（分析化学专业论文）用于检测活性氧自由基的荧光探针研制及其分析应用.pdf

独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致埘的地方外，论文q j 不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如 没有其他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育枫构的学位或证书使刚过的材 料。与我一同工作的l 刊志刘本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谫= | 意。 学位论文作者签名：导师签字 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向圈家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许沦文被查阅和借阅。 本人授权型韭可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在 解密后适用本授权书) 签字口划：2 0 0 6 年 1 月wf 1签字日划：2 0 0 6 年i ( 月柏 山东师范大学硕：j ：学位论文 摘要 生物新陈代谢过程- 1 1 产生众多的活性氧( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) ，包括 超氧阴离子自山基( 0 2 ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、羟基臼山基( o h ) 、一氧化氮( n o ) 、 过氧亚硝基( o n o o 一) 等，这些自山基与癌症、机体炎症、组织过氧化、蛋白质交 联变性、d n a 损伤和信号传导等有直接的关系，被统一称为对机体的氧化胁迫。 然而，由于生物体内活性氧的寿命非常短，导致通常情况下稳态浓度极低， 丽短寿命和低浓度意味着活性氧的测定非常困难。目前测定自由基的方法主要有 电l 了自旋共振法( e s r ) 、高效液相色谱法( i t p l c ) 、化学发光法( c l ) 等，相 比于以上方法，荧光法结合共聚焦显微成像技术和微区光谱检测技术，是唯一使 活细胞和组织内的r o s “实时、可见、定量”的检测方法，而在6 0 0 1 0 0 0 r t m 的 近红外北区，生物基体光吸收或荧光强度很小，且致密介质( 如组织) 的光散射大 大降低，激发光的穿透性更大，因而自发荧光的背景于扰大大降低，且能量较低 减少光照对细胞的损伤，所以近红外荧光探针 j u 有良好的发展前景。因此，设计 合成选择性好，灵敏度高，具有生物兼容性的红外、近红外荧光探针用来检测活 细胞和组织内的活性氧是生命化学学科发展中具有挑战性的前沿课题之一。 本论文基于活性氧弓l 起探针荧光增强的机理，开展了三方面的工作。 ( 一) 设计合成了新型近红外顺磁性自旋标记氮氧自由基荧光探针 c y 7 t e m p o ，基于非氧化机理对羟基自由基进行检测，并利用激光共聚 焦成像技术对细l 魍内羟基自出基进行显像。 ( 二) 没汁合成了2 苯乙烯基苯并噻唑啉荧光探针，选择性检测模拟生物体系 内的超氧阴离子自山基，并实现人肺癌细胞内的超氧阴离子自由基的荧 光成像，为医学临床上监测病变组织内超氧阴离子自由基提供了新方法。 ( 三) 以香豆素为探针用荧光方法来检测羟基自由基，是用于检测羟基自由基 的一种简单、准确、灵敏的方法。方法被应用于研究海产品和茶叶对羟 基自由基的清除能力，且对广范圈筛选抗氧化性食品有着重要哟应用。 关键词：活性氧，超氧阴离子自由基，羟基自出基，近红外荧光探针，激光共聚 焦扫描显微镜 | | 东师范大学颁士学位论文 a b s t r a c t v a r i o u sr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) a r eg e n e r a t e di nt h ec o u r s eo fb i o l o g i c a l m e t a b o l i s m ，s u c ha ss u p e r o x i d e ( 0 2 一) ，h y d r o g e np e r o x i d e ( i - 1 2 0 2 ) ，h y d r o x y lr a d i c a l ( h o ) ，n i t r i co x i d e ( n o ) a n dp e r o x y n i r t e ( o n 0 0 ) ，t h e s er o sp l a yav i t a l r o l ei n p h y s i o l o g y ar a p i dr i s ei ni n t r a c e l l u l a ro x i d a n tl e v e l su n d e ro x i d a t i v es t r e s sc o u l d c a u s ed a m a g et o b i o l o g i c a lm o l e c u l e s a n dr e s u l ti nv a r i o u sd i s e a s e s ，s u c ha s c a r c i n o g e n e s i s ，i n f l a m m a t i o n ，i s c h e m i a - r e p e f f u s i o ni n j u r y , a n ds i g n a lt r a n s d u c f i o n h o w e v e r , t h es h o r tl i v ea n dl o wc o n c e n t r a t i o no fr o sm e a nt ot h ed e t e r m i n a t i o n d i f f i c u l t ，e s p e c i a l l yt h ed e t e r m i n a t i o ni nv i v oa n di ns i t uh a sn ob r e a k t h r o u g h f l u o r e s c e n c ei m a g i n gm e t h o d sa r es e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t y , e a s eo fu s ea n dt a k e s f u l la d v a n t a g eo fb e n e f i t sp r o v i d e db yc o n f o c a ll a s e rs c a n n i n gm i c r o s c o p y ( c l s m ) c l s mi sat y p eo fh i g h r e s o l u t i o nf l u o r e s c e n c en f i c r o s c o p yt h a t c a ng i v et h e f l u o r e s c e n c ei m a g eo fc e l l sa n dt i s s u e s ，w h e r er o sw e r ed e t e c t e db yf l u o r e s c e n t p r o b e f l u o r e s c e n c ei m a g i n gm e t b o dc h a l l e n g e dt h et r a d i t i o n a l f l u o r e s c e n tm e t h o d a n da c h i e v e dt h ed e t e c t i n go fr o si nv i v oa n di ns i t u n e a r - i n f r a r e d ( n t r 、l i g h ta ta r o u n d6 5 0 9 0 0m i sl e s sa b s o r b e dt h a nv i s i b l el i g h t b yb i o l o g i c a ls u b s t a n c e s ，a n dc a l lp e n e t r a t em o r ed e e p l yi n t ot i s s u e s m o r e o v e r , i th a s t h ef u r t h e ra d v a n t a g et h a ta u t o f h l o r e s c e n c ei sn o to b s e r v e du p o nn 1 re x c i t a t i o n s o n i rf l u o r e s c e n tb i o i m a g i n gi so n eo ft h em o s tf a s c i n a t i n gf i e l d si nc h e m i c a lb i o l o g y ， o f f e r i n gr e s e a r c hc h a l l e n g e sa n do p p o r t u n i t i e s b a s e do nt h ec h a n g e si ns p e c t r u mc h a r a c t e r so ft h ef l u o r e s c e n tp r o b e sr e a c t i n g w i t hr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 。w eh a v ec a r r i e do u tt h r e ea s p e c t so fi n v e s t i g a t i o n ： f i r s t ，p i p e r i d i n e n i t r i co x i d er a d i c a l s p i n l a b e l i n g f l u o r e s c e n t p r o b e c y a n i n e 7 t e m p ow a ss y p t h e s i z e da sa n e a r - i n f r a r e df l u o r e s c e n tp r o b ef o rh y d r o x ) 1 r a d i c a l c y 7 t e m p oi san o n f l u o r e s c e n tc o m p o u n d s ，u p o nt r e a t m e n tw i t hm e t h y l r a d i c a lt h a ti s p r o d u c e db yt h e r e a c t i o nb e t w e e nh y d r o x y lr a d i c a la n dd i m e t h y l s u l f o x i d e ( d m s o ) q u a n t i t a t i v e l y , a n ds u b s e q u e n t l yg e n e r a t e st h ef l u o r e s c e n tp r o d u c t s e c o n d ，as p e c l r o f i u o r i m e l r i cm e t h o du s i n g2 - s t y r y l b e n z o t h i a z o l i n e ( s t y b z t ) a sa n e wf l u o r e s c e n tp r o b ew a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no fs u p c r o x i d ca n i o n 2 山东师范大学硕士学位论文 r a d i c a l ( 0 2 。) i ti sal l o n - f l u o r e s c e n tc o m p o u n d ，a f t e rt r e a t m e n tw i t h0 2 。，g e n e r a t e s t h ef l u o r e s c e n tp r o d u c t t h en e wp r o b eh a sh i g hs e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t y i n d e t e c t i n g0 2 一w eo b t a i n e dt h ef l u o r e s c e n c ei m a g e so fp r o b e sc o m b i n e dw i t h0 2 i n h u m a nl u n gc a n c e rc e l l su s i n gl a s e rc o n f o c a ls c a n t f i n gm i c r o s c o p e t h i r d ，t h i sp a p e rp r e s e n t e das p e c t r o f l u o r i m e t r i cm e t h o df o rd e t e r m i n i n gh y d r o x y l r a d i c a l sw i c l lc o u m a r i na sf l u o r e s c e n tp r o b e m a ds t u d i e dt h es c a v e n g i n gc a b i l i t yo f s e a f o o da n dt e s l e a ft oh y d r o x y lr a d i c a l s t h em e t h o dh a si m p o r t a n ta p p l i c a t i o nv a l u e f o rs i e v i n ga n t i o x i d a t i o nf o o da n dd 血l ko n al a r g es c a l e k e y w o r d s ：r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，s u p e r o x i d ea n i o nr a d i c a l s ( 0 2 。) ，h y d r o x y l r a d i c a l s ( i1 0 - ) n e a r - i n f r a r e df l u o r e s c e n tp r o b e ，c o n f o c a ll a s e rs c a n n i n g m i c r o s c o p y 3 山东师范大学硕士学位论文 第一章绪论 在生物的氧化代i 身 过程中不断产生各种活性氧自由基，超氧阴离子自由基 ( 0 2 ) 、羟基自由基( o h ) 、酯自由基( r o o ) 是三种具有代表性的活性氧自 由基。这些自由基和其他活性衍生物( 如1 0 2 ) 以及脂质( l h ) 过氧化的产物( 如 l o 、l o o 及l o o h ) 不断的通过非酶反应与酶反应产生，但在抗氧化酶及外 源性和内源性抗氧化剂的协同作用下不断被清除，在正常生理情况下活性氧可维 持在极低的有利无害的水平。平衡浓度的活性氧中一部分可履行生理作用，而另 一部分会损伤生物分子。目前已探明，每日每个细胞的生物分子可受到1 0 4 1 0 次活性氧的攻击而发生损伤。不过损伤分子可以得到修复、置换、降解代谢和重 新合成，因此不会发生活性氧对机体的损伤。在衰老、应激及某些病理情况下， 活性氧产生增多或机体清除能力减弱，从而对组织细胞的化学结构发生破坏性修 饰，损伤正常组织细胞的形态和功能【2 l 。 目前研究结果揭示的证据表明，活性氧几乎和人类几秘主要疾病都有关系 口 ，5 l 。癌症是威胁人类生命的主要疾病之一，医学界广泛接受的一种观点就是由 生物、化学、物理等因素引起机体发炎而导致癌症的发生1 6 , 7 1 ，尽管具体的机理 有待于进一步阐述，已有文献证明炎症细胞释放出来的活性氧和活性氮能够导! 致 上皮细胞增生扩散过程中的d n a 损伤，从而导致癌症i 羽，而抗氧化剂的干预，通 过阻断活性氧介导，可抑制癌细胞生氏，促使其凋亡f 9 1 。活性氧在高血压发生中 的作用越来越受到人们的重视。多项研究表明内皮源性的0 2 一和n o 这一对拮抗 物之间的失衡是导致广泛的血管收缩和外周阻力增高的原因【l o l 。心脏病是人类 死亡率最高的一种疾病。z w e i e r 等人提出心肌缺血再灌注损伤时产生了活性氧， 半醌自由基和食氮自由基队1 2 l 。最近出现一些关于爱滋病和活性氧的报道，爱滋 病感染免疫系统的各个部分，最后导致进行性的免疫缺陷。活性氧与爱滋病的关 系可从两个方面来看。一方面爱滋病细胞产生活性氧减少，可能使免疫杀伤能力 降低，爱滋病人容易感染各种疾病；另一方面，活性氧可以刺激爱滋病毒复制， 导致病情加重【l3 1 。阿尔茨海默病、帕金森病和脑卒中等疾病的发生发展与活性 氧密切相关。其原因主要与脑组织代谢特点等有关，包括脑组织耗氧量大脂质 含量高，而抗氧化的各种酶的含量与其它组织相比相对少，因此易受活性氧损伤。 i t l ；肝炎和糖尿病与活性氧密切相关“5 1 ；白内障的形成和视网膜的损伤是活性 山东师范大学硕士学位论文 氧和脂质过氧化的直接结果1 1 6 ；由此可见，从人类死亡率最高的心脑血l 管疾病， 到人类最可怕的癌症，以及近年来对人类造成巨大威胁的爱滋病，无一不和活性 氧有着密切关系。 随着活性氧对生物体的损伤作用逐步获得公认，对其检测已不仅仅局限于化 学和模拟生物体系内，而更多的转向生物活体内活性氧的存在、作用以及病变时 含量变化的研究。目前测定话性氧的方法主要有电子自旋共振法( e s r ) 【1 7 】、高效 液相色谱法( h p l c ) 【1 8 】、化学发光法( c l ) t 1 9 1 、荧光法1 2 0 - 2 6 等。相比于以上方法， 荧光法简单、易行，由于其探针特殊的光物理和光化学特性而具有灵敏度高、动 态响应范围宽的优点。更为重要的是，荧光法是唯一可以利用激光共聚焦成像技 术，使探针分子在不破坏生物活性的情况下进入细胞，与活细胞内的目标活性氧 结合生成荧光物质，实现细胞内活性氧实时可见的方法，适宜生命体内活性氧的 检测。2 0 0 3 年k e n - i c h is e t s u l d n a 等人设计合成了基于荧光法检测次氯酸阴离子 和羟基自由基的荧光探针a p f 和h p f ，h p f 能够专一性检测羟基自由基，而a p h 同时对次氯酸阴离子和羟基自由基产生荧光信号响应，当二者联用可以用来选择 性检测次氯酸阴离子，并且通过细胞实验证明a p f 和h p f 可以抵抗光诱导的自 动氧化，检测刺激状态下嗜中性白细胞产生的次氯酸阴离子【2 0 】；2 0 0 4 年c h a n g 等将荧光索的3 、6 位的羟基用片呐酮硼取代，合成了一种具有高度选择性测定 细胞内过氧化氢的光学探针p e r o x f l u o r - 1 ( p f l ) ，探针自身不发荧光，与过氧化氢 结合产生荧光产物荧光素。将活细胞样品用p f l 诱导，加入过氧化氢可直接在 荧光显微镜下观察到细胞的荧光成像，证实了探针对过氧化氢的选择性识别【2 l j ： 2 0 0 5 年h a t s u om a e d a 等学者利用非氧化还原原理设计了2 ，4 一二硝基磺酸酯类荧 光素用于检测超氧阴离子的荧光探针，用于人类嗜中性粒细胞中超氧阴离子 的检测。以上荧光探针虽然都应用于细胞内活性氧的检测，令人遗憾的是它们的 激发和发射波长均处于紫外可见波段，5 0 0 5 5 0 n m 的紫外可见光可以被探针吸收 的同时也被生物体内的一些物质如姐色索吸收，影响检测的准确度。在 6 5 0 9 0 0 m u 的近红外光区，生物基体光吸收或荧光强度很小，且致密介质( 如组 织) 的光散射大大降低，激发光的穿透性更大，因丽自发荧光的背景干扰大大降 低，应用于生物检测时具有很好的发展前景。 2 0 0 5 年e i t a s a s a k 等根据光诱导电子转移( p e t ) 理论设计了测定活体器官内一 山东师范大学硕士学位论文 氧化氮的近红外荧光探针d a c p 和d a c s 。当一氧化氮存在时，电子的激发使 探针分子内给体和受体之间发生电子转移( e t ) ，从而生成不同于初始状态的t 毡 荷分离态( c t ) ，探针两态具有可测光物理性能的差别，即可以观察到荧光显著增 强的现象。探针成功运用于小鼠肾中一氧化氮的测定，荧光显微镜下观察到随着 一氧化氮浓度的增高，探针标记的小鼠肾细胞荧光明显增强，应用荧光光谱仪扫 描得到荧光光谱，发现荧光强度与一氧化氮的浓度成线性关系，进一步证实了此 近红外荧光探针应用于检测生物器官内一氧化氮的可行性及实用性【2 4 1 。同年本 课题组设计合成了选择性测定细胞内过氧化氢的近红外荧光探针萘荧光素一j 磺 酸酯( n f d s 1 ) 探针自身不发荧光，当与过氧化氢结合后恢复为荧光物质萘荧光 素，产生强烈荧光。运用探针诱导加入过氧化氢的小鼠腹腔巨噬细胞，获得细胞 的显微荧光成像，证实了探针对过氧化氢的选择性识别作用【2 ”。然而，用于检 测其它种类自由基的近红外荧光探针目前未见报道。 本实验室已经基于多种近红外染料如萘荧光素、花菁等合成了多个系列适用 于生命体系及荧光成像活性氧分析的近红外分子荧光探针，测定与生物活体化学 成分一致的动、植物模拟体系中的活性氧，将荧光法与激光共聚焦显微成像技术 结合，实时、在线检测活体细胞内活性氧的动态变化，拍摄得探针与活体细胞内 活性氧结合后得细胞显微荧光照片。根据实验结果阐述复杂生命体内自由基的产 生部位、作用机制和致病机理，为新型药物的开发、实现某些重大疾病的早期诊 断和预防，基因表达，基因诊断等将具有重要的指导意义。 主要参考文献 【1 】f r i d o v i c hi s u p e r o x i d ed i m u t a s e m e t h e n z y m o l ，1 9 8 6 ，5 8 ，6 1 9 7 2 方允中，生物分子的自由基损伤及其修复或重新台成。第十次中国生物物理 学会学术会议论文摘要集1 9 9 8 【3 】h ，o h s h i m a ，m t a t e m i c h i ，t s a w a , a r c h b i o c h e m b i o o h y s ，2 0 0 3 ，4 1 7 ，3 - 1 1 4 】a m s h a h ，k m c h a n n o n ，h e a r t ，2 0 0 4 ，9 0 ，4 8 6 - 4 8 7 5 】5k j b a r n h a m ，c l m a s t e r s 。a i b u s h ，n a t r e v d r a gd i s c o v e r y , 2 0 0 4 ，3 ， 2 0 5 - 2 1 4 6 】f b a l k w i l l ，a m a n t o v a n l ，l a n c e t ，2 0 0 1 ，3 5 ，5 3 9 5 4 5 6 山东师范大学硕士学位论文 【7 】l m c o u s s e n s ，z w e r b ，n a t u r e ，2 0 0 2 ，4 2 0 ，8 6 0 - 8 6 7 【8 l o h s h i m a ，m t a t e m i c h i ，7 r s a w a ，a r c h b i o c h e m b i o p h y s 2 0 0 3 ，4 l7 ，3 一1 1 9 】a g u p t a ，s f r u s e n b e r g e r , g t b o w d e n ，c a r c i n o g e n e s i s ，1 9 9 9 ，2 0 ，2 0 6 3 2 0 7 3 1 ( j jm v s u i ，k e g a s h i r a ，s k i t a m o t o ，h y p e r t e n s i o n ，1 9 9 9 ，3 4 ，5 4 6 5 5 1 1 1 j l z w e i e r , b ，k 。r a y b u m ，m l 。w e i s f e l d t ，c i r c u l a t i o n ，1 9 8 6 ，7 4 ，3 7 1 3 7 8 【1 2 jj l z w e i e r , ek u p p u s a m y , r w i l l i a m szb i 0 1 c h e m ，1 9 8 9 ，2 6 1 ，1 8 8 9 0 - 1 8 8 9 4 【1 3 】刘耕陶，吴若术，第三届全国自由基生物学和自由基医学学术会议，1 9 9 4 ， 2 9 0 2 9 5 【1 4 j tc o y l e ，p p u t t f a r c k e n ，s c i e n c e ，1 9 9 3 ，2 6 2 ，6 8 9 6 9 5 1 5 】f f a r i n a t i ，r c a r d i n ，n d e m a r i a , j h e p a t o l ，1 9 9 5 ，2 2 ，4 4 9 - 4 5 6 【1 6 ji i f a r i n a t i ，r a k i s s ，f r e er a d i e b i 0 1 m e d ，1 9 9 9 ，2 7 ，1 2 8 4 1 2 9 1 【1 7 s yk y l i e ，r n m a l c o l m ，m h g a r y , n i t r i co x i d e b i 0 1 c h e m 2 0 0 2 ，6 3 1 3 3 1 8 18 】b l i ，；p l g u l i e r r e z , n v b l o u g h , a n a l c h e m 1 9 9 7 ，6 9 ，4 2 9 5 4 3 0 2 1 9 1x h l i ，qx z h a n g ，h m m a , d q ，z h a n g ，j l i ，d b z h u ，za m c h e m 。 s o c 2 0 0 4 ，1 2 6 , “5 4 3 - l l5 4 8 【2 0 】k s e t s u k i n a , y u r a n o ，k k a k i n i m a ，h j m a j i m a ，t n a g a n o ，zb i o c h e m 2 0 0 3 ，2 船，3 1 7 0 一3 1 7 5 【2 1 】m y c h a n g ，a p r a l l e ，e y 1 s a c o i f , c j c h a n g ，za m c h e m ，s o c 2 0 0 4 ，1 2 6 ， 1 5 3 9 2 1 5 3 9 3 1 2 2 】h m a e d a ，k y a m a m o t o ，y n o m u r a , i k o h n o ，l h a f s i ，n u e d a ，s y o s h i d a , m f u k u d a ，yf u k u y a s u ，y y a m a u c h i ，n 1 t o h ，a m c h e m ，s o c 2 0 0 5 ，1 2 7 ，6 8 6 9 2 3 】h m a e d a , yf u k u y a s u ，s y o s h i d a ，m f u k u d a ，k s a e k i ，h m a t s u n o ，y y a m a u c h i ，k y o s h i d a ，k h i r a t a , k m i y a r n o t o ，a n g e w c h e m i n t e d ，2 0 0 4 ，4 3 ， 2 3 8 9 2 3 9 1 2 4 】e s a s a k i ，h k o j i m a ，h n i s l f i m a t s u ，yu r a n o ，k k i k u c h i ，yh i r a m ，t n a g a n o ， ，a m c h e m s o c 2 0 0 5 ，1 2 7 , 3 6 8 4 3 6 8 5 【2 5 】k 。h x u ，b f a n g ，h t t u a n g ，gw y a n g 。z z c h c n ，p l i ，l ga n ，c h e m c o m m u t j 2 0 0 5 ，船，5 9 7 4 5 9 7 6 2 6 】b t m l g ，l z h a n g ，k i i x u ，t a l a n t a 2 0 0 5 ，6 8 ，8 7 6 8 8 2 7 山东师范大学硕士学位论文 第二章新型高灵敏度近红外荧光探针的合成及用于选择性检 测羟基自由基的研究 摘要基于顺磁性氮氯自由基可以快速捕获由羟基自由基与二甲亚砜定量产生 的甲基这一机理，我们设计合成了一种新的近红外荧光探针一一哌啶氮氧自由基 自旋标记荧光探针，用于检测细胞内的羟基自由基。探针与甲基结合后生成的荧 光产物激发发射波长位于7 8 0 1 8 0 0 n m ，可以有效避免细胞自发荧光的干扰，提高 检测方法的选择性和灵敏度。方法的线性范围为1 0 1 0 8 1 0 x 1 0 一m ，检测限为 1 0 6 x 1 0 一m 。细胞内羟基自由基的荧光成像表明探针具有膜穿透性，选择性捕获 细胞内的羟基自由基，并且可以对细胞内微摩尔级羟基自由基含量的变化产生响 应，表现了良好的生物适用性。 关键词近红外荧光探针，羟基自由基( o h ) ，共聚焦荧光成像，甲基自由基 ( c h 3 ) ，荧光法 1 引言 生物新陈代谢过程中产生众多的活性氧自由基( r o s ) ，包括超氧阴离子自由 基( 0 2 ) 、过氧化氢( h 2 0 2 ) 、羟基自由基( o h ) 、氧化氮( n o ) 、过氧亚硝基( o n o o 。) 等，这些自由基与癌症和炎症的发病“、组织过氧化 2 1 、蛋白质交联变性、核酸 损伤口1 和信号传导h 1 等有直接的关系，被统一称为对机体的氧化胁迫。然而，这 些活性氧在体内的产生和作用，以及过量时的致病帆制尚有待于进一步探究；生 物体内r o s 的寿命非常短，导致通常情况下稳态浓度极低，意味着r o s 的测定 非常困难。因此，高选择性和灵敏度是设计检测r o s 的方法时需首要考虑的问 题。 目前测定r o s 的方法主要有电子自旋共振法( e s r ) 吲，高效液相色谱 9 山东师范大学硕士学位论文 ( h p l c ) 嘲，化学发光法( c l ) 1 7 1 和荧光法睁”1 。荧光法由于灵敏度高于其它方法而显 示出较强的优越性。目前用于检测细胞内活性氧的荧光探针的设计大多基于氧比 机理。这类探针在用于检测复杂生命体内的活性氧时，显示出的弊端在于选择性 较差，不能够在多种自由基和活性酶中选择性捕获待测自由基。因此，对于目前 研究的热点一一生命活体内r o s 的检测来说，非氧化性反应机理有着良妻子的适用 性。 荧光法结合了共聚焦显微成像技术和微区光谱检测技术，是唯一能够实现活 细胞和组织内的r o s “实时、可见、定量”的检测方法。最前已报道的用于细胞 姨j r o s 成像的探针如t i p f 和a p f 1 0 1 存在的主要缺点是激发和发射波长位于紫外 可见光区，而在6 0 0 1 0 0 0 n m 的近红外光区，生物基体光吸收或荧光强度很小，且 致密介质( 如组织) 的光散射大大降低，激发光的穿透性更大，因而自发荧光的 背景干扰大大降低，且能量较低减少光照对细胞的损伤，所以近红外荧光探针拥 有良好的发展前景1 1 4 】。e i l as a s a k i 等1 1 1 基于光诱导电子转移原理合成了用于检 测n 0 的近红外荧光探针，本课题组成功合成了检测生物体内h 2 0 ：的近红外荧光 探针i 】2 1 ，而基于非氧化机理用于细胞内- o h 成像检测的近红外荧光探针尚未见报 道， o h 是生命新陈代谢过程中产生的碍前已知氧化性最强的自由基，能够损伤 h e l a ，m w 4 5 1 及h l - 6 0 等细胞，导致细胞破碎为膜包颗粒，最终被吞噬作用消除 1 5 l 。o h 可以破坏d n a 骨架，以及引起细胞膜a ：c d + 通道氧化还原电位的改变1 6 l 。 正是由于o h 在生命体中的重要作用，设计一种有效的o h 检测方法是同前，芭物 学、化学界研究的热点。然而日前已有的用于检测o h 的荧光探针生物兼容性不 好，相对于其它自由基的选择性差，且激发发射波长位于紫外可见区域，对生物 l o 山东师范大学硕士学位论文 体损伤大，受白发荧光的干扰1 1 0 , 1 7 - 2 0 】。本文有效解决了以上研究难点。 基于顺磁性氮氧自由基可以快速捕获由羟基自由基与二甲亚砜定量产生的甲 基这一机理 2 1 , 2 2 1 ，我们设计合成了一种新型近红外荧光探针顺磁性自旋标记氮氧 自由基2 - 4 一 4 一( 2 ，2 ，6 ，6 - t e t r a m e n t h y l 一1 - p i p e r d i o x y l ) - o x y l - 】_ 7 乙( 1 ”- p r o p y l s o d i u m s u l f o a t e 一3 ”，3 ”一d i m e t h y l i n d o 一2 - y l i d e n e ) 一3 ，5 - ( p r o p a a a e - 1 ”，3 ”一d i y l ) 1 ，3 ，5 - h e p t a t r i e n - 1 y o 一1 - p r o p y ls o d i u ms u l f o a t e 3 ，3 - d i m e t h y 一3 h - i n d o l i t u n ( c y 7 t e m p o ) ，用于检测细 胞内- o h 。在化学体系内用f e n t o n 反应的f e 2 + e d t a 与h 2 0 2 反应，产生o h ， 然后o h 与d m s o 快速定量反应生成甲基( c h 3 ) ，c h 3 与探针反应，生成稳定 的荧光产物。相比于氧化机理测定o h 的方法 2 0 , 2 3 1 ，通过测定o h 与d m s o 反 应生成的c h 3 而测定o h 的方法具有以下优点：d m s o 与o h 的反应维持在一 个较大的反应速率常数( 扫6 6 x 1 0 9m h s1 ) 【”1 能够快速与o h 反应生成c h 3 ，避免 了强氧化性o h 对生物体系的损伤。干扰试验表明。c y 7 t e m p o 对检测生物体 内的o h 具有较i 商的选择性。在以上实验的基础上进行了细胞内o h 的荧光显 像，巨噬细胞经过p m a 刺激后产生大量的活性氧自由基，经c y 7 t e m p o 孵育 后通过激光共聚焦扫描显微镜进行荧光成像，实时显示了探针对细胞内o h 的捕 获，并可刘微摩尔级别的- o h 含量的变化产生响应。证明了探针的膜可透过性和 检测- o h 的灵敏度。方法的线性范围为1 o x l o 8 - 1 0 x 1 0 m ，检测限为1 0 6 x 1 0 8 m 。 2 实验部分 2 1 仪器与试剂 分析所用试剂：黄嘌呤( x ) ，1 0 0 1 0 2t o o l1 1 ( 溶于1 0m mn a o h 溶液) 做贮 备液；黄嘌呤氧化酶：购于s i g m a 公司，g r a d e1 ：f r o m b u t t e r m i l k ，1 0 0 u n i t s r o t ， 山东师范大学硕士学位论文 于含2 3 0m o l1 “( n h 4 ) 2 s 0 4 j1 0m m 水杨酸钠的生理缓冲液中，2 ，8 保存；3 丙氨基1 羟基- 3 - 异丙基氧- 兰氨烯( n 0 c 5 ) ( 1 0m m ，用1 0m m 的n a o h 溶液 配制) ；3 - m o r p h o l i n o s y d n o n i m i n e ( s i n 一1 ) ，叔丁醇，抗坏m 酸，1 ，4 一氢醌以及 还原性谷胱苷肽( 1 m m ) 均为水溶液：二甲豫砜( d m s o ) ，佛波醇豆蔻酸i 溢( p m a 购于s i g m a ，1 0 0 t g1 。1 储备液，2 0 。c 保存；h 2 0 2 用高锰酸钾标定。c y 7 t e m p o 探针溶于无水d m s o ，5xi o - 3 m ，- 1 8 保存。r a w 2 6 4 7 细胞购于a m e r i c a nt y p e c u l t u r ec o l l e c t i o n ，m a n a s s a s 。 合成用主要原料：2 , 3 ，3 三甲基假吲哚( 北京成宇化工有限公司) ，1 , 3 一丙 烷磺内酯( 武汉风帆化工有限公司) ，三氯氧磷，环己酮；c y 7 c 1 ( 本室合成) ， 2 ，2 ，6 ，6 一四甲基哌啶醇氮氧自由基( t e m p o ，f r o ms i g m a ) 。氢化钠( 8 0 ，保 存于煤油中，使用前用正己烷洗涤抽滤得到干燥灰白色粉末) 。 所用试剂均为分析纯，水为超纯水( 1 8 2m oc m ) 。 仪器：f l s 9 2 0 型荧光仪( 英国e d i n b u r g h ) ，激发发射狡缝均为2m ；p h - 3 c 型酸度计( 上海雷磁仪器厂) ； b r u k e ra v a n c e3 0 0 核磁共振仪( d m s o 做溶剂) ； e s p 3 0 0 e 顺磁电子自旋共振仪( 德国b r u k e r ) ，微波桥位于x b a n d ，1 - 1 0 g h z ， 微波功率：5m w ，增益：1 0 0 0 0 0 ：调制幅度：1g a u s s 。 2 2c y 7 t e m p o 探针的合成与表征 2 2 1 c y 7 c i 的合成1 2 s 2 ，3 3 一三甲基一l 一( 3 - - 磺丙基) 一3 h 一吲哚内盐的合成( a )在l o om l 圆 底烧瓶中，分别加入5 0m l 甲苯，1 0m l ( 0 0 6 2 3m 0 1 ) 2 ，3 ，3 三甲基假吲哚，8 2 0m 1 ( o 0 9 3 5m o o l ，3 - 丙烷磺内酯，加热回流，开始加热时，反应液为深红色油状液体， 随着反应的进行，反应液颜色加深，成深紫红色。反应1 8 h 后，冷却至室温，过 山东师范大学硕士学位论文 滤得粉红色固体。川丙酮( 3 x l om 1 ) 洗涤。所得固体用甲醇和乙醚重结晶，真 空干燥得粉红色固体( c 1 4 h t o n 0 3 s ) 1 5 2 0 9 ，产率8 6 8 。熔点1 2 6 1 2 8 。c ，元 素分析结果( 理论值) ：c ，5 9 3 ( 5 9 6 ) ；h ，7 0 ( 7 1 ) ；n5 2 ( 5 0 ) 。 2 - c h l o r o - 1 - f o r m y l - 3 一h y d r o x y m e t h ) r l e n e c y c l o h e x e n e 的合成( b ) 4 0m ld m f 溶于 4 0 m l 二氯甲烷，在冰水浴中冷却，3 71 1 1 l 三氯氧磷溶于3 5m l 一二氯甲烷，在搅拌 下逐滴加入到d m f 中，然后加入1 0 9 环己酮，混合物加热回流3 h 。冷却后，倒 入2 0 0 9 冰中，静置过夜，得到黄色固体。所得固体用丙酮重结晶，溶解后，用 干冰冷却，得黄色棱状晶体( c 8 t t 9 c 1 0 2 ) 1 4 5 9 ，产率8 2 4 。熔点：1 3 0 1 3 1 ，元素分柝结果( 理论值) ：c ，5 5 4 ( 5 5 7 ) ；h5 4 ( 5 3 ) ；c i ，2 0 4 ( 2 0 5 ) 。 c y 7 c i 的合成1 1 8 9 ( 4m m 0 1 ) a 和0 3 4 5 9 ( 2m m 0 1 ) b 溶解在1 5 0m l 正丁醇和 苯的混合溶剂中( 7 ：3 ) ，在反应器上装一水分离器，分出反应生成的水。使反应 能够向正反应方向进行。混合物加热回流，并不断搅拌。反应3 h 后，冷却到室 温，减压蒸馏除去溶剂。沉淀用乙醚洗涤，得深紫红色固体粗产物，柱色谱分离 纯化，洗脱剂为甲醇一乙酸乙酯( 7 ：1 2v v ) ，得到绿色产物( c 3 6 h 4 4 0 6 n 2 5 2 0 1 ) ， 0 7 1 9 9 ，产率达4 9 。元素分析结果( 理论值) ：c ，6 1 6 ( 6 1 8 ) ；h ，6 5 ( 6