分子免疫学抗体,抗体多样性及其产生机制.ppt

抗体，抗体的多样性及其产生机制,高波2019-10-09,抗体研究简史,20世纪有关抗体研究获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家,20世纪有关抗体研究获得诺贝尔医学生理学奖的免疫学家,EmilvonBehring,1901,antitoxins,GeoregesKohlerandCesarMilstein,1984,monoclonalantibody,SusumuTonegama,1987,structureofIggene,GeraldEdelmanandRodneyPorter,1972,structureofantibody,PaulEhrlich,1908,productionofantibody,NobelPrizewinners,Burnet,1960，Clonalselection,Jerne,1984,Idiotypenetwork,抗体生物体最奇妙的分子,无限的多样性（diversity)功能与结构的双重性可变区抗原结合(特异性specificity)恒定区生物学效应功能分泌型和膜型表达,B细胞接受抗原刺激后增殖分化成浆细胞产生的糖蛋白。,基本概念,主要存在于血清中。,EmilvonBehring(1845-1917),抗毒素（1888）凝集素（1896,GruberandDurham）沉淀素（1897,kraus）抗体(antibody),是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白。,抗体一词的由来（19世纪末）,1937年Tiselius和Kabat用电泳方法证实抗体的活性存在于泳动最慢的血清组分，称为球蛋白,抗体与球蛋白关系,抗体球蛋白,1968和1972年WHO和国际免疫学会分别决定将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白.,抗体与免疫球蛋白关系,一、基本概念B细胞接受抗原刺激后增殖分化成浆细胞产生的糖蛋白与相应抗原特异性结合主要存在于血清中又称免疫球蛋白(Immunoglobulin)分泌型sIg、膜型mIg,1）四肽链通过链间二硫键组成H2L2重链：五类(isotype:a、g、m、d、e)轻链：两型(k、l),一、基本结构,免疫球蛋白的结构,RodneyPorter1917-1985NobelPrizein1972,GeraldEdelman1929-NobelPrizein1972,重链（Heavychain:H链）大约500a.a,糖基(+)类别（Class）:H链：,.(Ig)IgA,IgG,IgMIgD,IgE轻链（lightchain:L链）大约214a.a,糖基(-)型别（type）:,重链和轻链（Heavy&lightchains）,可变区(Variableregion,VH/VL,Fv)：结合抗原VH和VL：高变区HVR抗原结合部位互补决定区CDR骨架区FR14(1971,Kabat)恒定区(Constantregion,CH/CL)绞链区(Hingeregion),Thebasicstructureofimmunoglobulins,三个功能区(Domain),0102030405060708090100110120130140150160170180190200210220,50403020100,CDR1,CDR2,CDR3,抗体分子的多样性,Igl链的氨基酸序列,对来自不同B细胞克隆的Ig轻链氨基酸序列进行比较，发现V区的变化主要集中在3个分别由610个氨基酸残基组成的狭小区域内。这3个区又被称作高可变区或互补决定区（CDR），参与抗原结合部位的组成。,0102030405060708090100110120130140150160170180190200210220,50403020100,CDR1,CDR2,CDR3,抗体分子的多样性,DiversityandSpecificity,抗原,B细胞表位,抗体CDR,表位,铰链区（Hingeregion）,特点：1)极富弹性2)富含脯氨酸功能:1)有利于Ab与Ag的结合2)有利于Ab与补体的结合,IgG分子结合抗原前后的构象变化,结构域,1）Ig分子中由链内二硫键构成的致密立体球体(V/C/H)。2）b-sheet、b-barrel、immunoglobulinfold。3）CDRs(Hypervariableregions)、FRs(Frameworkregions)。,免疫球蛋白的结构功能区,“Ig-likeDomain(Ig样结构域)”,二、免疫球蛋白的其他成分,(1)化学本质：浆细胞分泌的多肽链,JCHAIN,IgAdimer,(2)存在：IgM（五聚体）,sIgA（双体）,IgM,连接链（joiningchain，J链）,Secretorypiece,Joiningchain,IgAdimer,分泌片（SecretoryPiece，SP),(1)化学本质：多肽链(70kD),(2)来源：上皮细胞,Jchain,（3）作用：a.帮助IgA穿越黏膜b.保护sIgA抵抗蛋白酶的水解作用,SecretoryIgA(sIgA),Plasmacells,IgAdimer,pIgR,SP,EpithelialCell,胃蛋白酶,木瓜蛋白酶,Fc,pFc,F(ab)2,Fab,三、免疫球蛋白的水解片段,木瓜蛋白酶作用于IgG分子重链间二硫键的N端侧，将其裂解为Fab段和Fc段。胃蛋白酶则切在该二硫键之C端侧，产生F(ab)2和pFc段。,类(Class):重链C区抗原性IgG、IgA、IgM、IgD、IgE亚类(Subclass):重链抗原性/二硫键数目位置IgG1-4型(Type):轻链C区抗原性k、l亚型(Subtype):轻链C区aa差异排列l14,免疫球蛋白的异质性,免疫球蛋白的类型,血清型,免疫球蛋白既可结合抗原，又可作为抗原，激发机体的免疫应答，因而也是一类抗原物质。由于免疫球蛋白的遗传基础不同，不同的免疫球蛋白的抗原性也有差异。利用血清学方法测定和分析免疫球蛋白抗原性予以分类，称为免疫球蛋白的血清型。,1、同种型(isotype)：同一种属所有个体免疫球蛋白分子共同的抗原特异性标志。由C区决定。,2、同种异型（allotype)：同一种属不同个体间免疫球蛋白分子所具有的不同的抗原特异性标志。由链、链、链、链C区决定。,3、独特型(idiotype,Id)：每个免疫球蛋白分子所特有的抗原特异性标志。由超变区特殊的氨基酸序列及其构型决定。,1）与相应抗原特异性结合：Fv2）激活补体：3）结合FcR：促吞噬(opsonization)介导过敏介导细胞毒(ADCC)免疫调理4）穿过胎盘和粘膜5）调节免疫功能,免疫球蛋白的功能,免疫球蛋白的功能,a.,b.,免疫球蛋白的功能,FcR,Antibody-DependentCell-mediatedCytotoxicity(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用),Targetcell,Ab,Effectorcell,Targetcell,表达Fc受体的组织细胞(NK、M、中性粒细胞）通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的的靶细胞。,ADCC,免疫球蛋白的功能,抗体的抗病毒效应,介导ADCC,经典途径激活补体,调理吞噬作用,免疫球蛋白的功能,IgG,IgM,IgA,IgE,IgD,各类免疫球蛋白的特点和功能,出生后3个月开始合成，35岁接近成人含量最多占血清总Ig的75%产生比较晚，是再次应答的主要抗体半衰期最长(t=23天)分布最广，血管外的主要抗体唯一能通过胎盘的Ig激活补体IgG13（经典），IgG4（替代）结合细胞巨噬细胞，单核细胞调理作用NK细胞，巨噬细胞介导ADCC结合SPA协同凝集实验,特性：,IgG,IgG,功能：,抗感染的主要抗体介导II,III型超敏反应介导自身免疫,调理介导ADCC固定补体中和病毒和毒素,抗菌抗病毒抗外毒素,IgG四个亚类的特点,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,血清含量(占IgG的百分比）702064血清半衰期(天)2323723通过胎盘+固定补体+结合Fc受体+,特性血清中含量第三出现最早的Ig分布局限，主要在血管内d)通过经典途径激活补体e)分子量最大f)凝集细菌e)结合细胞巨噬细胞,单核细胞-调理NK细胞,巨噬细胞-介导ADCC,IgM,J链,IgM,抗感染的先锋抗体介导II,III型超敏反应介导自身免疫天然血型抗体,调理作用(最强)激活补体中和病毒和外毒素凝集微生物介导ADCC,功能：,抗菌作用最强(5001000IgG)抗病毒抗外毒素,IgA,特点:,血清中含量第二(血清型IgA，serumIgA)主要以分泌型存在(外分泌液中）.(secretoryIgA,sIgA)sIgA通过初乳被动转移给新生儿,唾液,眼泪,乳汁,鼻黏膜,支气管分泌液,生殖道分泌物,前列腺液,小肠黏膜分泌液.,SC,Jchain,IgAdimer,sIgA,功能：,粘膜局部抗感染的主要抗体,阻止病原体粘附于粘膜细胞中和病毒和外毒素,伤寒沙门氏杆菌,奈瑟氏淋球菌脊髓灰质炎病毒，流感病毒,抗菌作用抗病毒作用抗外毒素作用,IgD分子,*在膜表面的表达是B细胞成熟的主要标志；*膜型IgD作为BCR的组成部分，发挥信号传导作用,StructureofIgEmolecule,IgE,特性,1)含量最少,2)与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的FcR受体结合,亲细胞性抗体:不与Ag结合，即可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的FcR牢固结合,3)不能激活补体,IgE,参与过敏反应(I型超敏反应),结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞导致各种生物活性的介质的释放,嗜酸性粒细胞有IgE的FcR，嗜酸性粒细胞通过此受体结合包被在蠕虫上的IgE的Fc段，最终杀死寄生虫,抗寄生虫感染,作用,人抗体分子的特性,抗体类别,IgG,IgA,IgM,IgD,IgE,重链类别,g,a,m,d,e,重链亚类,g1,g2,g3,g4,a1,a2,轻链类别,k,和,l,k,和,l,k,和,l,k,和,l,k,和,l,分子式,g,2,l,2,或,g,2,k,2,a,2,l,2,或,(a,2,l,2,),5,SCJ,a,2,k,2,或,(a,2,k,2,),5,SCJ,(m,2,l,2,),5,J,或,(m,2,k,2,),5,J,d,2,l,2,或,d,2,k,2,e,2,l,2,或,e,2,k,2,分子量,（,kDa,）,150,160,或,400,900,180,190,固定补体能力,+,0,+,0,0,血清浓度,(mg/100ml),1000,200,120,3,0.05,血清半衰期,(,天,),23,6,5,3,2,穿过胎盘,0,0,0,0,肥大细胞和嗜碱,性细胞脱颗粒,？,0,0,0,+,裂解细菌能力,+,+,+,?,?,抗病毒能力,+,+,+,?,?,2019-10-13,抗体的多样性及其产生机制,抗体的多样性抗体的多样性产生的机制抗体的类别转换,1897年PaulEhrlich提出侧链学说1930年Haurowitz提出直接模板学说1941年Pauling提出间接模板学说1955年NielsJerne提出自然选择学说1958年FMBurnet提出克隆选择学说,抗体生成理论的发展史,（一）抗体的多样性,抗体/免疫球蛋白的基因结构抗体基因的重排抗体基因的重排机制,抗体的多样性早期假说一：生殖细胞学说,抗体的多样性早期假说二：体细胞突变学说,Thegenomecontainsmanylociencodingantibodymolecules.Bcellexpressoneoftheseloci.DifferentBcellsexpressdifferentloci.,ThereareasmallnumberofantibodygeneswhichundergomutationastheBcellmatures,thusgivingrisetoBcellsexpressingantibodyofdifferentspecificity.,1971年Kabat基因嵌入模型,利根川进：抗体的基因重排理论,免疫球蛋白的基因结构,Inheavychains,theV,DandJsegmentsencodethevariabledomainwhiletheCsegmentencodestheconstantdomain.Inlightchains,theVandJsegmentsencodethevariabledomainwhiletheCsegmentencodestheconstantdomain.,抗体基因的重排,DuringBcellmaturation,immunoglobulingenesundergorearrangement.,DuringBcellmaturation,immunoglobulingenesundergorearrangement.,DuringBcellmaturation,immunoglobulingenesundergorearrangement.,DuringBcellmaturation,immunoglobulingenesundergorearrangement.,Thekappaandlambdalociundergosimilarrearrangement.SincetherearenoDsegments,thereisasingleV-Jrearrangement.Inbothheavyandlightchainrearrangement,anumberofJsegmentsmayremainbetweentheV(D)andCsegments.TheseareincludedintheRNAtranscriptbutaresplicedoutduringRNAprocessing.ThefinallightchainmRNAcontainsoneVJCunit.,KubyFigure5-4,KubyFigure5-4,抗体基因重排的机制,（1）重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS),在VH和VL基因3端、J基因5端和D基因两端有高度保守的核苷酸序列，包括一个7核苷酸组成的七聚体(heptamer)和一个9核苷酸组成的九聚体(nonamer)，两者间隔121或231个核苷酸，称为RSS。,只有间隔12个碱基对和间隔23个碱基对的RSS之间发生重组，而间隔长度相等的RSS之间不发生重组，这就是12/23碱基对规律(12/23basepairrule)，也叫做1+2圈规律(1+2turnrule)。,KubyFigure5-3,Recombinationsignalsequences-conservedsequencesinregionsjustupstreamordownstreamofgenesegments.Consistofaconservedheptamerandnonamerwitha12or23bpspacer.,KubyFigure5-3,Theone-turn/two-turnrule(12/23rule)-recombinationoccursonlybetweenasegmentwitha12bpspacerandasegmentwitha23bpspacer.,RecombinationSignalSequencesDirectRecombination,RecombinationActivatingGenes(encodeRAG-1andRAG-2)RAG-1andRAG-2mediaterecognitionofsignalsequencesandrearrangementofDNAsegments.MicedeficientinRAG-1orRAG-2areunabletorearrangeheavyorlightchaingenes.ThesemicehavenomatureBcells.-BcellswillnotmatureiftheycannotexpressaBCR.,（2）重组活化基因RecombinationActivatingGenes,RAG-deficientmicealsolackmatureTcells.-TheTcellreceptorisalsoencodedbylocicontaininggenesegmentsthatmustberearrangedbeforetheTCRcanbeexpressed.TcellswillnotmatureiftheycannotexpressaTCR.SCID(severecombinedimmunedeficency)micealsohaveadefectthataffectsrearrangementofBCRandTCRloci.TheyalsohavenomatureTorBcells.,Flowcytometryofnormalvs.RAG-1deficientmice:LymphnodecellsFITCanti-CD19(Bcellmarker)andPEanti-CD3(Tcellmarker),Normalmice,RAG-1-deficientmice,HowrecombinationintheVregionsofantibodyhappens?,Terminaldeoxynucleotidyltransferase(Tdt)Anenzymethatrandomlyaddsinnucleotidesduringjoiningofheavychain(NOTlightchain)segments.,ReadKubypages113-115:GeneSegmentsAreJoinedbyRecombinases,ProductiveandnonproductiverearrangementsJoiningofsegmentsisnotpreciseandmayresultinlossofthecorrectreadingframe.Thismayleadtointroductionofstopcodons-nonproductiverearrangements.,RSS,RSS,RSS:recombinationsignalsequenceRAG:recombinationactivatinggene,P-核苷酸和N-核苷酸的加入,Twoallelesareavailableateachlocus(maternalandpaternal).ABcellexpressesonlyoneheavyandlightchainallele.-ALLELICEXCLUSION,First,onealleleoftheheavychainisrearranged.Iftherearrangementissuccessful,theotherallelewillnotberearranged.Iftherearrangementisnonproductive,theotherallelewillberearranged.Onceaheavychainallelerearrangementisproductive,lightchainrearrangementwillbegin.Ifrearrangementofbothheavychainallelesisnonproductive,theBcellwillnotmaturefurtherbutwilldieofapoptosiswithinthebonemarrow.,Ifaheavychainalleleissuccessfullyrearranged,lightchainrearrangementbegins.Inhumans,thekappalocusisrearrangedfirst.Rearrangementoccursatonealleleatatimeandcontinuesuntilaproductiverearrangementoccurs.Ifbothkappaallelesrearrangenonproductively,rearrangementwillbeginatthelambdalocus.Ifall4alleles(bothkappaallelesandbothlambdaalleles)rearrangementsarenonproductive,theBcellwillnotmaturebutwillinsteaddieofapoptosiswithinthebonemarrow.,Ifeitherbothheavychainalleles,orallf