DNA的生物合成.ppt

,1,DNA的生物合成(复制)DNABiosynthesis，Replication,第十章,2,复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,3,复制的基本规律BasicRulesofDNAReplication,第一节,4,复制的方式半保留复制(semi-conservativereplication)复制的高保真性(highfidelity)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication),5,一、半保留复制的实验依据和意义,DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制的概念,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,CCACTGG,GGTGACC,AGGTACTG,TCCATGAC,TCCATGAC,AGGTACTG,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,AGGTACTGCCACTGG,TCCATGACGGTGACC,+,母链DNA,复制过程中形成的复制叉,子代DNA,目录,7,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式半保留式混合式,8,密度梯度实验,实验结果支持半保留复制的设想。,含重氮-DNA的细菌,第一代,第二代,梯度离心结果,9,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。,半保留复制的意义,遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,10,原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。,二、双向复制,11,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),12,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。,13,14,三、复制的半不连续性,领头链(leadingstrand),随从链(laggingstrand),15,顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。,16,DNA复制的酶学TheEnzymologyofDNAReplication,第二节,17,参与DNA复制的物质,底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol模板(template):解开成单链的DNA母链引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合其他的酶和蛋白质因子,一、复制的化学反应,(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi,目录,19,聚合反应的特点,DNA新链生成需引物和模板；新链的延长只可沿53方向进行。,20,二、DNA聚合酶,全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol,活性：1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性,35外切酶活性,53外切酶活性,?,能切除突变的DNA片段。,能辨认错配的碱基对，并将其水解。,核酸外切酶活性,目录,22,（一）原核生物的DNA聚合酶,DNA-polDNA-polDNA-pol,23,（一）原核生物的DNA聚合酶,24,功能：对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。,DNA-pol（109kD）,25,323个氨基酸,小片段,5核酸外切酶活性,大片段/Klenow片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性,N端,C端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,26,DNA-pol（120kD）,DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。它参与DNA损伤的应急状态修复。,27,功能是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。,DNA-pol(250kD),28,（二）真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol,起始引发，有引物酶活性。,延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。,参与低保真度的复制。,在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。,在线粒体DNA复制中起催化作用。,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,DNA-pol,29,（二）真核生物的DNA聚合酶,30,三、复制保真性的酶学依据,复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。复制保真性的酶学机制：（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读（二）复制的保真性和碱基选择,31,（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。,32,（二）复制的保真性和碱基选择,DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。嘌呤的化学结构能形成顺式和反式构型，与相应的嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于反式构型。,33,1.遵守严格的碱基配对规律；2.聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；3.复制出错时DNA-pol的及时校读功能。,DNA复制的保真性至少要依赖三种机制,34,四、复制中的分子解链及DNA分子拓扑学变化,DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。,35,（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白,E.Coli基因图,目录,37,解螺旋酶(helicase)利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链引物酶(primase)复制起始时催化生成RNA引物的酶单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整,38,（二）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase),解链过程中正超螺旋的形成,目录,40,拓扑异构酶作用特点既能水解、又能连接磷酸二酯键,拓扑异构酶拓扑异构酶,分类,41,拓扑异构酶,切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。,拓扑异构酶,切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,作用机制,目录,43,五、DNA连接酶,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。,DNA连接酶(DNAligase)作用方式,HO,5,3,3,5,DNA连接酶,ATP,ADP,5,3,5,3,目录,45,DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。,功能,46,DNA生物合成过程TheProcessofDNAReplication,第三节,47,（一）复制的起始,需要解决两个问题：,1.DNA解开成单链，提供模板。,2.合成引物，提供3-OH末端。,一、原核生物的DNA生物合成,48,E.coli复制起始点oriC,1.DNA解链,49,DnaA,DnaB、DnaC,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2.引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。,50,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。,引物,引物酶,51,（二）复制的延长,复制的延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。,52,OH3,3,目录,领头链的合成,目录,随从链的合成,目录,目录,56,阶段一,阶段二,57,阶段三,阶段四,复制过程简图,目录,59,复制过程动画,60,原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制片段在复制的终止点(ter)处汇合。,（三）复制的终止,61,随从链上不连续性片段的连接,目录,63,哺乳动物的细胞周期,DNA合成期,G1,G2,S,M,二、真核生物的DNA生物合成,细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。G1S及G2M的调节，与蛋白激酶活性有关。蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。,64,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动。复制的起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子(replicationfactor,RF)。增殖细胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。,（一）复制的起始,65,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,（二）复制的延长,66,染色体DNA呈线状，复制在末端停止。复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。,（三）复制的终止,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,目录,目录,切除引物的两种机制,目录,70,71,端粒酶(telomerase),端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT),组成,端粒酶的催化延长作用,爬行模型,目录,DNA聚合酶复制子链,进一步加工,目录,74,逆转录和其他复制方式ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays,第四节,75,逆转录酶(reversetranscriptase),逆转录(reversetranscription),一、逆转录病毒和逆转录酶,76,逆转录病毒细胞内的逆转录现象,77,分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。,以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。,试管内合成cDNA,cDNAcomplementaryDNA,78,二、逆转录研究的意义,逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。,79,滚环复制(rollingcirclereplication),三、滚环复制和D环复制,是某些低等生物的复制形式，如X174和M13噬菌体等。,滚环复制,目录,81,D环复制(D-loopreplication),是线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)的复制形式。,82,DNA损伤（突变）与修复DNADamage(Mutation)andRepair,第五节,83,遗传物质的结构改变而引起的遗传信息改变，均可称为突变。,在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤(DNAdamage)。,从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变。,84,一、突变的意义,（一）突变是进化、分化的分子基础（二）突变导致基因型改变（三）突变导致死亡（四）突变是某些疾病的发病基础,85,二、引发突变的因素,物理因素紫外线(ultraviolet,UV)、各种辐射,化学因素,目录,87,三、突变的分子改变类型,错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement),88,DNA分子上的碱基错配称点突变(pointmutation)。,（一）错配,89,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,90,（二）缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变。,缺失或插入都可导致框移突变。,91,缺失引起框移突变,92,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,目录,94,四、DNA损伤的修复,修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,光修复(lightrepairing)切除修复(excisionrepairing)重组修复(recombinationrepairing)SOS修复,修复的主要类型,95,（一）