬浮物浓度添加组其 s o d 活力则呈现逐步下降趋势，后期相对趋于稳定( 图4 4 ) 。实验结束时，相对 于对照组，5 0 和1 0 0m g l d 悬浮物浓度添加组其s o d 活力没有受到抑制，相反 有一定程度的加强；而2 0 0 和4 0 0m g - l 一浓度添加组s o d 活力都受到了较大程 度的抑制。 由图4 5 可以看出，通过单因素方差分析，当悬浮物添加浓度为5 0 和1 0 0 m g l o 时，除第2 0 d1 0 0m g l 。1 浓度添加组半滑舌鳎幼鱼肝脏s o d 活力与对照组 有显著差异外( 尸 o 0 5 ) ，但略有升 高：当悬浮物添加浓度为2 0 0 和4 0 0m g l 。时，各实验组其