（植物学专业论文）ros和离子通道在eatp调控蚕豆气孔运动过程中的作用.pdf

学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文( s r 2 + c a 2 + m 矿+ m n 2 + ，在正常的膜电压水平下这类通道主要处于关闭状态，只有 质膜去极化时才开放。 到2 0 0 0 年左右，人们利用膜片钳技术在植物细胞质膜上又检测到了超极化激活的 c a 2 + 通道。1 9 9 7 年，g e l l i 和b l u m w a l d 在番茄悬浮培养细胞质膜上发现了超极化激活 的内向c a 2 + 通道，该通道对c a 2 + 具有强选择性，其活性受l a 3 + 或尼群地平强烈抑制。随 后在保卫细胞和叶肉细胞( p e i 等，2 0 0 0 ；h a m i l t o n 等，2 0 0 0 ；m u r a t a 等，2 0 0 1 ；s t o e l z l e 等，2 0 0 3 ) 上也发现了质膜超极化激活的c d + 通道。人们还发现，可通过调节超极化激 活的钙通道活性来控制保卫细胞内的c a 2 + 浓度，进而调控气孔运动( w h i t e ，2 0 0 0 ；b l a t t ， 2 0 0 0 ；s c h r o e d e r 等，2 0 0 1 ；m u r a t a 等，2 0 0 1 ：k 6 h l e r 和b l a t t ，2 0 0 2 ) 。 在拟南芥( w a n g 等，2 0 0 4 ) 和川百合( s h a n g 等，2 0 0 5 ) 花粉细胞质膜上都检测 到了超极化激活的c a 2 + 通道。w h 等( 2 0 0 7 ) 实验结果表明，拟南芥中的超极化激活的 c a 2 + 通道对二价阳离子的通透性顺序为b d + c a 2 + m g + m n 2 + ，其活性受到无机抑制剂 l d + 、a 1 3 + 、g a 3 + 的强烈抑制；q u 等( 2 0 0 7 ) 在梨花粉细胞的膜片钳实验中得到了类似 的结果。 随着膜片钳技术的日益成熟，并结合其他生物研究手段，为细胞信号转导的研究提 供了可靠的证据，在植物逆境胁迫信号以及植物对病虫害侵袭的防御反应研究中也取得 了较大成功。s h a b a l a 等( 2 0 0 6 ) 以拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) 根为材料，利用膜片 钳技术测定其根细胞原生质体质膜内向k + 电流，并对n a + 对其k + 电流的影响进行的研究 发现，n a + 可明显抑制拟南芥根细胞原生质体的内向1 0 电流；外施c a 2 + 可缓解n a + 对内向 k + 电流的抑制。说明c a 2 + 参与了质膜上k + 通道对k + 和n a + 的选择性吸收的调节，从而使 植物适应盐胁迫。 1 0 引言 气孔是植物体内散失水份和吸收二氧化碳的主要门户，气孔的开关能够精确的调节 植物体内的含水量，对植物的水分代谢的调控至关重要。气孔运动受保卫细胞膨压调节， 保卫细胞膨压可由多种信号调控，当气孔保卫细胞质膜上的受体感受到外界信号( 光、 温度、水、c 0 2 、伤害等) 或植物自身信号( r o s 、a b a 、生长素等) 刺激时，这些信 号诱导产生胞内信息第二信使( c a 2 + 、i p 3 、c a m p 等) ，进而激活质膜上的多种离子通 道( c a 2 + 、k + 、c 1 + 通道等) 和与信号转导相关的酶类( 蛋白激酶、蛋白磷酸酶) ，通过 不同的信号途径调控气孔运动。 a t p 分子在细胞的线粒体和细胞基质中，作为重要的能源物质而广泛存在，参与了 多种生理生化反应，在细胞新陈代谢过程中发挥重要的作用。上世纪七十年代，人们注 意到a t p 可以作为一种信号分子在生理反应中起作用，植物细胞外a t p 在细胞信号转 导过程中的地位和作用逐渐引起了人们的关注，并取得了一定的研究成果，已有研究表 i 明e a t p 在维持细胞活力和调节基因表达方面发挥着重要的作用。还有研究发现外加 a t p 可以促进鸭跖草叶片气孔开放，但使用的外源a t p 浓度大都在毫摩尔水平，远远 高于细胞内正常的a t p 水平，所以当时并不认为a t p 是作为胞外信号分子起作用的。 通过2 0 0 9 年本实验室郝立华对外源a t p 对拟南芥气孔运动影响的研究发现，e a t p 确 实作为一种信号分子调节气孔运动，但是并没有研究离子通道在e a t p 调节气孔运动过 程中的作用，及其与其他信号组份之间的关系。因此，为进一步研究e a t p 对气孔运动 的影响及其可能的信号转导机制，本研究以蚕豆( v i c i a f a b a ) 为材料，研究了e a t p 在 蚕豆气孔运动过程中发挥的作用及其信号转导机制，重点研究离子通道和活性氧在 e a t p 调控气孔运动过程中的作用。 材料与方法 1实验材料 1 1 植物材料 本实验所用植物材料为蚕豆( h c i af a b a ) 。 1 2 化学试剂和酶试剂 化学试剂：a t p - n a 2 、a d p - n a 2 、a m p 、a d e n o s i n e 、a t p y s 、2 m e a t p 、b z a t p 、二 硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t o l ，d t t ) 、二亚苯基碘( d i p h e n y l e n e i o d o n i u m ，d p i ) 、地而流卓 ( d i l f i a z e m ) 、氯化钆( g d c l 3 ) 、t e a ( 氯盐) 、氯化钙( c a c l 2 ) 、氯化钾( k c l ) 、均购 自s i g m a 公司；氯化镧( l a c l 3 ) 、氯化铝( a 1 c 1 3 ) 、氯化钡( b a c l 2 ) 、氯化铯( c s c l ) 、 氯化镁( m g c l 2 ) 均使用国产分析纯试剂；m e s ( a m r e s e o ) 、葡萄糖酸钙( s i g m as tl o u i s ， m o ，u s a ) 、葡萄糖酸钾( s i g m a s tl o u i s ，m o ，u s a ) 、p v p 4 0 ( s i g m as tl o u i s ，m o ， u s a ) 、v c ( s i g m as tl o u i s ，m o ，u s a ) 、m g - a t p ( s i g m as tl o u i s ，m o ，u s a ) 、 i r i s a t p ( s i g m as tl o u i s ，m o ，u s a ) ；h e p e s ( n o v a g e n ) 、b s a 、山梨醇、t r i s 、c a ( o h ) 2 、 k h 2 p 0 4 、e g t a 等均为国产分析纯试剂。 酶试剂：腺苷三磷酸双磷酸酶( a p y r a s e ) 、葡萄糖己糖激酶( h e x o k i n a s e ) 、纤维素 酶c e l l u l y s i n ( c a l b i o c h e m ，l aj o l l a ，c a ，u s a ) 、纤维素酶o n a z u k ar sc e u u l a s e ( y a k u l t h o n s h a ，t o k y o ，j a p a n ) 、果胶酶y - 2 3 ( s e i s h i np h a r m a c e u t i c a l ，t o k y o ，j a p a n ) 。 2 实验方法 2 1 蚕豆的培养 蚕豆种子经表面( 0 1 的h g c l 2 ) 消毒后，在培养皿中浸泡4 6 d 使其萌芽，将其播 种在蛭石+ 营养土( 比例为1 ：2 ) 混合的培养基质中，置于光照培养室中培养。培养条 件：温度为2 2 1 8 c ，光暗周期为1 6 8 h ，光照强度为1 2 0 - 1 3 0 p , m o l m l s ，相对湿度为 7 0 。取生长3 4 周幼苗顶端完全展开的叶子进行实验。 2 2 蚕豆叶片气孔开度的检测 采集生长良好的3 4 周龄、顶端完全展开的蚕豆叶片( 第二对以上的叶片) ，撕取 带有保卫细胞的下表皮，用毛笔轻轻刷去残余的叶肉细胞，然后将表皮条于室内光照条 件下进行不同的药剂处理。以放置于基本缓冲液( 5 0 m m o l lk c l ，o 1 m m o l lc a c l 2 ， 1 0 m m o l lm e s ，p h 值用t r i s 调至6 1 啦6 1 5 ) 中的表皮条为对照组。检测不同药剂对 1 2 药剂溶解于基本缓冲液，然后将表皮条放于含有待测药 照组进行比较。将处理好的表皮条制成装片至于光学显 微镜( m o t i c 型号b 1 ) 载物台上，观察气孔运动的情况，记录气孔孔径，测量两个保 卫细胞内侧细胞壁边缘之间的最大距离作为气孔开度的数据，每组实验测量三个表皮 条，每个表皮条测量1 0 个气孔，实验重复4 次，求取平均值。n = 1 2 0 。 2 3 原生质体的制备 为了得到良好、健康可供膜片钳实验使用的原生质体，本实验采用两步酶解法制备 原生质体。 溶液成分： 基本溶液：5m m o l lm e s ，o 5m m o l lm g c l 2 ，o 5m m o l lc a c l 2 ，1 0l x m o l lk h 2 p 0 4 ， 0 5m m o l l v c ，用t r i s 调节p h 值至5 5 ，0 4 5m o l l 山梨醇调节溶液渗透压。用f m 8 p 型全自动冰点渗透压计将渗透压调至5 0 0 m o s m k g 。 酶解溶液1 ：在5 5 ( v v ) 基本溶液和4 5 ( v v ) 去离子水的混合组分中加入o 7 纤维素酶( c a l b i o c h e mc e l l u l y s i n ) ，0 1 ( w v ) p v p 一4 0 ，0 3 ( w v ) b s a 。 酶解溶液2 ：在基本溶液中加入1 5 ( w v ) o n o z u k ar sc e l l u l a s e ，0 2 ( w v ) p e c t o l y a s ey - 2 3 ，o 3 ( w v ) b s a 。 从3 - 4 周生长期的蚕豆植株上取幼嫩但已充分伸展的2 片叶子，放入冷的蒸馏水中， 撕取带有保卫细胞的下表皮，用毛笔轻轻刷去残余的叶肉细胞，将表皮条收集到载玻片 上用刀片将其切成小段，然后移入含有2m l 酶解溶液1 的1 0m l 小烧杯内，放在2 7 摇床上快速振荡( 1 5 0r p m ) 4 0m i n 。然后，加入5m l 基本溶液并继续快摇5m i n 。再 将表皮收集到2 2 0l x m 尼龙筛上并用基本溶液充分冲洗。将冲洗后的表皮转移至含有2 m l 酶解溶液2 的小烧杯内，黑暗下2 2 * ( 2 慢摇( 1 1 0r p m ) 1 0m i n 之后，将转速降至7 0 r p m 继续慢摇1 0 m i n ，之后用1m l 移液器，轻轻吸起表皮并轻轻释放，重复l o 次，继续慢 摇5 m i n 。取出样品并观察酶解的程度，直到原生质体完全圆滑，一些已开始从气孔中 移出为止。然后用4 0l x m 尼龙筛将第二次消化的混合液过滤( 这可让保卫细胞原生质体 通过) 到5m l 的离心管内，用基本溶液冲洗至5m l 体积。8 0 0r p m 离心5 m i n ，仔细吸 出上清液，在管底留下o 5 1m l ，轻弹管壁使原生质体小团重新悬浮起来，用基本溶液 重新装满。再8 0 0r p m 离心5m i n 后，小心吸出上清液，在管底留下约0 5 m l 的体积， 轻弹使小团重新悬浮，将离心管置于冰盒中，作为膜片钳实验材料。 2 4 保卫细胞原生质体质膜钙通道的检测 2 4 1 溶液成分 检测蚕豆保卫细胞原生质体质膜钙通道活性的溶液成分： 细胞浴液成分：l o m m o l l 葡萄糖酸钙，5m m o l l m e s ，t r i s 调节p h 值至5 5 ，0 5 m o l l 山梨醇调节渗透压。用f m 8 p 型全自动冰点渗透压计将渗透压调至5 8 0 m o s m k g 。 电极内液成分：0 5m m o l lc a c l 2 ，4m m o l lc a ( o h ) 2 ，2m m o l l m g - a t p ，0 5m m o l l i r i s a t p ，1 0m m o l le g t a ，1 5m m o l lh e p e s ，p h 7 o l ( 由 i r i s 校定) ，0 4 7 m o l l 山梨 醇调节渗透压。用f m 8 p 型全自动冰点渗透压计将渗透压调至5 7 0 m o s m k g 。 2 4 2 膜片钳记录与分析 在样品池内加入2 0 i x l 保卫细胞原生质体悬浮液，静置5 m i n ，然后加入8 0 0 i t l 细胞 外液，再静置5 m i n ，选择大小较均匀、良好、健康的原生质体用于全细胞记录。 玻璃微电极使用硅硼玻璃管( i b l 5 0 f - 4 ) ( w o r mp r e c i s i o ni n s t r u m e n t si n c ，u s a ) 由水平拉直仪( p u l l e r ) 两步法拉制而成，灌注电极内液后的电阻约为6 0 - - 9 0 m f 2 。全细 胞与电极间的高阻封接一般在1 m i n 内形成，然后利用电击或加大负压而使电极顶端的 细胞膜破裂以形成全细胞记录方式，全细胞方式的封接电阻不小于1 g o 。形成全细胞封 接后，利用放大器附加装置进行串联电阻补偿和电极及细胞电容补偿。记录软件为 p c l a m p ( v e r s i o n9 ，a x o ni n s t r u m e n t s ，f o s t e rc i t y ，c a ，u s a ) ，信号放大器为 a x o n p a t c h 2 0 0 b ( a x o ni n s t r u m e n t s ，f o s t e rc i t y ，c a ，u s a ) 。实验在室温( 2 2 ) 条 件下进行。全细胞数据采集速率为l k h z ，经l k h z 低频通透滤波器过滤后存入计算机。 每个处理记录5 个细胞，采用电压钳方式( 包括s t e p 和r a m p 两种) 记录，对记录到的 5 个细胞求取平均值，做出i v 曲线。这两种记录方式均是考察细胞质膜在一定的电压 条件下的通透性的变化，两者之间可相互印证，由这两种方式得到的i v 曲线是吻合的。 本实验采用的是步进式( s t e p ) 电压钳方式。 2 4 3 钙通道电生理学特征检测方法 选择大小较均匀、良好、健康的原生质体用于全细胞记录。对钙通道电生理学特征 的检测主要包括三个方面。一是利用记录尾电流的方法来计算该通道的逆转电位。二是 当记录到全细胞的钙电流时，在样品池中加入a t p 使其终浓度达到3 0 0 9 m o l l ，记录 a t p 对钙通道电流的影响。三是将2 0 9 l 保卫细胞原生质体悬浮液置于含有相应浓度的 d p i 或d t t 的细胞外液中，在记录到全细胞的钙电流时，再向样品池中加入a t p ，观 察d p i 和d t t 对我们检测到的钙通道电流是否有作用。以上三个部分的检测每个处理 1 4 记录5 个细胞，对得到的处理前和处理后的电流图进行统计学分析，做出i v 曲线图进 行比较。 2 5 保卫细胞原生质体质膜钾通道的检测 2 5 1溶液成分 检测蚕豆保卫细胞原生质体质膜钾通道活性的溶液成分： 细胞浴液成分：1 0m m o l lh e p e s ，1 0 m m o l l 葡萄糖酸钾，l m m o l lc a c l 2 ，4m m o l l m g c l 2 ，k o h 调节p h 值至6 0 ，0 4 3 m o l l 山梨醇调节渗透压。用f m 8 p 型全自动冰点 渗透压计将渗透压调至5 8 0 m o s m k g 。 电极内液成分：1 0m m o l lh e p e s ，9 8m m o l l 葡萄糖酸钾，2m m o l lk c l ，2m m o l l e g t a ，2m m o l lm g a t p ，k o h 调节p h 值至7 2 ，0 3 m o l l 山梨醇调节渗透压。用 f m 8 p 型全自动冰点渗透压计将渗透压调至5 7 0 m o s m k g 。 2 5 2 钾通道的膜片钳记录与分析与钙通道电生理学特征检测方法 如同以上钙通道部分( 2 4 3 ) 。 2 6 激光共聚焦显微技术( c l s m ) 测定保卫细胞内r o s 的变化 2 6 1 荧光染料的负载 选取生长良好的蚕豆幼苗顶端完全展开的叶片，撕取下表皮，用毛笔轻轻刷去残存 的叶肉细胞，置于5 0 9 m o l l 的h 2 d c f d a 溶液( 5 0 m m o l lk c l ，0 1 m m o l lc a c l 2 ， 1 0 m m o l lm e s ，p h 值用t h s 调至6 1 晰1 5 ) 中，常温黑暗孵育1 5 分钟左右，缓冲液 ( 5 0 m m o l l k c l ，0 1 m m o l l c a c l 2 ，1 0 m m o l l m e s ，p h 值用 i r i s 调至6 1 肛6 1 5 ) 多次冲 洗，洗掉残存的荧光染料。 2 6 2 激光共聚焦显微镜记录保卫细胞内r o s 的变化 处理好的表皮条置于显微镜下观察，首先在荧光镜下找到目标，用激光共聚焦显微 镜扫描，激发波长为4 8 8 n m ，发射波长为5 3 5 n m ，在t i m e c o u r s e 下记录荧光变化的图 像及数据。待扫出平稳曲线后( 1 5 0 s 左右) ，加入不同的药物处理，继续记录荧光变化图 像及数据。利用c o n f o c a la s s i t a n t 和p h o t o s h o p 7 0 软件进行图像处理。 结果与分析：口7 卜一，j1 7 l 1 细胞外a t p 在气孔运动过程中的作用 1 1 外加a t p 对蚕豆气孔运动的影响 为了确定e a t p 在气孔运动过程中的作用，我们首先外加不同浓度的a t p 对蚕豆叶 片表皮条进行处理，观察其对气孔开度的影响。根据本实验室在拟南芥研究中的经验， 我们选用3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 、1 0 0 0i t m o l l 四种不同浓度的a t p 处理蚕豆叶片表皮条，测 量处理后3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0 分钟时的气孑l 孔径。经3 0 0 i r t m o l l a t p 处理后，不同的时间 的气孔开度分别为6 5 0 、7 3 2 、7 5 6 、7 7 9 m n ，分别为对照的1 0 8 、1 0 8 、1 0 7 、1 0 8 ( 图2 a ) ；经4 0 0 p m o l l a t p 处理后不同时间的气孔开度为6 6 6 、7 4 9 、7 5 7 、8 0 1 i t m ， 分别为对照的1 1 3 、1 1 0 、1 0 9 、1 1 1 ( 图2 b ) ；5 0 0 i t m o l l a t p 处理后气孔开度结 果是6 5 4 、7 5 3 、7 9 1 、8 2 6l x m ，分别为对照的1 0 4 、1 1 1 、1 0 8 、1 0 8 ( 图2 c ) ； 1 0 0 0 i t m o l l a t p 处理的气孔开度为6 7 8 、7 6 0 、7 8 2 、7 9 8 p m ，分别为对照的1 1 3 、1 1 4 、 1 0 8 、1 1 7 ( 图2 d ) 。 以6 0 分钟时气孔开度的数据，对不同浓度外源a t p 处理后气孔开度进行了统计， 其中3 0 0 “m o l l a t p 处理的保卫细胞气孔开度为对照的1 0 8 。a t p 处理组与对照组经t 检验，p o 0 5 ，差异显著( 图2 e ) 。为了避免高浓度的a t p 对气孔运动产生副作用，所 以后面的实验均选择6 0 分钟和3 0 0 1 x m o l l a t p 进行测试。 1 6 0 9 3 06 09 01 2 0 0 时间( r a i n ) a 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 笛0越欺1壬f 9 8 7 6 5 4 3 2 1 o 皇t i v 趟氏罱f o2旨； nm8 v b 时 3 o 3 0 04 0 05 0 01 0 0 0 a t p ( p m o l l ) e 图2 外加a t p 对蚕豆气孔运动的影响 图a d 依次显示3 0 0 、4 0 0 、5 0 0 、1 0 0 0 p m o l l 的a t p 处理后蚕豆气孔开度随时间的变 化情况；e 显示不同浓度的a t p 处理6 0 分钟后气孔开度的统计结果。 f i g 2 e f f e c t so fa d d e da t po ns t o m a t a lm o v e m e n to fh c i a f a b a f i g a - dn o t et h et i m e c o u r s eo fs t o m a t a la p e r t u r ea f t e ra d d i n g3 0 0 ，4 0 0 ，5 0 0 ，10 0 0 t m o l l a t pi n t ob a t hs o l u t i o n ，r e s p e c t i v e l y f i g en o t e st h es t o m a t a la p e r t u r ea f t e rt r e a t e db ys e r i a l c o n c e n t r a t e da t pa t6 0m i n u t e s 1 2a t p 结构类似物对气孔运动的影响 为了排除a t p 作为能源物质、通过分解放能引起生理反应的可能性，以确认其细胞 外信号分子的身份，我们采用了不能被分解的a t p 结构类似物( a t p t s 、2 m e a t p 、b z a t p ) 处理蚕豆叶片表皮条，观察其对气孔开度的影响。经3 0 0 i _ t m o l l 的a t p y s 、2 m e a t p 、 b z a t p 处理6 0 分钟后气孔开度的数据表明，这三种a t p 结构类似物均能不同程度的促 1 7 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 名三型隶f 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 一巨n)莓f散壬扩 025 mm刚 d 时 o 0坦 心 c 问时 o 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 兮三越欺品f 进气孔开放程度加大，以2 m e a t p 的效果最明显，对照组的气孔开度约为6 9 8 p m ，处 理后增大到8 0 4 p m ，增幅为1 5 ( 图3 b ) ；其次是b z a t p ，对照组的气孔开度约为6 6 1 1 a m ， 处理后增大到7 4 7 i _ t m ，增幅为1 3 ( 图3 c ) ；再次是a t p t s ，对照组的气孔开度约为 6 3 0 9 m ，处理后增大到7 8 9 p m ，增幅为9 ( 图3 a ) ；最后是a t p ，处理后气孔开度的 增幅为8 ( 图2 a ) 。以上处理组与对照组数据经t 检验，p 0 0 5 ，差异显著。 0 时间( m i n ) a 06 0 时问( r a i n ) b u即 时间( r a i n ) c 图3 不可分解的a t p 结构类似物对蚕豆气孔运动的影响 图a - c 显示3 0 0 p , m o l l a t p t s 、2 m e a t p 、b z a t p 溶液处理6 0 分钟气孔孔径的统计结果。 f i g 3e f f e c t so ft h en o n - h y d r o l y z a b l ea t pa n a l o g so ns t o m a t a lm o v e m e n to fh c i a f a b a f i g a cn o t et h es t o m a t a la p e r t u r ea f t e rt r e a t e db y3 0 0 p m o l la t p t s ，2 m e a t pa n db z a t pa t 6 0m i n u t e s ，r e s p e c t i v e l y 1 3a t p 水解产物对气孔运动的影响 为了确定腺苷三磷酸分子结构完整性对a t p 促进蚕豆气孔开放效果的影响，我们利 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 一置三毯隶1扩 0 9 8 7 6 5 4 3 2 ，o 尽j v 趟泉f 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 舍0巡泉晕旷 用a t p 的逐级水解产物a d p 、a m p 及a d e n o s i n e 处理表皮条，观察其对气孔开度的影 响。蚕豆表皮条经3 0 0 1 t m o l la d p 处理，对照组的气孔开度约为6 0 6 i - t m ，处理后增大 到6 9 4 9 m ，处理组为对照组的1 1 4 ( 图4 a ) ；处理组与对照组的数据经t 检验，p 0 0 5 ，差异不显著。 1 0 9 8 售7 06 趟5 生4 3 2 1 0 o6 0 时间( m i n ) a o6 0 时间( m i n ) b u6 0 时间( m i n ) c 图4a t p 水解产物对蚕豆气孔运动的影响 图a c 显示3 0 0 9 m o l l a d p 、a m p 、a d e n o s i n e 处理6 0 分钟气孔孔径的统计结果。 f i g 4 e f f e c t so ft h ea t pd e r i v a t i v e so ns t o m a t a lm o v e m e n to fv i c i af a b a f i g a cn o t e t h es t o m a t a la p e r t u r ea f t e rt r e a t e db y3 0 0 9 m o l la d p , a m p , a d e n o s i n ea t6 0m i n u t e s ， r e s p e c t i v e l y 1 9 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 一暑n)谜隶罱圹 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 一目0趟崴1圭扩 1 4内源e a t p 在蚕豆气孔运动中的作用 为了确认内源e a t p 在蚕豆气孑l 运动中是否有作用，我们采用a t p 分解酶对蚕豆叶 片表皮条进行处理，以破坏细胞外a t p ，降低其水平，并于3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0 分钟时测 量气孔孔径。使用2 0 0u n i t s m l 的腺苷三磷酸双磷酸酶( a p y r a s e ) 对表皮条进行处理， 处理组气孔开度分别为2 6 4 、3 7 5 、3 9 0 、3 7 3 岬，对照组的分别为4 4 4 、5 2 1 、5 5 6 、 5 2 3 岬，处理组分别为对照的5 9 、7 2 、7 0 、7 1 ( 图5 a ) ；4 0 0u n i t s m l 葡萄糖 己糖激酶( h e x o k i n a s e ) 处理表皮条，处理组气孔开度分别为4 2 2 、4 2 8 、5 8 0 、5 5 8g t m ， 对照组的分别为5 2 6 、5 9 4 、6 3 3 、7 0 0l x m ，处理组分别为对照的8 0 、7 2 、9 1 、 7 9 ( 图5 b ) 。 图5 内源e a t p 在蚕豆气孔运动中的作用 图a b 显示2 0 0 u n i t s m l 腺苷三磷酸双磷酸酶、4 0 0 u n i t s m l 葡萄糖己糖激酶处理后气 孔运动的时间进程。 f i g 5 e f f e c t so fe n d o g e n o u se a t po ns t o m a t a lm o v e m e n to fh c i a f a b a f i g a - bn o t et h e t i m e - c o u r s eo fs t o m a t a la p e r t u r ea f t e r a d d i n g2 0 0u n i t s m la p y r a s eo r4 0 0u n i t s m l h e x o k i n a s ei n t ob a t hs o l u t i o no fe p i d e r m i s ，r e s p e c t i v e l y 2 活性氧( r o s ) 在e a t p 调节气孔运动过程中的作用 2 1 活性氧在e a t p 调节气孔运动过程中的作用 为了确定r o s 在e a t p 调节气孔运动过程中是否起作用，我们采用细胞质膜n a d p h 氧化酶专一性抑制剂d p i ( 浓度为1 0r t m o l l ) 或活性氧还原剂d t t ( 浓度为1m m o l l ) 和a t p 共同对蚕豆叶片表皮条进行处理，并于3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0 分钟测量了气孔孔径。 2 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 一暑三越隶f 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 售j一型土1圭矿 0 2 曲胁 b 时 0 30 02 曲胁 a 时 ；0 使用d p i 和a t p 共处理的表皮条，其气孔开度分别为单用a t p 处理的8 7 、8 0 、 7 4 、7 4 ；单用d p i 处理的气孔开度分别为对照的8 5 、8 4 、7 2 、7 2 ( 图6 a ) 。 使用d t t 和a t p 共处理的表皮条，其气孔开度分别为单用a t p 处理的6 1 、7 0 、6 8 、 6 2 ；单用d t t 处理的气孔开度分别为对照的9 7 、9 1 、9 0 、8 4 ( 图6 b ) 。结果 显示d p i 和d t t 均能强烈的抑制a t p 促进的气孔开放。 0 3 0 6 09 01 2 0 0 时间( m i n ) a 3 06 09 0 时间( m i n ) b 图6 活性氧( r o s ) 在e a t p 调节气孔运动过程中的作用 图a 显示3 0 0 i t m o l l a t p 、1 0 肛m o l ld p i 、a t p 和d p i 共处理后气孔运动的时间进程； b 显示3 0 0 p m o l la t p 、1 m m o l ld t t 、a t p 和d 1 v r 共处理后气孔运动的时间进程。 f i g 6e f f e c t so fr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e so ne a t pr e g u l a t e dt h es t o m a t a lm o v e m e n t f i g an o t e st h es t o m a t a la p e r t u r ea f t e ra d d i n g3 0 0l x m o l la t p , 10 肛m o l ld p i ，a t pa n dd p i i n t ob a t hs o l u t i o n ，r e s p e c t i v e l y f i g bn o t e st h es t o m a t a lm o v e m e n ta f t e ra d d i n g3 0 0i t m o l l a t elm m o l ld t t a t pa n dd t ti n t ob a t hs o l u t i o no f e p i d e r m i s ，r e s p e c t i v e l y 2 2e a t p 处理对保卫细胞内活性氧浓度变化的影响 通过2 1 的实验我们可以得出r o s 在e a t p 调节气孔运动过程中起到重要作用，为 了确认e a t p 能否诱导保卫细胞产生r o s ，我们利用激光共聚焦扫描显微技术，对经过 a t p 处理的蚕豆表皮条保卫细胞进行了r o s 检测；同样的方法，对经过d p i 、d t t 预 处理3 0 m i n 再用a t p 处理的保卫细胞进行r o s 检测。 蚕豆表皮条经h 2 d c f d a 染色后，利用激光共聚焦扫描显微技术，对保卫细胞全细 胞荧光图像进行捕捉( 图7 ) 。结果显示，只用缓冲液处理的保卫细胞胞内荧光强度基本 没有变化( 图7 a ) ；3 0 0 t m o l le a t p 处理后保卫细胞内荧光强度的变化显示，在加入 2 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 舍n)毯鼠1矿 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 旨t 1 v 遄棠1 士f a t p 之后4 m i n 时胞内的荧光强度与对照相比明显增强，到6 m i n 时荧光强度达到最强， 即r o s 的合成量达到顶峰( 图7 b ) ；先用1 0 l t m o l ld p i 预处理3 0 m i n ，再用a t p 处理 后保卫细胞胞内荧光强度没有增强( 图7 c ) ；先用l m m o l l d t t 预处理3 0 m i n ，再用3 0 0 l x m o l l e a t p 处理后蚕豆保卫细胞胞内荧光强度先增强继而减弱( 图7 d ) 。 园园园园 园囵囫囫 _ l o w 【r o s 】h i g h ， 图7a t p 对蚕豆保卫细胞内活性氧浓度的影响 图a d 分别显示不同药剂处理后保卫细胞内活性氧染料发出的荧光强度随时间的变化情 况，图片上方的数字为加入a t p 后的采样时间，c o n t r o l 为处理前保卫细胞本身所含的r o s 荧光。a 气孔缓冲液；b 3 0 0 m o l le a t p ；c 1 0 - t m o l ld p i 预处理3 0 m i n 后，再加入a t p 处理；d 1 m m o l ld t t 预处理3 0 m i n 后，再加入a t p 处理。 f i g 7t h ee f f e c to fa t p o nr o sc o n c e n t r a t i o ni ng u a r dc e l l so fv i c i af a b a t h ei m a g e s n o t et h et i m e - c o u r s eo ff l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y a f t e rd i f f e r e n tm e d i c a m e n tt r e a t m e n t ， r e s p e c t i v e l y s e r i a ln u m b e ri ss a m p l i n gt i m eo nt h et o po ft h ef i g u r e ，c o n t r o li sr o s f l u o r e s c e n c ei n c l u d e di nt h eg u a r dc e l lu n d e rn o m a lc i r c u m s t a n c e ( a ) s t o m a t a lb u f f e r ； ( b ) 3 0 0p m o l le a t p ；( c ) 1 0 t a m o l ld p ip r e t r e a t m e n tf o r3 0m i n u t e s ，t h e na d da t p ；( d ) 1 m m o l ld i tp r e t r e a t m e n tf o r3 0m i n u t e s ，t h e na d da t e 3 细胞质膜离子通道在e a t p 调节气孔运动过程中的作用 3 1 钙离子通道在e a t p 调节气孔运动过程中的作用 为了检测c a 2 + 通道在e a t p 调节气孔运动过程中是否有作用，我们采用c a 2 + 通道的 a b c u 阻断剂l a c l 3 、a 1 c 1 3 、g d c l 3 、地而流卓( d i l t i a z e m ，d l a ) 预处理蚕豆表皮条，即抑 制c a 2 + 通道的活性，之后再用a t p 处理，观察气孔开度的变化。 蚕豆叶片表皮条用l a c l 3 预处理3 0 分钟，再经a t p 处理6 0 分钟后，其气孔开度分 别为对照和单用a t p 处理的9 6 、7 6 ( 图8 a ) 。同样的方法，表皮条经a 1 c 1 3 预处理， 再经a t p 处理后，其气孔开度分别为对照和单用a t p 处理的7 7 、6 7 ( 图8 b ) 。经 g d c l 3 预处理，再经a t p 处理的气孔开度分别为对照和单用a t p 处理的7 7 、7 8 ( 图 8 c ) 。表皮条经d l a 预处理，再经a t p 处理的气孔开度分别为对照和单用a t p 处理的 8 3 、6 4 ( 图8 d ) 。这些结果表明，c a 2 + 通道的阻断剂能抑制a t p 促进的气孔开放。 1 0 9 8 名7 2 1 6 型5 柬4 铲3 2 1 o a t p1 m m l a c l 3 + a t p a a t p2 m m g d c l 3 + 娜 1 0 9 8 售7 三6 型5 奎4 f r k - - 3 2 1 0 a ，r p1 m m a l c l 3 十a t p b a t p 5 0 1 a m d l a + a t p cd 图8 钙离子通道阻断剂对a t p 促进气孔开放作用的影响 图a d 分别显示不同的钙离子通道阻断剂预处理3 0 分钟，再经a t p 处理6 0 分钟，对 气孔开度的影响。a l a c l 3 ；b a 1 c 1 3 ；c g d c l 3 ；d d l a f i g 8e f f e c t so fc a l c i u mc h a n n e lb l o c k e r so na t pp r o m o t e ds t o m a t a lo p e n i n g f i g a d 2 3 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 置j v 越崴磊矿 0 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 星j v 巡欺1 士f n o t et h ee f f e c t so fs e r i a lc a l c i u mc h a n n e lb l o c k e r sp r e t r e a t m e n to ns t o m a t a la p e r t u r eb e f o r e a n da f t e ra t p t r e a t m e n t ，r e s p e c t i v e l y ( a ) l a c l 3 ( b ) a 1 c 1 3 ( c ) g d c l 3 ( d ) d l a 3 2 蚕豆保卫细胞质膜上钙离子通道的检测 在细胞外c a + 浓度为1 0 m m o l l 的条件下，采用全细胞步进式电压钳制方式，记录 到了一个明显的质膜超极化激活电流( 图9 a ) 。该跨膜电流在膜电压低于1 0 0m v 时被 激活，电流强度随着质膜超极化程度的加强而增大，呈现出明显的超极化激活特征。数 据统计得出的i v 关系曲线显示( 图9 c ) ，该跨膜电流具有内向整流性，而且具有明显 的超极化激活特征。又采用全细胞渐进式电压钳制方法检测了跨膜电流的电压依赖性 ( 图9 b ) ，其结果与步进式电压钳方式得到的相一致。 b 图9 蚕豆保卫细胞质膜上跨膜钙电流的电压依赖性检测 图a 全细胞步进式电压钳记录的电流图，下方图为步进式电压钳程序；b 渐进式电 压钳记录到的跨膜电流；c 步进式电压钳记录到电流的i v 关系曲线( n = 5 ) 。 f i g 9t h ed e t e c t i o no fv o l t a g e d e p e n d e n to ft r a n s m e m b r a n ec a 2 + c u r r e n ti ng u a r dc e l l p l a s m am e m b r a n eo fh c i af a b a a c u r r e n tr e c o r d e df r o mw h o l e c e l ls t e pv o l t a g e c l a m p i n g t h ef i g u r eo nb o t t o mi n d i c a t e st h ev o l t a g