（老年医学专业论文）coh23对急性前髓白血病hl60细胞的作用及其机制研究.pdf

m | i f l | l 川1 1 1 1 i f i | | | 1 1 | | i 帅 17 6 9 16 2 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要4 二、英文缩略语7 三、论文 氤f 言8日u 舌8 实验材料与方法9 实验结果1 1 讨论1 6 结论1 8 四、本研究创新性的自我评价1 9 五、参考文献2 0 六、附录 综述2 3 在学期间科研成绩3 3 致谢3 4 个人简介3 5 c o h - 2 - 3 对急性前髓白血病h l 6 0 细胞的 作用及其机制研究 目的 研究5 一( 3 一a m i n o - 4 - m e t h o x y p h e n y l ) 一4 一( 3 ，4 ，5 - t r i m e t h o x y p h e n y l ) - 3 h 一1 ，2 - d i t h i 0 1 3 - o n e ( c o h 2 3 ) 对急性前髓白血病h l 6 0 细胞的作用及其作用机制。 方法 一、m t t 法 应用m 1 v r 方法检测c o h 2 3 和顺铂对h l 6 0 细胞的生长抑制作用。取对数 生长期细胞，调整细胞浓度，以每孔lx 1 0 3 个细胞密度接种到9 6 孔板，每孔加2 0 0 i ，t l 细胞悬液。实验分组：药物处理组( 药物浓度分别为0 o l ，0 0 3 ，0 1 ，o 3 ，1 0 ， 3 0 1 a g m l ) ；阴性对照组( 只加培养细胞，不加药) ；空白对照组( 只加培养基) ， 每个组设6 个复孔。将9 6 孔板放在3 7 。c 含5 c 0 2 的孵箱中培养4 4 小时后，每 个孔内加入2 0 1 x l 的3 - ( 4 ，5 - d i m e t h y l t h y t h i a z o l - 2 一y 1 ) 2 ，5 一d i p h e n y l - t e t r a z o l i u m b r o m i d e ( m t t ) 溶液继续孵育4 小时后，吸出上清液每孔加1 5 0 1 a ld m s o 震荡1 0 分钟 后应用酶标仪测各孔吸光度( o d ) 值，本试验重复三次，按以下公式计算抑制率： 抑制率= ( 1 给药组平均o d 值对照组平均o d 值) x 1 0 0 。 二、流式细胞术 通过流式细胞术碘化丙锭( p i ) 单染检测药物c o h 2 3 对h l 6 0 细胞周期分 布及凋亡的影响。取对数生长期的细胞，以l x l 0 5 个m l 的密度接种到培养瓶中。 实验分组：药物处理组( o 1 ，0 3 ，1 o p g m l c o h 2 3 处理2 4 小时；1 1 t g m l c o h 2 - 3 处理6 ，1 2 ，2 4 小时) ，阴性对照组( 只加培养细胞，不加药) 。收集细胞，用p b s 洗两遍，加入7 0 终浓度的酒精4 c 固定过夜，2 0 p g m l 的r n a s e 3 7 * c 水浴箱中 孵育3 0 分钟后，加入终浓度为5 0 p g m l 的p i 溶液4 。c 避光孵育3 0 分钟，流式细 胞仪检测细胞各周期百分率和凋亡细胞百分率。 三、吖啶橙( a 0 ) 溴乙锭( e b ) 双染色法 通过吖啶橙( a 0 ) 溴乙锭( e b ) 双染色法观察凋亡细胞的形态学改变。取 对数生长期细胞，以1 x 1 0 5 个m l 的密度接种到培养瓶中。实验分组：药物处理 组( 1 l a g m l c o h 2 3 处理6 ，1 2 ，2 4 小时) ，阴性对照组( 只加培养细胞，不加 药) 。收集细胞，调整细胞浓度至l x1 0 6 个m l ，取1 0 0 p g m l 的a o e b 混合液1 p l 加到2 5 1 a l 的细胞悬液中吹打混匀，取一滴加到载玻片上盖上盖玻片，免疫荧光显 微镜下观察细胞形态学改变。 四、免疫荧光 通过免疫荧光技术观察药物处理组细胞的微管蛋白形态学变化。取对数生长 期细胞，以l x l 0 5 个m l 的密度接种到培养瓶中。实验分组：药物处理组 ( 1 p g m l c o h 2 3 处理2 4 小时) ，阴性对照组( 只加培养细胞，不加药) 。4 多 聚甲醛固定1 0 分钟，0 5 t r i t o n x 1 0 0 打孔3 0 分钟，5 牛血清白蛋白3 7 水浴 箱中封闭2 小时，1 ：5 0 鼠抗1 3 - t u b u l i n 单克隆抗体4 c 孵育过夜，1 ：5 0 抗鼠l g g 抗体室温避光孵育2 小时，l ：1 0 0 的h o e c h s t3 3 3 4 2 染核1 0 分钟，5 0 甘油封片， 荧光显微镜下观察细胞微管形态变化。 五、蛋白免疫印记( w e s t e r nb l o r ) 法 通过w e s t e r nb l o t 方法检测药物处理后细胞内的蛋白表达情况。取对数生长期 细胞，以1 x1 0 5 个m l 的密度接种到培养瓶中。实验分组：药物处理组( c y c l i nb ， p 3 4 c d c 2 ，c a s p a s e 3 ：o 1 ，o 3 ，1 p g m l c o h 2 3 处理2 4 小时；b c l 一2 - 1 p g m l c o h 2 3 处理2 4 小时) ，阴性对照组( 只加培养细胞，不加药) 。收集细胞，测蛋白浓度， 蛋白定量，加样，跑胶，转印，封闭后，一抗4 c 孵育过夜，二抗室温孵育2 小 时后e c l 发光。以1 3 - a c t i n 为内对照，用凝胶成像分析系统测定各条带灰度值，并 取其与1 3 - a e t i n 的比值为相对表达量分析蛋白的表达情况。 结果 通过m t t 检测方法我们可以看出，c o h 2 3 与顺铂都能够明显的抑制h l 6 0 2 细胞生长，但c o h 2 3 对细胞的抑制作用强于顺铂( i c 5 0 分别为：0 0 2 6 + 0 0 0 4 、 0 9 6 3 + 0 0 1 2 ) ，两者相比差异有统计学意义，p 0 0 5 ；流式细胞术碘化丙啶p i 单 染结果表明，随着药物剂量的增加和药物作用时间的延长，g 2 m 期细胞所占比率 和凋亡细胞所占比率逐渐增加，较阴性对照组相比差异有统计学意义，p 0 0 5 ； a o e b 双染色法观察到了凋亡细胞的形态学演变过程，从细胞核浓缩，核裂解到 凋亡小体的形成；免疫荧光显微镜下观察到c o h 2 3 可抑制微管蛋白的聚合作用； w e s t e r nb l o t 结果表明c o h 2 3 使细胞内周期相关蛋白c y c l i nb 表达明显增强，较 阴性对照组相比差异有统计学意义，p 0 0 5 ；且使凋亡相关蛋白c a s p a s e 3 被活化 和抗凋亡蛋白b c l 2 下调，较阴性对照组相比差异有统计学意义，p 0 0 5 。 结论 本研究结果表明，c o h 2 3 是通过阻滞h l 6 0 细胞在g 2 m 期并且诱导细胞 凋亡来实现其抑制h l 6 0 细胞增值的作用。c o h 2 3 诱导的细胞周期阻滞与上调 g 2 m 期相关调节蛋白c y c l i nb 的表达和抑制微管蛋白的聚合作用有关；c o h 2 3 诱导的h l 6 0 细胞凋亡与抗凋亡蛋白b c l 2 的表达下调和凋亡蛋白c a s p a s e 3 的激 活有关。 关键词 c o h 2 3 ；g 2 m 周期阻滞；凋亡；h l 6 0 细胞 英文论著摘要 e c ta n dm e c h a n i s mo fc o h 2 3i nhumanhecta nm e c h a ne 一一 p r o m v e l o c y t i cl e u k e m i ah l c e l l s o uc e l l s h l -， - o b j e c t i v e s t h ep u r p o s eo ft l l i ss t u d yw a st oi d e n t i f yt h ee f f e c ta n dm e c h a n i s mo fc o h - 2 - 3 i nh u m a np r o m y e l o c y t i cl e u k e m i ah l 6 0c e l l s m e t h o d s 1 、m t t t h e c y t o t o x i c r e a c t i o n w a sa s s e s s e d u s i n g t h em t t ( 3 一( 4 ， 5 - d i m e t h y l t h y t h i a z o l - 2 - y 1 ) 2 ，5 - d i p h e n y l - t e t r a z o l i u m b r o m i d e ) a s s a ym e t h o d m i t ( 5 m g m l ) w a sd i s s o l v e di np h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ( p b s ) a n df i l t e r e d c e l l sa ta d e n s i t yo f1 ，0 0 0c e l l sp e r2 0 0 1 上lm e d i u mp e rw e l lw e r es e e d e di na 9 6 一w e l lp l a t e c e l l s w e r et h e nt r e a t e dw i t h0 ，0 0 1 ，o 0 3 ，o 1 ，0 3 ，1 ，3 1 x g m lc o h 一2 3f o r4 4 ha t3 7 0 ci n 5 c 0 2 a f t e ri n c u b a t i o n ，2 0p lm t ts o l u t i o n s ( f i n a lc o n c e n t r a t i o no 5 m g m l ) w a s a d d e dt oe a c hw e l la n di n c u b a t e da t3 7 0 cf o raf u r t h e r4 h t h e9 6 - w e l lp l a t ec o n t a i n i n g t h ec e l l sw a sc e n t r i f u g e da t10 0 0 r p mf o r5m i n a t4 0 c t h em t ts o l u t i o nw a sr e m o v e d f r o mt h ew e l l sa n dt h ef o r m a z a nc r y s t a l sw e r ed i s s o l v e di n15 0 p ld m s o a f t e r10 m i n ， t h ep l a t e sw e r er e a do nam i c r o p l a t er e a d e ra t5 7 0 n m w a v e l e n g t h 2 、f l o wc y t o m e t r y t h ee f f e c to fc o h - 2 - 3o ng r o w t hi n h i b i t i o nw a sa s s e s s e da st h ep e r c e n t a g eo f i n h i b i t i o ni n c e l lg r o w t h t h ee x p e r i m e n t sw e r er e p e a t e dt h r i c e a n a l y s i so fd n a c o n t e n tb yf l o wc y t o m e t r y , c e l l st r e a t e dw i t h0 ，o 1 ，0 3 ，ll 上g m lc o h - 2 3f o r2 4 ho r lp g m lc o h 一2 - 3f o r0 ，6 ，12 ，2 4 hw e r ec o l l e c t e db yc e n t r i f u g a t i o n ，w a s h e dt w i c ew i t h 4 p b s ，a n dt h e nf i x e dw i t h7 0 e t h a n o la t4 0 cf o ro v e rn i g h t t h ef i x e d c e l l sw e r e c o l l e c t e db yc e n t r i f u g a t i o na t10 0 0r p mf o r5m i na n dw a s h e do n c ew i t hp b s a f t e r t r e a t m e n tw i t hr n a s e ( 2 0 p g m l ) f o r3 0 m i na t3 7 0 c ，c e l l sw e r es t a i n e dw i t hp r o p i d i u m i o d i d e ( 5 0 i t g m l ) f o r3 0 m i na t4 0 ci nt h ed a r ka n da n a l y z e dw i t haf l o wc y t o m e t e r t h ee x p e r i m e n t sw e r er e p e a t e dt h r i c e 3 、a o e bf l u r e s c e n c es t a i n i n g a o e bf l u r e s c e n c es t a i n i n gt od e t e c ta p o p t o s i s ，c e l l sw e r et r e a t e dw i t h1i t g m l c o h 2 3f o r0 ，6 ，12 ，2 4 h t h em o r p h o l o g i c a lc h a n g e sw e r ea n a l y z e db yf l u o r e s c e n t m i c r o s c o p yu s i n ga c r i d i n eo r a n g e ( a o ) a n de t h i d i u mb r o m i d e ( e b ) s t a i n i n g b r i e f l y , 1n lo fas t o c ks o l u t i o nc o n t a i n i n g10 0 t g m le a c ho f a oa n de bw a sa d d e dt o2 5 i t lo f c e l ls u s p e n s i o n v i a b l ec e l l sw e r ec o l o r e dg r e e nw i t hi n t a c tn u c l e i a p o p t o t i cc e l lw a s d e m o n s t r a t e db yt h ea p p e a r a n c eo fc e l ls h r i n k a g ew i t hc o n d e n s a t i o na n df r a g m e n t a t i o n o fn u c l e ia n dt h ef o r m a t i o no fa p o p t o t i cb o d y 4 、i m m u n o f l u o r e s c e n c e c e l l st r e a t e dw i t h1i t g m lc o h 一2 3f o r2 4 h w e r eh a r v e s t e da n dt h e nf i x e di n4 p a r a f o r m a l d e h y d ef o r1 0m i na tr o o mt e m p e r a t u r e a f t e rw a s h i n gi np b s f o r5m i n ， c e l l sw e r ep e r m e a b i l i z e di no 5 t r i t o nx - 1 0 0i np b sf o r3 0m i n a f t e rb l o c k i n gw i t h 5 b s af o r2 ha t3 7 0 c ，c e l l sw e r ei n c u b a t e dw i t h1 ：5 0m o u s ea n t i - p - t u b u l i n m o n o c l o n ma n t i b o d yf o ro v e m i g h ta t4 。c a f t e rp r i m a r ya n t i b o d yi n c u b a t i o n ，c e l l s w e r er i n s e di np b st h r e et i m e sa n dt h e ni n c u b a t e dw i t hl ：5 0f i t c c o n j u g a t e d s e c o n d a r ya n t i m o u s el g ga n t i b o d y f o r2 ha t3 7 0 ci n t h ed a r k d n aw a s c o u n t e r s t a i n e dw i t h1 ：10 0h o e c h s t3 3 3 4 2f o r5m i na tr o o mt e m p e r a t u r ei nt h ed a r k s t a i n e dc e l l sw e r ev i s u f l i z e du n d e raf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e 5 、w e s t e r nb l o t c d l st r e a t e dw i t hv a r i o u sc o n c e n t r a t i o n so fc o h 一2 3w e r eh a r v e s t e d p r o t e i n e x t r a c t s ( 8 0 p g ) p r e p a r e dw i mr i p al y s i s b u f f e rw e r es e p a r a t e do na n8 12 s d s p o l y a c r y l a m i d eg e l sa n dt r a n s f e r r e dt op o l y v i n y l i d e n ef l u o r i d e ( p v d f ) m e m b r a n e 5 r e s u l t s c o h 2 3a n dc i s p l a t i nw e r ef o u n dt oi n h i b i tt h eg r o w t ho fh l 6 0c e l l si na t i m e a n dd o s e - - d e p e n d e n tm a n n e r c e l lc y c l ea n a l y s i ss h o w e dg 2 m p h a s ea r r e s ta n d a p o p t o s i si nh l 6 0c e l l sa f t e re x p o s u r et oc o h - 2 - 3 m o r p h o l o g i c a lc h a n g e ss u c ha st h e p r e s e n c eo fc h r o m a t i nc o n d e n s a t i o na n dn u c l e a rf r a g m e n t a t i o na f t e ra o e bs t a i n i n g w e r eo b s e r v e d w eo b s e r v e dt h a tt h en o r m a la r r a n g e m e n ta n do r g a n i z a t i o no f m i c r o t u b u l en e t w o r k sw e r ed e s t r o y e d a n a l y s i so ft h ec e l lc y c l e - r e l a t e dp r o t e i n s d e m o n s t r a t e dt h a tc o h - 2 - 3i n c r e a s e dt h ep r o t e i nl e v e lo fc y c l i nb c o h 一2 3a l s o c a u s e dac o n s p i c u o u si n c r e a s ei na p o p t o s i s ，w h i c hw a sa s s o c i a t e dw i t ha c t i v a t i o no f c a s p a s e - 3a n dd o w n r e g u l a t i o nt h ep r o t e i nl e v e l so f b c l - 2 c o n c l u s i o n o u rd a t ad e m o n s t r a t e dt h a tc o h - - 2 3c a ni n d u c eg 2 m p h a s ea r r e s ti nh l 6 0c e l l s t h r o u g hu p - r e g u l a t i n gg 2 m - - p h a s er e g u l a t o r yp r o t e i n s a n d i n h i b i t i n g t u b u l i n p o l y m e r i z a t i o n a p o p t o s i si n d u c e db yc o h 一2 - 3m a yb et h r o u g ht h em i t o c h o n d r i a l p a t h w a y sa n dc a s p a s e - d e p e n d e n tm a n n e r k e yw o r d s c o h 一2 3 ；g 2 m p h a s ea r r e s t ；a p o p t o s i s ；h l 6 0c e l l s 6 英文缩略语 英文缩略词英文全称中文全称 c o h 2 3 5 ( 3 a m i n o 4 m e t h o x y p h e n y l ) 4 ( 3 ， c a 4 o p z 杂合物 4 ，5 - t r i m e t h o x y p h e n y l ) 一3h 1 ，2 一 d i t h i 0 1 3 o n e h l 6 0 h u m a np r o m y e l o c y t i cl e u k e m i ac e l l s急性前随白血病细胞 pi p r o p i d i u mi o d i d e碘化丙锭 a oa c r i d i n eo r a n g e吖啶橙 eb e t h i d i u mb r o m i d e溴乙锭 m t t 3 ( 4 ，5 d i m e t h y l t h y t h i a z o l - 2 一y 1 ) 2 ，5 -3 ( 4 ，5 二甲基噻唑 d i p h e n y l t e t r a z o l i u m b r o m i d e 一2 ) - 2 ，5 - - - 苯基四氮 唑溴盐 c a - 4c o m b r e t a s t a t i na - 4考布他汀 7 论文 c o h - 2 - 3 对急性前髓白血病h l 6 0 细胞的 作用及其机制研究 刖 吾 微管由a 和p 微管异二聚体组成，在调控细胞的许多生物学功能上起重要 作用，包括细胞内因子的趋化作用，物质的运输和分泌作用，细胞的支架作用， 尤其是在调节细胞增殖，分化和凋亡方面发挥着重要的作用f l 】。微管与有丝分裂 纺锤体结合部位结合参与调控细胞的染色体分离，因此破坏微管能使细胞生长阻 滞在g 2 m 期并且导致细胞凋亡【2 钏。美国著名天然药物化学家p e t t i t 从南非矮生 柳树c o m b r e t u mc a f f t u m 中发现了c o m b r e t a s t a t i n a 4 ( c a 4 ) ( 图l ( 1 ) ) 等具有 极强抗肿瘤活性的顺式二苯乙烯类化合物，c a 4 等化合物可与微管蛋白秋水仙碱 结合部位结合，抑制微管蛋白聚合，阻断肿瘤细胞的有丝分裂，使细胞停滞在g 2 m 期【5 8 】。c a 4 及其衍生物的作用机理研究证实，该类化合物不仅直接杀灭肿瘤细 胞，更可抑制实体瘤血管内皮细胞内的微管蛋白聚合，改变细胞骨架结构，引起 肿瘤血管内皮细胞的变形，导致血栓的形成，阻断氧气和营养的供应和细胞代谢 废物的排出，进而引起实体瘤内部肿瘤细胞的大面积坏死。同时还发现，处于病 理状态下的肿瘤血管内皮细胞对c a - 4 高度敏感，而正常组织的血管内皮细胞对 c a - 4 并不敏感，在一定剂量下对肿瘤血管内皮细胞呈现良好的选择性，既可破坏 肿瘤的血管体系又不影响正常器官的血流量。c a - 4 等化合物既不同于传统的细胞 毒药物，又有别于肿瘤新生血管抑制剂，是一种全新类型的抗肿瘤药物。c a - 4 的 水溶性前体c a 4 p 已经进入临床试验的i i 和i i i 期研究中【9 】。 o l t i p r z a ( o p z ) ( 图1 ( 2 ) ) 是从十字花科蔬菜中提取的3 h 1 ，2 二硫杂环戊 烯3 硫酮类化合物，作为一种抗肝癌的化学药物已经进入临床研究阶段【l o 1 2 1 。裸 鼠体内建立的血管肉瘤模型经过o p z 处理后导致肿瘤血流量减少8 1 【1 3 j 。 此类化合物具有很强的抗肿瘤活性，在这些化合物中4 ，5 二取代苯基3 h 1 ，2 二硫杂环戊烯3 酮类化合物( c o h 2 3 ) 的抗肿瘤作用最明显( 图1 ( 3 ) ) ，因此 在本文中我们将阐述c o h 2 3 对h l 6 0 细胞的作用及其作用机制。 9 o 人急性前髓白血病h l 6 0 细胞从上海生物科学院购买。h l 6 0 细胞用含1 0 胎 牛血清的r p m i 1 6 4 0 培养基，在3 7 。c ，含5 c 0 2 的湿润空气培养箱中培养。 ( 二) 四唑盐( m t t ) 比色法 称取5 0 m g 的m t t 粉末溶于1 0m l p b s 溶液中，配制成终浓度为5 m g m l 的 m t t 溶液，并用无菌滤器过滤除菌后保存至2 0 。c 冰箱内备用。在无菌条件下取一 个9 6 孔板，每个孔内加入2 0 0 i a l 含1 0 0 0 个细胞的培养基。实验分组：药物处理 组( o 0 1 ，0 0 3 ，o 1 ，0 3 ，l ，3 9 9 m l 的c o h 一2 - 3 和顺铂处理h l 6 0 细胞4 8 小时) ； 阴性对照组( 只加培养细胞，不加药) ；空白对照组( 只加培养基) ，每个组设6 个复孔。孵育4 4 小时后，每个孔内加入2 0 9 lm t t 溶液继续孵育4 小时，离心， 吸出上清液，每孔加入1 5 0 1 t ld m s o 震荡1 0 分钟，应用酶标仪测各孔吸光度( o d ) 值，本试验重复三次，按以下公式计算生长抑制率：抑制率= ( 1 给药组平均o d 值对照组平均o d 值) x 1 0 0 。 ( 三) 流式细胞术 取对数生长期的细胞，以l x l 0 5 个m l 的密度接种到培养瓶中。实验分组： 药物处理组( 0 1 ，o 3 ，1 g m l c o h - 2 3 处理2 4 小时；1 l a g m l c o h 一2 3 处理6 ， 1 2 ，2 4 小时) ，阴性对照组( 只加培养细胞，不加药) 。以1 0 0 0 转分钟离心5 分 钟收集细胞，用p b s 沈两遍，加入7 0 终浓度的酒精4 。c 固定过夜。离心( 转数 同上) 收集细胞并用p b s 洗一次。用终浓度为2 0 1 a g m l 的r n a s e 3 7 。c 孵育3 0 分 钟后，加入终浓度为5 0 1 t g m l 的碘化丙啶( p i ) 溶液4 避光孵育3 0 分钟，流式 细胞仪检测细胞各周期百分率和凋亡细胞百分率。 ( 四) 吖啶橙溴乙锭( a 0 e b ) 双染色法 取对数生长期细胞，以l x l 0 5 个m l 的密度接种到培养瓶中。实验分组：药物 处理组( 1 1 t g m l c o h 一2 - 3 处理h l 6 0 细胞6 ，1 2 ，2 4 小时) ，阴性对照组( 只加培 养细胞，不加药) 。调整细胞浓度至l x l 0 6 个m l ，取1 0 0 a g m l 的a o e b 混合液 l o 光 取对数生长期细胞，收集对照组和经1 9 9 m l 的c o h 2 3 处理2 4 小时的细胞， 4 多聚甲醛固定1 0 分钟，p b s 洗涤5 分钟，0 5 t r i t o nx 1 0 0 打孔3 0 分钟，5 牛血清白蛋白3 7 。c 封闭2 小时，p b s 洗3 次每次l o 分钟，1 ：5 0 鼠抗 3 - t u b u l i n 单克隆抗体4 。c 孵育过夜，p b s 洗3 次每次1 0 分钟，1 ：5 0 抗鼠l g g 抗体3 7 。c 水 浴箱避光孵育2 小时，p b s 洗3 次每次l o 分钟，1 ：1 0 0 的h o e c h s t3 3 3 4 2 染核1 0 分钟，p b s 洗3 次每次1 0 分钟，5 0 甘油封片，荧光显微镜下观察细胞微管形态 变化。 ( 六) 免疫印迹w e s t e r nb l o t 法 收集细胞，p b s 洗2 次每次5 分钟，每组加入1 0 0 1 x l 裂解液( 内含1 蛋白 酶抑制剂，冰上操作) ，超声破碎，冰上静止2 0 分钟以便细胞充分裂解，高速离 心1 2 0 0 0 95 分钟，收集上清液。用考马斯亮兰法，以牛血清白蛋白作为标准进行 蛋白定量，计算各样品蛋白浓度。将含8 0 1 x g 的总蛋白进行s d s p a g e 电泳1 5 小 时后，转印至p v d f 膜，5 脱脂奶粉室温封闭2 小时，经t t b s 冲洗3 次，一抗 4 。c 孵育过夜，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育2 小时，t t b s 洗3 次后e c l 发 光。以f l - a c t i n 为内对照，用凝胶成像分析系统测定各条带灰度值，并取其与1 3 - a c t i n 的比值为相对表达量分析蛋白的表达情况。 ( 七) 统计分析 所有结果采用均数标准差来表示，采用s p s s1 6 0 软件分析数据，资料比较 采用t 检验。检验水准a = 0 0 5 。 结果 一、c o h - 2 - 3 对细胞增殖的影响 顺铂是人们所熟知的一种较强的抗肿瘤药物，在本研究中我们应用m t t 法检 测不同浓度的顺铂和c o h - 2 3 对h l 6 0 细胞增殖的影响。从图中我们可以看出， 药物浓度( 1 - t g m 1 ) 制 计 图2 ，顺铂和c o h 2 3 对h l 6 0 细胞增殖的影响 二、c o h - 2 - 3 对h l 6 0 细胞周期的影响 应用流式细胞术p i 单染检测c o h 2 3 对h l 6 0 细胞周期的影响。阴性对照组 细胞g 2 m 期细胞所占比率为1 5 2 + 1 7 8 ，经1 0 1 t g m lc o h 2 3 作用6 ，1 2 ，2 4 小时后g 2 m 期细胞所占比率分别为6 8 5 + 6 9 4 ，9 0 3 + 5 5 9 ，9 6 5 o 0 6 ，即 在相同药物浓度条件下，随着c o h 2 3 作用时间的延长位于g 2 m 期的细胞比率 越来越大，较阴性对照组比较差异有统计学意义p 0 0 5 ；经o 1 ，0 3 ，1 0 1 t g m l c o h 2 3 处理细胞2 4 小时后g 2 m 期细胞所占比率分别为3 2 7 + 0 0 5 ， 8 8 9 - 1 - 0 0 8 ，9 6 5 o 0 6 ，即在相同药物作用时间条件下，随着药物剂量的增加 位于g 2 m 期的细胞比率越来越大，较阴性对照组相比差异有统计学意义，p 0 0 5 ， 上述结果表明：c o h 2 3 能诱导h l 6 0 细胞阻滞在g 2 m 期并且呈时间和浓度依 赖性( 图3 ) 。 1 2 黾 堇 ； l 黾 i ；i la j一0 1 2 咯 1 0 0 * o 8 咯 6 咯 4 咯 2 伪略 o j j ，1 c o n t r o l 0 1 嵋缸 基蠹 l 三i j 0 3 岖缸 2 嗽 0 0 8 口 6 0 4 0 2 口 啪 誓嘉 器量i 仝j l 0 g m l 061 2弘0o 10 3l 妇 c c 础随l i o n ( 蚵岫 图3 ，流式细胞术p i 单染检测c o h - 2 3 对h l 6 0 细胞周期的影响，p 0 0 5v s 对照组，n = 3 当细胞发生凋亡，凋亡细胞内的d n a 被降解后，小分子的d n a 可通过细胞 膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可以带走部分d n a ，造成了凋亡细胞的d n a 倍体性下降，表现为在正常g 0 g 1 期峰前出现亚二倍体( s u b g l ) 峰，即凋亡峰。 在本实验中，阴性对照组s u b g l 期细胞所占比率为0 0 9 - 2 - 0 0 0 5 ，经1 0 “g m l c o h - 2 3 作用1 2 ，2 4 小时后分别为4 5 8 i - 0 0 1 ，1 4 8 3 ：l - 0 0 2 ；0 1 ，o 3 ，1 0 “g m l c o h 2 3 作用细胞2 4 小时后分别为3 4 i ：l - 0 0 0 5 ，6 6 9 1 - 0 0 0 8 ，1 4 8 3 - 2 0 0 2 ， 药物处理组较阴性对照组相比差异有统计学意义，p 0 0 5 。上述结果我们可以看 出，c o h - 2 - 3 可浓度和时间依赖性的诱导h l 6 0 细胞发生凋亡并且随着细胞阻滞 在g 2 m 期时间的延长凋亡细胞比率逐渐增加( 图3 ) 。 为了进一步确定凋亡的存在，我们利用a o e b 双染色法观察药物处理后细胞 形态学改变。凋亡的固有特征为细胞核的浓缩，裂解和凋亡小体的形成。在本研 究中我们发现，经1 0 1 t g m lc o h 2 3 处理细胞6 ，1 2 ，2 4 小时后，出现了细胞核 的浓缩，裂解和凋亡小体的形成( 图4 ) ，进一步证明了凋亡的存在。 l2 h2 4 h 图4 ，a 0 e b 染色法观察细胞形态学变化，1 0 r t g m lc o h - 2 - 3 处理h l 6 0 细 胞后出现：6 h 核浓缩；1 2 h 核裂解；2 4 h 凋亡小体，标尺：5 0 1 l t m 三、c 0 1 - 1 - 2 - 3 对细胞内微管蛋白聚合作用的影响 微管是细胞内的重要组成成分，在调控细胞周期上发挥着重要的作用。为了 明确微管是否参与了c o h 2 3 诱导的细胞周期阻滞过程，我们应用免疫荧光激光 共聚焦技术观察细胞内b 一微管蛋白( 1 b - t u b u l i n ) 的变化。经1 0 r t g m l c o h 一2 3 处 理h l 6 0 细胞2 4 小时后，我们观察到药物处理组细胞内的正常微管蛋白的结构被 破坏，微管蛋白的聚合作用被抑制( 图5 ) 。本研究结果表明：c o h 2 3 阻滞h l 6 0 细胞在g 2 m 期可能与抑制微管蛋白的聚合有关。 1 4 c l _ - 一 c c u f 7 r a 匕 c 乙 t u b u li n h o e c hs t 图5 ，免疫荧光显微镜下观察细胞内微管的形态学变化，1 0 p g m l c o h 2 3 处理h l 6 0 细胞2 4 小时后，细胞内微管的结构被破坏( 箭头所示) ，标尺：5 0g m 四、g 2 m 期相关蛋白的表达 研究表明，p 3 4 。妣和c y e l i nb 是两个重要的周期相关调节蛋白。本实验结果 表明：c o h 2 3 使细胞内的c y c l i nb 蛋白表达水平明显增强，较阴性对照组相比 差异有统计学意义( p o 0 5 ) ( 图6 a ) 。上述结果表明：c y c l i nb 表达增强 可能是c o h 2 3 阻滞h l 6 0 细胞在g 2 m 期的机制之一。 五、c o h - 2 - 3 诱导细胞凋亡的机制 凋亡是由各种信号途径介导的主动过程。为了明确c o h - 2 3 诱导h l 6 0 细胞 发生凋亡的作用机制，在本实验中我们应用w e s t e r nb l o t 法检测凋亡相关蛋白 e a s p a s e 3 和b c l 2 的表达情况。b c l 2 定位于线粒体外膜在抑制线粒体的表达相关 的凋亡中起到重要的作用。在本研究我们发现经c o h 2 3 处理的细胞b c l 2 表达 下调与阴性对照组相比差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ( 图6 c ) 。此外，为了研究 e a s p a s e s 家族是否参与了c o h 2 3 诱导h l 6 0 细胞的凋亡过程，我们应用w e s t e m b l o t 法检测了c a s p a s e - 3 蛋白的表达情况。经c o h - 2 - 3 处理后细胞内的c a s p a s e - 3 被激活，药物处理组( 0 3 ，l i _ t g m lc o h - 2 - 3 ) 的激活型c a s p a s e - 3 表达明显增强 较阴性对照组相比差异有统计学意义( p w = 4 o o o 口 l 2 p t 昌 10 8 d 1 0 6 n 上 o 4 o o 2 o 0 00 i0 31 0 c o n c e n t r a t i o n ( 吲1 ) 0 00 1o 31 - 0 c o n c e n t r a ti o n ( 心1 ) o o1 0 c o n c e n t r a t i o n ( 吲m 1 ) 图6 ，w e s t e r nb l o t 检测细胞内蛋白表达，p 0 0 5v s 对照组，n = 3 讨论 c o h 2 3 是一种新型的c a - 4 o p z 杂合物，对h l 6 0 细胞表现出非常强的抗 1 6 增殖活性。在本实验中我们主要介绍了c o h 一2 - 3 是如何抑制h l 6 0 细胞增殖的及 其作用机制。通过m t t 法检测我们发现，c o h 一2 - 3 对细胞增殖的抑制作用强于顺 铂对细胞的增殖抑制作用并且呈浓度依赖性；流式细胞术p i 单染结果表明 c o h 2 3 能够使h l 6 0 细胞阻滞在g 2 m 期且诱导其凋亡并且呈时问和浓度依赖 性；a o e b 双染色法观察到经c o h 2 3 处理过的细胞发生了核的浓缩和裂解，进 一步明确了凋亡的存在；通过免疫荧光激光共聚焦检测方法我们观察到药物处理 组细胞的微管蛋白聚合受抑制，这可能参与了c o h 2 3 诱导h l 6 0 细胞阻滞于 g 2 m 期的过程。有研究表明，微管蛋白结合剂能够激活有丝分裂纺锤体检测点， 此检测点