（药物化学专业论文）酿酒酵母pp2c类蛋白磷酸酯酶对线粒体atp酶活性的调控.pdf

摘要 p p 2 c 类蛋白磷酸酯酶家族是一类丝苏氨酸蛋白磷酸酯酶，目前发现由七个 成员组成，分别是p t c l p 、p t c 2 p 、p t c 3 p 、p t c 4 p 、p t c 5 p 、p t c 6 p 和p t c 7 p ，其中p t c 5 p 、 p t c 6 p 和p t c 7 p 定位于线粒体内。文献报道在酿酒酵母线粒体中存在有8 0 个不同的 磷酸化位点【l 】，其中一部分位于线粒体内膜上的a t p 合酶的组成亚基上，a t p 合 酶组成亚基的磷酸化状态影响到了a t p 合酶分子的组装。为了研究p p 2 c 类基因的 缺失对细胞中线粒体a t p 合酶的影响，我们分别研究了p p 2 c 类基因缺失株的表型 以及线粒体a t p 酶活性，结果发现尸z c j 基因的缺失会导致线粒体a t p 酶活性显著 下降，并且在y p d 和y p a 平板上表现出明显的生长缺陷。而p 纪j p 纪5 以及p 幻j p 幻7 双缺失株的a t p 酶活性有不同程度的提升，并且在平板上的生长情况也较雕j 单 缺失株好，表明p t c l 基因分别与p t c 5 和p t c 7 基因之间在调控线粒体a t p 合酶活 性上存在遗传互作。 关键词：酿酒酵母p p 2 c 类蛋白磷酸酯酶a t p 合酶非发酵碳源 a b s t r a c t t y p e2 cp r o t e i np h o s p h a t a s e s ( p p 2 c ) a r ep r o t e i ns e r i n e t h r e o n i n ep h o s p h a t a s e s u n t i ln o w , t h e r ea r es e v e np p 2 cp r o t e i np h o s p h a t a s e si d e n t i f i e di ns a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ， i n c l u d i n gp t clp ，p t c 2 p ，p t c 3 p ，p t c 4 p ，p t c 5 p ，p t c 6 pa n dp t c 7 p p t c 5 p ， p t c 6 pa n dp t c 7 pa r ep r e s e n ti nm i t o c h o n d r i a r e c e n ts t u d i e si n d i c a t et h a tt h e r ea r e8 0 p h o s p h o r y l a t i o ns i t e si nm i t o c h o n d r i a lp r o t e i n sa n dm a n y o ft h e s es i t e sa r el o c a t e di n t h es u b u n i t so fm i t o c h o n d r i a la t ps y n t h a s e t oi n v e s t i g a t et h er e g u l a t i o no fp p 2 c o n m i t o c h o n d r i a la t p a s ea c t i v i t yi ny e a s t ，w ee x a m i n e dt h ea c t i v i t yo fm i t o c h o n d r i o n a t p a s ei nd e l e t i o nm u t a n t so ft h e s ep p 2 cg e n e s o u rr e s u l t si n d i c a t et h a tt h ed e l e t i o n o fp t c lc a nd e c r e a s et h ea c t i v i t yo fa t p a s ea c t i v i t y , w h i c hc o r r e l a t e st h eg r o w t h d e f e c to fp t c lm u t a n tc e l l so ny p da n dy p ap l a t e i na d d i t i o n ，t h ed o u b l ed e l e t i o n m u t a n to fp t c l p t c 5a n dp t c l p t c7d e m o n s t r a t ei n c r e a s e da t p a s ea c t i v i t i e st h a nt h e s i n g l ep t c im u t a n ta n db e t t e rg r o w t hp h e n o t y p e s i nc o n c l u s i o n p t c li si n v o l v e di n t h er e g u l a t i o no fm i t o c h o n d r i a la t ps y n t h a s ea c t i v i t y , a n db o t hp t c 5a n dp t c 7 i n t e r a c tg e n e t i c a l l yw i t hp t cli nt h er e g u l a t i o no fm i t o c h o n d r i a la t ps y n t h a s e a c t i v i t y k e yw o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v 括i a e ，t y p e2 cp r o t e i np h o s p h a t a s e ，a t p s y n t h a s e ，n o n f e r m e n t a t i v ec a r b o ns o u r c e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤鲞盘堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：弦昭l 遗签字日期：如。8 年7 月j 日 l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨鲞盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权鑫鲞盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：飙范 导师签名： 签字日期：厶6 譬年7 月f 日 ， 拍专肥 答字r 期山略年f 7 月f 日 第一章引言 1 1 酵母及酿酒酵母简介 第一章引言 酵母菌是一类主要以单细胞形式存在，以细胞出芽或横裂的方式进行繁殖的 真菌的统称口1 ，是真菌的重要组成部分。 酵母菌一般呈卵圆形、球形或圆柱形，直径约为5 1 01 tm ，细胞壁的成分以葡 聚糖为主。酵母菌具有典型的细胞结构，除了有细胞壁、细胞膜、细胞质之外， 还含有真正的细胞核和线粒体、内质网等细胞器，其细胞核有明显的核膜口1 。酵 母菌通常以出芽方式繁殖。当酵母长到一定大小时，先在细胞的一端( 或两端或 多端) 发生一小突起，并进行核分裂，分裂的核，一个留在母细胞内，一个进入 小突起内，突起膨大而成芽体。以后由于细胞壁的收缩，使芽体与亲体隔离，芽 细胞可以继续生长，成为新个体。如果在母细胞的多个方向出芽，则称为多边芽 殖，这时细胞都是圆形、椭圆形、腊肠形，大多数酵母菌均如此。如果在细胞两 端出芽，称为二端芽殖，此时细胞多为柠檬形。如果在三端出芽，细胞则呈三角 形，这种情况较少。 酵母菌有6 0 个属，约5 0 0 个种，常用于科研的典型菌种有酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ) 、白 念珠菌( c a n d i d aa l b y c a n s ) 等。 酿酒酵母，又称啤酒酵母或芽殖酵母( b u d d i n gy e a s t ) ，属于半知菌亚门， 芽孢菌纲，隐球酵母目，隐球酵母科，酵母属。细胞呈圆形或椭圆形，以出芽方 式生长，能形成子囊孢子。在实验室培养时，绝大部份菌落呈乳白色，表面平滑， 稍显光亮，部份菌株菌落粗糙具皱折口1 。 随着酿酒酵母基因组序列的成功破译，对于酵母的研究已经进入了基因功能 研究的时代。1 9 9 6 年4 月，在国际互联网的公共数据库中公布了酿酒酵母的完整 基因组序列( h t t p ：w w w y e a s t g e n o m e o r g ) ，它被称为遗传学上的里程碑。酿 第一章引言 酒酵母的全基因组序列( 1 2 0 6 8 k b ) 中含大约5 8 8 5 个0 r f s ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) h 1 ，它们分布在1 6 条染色体上，这是人们第一次获得真核生物基因组的完整核苷 酸序列。 1 2 酵母作为模式生物的作用 酿酒酵母细胞具有易于培养、遗传系统相对简单而且清楚等许多优点是研究 真核生物调控的模式生物。酵母作为模式生物的最好例子体现在那些通过连锁分 析、定位克隆然后测序验证而获得的人类遗传性疾病相关基因的研究中，后者的 核苷酸序列与酵母基因的同源性为其功能研究提供了极好的线索，其最直接的作 用体现在生物信息学领域。当人们发现了一个功能未知的人类新基因时，可以迅 速地到任何一个酵母基因组数据库中检索与之同源的功能己知的酵母基因，并获 得功能方面的相关信息，从而加快对该人类基因的功能研究。研究发现，有许多 涉及遗传性疾病的基因均与酵母基因具有很高的同源性，研究这些基因编码的蛋 白质的生理功能以及它们与其它蛋白质之间的相互作用将有助于加深对这些遗 传性疾病的了解。 此外，人类许多重要的疾病是多基因遗传性疾病，揭示涉及这些疾病的所有 相关基因是一个困难而漫长的过程，酵母基因与人类多基因遗传性疾病相关基因 之间的相似性将为我们提高诊断和治疗水平提供重要的帮助。f r a n c o i s e 等研究了 1 7 0 多个通过功能克隆得到的人类基因，发现它们中有4 2 与酵母基因具有明显 的同源性，这些人类基因的编码产物大部分与信号转导途径、膜运输或者d n a 合成与修复有关，而那些与酵母基因没有明显同源性的人类基因主要编码一些膜 受体、血液或免疫系统组分，或人类特殊代谢途径中某些重要的酶和蛋白质。 酿酒酵母作为一种模式生物在实验系统研究方面还具有许多内在的优势。首 先，酵母是一种单细胞生物，能够在基本培养基上生长，使得实验者能够通过改 变物理或化学环境完全控制其生长。其次，酵母在单倍体和二倍体的状态下均能 生长，并能在实验条件下较为方便地控制单倍体和二倍体之间的相互转换，对其 基因功能的研究十分有利。如在单倍体状态下，只需一次基因替换，就能得到某 个特定基因缺失的酵母株；而对于一些缺失后致死的基因，人们可以在二倍体菌 2 第一章引言 株中进行基因替换，然后通过孢子筛选，获得带有基因缺失的单倍体菌株。此外， 酵母的生命周期很适合经典的遗传学分析，使得在酵母1 6 条染色体上构建精细的 遗传图谱成为可能。更重要的是，目前已发展了一些非常有效的技术使得酵母基 因组中6 0 0 0 个基因中的任何一个基因均能被突变的等位基因取代，甚至从基因组 中完全缺失，这种方法具有很高的效率和准确性。 1 3p p 2 c 类蛋白磷酸酯酶 图1 - l丝苏氨酸蛋白磷酸酯酶分类示意图5 】 f i g l - ls e r t h rp r o t e i np h o s p h a t a s e s 可逆的蛋白磷酸化是真核细胞的一个关键调控机制。添加磷酸基团的蛋白激 酶和去除磷酸基团的磷酸酯酶，负责控制其底物的磷酸化状态。真核细胞内有两 个丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酯酶家族p p p 和p p m ，可以使磷酸化的丝氨酸苏氨酸 残基去磷酸化【6 1 。p p p 家族又包括p p l ，p p 2 a 和p p 2 b - - - 个亚组，它们由不同的调 节亚基组合形成各式各样的全酶，这些酶在催化区序列有着高度的保守性。p p p 家族的去磷酸化活性会被抑制子1 、抑制子2 和肿瘤启动子冈田酸抑制，不受二价 阳离子的影响。另一类磷酸酯酶p p m 家族的成员都是单体酶，与p p p 家族的序列 不相关，其中最主要的就是2 c 类蛋白磷酸酯酶( p p 2 c t y p ep r o t e i np h o s p h a t a s e s ) 。 p p 2 c 类蛋白磷酸酶是一类丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶，在细胞内以单体形式存在， 酶催化活性依赖于m 孑+ 或m n 2 + 。p p 2 c 类蛋白磷酸酯酶通过去磷酸化作用负调控 3 第一章引言 蛋白激酶级联信号系统，参与细胞周期、胁迫信号转导、基因转录、蛋白质翻译 及翻译后修饰等细胞活动过程。h 2 0 2 、不饱和脂肪酸、c a 2 + c a m 、脂质信号分 子等均可调节p p 2 c 类蛋白磷酸酯酶的活性。目前发现的p p 2 c 蛋白磷酸酯酶有 p t cl p 、p t c 2 p 、p t c 3 p 、p t c 4 p 、p t c 5 p 、p t c 6 p 和p t c 7 p 。序列分析表明p p 2 c 超家族 的成员有1 1 个保守的基序( m o t i f ) 7 1 。此外，p p 2 c 类蛋白磷酸酯酶催化活性依 赖于m n 2 + 或m 9 2 + ，然而此活性对肿瘤促进因子o a 和p p p 家族的其他抑制剂并不 敏感【8 】【9 】【l o 】。 虽然关于p p 2 c 磷酸酯酶在酵母中的生物学功能方面的报道至今已经有1 6 年 了，但是我们关于它们每个成员的特殊功能及其如何被调节方面的知识还是相当 有限的。被公认的是p t c l p 、p t c 2 p 和p t c 3 p 负调控h o g ( h i g h o s m o l a r i t yg l y c e r 0 1 ) 途径。p t c l p 在维持h o g l p 的基础水平活性和调节渗透压两方面起着显著作用 【1 1 】【1 2 】。p t c l p 缺失后酵母仍能生长，但是在非发酵碳源的利用方面有缺陷，对 r a p a m y c i n 的耐药性降低。p t c 2 p 和p t c 3 p 在高渗透压条件下限制h 0 9 1 p 激酶的最大 活性。p t c 4 p 同样可以将h 0 9 1 p 去磷酸化【8 】。最近发现p t c 5 p 还具有丙酮酸脱氢酶 ( p d h ) 的磷酸酯酶活性，它存在于线粒体中【1 4 】。p t c 6 p 定位在线粒体内膜，与 线粒体自噬( m i t o p h a g y ) 有关，可能参与将线粒体导入自噬体的信号传导过程。 p t c 6 p 缺失后酵母仍能生长，但对r a p a m y c i n 的耐药性降低【l o 】。p t c 7 p 趟g , 存在于线粒 体，它的转录过程受碳源特别是乙醇碳源调节，与氧气不充足条件下的碳源利用 有关【1 4 】。 表1 1p p 2 c 类蛋白磷酸酯酶家族 t a b l el - l t y p e2 cp r o t e i np h o s p h a t a s e 4 第一章言 14 册酶 迄今己知自然界中存在三种类型驱动离子的a t p 酶，即p 型、f 型和v 型。 它们的基本功能是通过水解a t p 提供的能量转运离子，或者是通过离子梯度合 成a t p 。 姥i | 懑 图1 - 2a t p 酶结构示意图 f i g l - 2 t h es t r u c t u r e o f a t p m e p 型a t p 酶来源于英文磷酸化( p h o s p h o r y l a t i o n ) 的字头。这类a t p 酶一般由 单肽链组成，相对分子质量为1 0 0 0 0 0 左右，如c a v - a t p 酶n a + ，k + - a t p 酶的a 亚基等，通过水解a t p ，转运c a 2 + 或n a _ ，k + 。这类酶的作用机制符合e 1 e 2 构象 变化假说。 f 型a t p 酶大量存在于真核细胞中的线粒体内膜上，通过呼吸链复合体i 建立的质子梯度，产生质子推动力( p r o t o n m o t i v ef o r c e ) 用于台成a t p ，因 此称其为f 型a t p 酶，或质子a t p 酶。f 型a t p 酶一般由9 1 2 个亚基组成，它由镶嵌 于膜脂双层部分的f 0 和朝向基质侧的膜外部分f ，构成，一般还认为含有连接f 。 和f o 的柄部如o s c p ( 致寡酶素敏感蛋白) 。f o 的功能是转运质子，主要由1 2 个c 亚基、a 亚基和2 b i f f 基组成；f 1 由3 口亚基、3 阻基、t 亚基、5 亚基和$ 亚基组成。 f i 的功能是合成a t p 。f 型a t p 酶的催化机制是m p a u ld b o y e r 提出的结合变构 ( b u i d i n g - c h a n g e ) 假说：a 亚基和p 亚基交替排列成橘子瓣状啦肛六聚体，而t 亚 基、6 亚基和亚基呈不对称分布。跨膜质子梯度使t 亚基转动，从而带动b 亚基结 第一章引言 构变化，使p 亚基结合a t p 能力变化。 v 型a t p 酶由于主要分布于真菌( f u n g i ) 和酵母的微囊上( v a c u o l e s ) ，因而 叫做v 型a t p 酶。它的功能与f 型a t p 酶刚好相反，是通过水解a t p 释放的能量转 运质子，是致电质子泵( e l e c t r o g e n i cp u m p ) 。v 型a t p 酶还没有三维结构的报道， 但从其亚基的分离、分析以及氨基酸一级序列上看，v 型a t p 酶与f 型a t p 酶属同 源体，与f - 型a t p 酶一样，v - a t p 酶也有膜外部分v l ( 相当于f 1 ) 和跨膜部分v o ( 相 当于f o ) 两部分组成。按亚基相对分子质量从大到小顺序，v l 由3 a 亚基( 相当 于f 型p 亚基) 、3 b 亚基( 相当于f 型a 亚基) 、d 亚基、e 亚基和f 亚基等组成，其 功能是水解a t p ；v o 由9 1 2 个c 亚基等组成，其功能是转运质子。 表1 - 2p 型、f 型和v 型三类a t p 酶的基本性质 t a b l e1 - 2t h eb a s i ci n s t i n c t so fp , fa n dv t y p ea t p a s e a t p 肽链功能催化机制抑制剂例子 酶 p 型单肽链水解a t pe 1 e 2 构象变化v 0 3 。c a 2 + a t p 酶， o u a b a i n n a + ，k + a t p 酶 f 型 多亚基合成a t p结合变构o i i g o m y c i nf o f t a t p 酶 d c c d v 型多亚基水解a t p结合变构n e m ，n 0 3 v - a t p 酶 本课题涉及的a t p 合酶属于f 型a t p 酶，它在细胞里扮演着一个不可或缺的角 色【l6 1 。一般来说，细胞所需的大多数a t p 都是由a t p 合酶产生的。a t p 合酶或称 f o f i a t p 酶，该酶在分离状态下具有a t p 水解酶的活性，在结合状态下具有a t p 合酶的活性。除了线粒体中有a t p 合酶外，植物叶绿体的类囊体和好氧细菌都有 a t p 合酶的同源物，是生物体能量代谢的关键酶。在真核生物中该酶位于质膜或 线粒体内膜上1 1 7 】，参与氧化磷酸化与光合磷酸化反应，在跨膜质子动力势的推动 下催化合成生物体的能量a t p 。 a t p 合酶主要由两部分组成：水溶性的f l 复合体与疏水跨膜f o 部分，f 1 部分 由5 种亚基组成，分别是a 、d 、丫、6 和亚，f 1 有6 个核苷酸结合位点，其中3 个为 催化位点，位于b 亚基上，催化a t p 的合成或水解；它单独存在只具有水解a t p 6 第一引言 的能力，不具催化御合成的活性。f o 嵌合在膜上，是一个蘸水蛋白复合体。形 成一个跨膜质子通道。两者都是分子转动马达，在离体情况下，册水解可驱动 f 1 转动，跨膜质子流则可使f 。进行转动。f o 与f 1 整合后形成a 1 甲合酶具有合成a 1 甲 的功能。 f l 栅酶是现有最小的和最快的转动马达之一【1 羽q ，它是f l f o 脚成酵的 一部分，这种酶负责细胞能量转换，将代谢能转换成细胞能量流a 1 t 。f i - a t p 合 成酶可轻易反方向工作，通过其中央绕周围a3 b3 亚单元转动的y - 亚单元来将 a t p 水解成a d p 和无机磷酸，人们广泛认为流过册酶的f 0 部分的质予以相反 方向驱动转动，导致舯的生物合成刚。在生物学研宄中，常通过测定酶促反应 释放的无机磷量或a 1 p 的减少量以及d h 变化等来测定册酶的活力o i 】阱】。 a t pb i n d i n g 图1 - 3a t p 台酶结构简图 f i g l - 3 t h es t t u c d m m o f a t ps y n t h a s e 1 5 酵母a t p 酶活性研究进展 根据细胞分裂方式的差异，可将酵母分为芽殖酵母租裂殖酵母，前者以酿酒 酵母( s a c c h a z o 邶c e sc e z e v j s l a e ) 为模式生物，后者则以粟酒裂殖酵母( s c h i z o s a c c h a t o m 2 c e s o o z e ) 为模式生物。早在1 9 9 9 年，国内就有对粟酒裂殖酵母质膜 t p 酶的制备及活性测定的相关研究报道酬，而对芽殖酵母的a t p 酶的活性研宄相 关的报道很少。尽管酿酒酵母与集酒裂殖酵母经常被联系在一起，但两者之间在 进化、细胞周期调控以硬与哺乳动物细胞之间的关系上相差很大。而酿酒酵母的 1 _ ! 盆 第一章引言 基因顺序与哺乳动物之间有着很大的相似性，所以有关a t p 酶的研究就显得更加 有意义。 根据国内外相关文献，对a t p 酶水解活性的研究主要根据以下原理：a t p 酶 可催化a t p 水解生成a d p 和无机磷酸，在生物学研究中，常通过测定酶促反应体 系中a t p 的减少量或释放的a d p 和无机磷酸量，以及p h 变化等来测定a t p 酶的活 - h ， 2 4 2 5 1 1 2 6 2 7 o 美国纽约的科学家s e r g i op a d i l l a l o p e za n dd a v i dap e a r c e 于2 0 0 6 年发表在 j b c 上的一篇研究论文【2 引，报道了当酿酒酵母缺失掉b t n i p 后，细胞通过调控液 泡膜上的a t p 酶的活性来维持液泡内的p h 平衡，并通过磷钼蓝比色法测定了液泡 膜上a t p 酶的活性，采用了叠氮化钠作为抑制剂加入到反应体系中，来抑制线粒 体中a t p 酶的活性；加入钒酸钠作为抑制剂来抑制质膜上旷a t p 酶的活性；加入 钼酸铵来抑制酸性磷酸酶的活性。 美国佛罗里达州科学家m i n gl u 、y u r iys a u t i n 、l s h a n n o nh o l l i d a y 和 s t e p h e nl g l u c k 等人，发表在j b c 上的一篇关于酿酒酵母中糖酵解酶二磷酸果糖 酶调控液泡膜上h + - a t p 酶的亚基的表达、组装以及活性的研究【2 3 1 ，也同样用了 上述方法测定a t p 酶的活性。 除了采用定磷法来研究a t p 酶的活性外，相关的方法中用的比较多的是孔雀 绿比色法【2 9 1 ，但是在本课题的工作中发现，孔雀绿这种染料本身的颜色很深，会 造成背景颜色过重，不容易观察体系发生的细微变化，另外在操作过程中容易产 生绿色的沉淀，所以此方法有一定的局限性。 1 6 本论文的研究内容 利用蛋白组学的手段分析表明【l 】，酿酒酵母线粒体蛋白中存在很多不同的磷 酸化位点，这些位点的磷酸化或者去磷酸化状态直接影响到了蛋白质分子在细胞 内的生物学活性。其中，位于线粒体内膜的a t p 合酶的a 亚基在1 7 8 位和5 7 位有两 个丝氨酸磷酸化位点；b 亚基在3 7 3 位有丝氨酸磷酸化位点，在2 3 7 位和i1 2 位有 苏氨酸位点；y 亚基在6 2 位和3 位有两个丝氨酸磷酸化位点；6 亚基在2 1 位有丝 氨酸磷酸化位点，亚基的5 2 位有苏氨酸磷酸化位点，这些丝苏氨酸残基的磷酸 第一章引言 化或者去磷酸化状态直接影响到了a t p 合酶分子的组装，进而会影响a t p 酶的活 性。而p p 2 c 类蛋白磷酸酯酶家族是一类丝苏氨酸蛋白磷酸酯酶，包括七个成员 p t c l p 、p t c 2 p 、p t c 3 p 、p t c 4 p 、p t c 5 p 、p t c 6 p 、p t c 7 p ，其中p t c 5 p 、p t c 6 p 和p t c 7 p 定 位于线粒体内，它们可以将蛋白质分子中磷酸化的丝苏氨酸残基去磷酸化，从 而影响蛋白质在生物体内的生物学活性。 有氧条件下，酿酒酵母既可以利用发酵型碳源进行糖酵解和三羧酸循环氧 化磷酸化产能，也可以利用非发酵型碳源通过乙醛酸途径产能。为进一步研究 p p 2 c 类的蛋白磷酸酯酶在影响线粒体a t p 酶活性方面的作用，我们分别在发酵型 培养基y p d 和非发酵型培养基y p a 上测定了p p 2 c 类缺失株中线粒体a t p 酶的活 性。酶活性测定结果显示，无论是在发酵型培养条件下，还是在非发酵培养条件 下，细胞缺失掉尸彤j 基因，均会发生线粒体a t p 酶活性的显著降低，而在缺失 尸乃珀勺基础上，同时缺失掉p t c 5 和或p t c 7 ，a t p 酶活性会有不同程度的提升， 说明在维持细胞中a t p 酶活性方面，p t c i 起着非常重要的作用，p t c i 与p t c 5 、 p t c 7 ：l 间存在遗传互作。此外，我们还进行了p p 2 c 类的缺失株在y p d 和y p a 上 的表型检测。 本论文研究工作主要分以下几部分： 1 、将p p 2 c 类的单基因、双基因和三基因缺失株分别在液体y p d 和y p a 中大量 培养后收集细胞。 2 、采用差速离心和蔗糖密度梯度离心的方法提取和纯化线粒体，得到高纯 度的线粒体样品。 3 、采用w e s t e r nb l o t 的方法检钡j j a t p 合酶中b e t a 亚基的相对表达量，并以此 衡量线粒体样品中的a t p 酶的相对含量。 4 、测定细胞线粒体中a t p 酶的活性。 5 、分别在发酵型培养基y p d 和非发酵型培养基y p a 上检测p p 2 c 类的单基因、 双基因和三基因缺失株的表型。 9 第一章实验材料和方法 2 1 实验材料 2 1 1 实验菌种 第二章实验材料和方法 表2 1 本实验中用到的菌株 t a b l e 2 1s t r a i n su s e di nt h i sw o r k 菌株编号 菌株名称 基因型来源 b y 4 7 4 l l h s c l o l l h s c 2 0 2 l h s c 。3 0 3 l h s c 4 0 4 l h s c 5 0 l l h s c 6 0 1 l h s c 7 0 7 l h s c 7 1 0 2 l h s c 7 2 0 2 1 ll h s c 7 3 0 2 l h s c 7 4 0 5 1 3l h s c 7 5 0 2 l h s c 7 6 0 4 1 5l h s c 7 5 l o l m a t ah i s 3 dil e u 2 a om e t l s d ou r a 3 a o b y 4 7 4 l ；p t c l 厶；k a n m x 4 b y 4 7 41 ；p t c 2 厶 k a n m x 4 b y 4 7 4 1 ：p t c 3 4 ；k a n m x 4 b y 4 7 4l ；p t c 4 厶： k a n m x 4 b y 4 7 41 ：p t c 5 4 ：k a n m x 4 b y 4 7 4 1 ；p t c 6 , 4 , , k a n m x 4 b y 4 7 4 1 ；p t c 7 , 4 ：k a n m x 4 b y 4 7 4 1 ；p t c l 厶；k a n m x 4p t c 7 厶 ；k a n m x 4 b y 4 7 4 1 ；p t c 2 厶；k a n m x 4p t c 7 厶：k a n 脚 b y 4 7 4 1 ；p t c 3 厶；k a n m x 4p t c 7 厶：k a n m x 4 b y 4 7 4 1 ；p t c 4 , 4 ：k a n m _ x 4p t c 7 厶? ：k a n m x 4 b y 4 7 41 ；p t c 5 厶：k a n m x 4p t c 7 厶：k a n m x 4 b y 4 7 41 ；p t c 6 , 4 k a n m x 4 p t c 7 ；k a n m x 4 b y 4 7 4 1 ：p t c l 厶 ：k a n m x 4p t c 5 厶 k a n m x 4 ，p t c 7 , 4 ； k a n m x 4 1 0 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 实验室保存 l 2 3 4 5 6 7 8 9 第一章实验材料和方法 l h s c 5 1 0 1 b y 4 7 4 1 ；p t c l z 3 ：k a n m x 4p t c 5 实验室保存 厶： k a n m x 4 l h s c 5 6 0 6b y 4 7 41 ；p t c 5 z ：k a n m x 4 p t c 6 实验室保存 a ：k a n m x 4 l h s c 5 6 7 0 1 b y 4 7 4 1 ；p t c 5 a ：k a n m x 4p t c 6 实验室保存 丝! 丝型：2 丝! 垒! 塑丝望 2 1 2 实验用主要仪器 表2 2 本实验中用到的主要仪器 t a b l e 2 - 2 i m p o r t a n ta p p a r a t u su s e di nt h i sw o r k 第一章实验材料和方法 2 1 3 实验用主要试剂 表2 3 本实验中用到的主要试剂 t a b l e 2 3 i m p o r t a n tm a t e r i a l su s e di nt h i sw o r k 药品名称生产厂家 纯度 氢氧化钠 e d t a 无水乙醇 异丙醇 盐酸 冰醋酸 葡萄糖 甘油 酸洗玻璃珠 琼脂粉 蛋白胨 琼脂糖 酵母提取物 s d s t r i sb a s e 过硫酸铵 d t t t e 姬d 聚丙烯酰胺 甲叉一双丙稀酰胺 1 3 一巯基乙醇 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 上海y i t o 生物试剂有限公司 o x o i dl t de n g l a n d 联星生物 n o v o n 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 北京鼎国生物技术发展中心 b b l 分装 上海生工生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 1 2 a l l * b r * a r 牛 a r 木 a r 木 a r 木 b r * a r ：l c b r ，i c b r 木 b r * b r 木 b r ：i c b r * b r * a r 木 b r 木 b r 木 b r * b r * b r * 第一章实验材料和方法 溴酚兰 p r o t e i ns t a n d a r d 甘氨酸 甲醇 脱脂奶粉 吐温- - 2 0 一抗 二抗 显色底物 显影液 定影液 无水乙酸钠 抗坏血酸 钼酸铵 碳酸钠 酒石酸锑氧钾 硫酸 磷酸二氢钾 磷酸氢二钾 蔗糖 s o r b i t o l p m s f b s a m o p s s n a i l a s e 一 淝s a t p n a l 2 氯化钾 硫酸镁 硝酸钾 钒酸钠 上海生工生物工程有限公司 晶美生物工程有限公司 上海生工生物工程有限公司 天津市光复精细化工研究所 雀巢脱脂奶粉 天津市光复精细化工研究所 天津润泰生物工程有限公司 天津润泰生物工程有限公司 p i e r s e 柯达 柯达 天津市化学试剂一厂 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 天津市光复精细化工研究所 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津市化学试剂一厂 天津科密欧化学试剂开发中心 天津鼎国生物 天津华生生物 s i g m a 天津华生生物 s i g m a 天津华生生物 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂 b r * b r * b r 木 a r 宰 b r * b r * b r * b r 木 b r * b r * b r * a r 水 a r 木 a r 木 a r 木 a r 木 a r 木 a r * a r ，i c a r 木 a r ：l c b r * b r * b r 水 b r * b r * b r 宰 a r ，i c a r 木 a r ，i c a r ，i c a r 唪：分析纯，b r 水：生化试剂 1 3 第一章实验材料和方法 2 1 4 实验用主要培养基 y p d 培养基：蛋白胨2 0 9 ，葡萄糖2 0 9 ，酵母提取物1 0 9 ，溶于1l 双蒸 水。固体培养基外加2 0 9 琼脂粉。0 1 m p a 灭菌2 0 m i n 。 y p a 培养基：蛋白胨2 0 9 ，无水乙酸钠2 0 9 ，酵母提取物1 0 9 ，溶于1l 双 蒸水。固体培养基外加2 0 9 琼脂粉。0 1m p a 灭菌2 0 m i n 。 2 1 5 实验用溶液及缓冲液的配制 提取线粒体所用b u f f e r a ： 成分及终浓度配置1 l 溶液各成分的用量 1 0 0 r a mt r i s i 七s 0 , 1 2 11 4 9t r i sb a s e ，i - h s 0 4 调p h = 9 4 1 0 m md t t 1 2 0 2 5 m l4 m 明盯 加水定容到1 l 提取线粒体所用b u f f e r b ： 成分及终浓度配置ll 溶液各成分的用量 1 2 ms o r b i t o l 2 0 m mp o t a s s i u mp h o s p h a t e ， ( p h = 6 8 ) h 2 0 2 1 8 6 0 4 9 k 2 h p 0 4 1 3 9 5 4 8 9 ， k h 2 p 0 4 2 6 9 2 8 9 加水定容至l l 提取线粒体所用b u f f e r c ： 成分及终浓度 配置o 5 l 溶液各成分的用量 10 m m t r i s - h c l ，p h 7 4 0 6 ms o r b i t o l l m me d 历 1 m m p m s f 5 0 m l10 0 m mt r i s h c l 5 4 8 0 1 9 l m l0 5 me d t a 5 m ll0 0 m m p m s f 0 2 ( w v ) b s a l g h 2 0加水4 4 4 m l 提取线粒体所用b u f f e r d ： 1 4 第一章实验材料和方法 成分及终浓度配置0 i l 溶液各成分的用量 2 5 0 r a ms u c r o s e 10 m m m o p s ，p h 7 2 1 m m e d l a h 2 0 4 5 5 4 3 9 l o m ll o o m m m o p s l o m l1 0 m m e d l a 8 0 m 1 提取线粒体所用b u f f e r e ： 成分及终浓度 配置0 1 l 溶液各成分的用量 2 5 。c 下0 i m o l ! 磷酸钾缓冲液的配制： 考马斯亮蓝( c o o m a s s i eb r i l l i a n tb l u e ) 试剂的配制： 成分及终浓度配置l l 溶液各成分的用量 考马斯亮蓝g 一2 5 0 9 5 乙醇 8 5 磷酸 水 0 i g 5 0 m l 1 0 0 1 8 5 0 m l 1 5 第一章实验材料和方法 注：溶解混匀后用滤纸过滤。 标准蛋白质( b s a ) 溶液的配置：称量b s a 固体1 0 m g 溶解于l m l 的水中， 得到10 u g u l 的溶液作为标准贮液。 1 m l2 s b 配制： 成分及终浓度 配置i m l 所需各成分的用量 l mt r i s c 1p h 6 8 8 0 甘油 1 0 s d s 1 3 一巯基乙醇( 后加) 1 0 0 x 溴酚兰( b b ，后加) d d 也0 1 2 5 u i 2 5 0 u i 4 0 0 u l 5 0 u l 1 0 u l 1 6 5 u l lox e l e c t r o p h o r e s i sb u f f e r ( r u n n i n gb u f f e r ，t o of o rt r a n s f e rb u f f e r ) ： 1 成分及终浓度 配置l l 所需各成分的用量 2 5 0 m mt r i sb a s e 1 9 2 m 甘氨酸 0 1 s d s 水 3 0 3 9 1 4 4 9 1 9 加水至1 l i o xr u n n i n gb u f f e r 甲醇 d m 0 1 0 0 m l 2 0 0 m l 7 0 0 m l 注：混匀后在4 c 保存! t r a n s f e rb u f f e r 至少可以用两次。 1 0 t b sb u f f e r ： 成分及终浓度 配置l l 所需各成分的用量 2 0 0 m mt r i sb a s e 1 3 7 mn a c l d d h 2 0 2 4 2 9 8 0 9 用h c l 调p h = 7 6 ，然后加水至9 0 0 r a l 1 6 第一章实验材料和方法 w a s h i n gb u f f e r ( t b s tb u f f e r ) ：0 0 5 - 0 1 t w e e n - 2 0 ( v v ) i n1 t b s ( a d d 0 5 1 m lt w e e n - 2 0i n1 l ，用0 5 m l 即可) b l o c k i n gb u f f e r ：在w a s h i n gb u f f e r 加入5 的脱脂奶粉( 即1 0 0 m lt b s t + 5 9 脱脂奶粉) 一抗杂交液：在w a s h i n gb u f f e r 加入5 的脱脂奶粉+ 一抗 二抗杂交液：在w a s h i n gb u f f e r 加入5 的脱脂奶粉+ 二抗 显影液：1 4 5 l 水加入o 5 l 溶液a 混和均匀再加入2 0 4 m l 溶液b 混和均匀， 然后加入1 8 2 m l 溶液c 混和均匀。 定影液：1 4 5 l 水加入0 5 l 溶液a 混和均匀再加入4 6 m l 溶液b 混和均匀。 3 0 聚丙烯酰胺贮液：3 0 9 聚丙烯酰胺，0 8 9 甲叉一双丙稀酰胺，加入双蒸 水至1 0 0 m l ，过滤贮存于4 度。 浓缩胶缓冲液：0 5m o l lt r i s h c l ，p h 6 8 ，过滤贮存。 分离胶缓冲液：1 5m o l lt r i s h c l ，p h 8 9 ，过滤贮存。 1 0 过硫酸胺溶液：临用前用蒸馏水配制。 1 0 s d s 溶液：称取1 0 9 s d s 溶解于1 0 0 m l 水中，灭菌后作为贮液用，室温 保存。 1 0 分离胶的制备： 浓缩胶 3 0 胶储液 浓缩胶缓冲液 0 6 8 m l 0 4 8 m l 第一章实验材料和方法 水 1 0 s d s a p t e m e d 2 8 m l 5 0 u l l o u l 5 u l s t r i p p i n gs o l u t i o n 的配制： 成分及终浓度配制0 1 l 所需各成分的用量 2 5 m mg l y ci n e h c lp h = 2 1 ( 衫v ) s d s 水 0 1 8 7 7 9 1 9 加水至0 i m l p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i