（森林保护学专业论文）交织顶孢霉水提物中核苷类物质的研究.pdf

摘要交织顶孢霉( 4 c 旭m d ，z f 聊zf ，即胁口m ，l ( g i l 蚴a b b o t t ) g a m s ，r c e f 2 6 0 ) 是从古尼虫草小孢变种上分离出来的一株极具药用价值的菌株。前期的药理试验证明，其水提物对大鼠实验性肝缺血再灌注损伤模型( i r ) 有明显的保肝作用，而且进一步的研究表明主要起作用的成分为核苷类。本研究对该菌株代谢物保肝作用机制、核苷类物质的分离纯化、不同细胞破碎方法对核苷类物质提取的影响、核苷类物质发酵条件和提取工艺对核苷类物质的影响进行了较为系统的研究，旨在为利用交织项孢霉内含物一核苷类物质作为药物开发提供依据。用r c e f 2 6 0 菌体水提物进行免疫性肝损伤和化学性肝损伤保护机制的研究。以a l l 、a s t 、m d a 、s o d 和肝坏死程度为综合指标来评价不同剂量水提物的保肝作用。结果表明，两种不同肝损伤模型中，不同剂量的水提物均可使b c g + l p s 、c c l 4和d 删n 诱导的血清a l | t 、a s t 升高的活性降低，同时能降低肝匀浆中m d a 的水平，提高s o d 的活性，而且还可以使b c g + l p s 诱导的肝匀浆中升高的t n f q 和i l i 的含量降低，具有明显的肝损伤保护作用，且量效作用明显，其中大剂量水提物的保肝作用最强，显著高于中剂量组和低剂量组。经t l c 、h p l c 、m s 测定分析，结果发现：r c e f 2 6 0 水提物的主要有效成分为核苷类物质，经分离纯化得到尿苷、胸腺嘧啶核苷和腺苷。r c e f 2 6 0 菌体水提物的得率为1 5 9 3 。用h p l c 法进行核苷类物质的定量分析，将样品的峰面积与标样的标准曲线进行对照，计算得出r c e f 2 6 0 菌体水提物中主要核苷组成为尿菅2 1 1 4 、黄嘌呤核昔1 0 4 2 、胞嘧啶核苷1 7 7 7 、胸腺嘧啶2 1 1 、胸腺嘧啶核营1 2 5 9 、腺苷6 6 9 、虫革素l t3 4 ，其它2 7 9 4 ( 主要为糖类和肽类) 。为了提高菌体中总核苷的提取率，比较了干法和湿法提取对r c e f 2 6 0 菌体中总核昔含量的差异。其中，湿法提取比较了微波法、酶解法、自溶法、酸热法和超声波、反复冻融法等多种细胞破碎方法对核苷类物质提取率的影响。结果发现微波法处理4 r n i n ，溶液中核苷类物质就达到o 9 4 6 0 m i n l ：酶解法中含量为o 1 5 的绿色木霉、纤维素酶、木瓜蛋白酶的破壁效果较好，处理5 h 后溶液中核苷类物质的含量分别为1 - 3 5 0 3 、1 2 8 2 3 、1 5 4 3 3 m m l ：自溶法处理1 2 h 的含量为1 7 3 9 6 m m l 。综合各方面因素最终选定微波低温解冻档处理4 m i n 为最适的提取方法。干法提取时首先要将发酵所得的湿菌丝进行干燥。本研究比较了不同温度的干燥处理的效果，结果表明：6 5 、6 0 条件下烘干的菌粉中核苷类物质提取率较高，分别为1 0 1 和1 0 0 ，4 0 和冻干条件下含量较低。因此生产上可以选择操作方便、简单易行且成本较低的烘干方法，然后作进一步的提取。从不同水浴温度、浸提溶剂、浸提比例和浸提时间对核菅类物质影响的正交试验? ；娜霄、导师间童钾垒文公布结果中可以发现- 上述各个因素对核苷类物质的提取均有显著的影响。最佳提取工艺为：水浴温度5 0 、浸提溶剂5 0 乙醇、浸提比例1 ：5 、浸提时间6 0 m i n 。以核苷类物质的含量为指标，比较不同的碳源、氮源、无机盐、起始口h 值、维生素、温度以及营养因子浓度对其影响，最终筛选出适于r c e f 2 6 0 菌株工业化生产的最佳发酵工艺配方：麸皮3 ，葡萄糖l ，黄豆粉3 ，酵母粉2 ，m g s 0 4 0 0 2 、k 2 h p 0 4 0 0 6 ，复合维生素o 0 5 。试验中还比较了几种不同来源虫草菌粉中核苷类物质的差异，结果表明：r c e f 2 6 0 菌粉中核苷类物质的含量高于冬虫夏草生药和中国被毛孢菌丝粉。关键词：交织顶孢霉核瞢类细胞破碎提取工艺发酵a b s t r a c tr c e f 2 6 0i sav a l m b l es n 面no f4 c r p 用删f h 珊f 删“七砷删( g i l m 姐& a b b o t t ) g a m sf o rm e d i c i n a lu s e ，i s o l a t e d 肋mc 0 咖e 舻触n 斤f fv 札m 栩o r n l ep 咖l a r ye x p e r i m e mh a sr e v e a l e dt h a ti t sa q u e o u se x t f a c th a so b v i o u se 髓c t so fi i v e rp r o t e c t i o nb a s c do ni rm o d e l ，a l i dt h a tt l l em a i n 如n c t i o n “c o m p o n e n t sa r en u c l e o s i d e s 1 1 1o r d e rt op f o v i d ep r o o ff o rm e d i c i n ee x p l o i 钮t i o no ft 王l en u c l e o s i d e s ，也e1 i v e r p m t e c t i o nm e c h a i l i s mo ft l l ee x 打a c to ni n j u r e dm i c e ，i s o l a t i o na n dp 嘶虹c a t i o no ft h en u c l e o s i d e s ；t l l ee 丘b c t so fd i f f b r e n te x t r a c t i o nc o n d i t i o n so n 也e 眦c l e o s i d e sa 1 1 dl i q u i df e 功1 e n t a t i o nt e c h n i q u e sw e r es t u d i e di nt 1 1 et h e s i s i nm ei m m u n ea n dc h e m i c a ll i v e rd a m a g em o d e l ，d i 丘b r e n td o s a g e so fa q u e o u se x t r a c tf 如mr c e f 2 6 0m y c e l i u ma l ls i g n i a n t l yd e c l i 北d 也er a i s e dl e v e l so fa l l ja s ta n dm d ai nl i v e r so f 刈u r e di n i c ei n d i l c e db yb c g + l p s ，c c l 4a i l dd - g a l na n d 嘣s e dm ea c t i v 时o fs o d m e a n w 磷e ，m er a i s e da c t i v 耐e so ft n f - aa 1 1 di l ii n d u c e db yb c ( 卜h l p sw e r er e d u c e d n l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea q u e o u se x t r a c te x e r t e de v i d e n tp r o t e c t i v ee 丘色c to nl i v e ra n d 也a tt h ee f f e c tw 弱d o s a g ed e p e n d e n t a q u e o u se x t r a c t i o nt e s t ss h o w e d 廿l a t l ey i e l do fn u c l e o s i d e s 舶mr c e f 2 6 0m y c e l i u m 、v a s1 5 9 3 1 ke x 船哦w 勰a f l a l y z e d 谢血t l c ，瑚l ca 1 1 dm s ，a n dt h ef e s u i t ss h o w e dt h a tt 主龇w e r es e v e r a lk i n d so fn u c l e o s i ( i e si nt h ee x t r a c t a n dm ec o m p o s i t i o n so f t h en u c l e o s i d e sw e r ea sf o l l o 、v i n g ：u r i d i n e2 1 1 4 ，x a n t h o s i n e1 0 4 2 ，c ”i d i n e1 7 7 7 ，t 1 1 y m i n e2 1 1 ，n y m i d i 北1 2 5 9 ，a d e n o s i n e6 6 9 a f l d oc o r d y c e p i n1 3 4 t h ee x 仃讹tw 鸽触t h e ri a o l a t e dw i 也l ca n dp 嘶f i e d 、v i 也p r e p a r a t i v eh p l c ，a n d嘶d i n e ，a d e n o s i n e ，觚d 蜥d i n ew e r eo b t a i n e d t h eg e n e r a lc o n t e mo fn u c l e o s i d e si nm ew e tm y c e l i u ma n dm y c e l i a lp o 、v d e rb yd i 髓r e n te x m i c t i o nm e 也o d sw e 碍c o m p 缸e d ，i i l c l u d i n gm e 吐l o d so fm i c m w a _ v e ，e n 巧m e ，a u t o l y s i s ，a c i d h e a t i n g ，u l t r a s o n i ca n d 缸e z r c s o l v m g t h er e 5 l l i t ss u g g e 咖dt l l a tt r e a 衄e n td m ei nm em e m o d so fe n 捌m e 锄da u t o l y s i s 、鹤t o ol o n g ，缸dn l ea c i d - h e a t 血gw e 弱yt oc a u s ed e n a t u r a l i 刎o n m i c m w a v e 仃e a d n gf o r4 m i n 、v 鹤m e r e f o r cs e l e c t e da s增o p t i m a lm e t l l o df o rw e tm y c e l i a i no r d e rt 0o p t i m i z ead 晌gm e ( h o do fw e tm y c e l i ap r o d l i c e d 证f e m e n t a t i o n ，d i 恐r e n td r y i n gm e t h o d sa i l dd r y i n gt e m p e r a t u r ew e r e m p a r e d ，i n c l u d i n g & e z ed f y i n ga n do v e nd r y i n ga t4 0 7 0 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dm a to v e nd r y i n g “5 5 6 5 、e r ec o m p a m b l es u i t 西l e ，a n dt h ey i e l da ts u c ht e m p e r a t u r ew 笛o b v i o u s l yh i g h c rm a nt l l a ta t4 0 a i l df r z ed r y i n g f nc o n c l 啷i o n ，t l l em e t h o do f 也eo v e nd r y i n ga t5 5 6 5 i、v a st h co p t i o n a lw a yf o rc o n v e n i e n to p e r a l i o ni ni n d u s 廿y 、i t t ll o wc o s t c o m p a r i s o no fe x t r a c t i n gt e r r 巾e f a t u r e ，s o l v e n tt y p e ，s o l v e n t m y c e i i “陬i o 叫l de x t r a c t i n gt i m ei nw a t e rb a 血，t h eo p t i m u me x 仃a c t i o nc o r l d i t i o nw 髂d e t e n n i n e da sf o l l o w s ：i 衄e r g et h em y c e l i ap o w d e ri n5m n ev o l u m eo f5 0 e m a n o l ，r e e l i n ge x 把a c t i o na t5 0 f j r6 0m i n u t e s as e r i e se x p e r i m e m sw e mc o n m l c t e di n c l u d i n gs c r e e i l i n go fc a r b o n 姐di l i 仃o g e nr e s o u r c e s ，i n 0 唱a l l i cs a l t ，v i t a 】 n i l l ，i n i t i a lv a l u eo fp ho fm e d i 啪，f b 咖e n t a t i o nt e m p e r a t u r ea n do r 吐l o g o n a lt e s t s 1 ko p t 岫啪l i q u i dm e d i mf o ri n d 州础f e h n e n 协t i o no ft h es 仃a i nr c e f 2 6 0 、v 踮d 曲e r m i i l e db yc o m p a r i n gm ec o n t e mo fn u c l e o s i d e s t h em a i nc o m p o n e n t so ft 1 1 em e d i 啪w e r e 鹊f o l l o w s ：b r a n3 ，g l u c o s c1 ，b e a i lp o w d e r3 ，y e a s tp o w e r2 ，m g s 0 40 0 2 、k 2 h p 0 40 0 6 a n dc o 唧o m dv i t a r n i n0 0 5 d i f r e r e 毗c 0 r d y c 印sm y c e l i a lp o w d e r sw e 舱c o m p a 咒da n dt h er e s u l 乜s h o w e d 恤c o n t e mo fm l c l e o s i d e s 丘o mr c e f 2 6 0m y c e l i ap o w d e rw a sh i g h c rt h 锄t 1 1 0 s e 丘o mc o r d v c e p ss i n e m i s 砒dh i r s m e h ds 眦瑚t s k e yw o r d s ：c d 哪惦卿珂”f fv a fm i i l o r ，n u c l e o s i d e s ，c e l l 、d i s m p t i o n ，e 柚a c tt e c h n i q u ef c m l e n t a t i o n独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：碰垂时间：刎年莎月，日关于论文使用授权的说明本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：出时间：，乎年月日导师签名：时间：嬲年月占日引言虫草属( c 0 删旧昝艚( f r ) l i n k ) 是子囊菌中的一大重要昆虫病原真菌，也是虫生真菌中的重要类群之一。目前全球虫草的种类约4 0 0 种“1 ，我国的虫草正式发表的约9 0 余种”1 。我国的虫草种类众多，分布广泛，是一类宝贵的生物资源，可供人类开发和利用。除用于生物防治和食用外，虫草属中许多种类还是名贵中药材，在民间应用流传已达三千年的历史。曾记载于本草纲目的冬虫夏草( c 曲理脑括( b e r k ) s a c c ) 被认为“功与人参同”；本草从新认为其具有“保肺、益脾、止血、化痰、已劳嗽”等功能。蛹虫草( 面r a 订s ( f r ) l i n k ) 药典中称为“北冬虫夏草”，其药效与冬虫夏草相近。蝉花( s 0 6 d j 角阳( h i l l ) 8 e r k p b r ) “本草纲目”记载主治“小儿吊惊癫、夜啼、心悸”，现今中医仍用它治疗这些疾病。1 。由此可见，虫草是一类极具价值的待开发的医药宝库。近年来，人们已从虫草及其无性型中分离得到多种生物活性物质。根据其化学结构大致可以分为核苷类、多糖类、生物碱类、环状肽类、酶类等”1 。各种药理试验表明这些生物活性物质具有抗菌、抗肿瘤、杀虫、免疫调节、抗辐射、抗衰老、治疗疑难病症等作用，在农业、医药上有重要的用途。”。e v a n s ；：。”1 9 8 2 年从蛹虫草中得到几种代谢产物，如昆虫毒素、虫草素，具有一定的商业开发价值。我国是肝病发生率较高的国家，寻找和研究治疗肝病的有效药物，一直是广大科研工作者的心愿。近年来，人们从天然药物中觅到了不少对肝脏确有疗效的药物。到目前为止，临床试验已经证明有多种药用真菌对肝损伤具有很好的保护作用。如假密环菌( 加f a 订p 如 a 6 e s c 朗s ) 杂多糖y h i r 4 和活性蛋白对c o n a 和a f t b l 诱导肝损伤有拮抗作用；从灵芝( 白门d 如墙2j 叼j 出动子实体中提取的两种三萜类组分g t 和g t z ，对c c k 、d g a l 、b c g + l p s 三种实验性小鼠肝损伤有明显的保护作用，可显著降低肝损伤所致的血清a l t 和肝脏t g 的升高；冬虫夏草生药( cs j 打鲋s j s ) 和中国拟青霉( 忍p c ，伽弦印ss j r 7 鲫s 妇s pn o v ) m 。预防性给药对b c g + l p s 诱导的小鼠免疫性肝损伤具有一定的保护作用，此外还具有促进肝细胞再生的功效。f r d e r i k s e n 等“”于2 0 世纪5 0 年代由此报道了从蛹虫草的培养液中分离出核菅类抗菌素一虫草素并发现其显著的抗癌活性，引起人们对虫草属真菌中核苷类化合物的广泛重视，新的核苷类物质不断被发现。徐文豪等“”利用强酸性离子交换树脂、大孔吸附树脂和硅胶层析从西藏产冬虫夏草的子座中分离出次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤、尿嘌呤和次黄嘌呤；从虫体中得到腺嘌呤、腺苷、鸟嘌呤、次黄嘌呤。姜泓等“圳从人工培养的蛹虫草予实体中分离获得5 种核苷类化合物，如腺昔、虫草素、胞苷、肌苷、尿苷。虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素，为一种细胞毒性物质“，具有多种药理作用，是目前的研究热点之一，它的生物活性越来越受到人们的重视。其生物效应主要有：对链球菌、鼻疸杆菌、石膏样小芽孢癣菌、羊毛状小芽孢癣菌及须疮癣菌等病原真菌和细菌均有一定的抑制作用“”1 ；早在2 0 世纪七十年代就已发现虫草素具有抑制肿瘤的作用，九十年代研究发现，添加腺苷脱氨酶( a d e n o s i n ed e a i i i i n a s e ，a d a ) 抑制剂对虫草素抗肿瘤活性的表达起着重要作用，虫草素的研究从而获得突破性进展“”，它可延长接种艾氏腹水癌细胞小鼠的存活时间，对小鼠s 1 8 0肿瘤、人表皮样癌、l e w i a 肺癌及人富颈癌h e l a 细胞等“1 均有明显的拮抗抑制作用，美国1 9 9 7 年已将虫草素用于一期临床实验治疗急性前b 和前t 淋巴细胞白血病患者“2 剖；虫草素能抑制蛋白质激酶的活性哺1 、抗核苷磷酸化酶对糖基的裂解，对体液免疫有调节作用，能明显增加犬冠脉血流量，降低冠脉、脑及外围血管阻力，并对核酸的甲基化和m r n a 的翻译有抑制作用。1 。除此之外它还可抑制一种脑炎病毒。并对人体免役缺陷型病毒h i v 一型的侵染及其反转录酶的活性亦有抑制作用”，对尖音库蚊( 白日彳p j p j 钟甸、埃及伊蚊( 彳p 幽sa 馏腰 j ) 和另一种伊蚊( 爿丘脚印“曲的幼虫有显著的致死作用。用白纹伊蚊( 爿a - 6 印j c f “0 的组织培养试验表明，虫草素的作用机理是引起核变性和细胞质崩解。，”t r i g g 1 在1 9 7 1 年也曾发现虫草素有抗疟原虫的作用。腺苷( a d e n o s i n e ，a d o ) 是一种内源性嘌呤核苷酸，又称为腺嘌呤核苷，具有广泛的心血管效应m 1 。现代药理研究还表明，腺瞢作为虫草的主要活性成分，具有广泛的生理活性，主要包括调节冠脉血流量和镇静。可舒张血管平滑肌，促进冠状血管扩张及心肌代谢的机能，抑制血小板凝聚，增加冠脉和脑血流量，降低脑耗氧量，改善冠脉和脑循环，减慢心率，防止心律失常“”“，因此可以用于冠状血管障碍、狭心症、动脉硬化症及高血压症等疾病的治疗，是人体循环系统疾病的药物。此外，腺苷及其衍生物还可以作为抑制血液凝固药物，用腺苷来保藏血液效果很好。肌苷( i n o s i n e ) 又名次黄嘌呤核苷”+ 酬，在医疗上广泛用于治疗心脏病、肝病及由放射线和抗癌药物所引起的白血球减少症、血小扳减少症、视神经萎缩、中心性视网膜炎、并能预防和解除由血防药物引起的对心脏或肝脏的副作用；除此之外，肌苷与锑剂合用可预防血吸虫病药物所因起对心脏和肝脏的副作用；制成肌昔二醛、异丙肌苷、三氮唑核苷等药物对肿瘤和病毒有很好的治疗作用。肌苷于1 9 7 0 年在意大利首次上市，我国1 9 7 1 年即正式生产，对其进行了大器的研究。，从虫草属真菌中提取得到的其它核苷类化合物也具有一定的药理活性：用豚鼠左心房组织培养实验证明n 6 _ ( 2 一羟乙基) 腺嘌呤核苷是第一个生物来源的钙离子拮抗剂和心肌收缩因子，而且对辐射伤害的保护效果可达到巯基乙烯胍( m e r c a p t o e t h y l g u a n i d i n e ) 的水平“1 ；腺嘌呤“7 3 ( 又称维生素目) ，可刺激白细胞增生，使其均衡，主要用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是由于肿瘤化疗、放疗引起的白细胞减少症；6 一巯基嘌岭帆”3 ( 6 一m p ) 为急性淋巴细胞白血病( a l l )维持治疗的核心药物之一，对儿童淋巴细胞细胞自血病的效果优于粒细胞和单核细胞白血病；鸟苷”的用途十分广泛，是食品和医药产品的重要中间体，可用于合成食品增鲜剂5 一鸟苷酸二钠、呈味核苷酸二钠和核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等。1 9 9 6 年，本研究室从古尼虫草小孢变种中分离出一株交织顶孢霉m c 旭j l o n m mf m p 打m m ( g i l m a i l a b b o t t ) g 锄s ，r c e f 2 6 0 】，前期的药理试验表明其菌丝体粗提物对大鼠实验性肝缺血再灌注( i r ) 有明显保护作用，经h p l c 等分析结果推测，主要成分为核苷类物质，并经分离纯化已从r c e f 2 6 0 菌株的租提物中得到若干种核苷类物质纯品”“。核苷主要存在于细胞内部，因此要提高其产量，首先要解决的问题就是找到一种合适的方法将细胞破碎，使得胞内物质完全释放出来，同时又不能破坏其化学结构，保持自身的活性。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键性步骤”1 ，其方法也很多，按照是否存在外加作用力分为机械法和非机械法两大类，机械法中高速湿法珠磨和高压匀浆法不仅在实验室被广泛采用，而且巴经在工业生产中应用，超声波破碎法则普遍用于实验室规模；非机械法中的酶解法和化学渗透法目前在实验室中的研究开发也相当活跃。压榨法和冷冻干燥法等在实验室范围内也经常使用，但其工业化应用受到诸多因素的限制。而且目前人们还在探寻新的细胞破碎方法，如激光破碎法1 、低温玻璃化破碎”“、利用噬菌体破碎细胞壁“”等，细胞破碎技术的研究有待于不断深入与完善。但在实际应用中，不管是机械法还是非机械法，都有自身的局限性。机械法因高效、价廉、简单而得以工业化应用，但敏感性物质的失活问题、碎片去除以及杂蛋白太多等问题仍有待解决，因此细胞破碎技术远远没有得到完善，近几年这方面的论文仍然不少，细胞破碎技术研究的发展方向已经超出了单一的细胞破碎领域，采用多种细胞破碎方法项结合，同时与上下游过程项联系”1 。药用真菌是一类天然药物，其医疗和保健作用不仅在中国和东南亚地区得到致的肯定，而且近年来也开始得到世界各国的重视。特别在中国加入w t o 以后，药品生产将面临极其严峻的挑战，大力开展药用真菌的科学研究和新药的开发，具有重要和迫切的意义。近年来，本实验室一直致力于虫草的基础性研究以及虫草产品的开发研究。1 9 9 6年从古尼虫草小孢变种中分离出一株交织顶孢霉( 一砌p j 船 姗，r c e f 2 6 0 ) ，在前期的研究已经确定了其较完善的液体深层发酵条件，以及胞内、胞外多糖的药理作用和提取、分离、纯化工艺。其主要药效为免疫调节作用，同时还具有抗衰老的功效，可提高人的机体免疫力。经毒理实验表明该菌深层发酵所得的菌丝粉安全无毒”，同时功能测试表明该菌丝体具有增强细胞免疫、体液免疫和单核巨噬细胞吞噬能力。2 0 0 0 年由此虫草菌丝体生产的“思壮”虫草胶囊已被国家卫生部食品、化妆品审批委员会审察批准为保健食品( 卫食健字( 2 0 0 0 ) 第0 2 1 5 号) 并获得专利。进一步的实验表明，其菌丝体粗提物可通过提高肝细胞内g s h p x 活性，抑制自由基的产生，并减轻肝细胞膜脂质过氧化反应，达到保护肝细胞作用。由此可见，交织顶孢霉菌丝体粗提物开发研制肝细胞保护药物具有良好的前景。本试验将在原有研究基础上，进一步探讨其保肝作用机理，主要致力于r c e f 2 6 0菌体水提物保肝作用的研究，并对其主要功效成分进行分离纯化、研究不同处理方法对菌体内含物的影响、优化目标产物的发酵条件，为r c e f 2 6 0 菌体水提物开发为保肝药物莫定基础。41 实验材料材料与方法1 1 菌种及其来源由本实验室自古尼虫草小孢变种( c o ，砂c 印s 删n n j fv 牡m f 加r ) 上分离纯化的交织顶胞霉叫c 阳m d ”f 绷f 妒，f 叩m 朋( g i l r i l 趾& a b b o 札) g 眦s 】，菌株编号r c e f 2 6 01 1 1培养基：1 11 1 固体斜面培养基黄豆粉3 0 l ( 煮汁，两层纱布过滤) ，白砂糖2 0 l ，酵母浸出粉l o l ，琼脂2 0 l1 1 1 2 种子培养基黄豆粉3 0 l ( 煮汁，两层纱布过滤) ，白砂糖2 0 l ，酵母粉1 0 9 ，l1 ，11 3 发酵培养基黄豆粉3 0 9 l ( 煮汁，两层纱布过滤) ，白砂糖2 0 l ，酵母粉1 0 l ，m g s 0 40 0 5 ，k h 2 p 0 40 0 5 1 1 2 发酵条件1 12 1 液体摇瓶装液量2 0 m l ，5 0 m l 、接种量1 0 、培养温度2 5 、摇床转速1 5 0 彻d 、时间7 d 。1 1 2 2 种子罐接种量3 、压力o 1 m p 、温度2 5 、通气量2 5 0 l i 、时间4 8 h 。1 1 2 3 发酵罐接种量1 0 、压力0 1 m p 、温度2 5 、通气量2 5 0 0 l m 、时间9 6 h 。1 1 3 供试菌粉r c e f 2 6 0 菌粉、冬虫夏草生药、人工发酵中国被毛孢( 本实验室提供，菌株编号r c e f 2 7 3 )1 2 实验试剂b c g ：上海生物制品研究所( 2 0 0 3 0 1 叭) 。l p s ：美国s i g m a 公司产品。s o d 测试盒：南京建成生物工程研究所( 2 0 0 3 0 7 0 7 ) 。m d a 测试盒：南京建成生物工程研究所( 2 0 0 3 0 7 0 2 ) a s t 测试盒：南京建成生物工程研究所( 2 0 0 3 0 7 0 2 ) 。i l 1 测试盒：美国t p i 公司产品( 2 0 0 3 0 7 1 5 1 2 ) 。t n f 测试盒：美国t p i 公司产品( 2 0 0 3 0 7 1 5 1 2 ) 。四氯化碳：上海长江化工厂( 9 4 0 8 1 7 ) 。d - 氨基半乳糖：重庆医科大学生物医学工程研究室( 0 3 0 2 1 5 ) 。a l t 测试盒：南京建成生物工程研究所( 2 0 0 3 0 6 1 4 ) 。r c e f 2 6 0 水提物用前用0 9 氯化钠溶液配成相应浓度绿色木霉( m 曲d 如，册口v f ，胁) ：上海丽璩东风生物技术有限公司，酶活1 5 ，0 0 0 u g蜗牛酶( s n a i l 弱e ) ：北京百泰生化技术公司，酶活1 0 ，0 0 0 u 值溶壁酶( l y w a l l 甜撇) ：广东省微生物研究所，酶活l o ，o o o u ，g纤维素酶( c e l i u l 髂e “o z 血”r - 1 0 ) ：诎u l to fj 印a n 北京经科公司，酶活1 0 ，0 0 0 u 但木瓜蛋白酶( p a p a i n ) ：广西大学化工学院海发生物酶制品厂，酶活8 0 5 ，o o o u 幢甲醇：h p l c s p e c t o r ，1 b d i ac o m p 越l y ，u s a 核苷标样为s i g m a 公司产品。其余均为化学纯硅胶：2 0 0 一3 0 0 目，青岛海洋化工厂。高效薄层硅胶g f 2 5 4 ：青岛海洋化工厂。乙醇：分析纯试剂，上海试剂厂综合经营公司。甲醇：分析纯试剂，淮化试剂厂生产。其余均为化学纯1 3 实验仪器7 2 2 s 分光光度仪：上海精密科学仪器公司b p 2 1 1 d 电子天平：德国s a n a r i u s 生产d l 5 m 电热高速冷冻离心机：北京医疗设备厂意成公司产品v f t b 数显水浴锅：北京市长风仪器仪表公司。l g j i 5 冷冻干燥机：军事医学科学院实验仪器厂研制，北京四环科学仪器厂生产。d l 5 m 电热高速冷冻离心机：长沙湘仪离心机仪器公司。g s y 一8 电热恒温水浴锅：北京医疗设备厂意成公司。m u l d s k a nm k 3 酶标仪：上海雷勃分析仪器有限公司高效液相：y o u n g l i n ，k o 咒缸，a u t o c h 锄工作站。s o l v e n td e i i 嘲rp t i i 】叩s p 3 0 d 、a b s o r b 姐c ed e 咄0 瞳u v 7 3 0 d ：y o u n g l i n ，k o r e a n 。d i 锄o n s i l 下m ( 钻石) c l s 柱( 5 u m ，2 5 0 4 6 m m ) ：迪马公司。y x q s g 4 1 2 8 0 手提式压力蒸汽灭菌锅：上海华线医用核子仪器有限公司。h z o f1 6 0 全温振荡培养箱：哈尔滨市东联电子开发有限公司。6w p 7 0 0 微波炉：顺德格兰仕电器厂有限公司。2 k 1 5 高速冷冻离心机：s i 舯a ，美国。6 0 l o 紫外一可见分光光度计：惠普上海分析仪器有限公司。8 1 8 台面式p h 测试仪：o r i o n ，美国。s f e 3 0 c 发酵控制系统：常州新区三环生物工程成套设备有限公司。d z f i 1 2 电热蒸汽发生器：上海佳田制造有限公司。d h g - 9 0 5 3 a 型电热恒温鼓风干燥箱：上海益恒实验仪器有限公司。r 5 0 旋转蒸发器：上海申生科技有限公司。w 5 0 升降恒温水浴锅：上海申生科技有限公司。索式抽提器：中国科技大学玻璃仪器厂。1 4 实验动物昆明小鼠，6 ，2 0 2 9 ，由安徽医科大学实验动物中心提供，皖医实动准字第0 1 号2 实验方法2 1r c e f 2 6 0 菌体水提物对肝损伤的保护作用2 1 1r c e f 2 6 0 菌体水提物的提取称取定量烘干的交织项孢霉菌粉，按l ：5 的比例加入遥量的水，7 0 浸提5 0 m i n ，5 ，o o o r p m 离心1 0 1 1 1 i n ，取上清液于5 0 条件下浓缩至一定体积，加入等量的无水乙醇，醇沉过夜，离心后取上清液于4 5 浓缩至一定体积，冷冻干燥得到r c e f 2 6 0 菌体水提物。2 1 2r c 盱2 6 0 菌体水提物对小鼠免疫性肝损伤的保护作用2 1 2 1小鼠免疫性肝损伤模型的制备及给药方式小鼠正常饲养2 d ，随机分成5 组，每组l o 只，即：正常对照组、b c g + l p s 模型组。r c e f 2 6 0 菌体水提物小剂量组：1 2 5 m 班g ；中剂量组；2 5 0 m g ，l 【g ；大剂羞组：5 0 0 m 眺g 。制作免疫性肝损伤模型，即由尾静脉i v0 2 m l 内含b c g2 5 m g 的生理盐水悬液，1 2 d 后每尾静脉i vl p s1 0 u g ，1 6 h 后处死小鼠，取血和肝组织作有关检测。在造模过程中，试验组每天灌胃相应的r c e f 2 6 0 菌体水提物( 1 2 5 、2 5 0 、5 0 0 m 舭g ) ，正常对照组和模型对照组灌胃等量的生理盐水连续1 2 d 。2 1 2 2 肝损伤指标的检测尾静脉i vl p s1 6 h 后摘除小鼠眼球取血，分离血清，比色法测定a l t 、a s t ；同时，脱颈椎处死小鼠，取肝脏左叶相同部位，用1 0 福尔马林液固定，作病理检查。按肝脏坏死程度分为4 级：o 级，没有坏死；1 级，轻度肝坏死：2 级，中级肝坏死；3 级，严重坏死。累计每组动物肝坏死级数，计算其平均肝坏死级数与标准差。选肝脏右时用冷生理盐水漂洗去除积血，拭净后再用冷生理盐水制备1 0 肝匀浆，分别按t b a 法和n b t 法测定丙：醛( m d a ) 和超氧歧化酶( s o d ) 的含量，用e l i s a 法测定肝匀浆中t n f a 和i l i 的含量。2 1 2 3 统计学处理数据应用s p s s 软件包迸行处理，用t 检验比较组间差异的显著性。2 1 3r c e f 2 6 0 菌体水提物对小鼠化挚性肝损伤的保护作用、2 1 3 1c c i 诱导小鼠急性化挚 生肝损伤模型的制备及给药方式小鼠正常饲养2 d ，随机分成5 组，每组l o 只，即：正常对照组、c c 】4 模型组。r c e f 2 6 0 菌体水提物小剂量组：1 2 5 m g 瓜g ；中剂量组：2 5 0 m 眺g ：大剂量组：5 0 0 m g 瓜g 。正常对照缓和c c l 4 模型组用0 9 生理盐水灌胃，实验组小鼠灌胃相应药物，每同1次，共4 次。末次给药后l h ，腹腔注射c c l 41 0 0 m g l 【g ( 正常对照组除外) ，造成肝损伤模型。禁食1 6 h 后其余操作同2 1 2 2 。2 2 2 2d - g a i n 诱导的小鼠急性化学性肝损伤的作用小鼠正常饲养2 d ，随机分成5 组，每组l o 只，即：正常对照组、d g a l n 模型组。r c e f 2 6 0 菌体水提物水提物小剂量组：1 2 5 m g k g ；中剂量组：2 5 0 m g ，k g ；大剂量组：5 0 0 m g m g 。正常对照组和d 酬n 模型组用o 9 生理盐水灌胃，实验组小鼠灌胃相应药物，每日1 次，共4 次。末次给药后l h ，腹腔注射d 叫n8 0 0 m 眺g ( 正常对照组除外) ，造成肝损伤模型。其余操作问2 1 2 2 。2 2r c e f 2 6 0 菌体水提物中有效成分的初步分析2 2 1水提物中核苷类物质分定性分析2 z1 。1 薄层屡析法基本原理薄层层析法( 锄b l a y e fc k i 跚啪a 鲫h y ，简称t l c ) 是一种将固定相在固体上铺成薄层进行色谱的方法，已广泛用于定性和定量分析、分离、纯化、制备目的，它是在吸附层析的基础上发展起来的，作用机理主要包括吸附、分配、离子交换和凝胶过滤等作用。t l c 具有以下特点。”：1 ) 设备简单，操作方便。只须一块玻璃板和一个展开缸，即可进行复杂混合物的定性和定量分析：2 ) 快速，展开时间短。其实验操作与纸层析相同，但比纸层析速度快，一般仅需1 5 3 0 m i n ；3 ) 由于广泛采用无机物作吸附剂，t l c 可以采用腐蚀性的显色剂；4 ) 可以广泛地选择各种固定相和移动相：5 )扩散作用较少，斑点比较密集，检出灵敏度高；6 ) 分辨力高，它既能分离o 0 1 u g 的微量样品。又能分离5 0 0 m g 甚至更多样品作制备用：7 ) 技术多样化：8 ) 与气相色谱比较起来，t l c 更适于分析热不稳定、难于挥发的样品，但不适于分析挥发性样品。按照相似相溶规律，极性组分易溶于极性溶剂，非极性组分则易溶于非极性溶剂中，因此在同一薄板上，不同极性化合物的组分在同一溶剂中的溶解度不同，溶解度愈大，移动速度愈快：反之则反。展层的过程即样品各组分得到分离的过程，它也是个吸附，解析，再吸附，再解析的连续过程。薄层层析的定性分析与纸层析类似，对组分简单的样品的定性，可根据在同一薄层板上，样品组分的r f 值和标准品的r f 值对照，对于复杂样品的定性，需数种方法才能确定：薄层层析后，样品组分的定量分析有洗脱测定法和原位法。实验方法样品溶液准备一在硅胶板g f 2 5 4 上点样一挥发溶剂一展开剂中展开一挥去展开剂一紫外灯下观察斑点( 2 5 4 删)2 2 1 2 高效液相色谱( h p l c ) 分析与制备基本原理高效液相色谱( l i 曲p e r f o r r n e n c el i q u i dc l 啪m a t o g m p h y ，简称h p l c ) 是在原有的液相柱层析基础上引入气相色谱的理论并加以改进和发展起来的，兼具分离效能高、选择性高、检测灵敏度高和分析速度快的特点，因此应用范围也日益扩展。m ，l c分离方法的原理如图1 所示模型”“。图中箭头方向画出一个方向的传质过程，实际上在动态平衡状态下这个过程是可逆的。反相高效液相色谱是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式。很多有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值就越高。在h p l c 中这是应用最f 同i i _ 1 _ j团田团团协圈l 葛靛镶鞠色鞋毋方往囊绷f t 暑l 锄b 馆t i 硼什i 酩i 靼i 慵哺。如lo f】p 址“jm 舟l l 摹鲁啦j p 挂聱鼻舅- 卜骨叠静骨f ， 芥盛量下世越量羹建鼍矗静t 曩n 蔫一雌糟e 蕾k 1 麓- 舟鼍毒q ，冀乎奎e 薯i 叫也椎l 鼙一罩h 捧库t t t 广泛的一种分离模式。由于使用了非破坏性检测器，在大多数情况下，可除去流动相，实现对少量珍贵样品的回收，亦可用于样品的纯化制备。实验方法样品的制备一离心或过滤一进样，洗脱剂洗脱一检测一收集或根据检测图谱分析。2 2 1 3 质谱( m s 谱)基本原理”0 1有机化合物分子在高真空中，受到电子流轰击、强电场作用或其它粒予流作用，9不仅会失去外层电子生成分子离子；同时，化学键也发生某些有规律的裂解，生成各种特征质量的碎片离子。根据质谱图可以测得化合物的分子量及结构单元信息。方法l m g 样品溶于l m l 色谱甲醇中，分别采用e s i 离子化法测试质谱图，确定分子量及主要碎片的质荷比。2 2 2 水提物中核苷类物质的定量分析称取r c e f 2 6 0 菌粉i g ，按1 ：5 的比例加入适量的水，7 0 浸提6 0 m i n 。5 ，0 0 0 r p m离心1 0 m i n 。水洗沉淀后再次离心，合并上清液。5 0 浓缩后加入等量的无水乙醇，醇沉过夜，离心后4 5 浓缩至一定体积。冷冻干燥得到r c e f 2 6 0 菌体水提物，称重。精确称取水提物l g ，用蒸馏水定容到1 0 0 m l 容量瓶中，超声波提取1 h 后定容到1 0 0 m l 。滤液经1 4 ，0 0 0 r p m 离心，所得上清液为核苷类物质的粗提液，用h p l c 方法进行定量分析。2 3 不同处理方法对菌体内含物提取率的影响2 3 1湿法提取工艺的研究2 3 1 1 微波法将发酵罐( 7 0 l ，装液量5 0 l ，2 5 培养6 d ) 培养的成熟菌丝体直接进行细胞破碎试验( 以下几种细胞破碎方法的样品均来源于同一批发酵液) ，取2 0 m l 菌液装入5 0 m l 三角瓶，在微波炉中内将温度调至低温解冻档，分别处理2 m i n 、4 m i n 、6 m i n 、8 n l i n 、1 0 m i n 、1 2 l i n ，每l r n i n 用流水冷却1 次，每个处理3 个重复，同时取滤液l m l 加入等量的无水乙醇醇沉过夜，1 0 ，0 0 0 r p m 离心1 0 i n i n ，取0 1 m l 上清液加入4 9 m l5 0 乙醇混合均匀后在2 6 0 n m 的波长