（有机化学专业论文）蛋白酶与核酸前体及核黄素荧光作用研究.pdf

熙熙急鬈黜撒教 摘要 摘要 本文研究了蛋白酶与核酸前体的荧光作用。结果发现，核酸碱基a d e 、t h y 、 c y t 、u r a 及核苷u r 、d u r 、g s 对蛋白酶h s a 、b s a 的荧光淬灭作用很强且 符合稳态的s t e r n - v o l m e r 线性方程，荧光淬灭速率常数k 。达1 0 1 0 m 。1 s ，属 于扩散控制，表明核酸碱基及核苷基态可作为电子受体与含色氨酸的蛋 白酶单重态发生具有电子转移性质的相互作用。这种作用导致形成活泼 的t r p t 和nb ，从而同时导致核酸碱基和蛋白质的双重损害。同时观察 到核酸碱基、核苷对蛋白酶荧光淬灭的激发波长依赖性。入e x 在2 8 0 - 3 1 0n m 范 围改变时，l 【q 一入e x 关系中均存在着两个区域：入e x = 2 9 5 3 1 0a m 的平伏区和 入e x = 2 8 0 2 9 5n m 的急速上升区。在这两个区域，荧光淬灭作用分别为电子 转移机理和e l 一e n t 共存机理。另外，在入e x = 2 8 7 咖时，脱氧尿苷d u r 对 牛血清白蛋白b s a 淬灭的s t e r n v o l m e r 曲线出现上翘现象，根据修饰的 s t e r n - v o l m e r 方程和稳态与动态淬灭相结合理论求出了两者作用的稳态结合 常数k 。和动态淬灭常数l ( d 。 本文还进行了蛋白酶b s a 与核黄素r f 荧光作用的初步研究。结果表明，蛋 白酶b s a 对核黄素r f 有荧光淬灭作用，且作用很强，淬灭速率常数k 。达到1 0 ” m 叫s 。同时s t e r n - v o l m e r 曲线发生了向x 轴的偏离，说明有某种基态缔合物 的生成或发生了b s a 对r f 的不完全淬灭。 同胁云学 a b s t r c t a b s t r c t f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go ft h et r y p t o p h a n ( t i 冲) r e s i d u ei nt h ep r o t e i ne n z y m e s ， h s aa n db s a ，b yn u c l e o b a s e s ( 删，c t s ，u r a ，a n d ) a n dn u c l e o t i d e s ( u r i d i n e ， 2 - d e o x y u r i d i n e ，g u a n o s i n e ) r e v e a lt h a tt h eq u e n c h i n g i n t e r a c t i o n sa r es t r o n ga n da g r e e w i t hs t e m v o l m e rl i n e a re q u a t i o n s t h eq u e n c h i n gr a t ec o n s t a n tl 【qr e a c h e st h e m a g n i t u d eo f1 0 1 0m 。1 s 一，c l o s et od i f f u s i o n c o n t r o l l e dr a t e t h i si l l u s t r a t e st h a tt h e n u c l e i ca c i dp r e c u r s o r si nt h eg r o u n ds t a t e sc a nb e h a v ea se l e c t r o na c c e p t o r st o u n d e r g oe l e c t r o nt r a n s f e r ( e di n t e r a c t i o n sw i 也仃p t o p h a n c o n t a i n i n gs e r u ma l b u m i n s ( h s a ，b s a ) ，w h i c hp r o d u c ep h o t o c h e m i c a ld u a l - d a m a g eo fp r o t e i ne n z y m e sa n d n u c l e i ca c i d p r e c u r s o r s b e s i d e s ，t h i s i n t e r a c t i o ne x h i b i t se x c i t a t i o n w a v e l e n g t h - d e p e n d e n c eo fw h i c ht h e 入“2 9 5 - 310n mr e g i o ni sc h a r a c t e r i s t i co f e l e c t r o nt r a n s f e rp r o c e s sw h i l et h e 入“2 8 0 - 2 9 5n l nr e g i o ni sc h a r a c t e r i s t i co fb o t h e l e c t r o nt r a n s f e ra n de n e r g yt r a n s f e rp r o c e s s i nt h ei n s t a n c eo f 入c x = 2 8 7n m ，t h ei n t e r a c t i o no fb s aw i t h 2 - d e o x y u r i d i n ei sc h a r a c t e r i s t i co fc o m b i n e dd y n a m i ca n ds t a t i cq u e n c h i n g t h e s t e m v o l m e r p l o t i sa nu p w a r dc u r v a t u r e ，c o n c a v et o w a r dt h ey - a x i s t h e a s s o c i a t i o nc o n s t a n to fs m i l eq u e n c h i n gk sa n dd y n a m i cq u e n c h i n gc o n s t a n tk oa r e o b t a i n e da c c o r d i n gt ot h em o d i f i e df o r mo fs t e m - v o l m e re q u a t i o n f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fr i b o f l a v i nb yb s ad i s p l a y st h a tt h eq u e n c h i n g i n t e r a c t i o ni ss t r o n ga n dt h eq u e n c h i n gr a t ec o n s t a n tl ( qr e a c h e s3 2 3 1 0 1 3m 1 s 一 a st h er e s u l to fg r o u n ds t a t ec o m p l e xf o r m a t i o no rp a r tq u e n c h i n g ，t h es t e r n v o l m e r p l o td e v i a t e sf r o ml i n e a r i t yt o w a r dt h ex - a x i s 冈胁云学 t o n g j i u n i v e r s n y 第一章引言 1 1生物活性分子光化学研究的意义 近二十年来，生命科学的发展使得我们对于核酸等储存遗传信息 物质以及蛋白质的研究，在分子这一层次上获得了突破性的进展，生 命科学更是进入了与化学密切联系的时期1 1 1 。许多生物活性分子如蛋 白质、核酸、以及维生素等都具有非常重要的生理功能。例如蛋白质 是生物体的基本组成成分，起着支持、调节、防御、运输等多种功能； 脱氧核糖核酸( d n a ) 是重要的遗传物质；维生素则是维持机体正常生 长和健康所必需的，它们具有调节物质代谢的功能。这些生物活性分 子的受损或缺乏，就会引起生物机体某些功能的紊乱和丧失从而导致 疾病、衰老甚至死亡，因此生物活性分子损害机理的研究一直受到生 物学家和化学家的广泛关注【2 】。 光是生物赖以生存的环境中最重要的因素之一，对生物体的结构 和功能具有重要的影响【3 ，4 1 ，在光合作用、视觉光化学、生物周期、 环境光化学、生物发光等过程中起着必不可少的作用。同时紫外线也 能引起一系列生物活性分子的光化学损害，例如经常在强日光下工作 的人员容易患皮肤癌、光化学大气污染等。 生物活性分子光损害的范围非常广泛，而且危害很大。如组成蛋 白质的色氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸等残基受强光作用后可导 致酶的去活化降解，而核酸碱基容易受光作用引起核酸分子的损害甚 至导致密码的改变。因此对生物活性分子的光化学损害机理的研究具 有重要的理论和实际意义。 冈胁云学 t o n g j iu n i v e r s i t y 硕士研究生学位论文第一章 1 2生物活性分子的电子转移光化学损害 在现代研究生物活性分子的光化学损害机理的手段方面，随着现 代分子生物学和生物分子技术的发展，发光标记的探针技术得到了长 足的发展。其中，稳态及动态荧光探针技术就是较为成熟和可靠的方 法之一。这种方法可以借助荧光探针的作用跟踪和探测生命大分子在 各种生理或仿生理条件下的代谢途径和损害机理，同时它也是研究电 子转移反应的的有力工具。研究表明人体中的半数反应是通过电子转 移过程完成的，著名的光合作用就是最典型的例子。不仅如此，荧光 方法还具有成本低，操作安全，无污染，稳定性好，荧光试剂可以长 期保存的优点。正因为如此，近年来荧光探针技术被广泛应用于生物 分子代谢和损害机理的研究。 1 9 7 7 年k u b o t a 等【5 1 将9 氨基吖啶( 9 a a ) 嵌插在d n a 链和多核 苷上，发现d n a 上的9 a a 的荧光完全被淬灭。1 9 9 1 年h a r r i m a n 等 【6 ，7 1 报道了某些连接在d n a 上的多环正离子染料如亚甲兰、n ，n 二 甲基一2 ，7 二氮芘盐等的荧光被淬灭，指出这是因为激发态的染料从邻 近的核酸碱基上快速夺取电子造成的。蒋丽金等研究了竹红菌甲素 ( h a ) 对色氨酸( t r p ) 的敏化光氧化反应【8 】，同时观察了n a n 3 、蛋氨酸、 半胱氨酸、k 3 f e ( c n ) 6 等不同种类的淬灭剂对h a 敏化t r p 光氧化反 应的阻碍作用，证实了h a 敏化t r p 的光氧化反应是以1 0 2 为主，兼 有电子转移机制。此后，蒋丽金等又用磺化h a 去淬灭t r p 以及含t r p 的蛋白酶( 如人血清白蛋白h s a 、牛血清白蛋白b s a 等) 【9 1 ，证明h a 可作为新的一类蛋白质淬灭剂来研究蛋白质的结构，提出了有机分子 与蛋白质之间的亲和力对蛋白质荧光淬灭有一定影响的新观点。 对单个核酸碱基的光化学损害研究方兴未艾。1 9 8 7 年k e m p 等1 0 】 应用闪光光解技术研究了一些亲电分子对三线态的嘧啶碱基( 如t h y 、 2 冈胯云学 t o n g j iu n i v e r s i t y 硕士研究生学位论文 第一章 胞嘧啶c y t 、尿嘧啶u r a c i l ) 的荧光淬灭，指出一些药物( 如 m e t r o n i d a z o l e 和m i s o n i d a z o l e ) 亦可参与d n a 的光辐射损害；后来樊 美公等1 用荧光淬灭方法，考察了四氰基乙烯( t c n e ) 与核酸碱基的 电子转移光反应。h a s h i m o t o 报道了一些嘌呤衍生物( 如t e m u 等) 及 其去质子阴离子对芘的荧光淬灭【1 2 】，发现淬灭具有溶剂效应，即在 乙腈中是单纯的动态淬灭过程，而水中观察到了较弱的基态络合物的 形成，淬灭过程同时涉及到动态和静态淬灭作用。樊美公等迸一步通 过几种常见碱基在水溶液中对芘的荧光淬灭的研究 1 3 1 发现，淬灭作 用具有碱基效应，即嘌呤类碱基的淬灭是单纯的静态淬灭过程，嘧啶 类碱基的淬灭则是单纯的动态淬灭过程，阐明了淬灭过程中嘌呤类碱 基充当电子给体和嘧啶类碱基充当电子受体，但这种解释还有待进一 步证实。 1 3 内源性蛋白质荧光探针 已发现和应用的荧光探针主要可以分为两类，一种是内源性荧光 探针，另一种为外源性荧光探针。内源性荧光探针为天然产物，主要 包括芳香类氨基酸，n a d h ，核黄素和维生素b 6 、血卟啉、叶绿素 衍生物等。外源性荧光探针是在没有荧光或荧光很弱的母体上外接荧 光探针，以产生荧光。此类物质主要有丹磺酰氯、荧光素、丹明等物 在内源性荧光物中，蛋白质荧光主要由其氨基酸组份的侧基发光 团色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t ”) 、苯丙氨酸( p h e ) 等的荧光加合而成， 因此蛋白质荧光构成理论上是十分复杂的。表l 为三种氨基酸在水溶 液中的各种荧光参数【1 5 - 16 1 。三种氨基酸结构式如图1 所示。 哂髓t o n g l j 螽iu n i v e r s 嗨i t y 良h 形豪咎勘载色 争一害 表1 三种氨基酸在水溶液中的各种荧光参数 s p e c i e s 丸( 姗) 啪m ) b 怒；：d t hq 器m “篱e p h e n y l a l a n i n e 2 6 02 8 2 _ _ _ 。0 0 2 6 8 t y r o s i n e t r y p t o p h a n h s a 2 7 5 2 9 5 3 0 4 3 5 3 3 4 2 3 4 6 0 0 1 4 0 1 3 3 6 3 1 5 6 bsa- 3 5 8 _ _ _ _ _ 7 0 上 n h 2 l c h 2 c h i c o o h t r y p t o p h a n p h e n y l a l a n i n e t y r o s i n e 图1 三种氨基酸结构式 4 冈解六学 t o n g j iu n i v e r s i t y 硕士磅究生学位论文第一章 w a v e l e n g t h ( n m ) 图2 三种氨基酸的荧光吸收光谱图 图2 为三种氨基酸的吸收光谱图。 蛋白质荧光通常在2 8 0n m 附近或更长波长处激发，因此，苯丙氨酸( p h c ) 在大多数情况下并不被激发。并且，由于蛋白质中苯丙氨酸的量子产率很小， 所以它的发射也很难被观察到。蛋白质在2 8 0n m 处的吸收主要为酪氨酸( t y r ) 、 色氨酸( 1 却) 的吸收，在波长大于2 9 5n i n 时，吸收主要由色氨酸( t r p ) 造成。这 表明色氨酸( t r p ) 的荧光可以在2 9 5 3 0 5 砌进行选择吸收。 三种氨基酸的荧光发射图谱如图3 所示。从图中可以看出酪氨酸( t y r ) 的 发射波长在3 0 0n m 附近，色氨酸( 1 砷) 的最大发射在3 4 5 3 6 0n n l2 n 。 冈腾云学 t o n g j iu n i v e r s i t y 硕士研究生学位论文第一章 w a velen g t h ( nm l 图3 三种氨基酸的荧光发射图谱 已知许多蛋白酶含有一个或多个t r p ，它们分布在蛋白酶大分子 肽链的不同确定部位【1 7 】，如溶菌酶有6 个t r p ，其中3 个t r p 处于活 性部位( t r p 6 2 、t r p 一6 3 和t r p 1 0 8 ) 。蛋白酶中的色氨酸t r p 可分为两 类：一类是内埋的，另一类则是外露的。图4 给出了含色氨酸的蛋白 酶，核酸内切酶( e n d o l l i ) ，的结构图。e n d o i i 含有两个色氨酸残基 t r p - 1 7 8 和t r p - 1 3 2 ，分别为内埋型和外露型n 引。 6 卜卜一价z u 卜z u u z u u u 芷o 3 j l 国默骢懑鼹一一蚊 绀 c l u s t e r 图4 含色氨酸的蛋白酶核酸内切酶h i ( e n d o i i i ) 的结构图 本文工作中所采用的人血清白蛋白h s a 中含有一个t r p ( t r p 2 1 4 ) ，牛血清白蛋白b s a 含两个t r p ，它们均暴露在蛋白质的 外面【1 9 】。虽然蛋白质荧光由色氨酸( t r p ) 、酪氨酸( t y r ) 、苯丙氨酸( p h e ) 的荧光加合而成，但主要来自色氨酸( t r p ) ，占9 0 以上。这一点从 图5 中可以看出。图5 中1 、2 、3 曲线分别为h s a 、t r p 、t y r 和t r p 混合物( 混合摩尔比l8 ：l ，与h s a 中两种残基摩尔比相近) 的荧 光发射图。从图中可以看到，尽管酪氨酸含量较高，但h s a 的发射 主要由色氨酸决定。同时，我们也看到，与色氨酸在水中的发射波长 相比，h s a 中色氨酸的发射波长发生了蓝移。这种蓝移主要是由水 溶液中蛋白质模式对色氨酸残基的屏蔽造成的。因此，在大多数蛋白 质中，酪氨酸的荧光是很小的，而且也不易被检测到。 7 冈降云学 t o n g j iu n i v e r s n y 入m 工上 图5h s a 、t r p 、t y r 和t i p 混合物的荧光发射图 h s a ( 1 ) ，t r p ( 2 ) ，t y r 和t r p 混合物( 3 ) ( 混合摩尔比1 8 ：1 ，与 h s a 中两种残基摩尔比相近) 因此，通过研究天然荧光蛋白酶人血清白蛋白h s a 和牛血清白蛋白b s a 中t r p 的情况，我们可以了解蛋白质荧光的某些行为和特征。我们用 2 9 5 一3 1 0 n m 波长选择性激发h s a 和b s a 中的t r p ，可以避免激发到 蛋白质中的其它氨基酸2 们，以便选择性的来进行蛋白酶与其他具有 生物活性的分子之间的荧光作用研究。由于本文中所采用的荧光研究 方法主要为荧光淬灭作用，并且需要涉及到电子转移反应，因此有必 要在这里介绍一下光电子转移反应及荧光淬灭的一些基本情况。 冈解云学 t o n g y lu n i v e r s i t y 1 4 电子转移过程 近来电子转移( e l e c t r o nt r a n s f e r ，e t ) 的研究进展十分引人注目， 是现代化学的重要领域之一。许多重要的生命过程( 包括绿色植物的 光合作用，生物体内的2 0 0 多种氧化还原酶参与的新陈代谢等) ，太 阳能的储存和利用、分子器件( m e d ) 研制等都涉及到e t 过程。此外， 电子转移光氧化反应也为有机合成提供了新的路线【2 1 2 2 1 。 e t 过程包括初级电子转移和次级电子转移。激发单重态( 1 s e n s * ) 或激发三重态( 3 s e n s * ) j a 反应底物分子( d ) 中夺取一个电子后形成电 荷转移络合物c t c ( c h a r g et r a n s f e rc o m p l e x ) 的过程是初级e t 过程； 初级e t 过程中形成的自由基离子非常活泼，能与其它物种( 如0 2 ) 等 进一步发生电子转移，这一过程是次级e t 过程。借助现代研究方法， 可提供电子转移过程的直接或间接证据，使电子转移理论有了较大的 发展。图6 表示了一种常见的光诱导电子转移光氧化过程。 逆e b ( s 。d + ) ， 图6 光诱导初级电子转移过程 ( s + d 4 - ) 初级e t 能否顺利进行与溶剂的极性和光敏剂的性能有很大的关 9 国蕊砌n g i y 骚fu n i v 士e r s 吗i t y 穰鼬形鬯咎勘文分 分一量 系。极性溶剂能有效分离电荷，利于发生初级e t 过程；而非极性溶 剂中电荷不易分离，而易发生电子回传( 逆e t 过程) ，重新回到反应 物，这是一个耗能的过程，因此如何阻止或减少这类电子回传，促进 离子对中正、负离子自由基的分离，从而提高电子转移过程的效率已 成为近期光诱导电子转移研究的中心课题之一【23 1 。 1 5 荧光淬灭方法 荧光淬灭技术光物理方法也常用于研究能量转移和电子转移过 程【2 4 1 。利用这种方法可以深入了解许多光化学和光物理过程。荧光 淬灭方法分为稳态和动态荧光淬灭两种。前者是测定荧光强度随淬灭 剂浓度【q 的变化情况；后者测定荧光寿命( r ) 受【q 】的影响。通过 s t e r n v o l m e r 关系式求出的淬灭速率常数k q 来判断淬灭的性质。 荧光淬灭的途径有两类：能量转移和电子转移。早期的荧光淬灭 研究主要着重能量转移，这与所用的三线态敏化剂有关。八十年代， 由于时间分辨闪光光解技术，荧光淬灭及化学诱导核极化( c i d n p ) 技 术的广泛应用，电子转移理论有了很大的发展【2 5 2 6 1 ，特别是m a r c u s 由于提出电子转移动力学理论并为后来实验所证实f 2 7 1 ，并获得1 9 9 3 年诺贝尔化学奖。 电子转移淬灭是指电子从给体的占用轨道跃迁到受体的未占用 轨道后引起其荧光强度和荧光寿命的降低。通常判断淬灭到底是能量 转移还是电子转移过程，大致可遵循以下几个原则：( 1 ) 如果能量 受体比能量给体的能量大3k c a l m o l 以上，即敏化剂的激发波长与淬 灭剂的吸收曲线没有重叠，并且其荧光发射曲线不与淬灭剂的吸收曲 线发生交盖，则不可能发生能量转移；( 2 ) 根据r e h m w e l l e r 公式 中电子给、受体间e t 的自由能变化( g ) 值来判断e t 是否是热力学 上有利的过程；( 3 ) 电子转移要求给、受体间的有效距离小于或等于 1 0 冈胯云学 t o n o bu n i v e r s l l y 1 0 a o ，其淬灭速率常数接近扩散控制( 10 1 0 m 。1 s 。1 ) ；而能量转移淬灭发 生在1 0 1 0 0a o ，淬灭速率常数一般小于扩散控制速率常数。 1 6本选题的构想 对蛋白酶和核酸前体及核黄素等生物活性分子的光动态损害机 理的研究可以帮助我们深入了解这些生物分子光损害的途径和规律， 并且在进一步寻求预防和减少光化学损害作用方面有着重要的理论 和实际意义。虽然人们分别对蛋白质和核酸迸行了广泛研究，但是有 关蛋白质与核酸之间光诱导相互作用的可能性及特性仍很少见报道。 因此，我们选择具有天然荧光的蛋白酶，人血清白蛋白h s a 和牛血清白蛋 白b s a ( 分别含有一个和两个t r p 发色团) 与其他具有生物活性的分子进 行荧光作用研究。具体的工作内容包括： 1 蛋白酶与核酸前体( 包括核酸碱基及核苷) 荧光淬灭的研究。 分别选取胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤四种核酸碱基及 尿苷、脱氧尿苷、鸟苷三种核苷在水溶液中对人血清白蛋白 h s a 及牛血清白蛋白b s a 进行淬灭，研究蛋白酶与核酸碱基 及核苷之间的相互作用机理。 2 对上述作用过程中蛋白酶与核酸前体荧光淬灭曲线进行理论上 的探讨和分析，并求两者作用的结合常数。 3 蛋白酶与核黄素荧光淬灭作用的初步探讨。在水溶液中，用蛋 白酶对核黄素进行荧光淬灭，研究两者相互作用的机理。 冈胯苁学 t o n g j iu n i v e r s i t y 硕士研究生学位论文第二章 第二章蛋白酶与核酸碱基及核苷的荧光作用 2 1 核酸前体( n p ) 参与的光致电子转移( p e t ) 过程 d n a 是生物体重要的遗传物质，而核苷酸是d n a 最基本的结构单 元。它由单糖、磷酸基和核酸碱基三部分构成。其光化学损害的部位主 要是核酸碱基及核苷 2 引，而核酸碱基的变化可能是导致基因突变、d n a 断裂以及物种变异的一个重要原因，因此对核酸碱基及核苷的光动态损 害机理的深入研究具有重要的理论和实际意义。 理论上，一个核酸前体( 核酸碱基及核苷等) ( n p ) 及其衍生物可参 与以下四种可能的光致电子转移( p e t ) 的荧光淬灭过程： a ，+np_ a + n p + d-6n p _ d + 4 - n p - a +n p * a - 。+ n p + 。 ( 1 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) 式l 、2 表示n p 基态分别作为电子受体和给体与外源作用物的激发态( 分别作 电子给体d 和受体a ) 之间的p e t 过程，而3 、4 式则为激发态n p + 分别作为 电子受体和给体与外源作用物基态作电子给体d 或受体a 之间的p e t 过程。这 些p e t 过程均先生成激基络合物，后者在极性溶剂中易于离解成自由基离子对。 然而由于最常见的嘧啶碱基( c ，t ，u ) 、嘌呤碱基( a ，g ) 及其核苷在常温下荧光 很弱，荧光量子产率低，它们的紫外吸收约在2 6 0n m 紫外区，激发波长很低，而且其 荧光发射波长也较低【2 9 1 ，一般3 0 0n m ，故易与大多的作用物吸收峰重叠， 造成选择激发波长困难并引起复杂的情形，所以上述第3 ，4 过程一般难以实现。 为此我们先着重应用荧光淬灭方法模拟研究第l ，2 过程。 1 2 冈胁么学 t o n g j iu n i v e r s i t y 硕士研究生学位论文第二章 为研究过程( 1 ) ，本文选择蛋白酶生物活性分子，例如人血清白蛋 白( h s a ) 、牛血清白蛋白( b s a ) 等含色氨酸t r p 发光体的蛋白酶作为电 子给体敏化剂，选取胸腺嘧啶、尿嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤四种核酸碱基 及尿苷、脱氧尿苷、鸟苷三种核苷作为电子受体来进行研究。结构式如 图7 所示。 n h 2 a d e n i n e a d n 剁一 g u a n o s i n e g s 上 h o d e o x y u r i d i n e d u r n h 2 i c h 2 c h i c o o h t r y p t o p h a n t r p o h h o c h 2 t h y m i n e t h m u 五d i n e u r t r y p t o p h a n - c o n t a i n i n gs e r u ma l b u m i n h u m a ns e r u ma l b u m i n ( h s a ) 一o n et r pr e s i d u e b o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) - t w ot r pr e s i d u e s 图7核酸碱基、核苷及色氨酸结构式 本文选用的h s a 分子量约为6 7 5 0 0 ，仅含一个t r p ，位于2 1 4 位； 瘁等。拭慧。妁 妁= 怠硫t o n g i j 豫iu n i v 士e r s 嗨i t y 聚雠形电昏凯就色莨譬 b s a 分子量约8 8 0 0 0 ，含有两个t r p ，均为外露型。本文通过上述核酸 碱基对t r p 及这些蛋白酶的荧光淬灭实验，了解核酸碱基及核苷作为电 子受体与敏化剂电子给体单重态相互作用的特点及其规律，揭示核酸与 蛋白质问可能的光化学损害途径。 2 2 蛋白酶与核酸前体荧光作用电子转移过程的理论分析 核酸前体能否与电子给体敏化剂蛋白酶之间发生如( 1 ) 式所示的 光致电子转移过程，热力学上可根据r e h m w e l l e r 公式( 式5 ) 中自由能 变化值g 加以判断3 0 j ： a g ( k c a l t 0 0 1 ) = 2 3 0 6x ( e 鲫一e 耐一p ：lo t s 一层) ( 5 ) 式中e “是电子给体的氧化电位，e d 是电子受体的还原电位，e o o 是 敏化剂的最低激发态的能量，e 0 2 q 是正负离子基相互作用的库仑项， 取决于所用的溶剂，如在乙腈中其值为o 0 6e v 。如果g 0 ，则应为热力 学上不利的过程，表明e t 过程难以实现。 t r p 是一种很好的电子给体敏化剂，水溶液中其e o x = 1 0 1 5 v ，e o , o = 4 4 2e v 【3 1 1 ，根据r e h m w e l l e r 公式可以估计，只要电子受体i e 甜i 3 0v ，即可使g 0 ，从热力学上讲就可与t r p 发生e t 作用。而核酸 碱基在水溶液中的e 。d 为1 2 一1 5v 【32 1 ，根据式( 5 ) r e h m w e l l e r 公式算得g 一5 0 8 叫3 9 千卡克分子，反应吉布斯自由能g 值为负且负值较大，说明核酸碱基与t r p 间的e t 过程不仅能够进行， 而且是热力学上非常有利的过程。 1 4 冈腾云学 t o n g j iu n i v e r s i t y 硕士研究生学位论文第二章 2 3 稳、动态荧光淬灭方程 淬灭剂可使敏化剂的荧光强度( i ) 和荧光寿命( t ) 降低。稳态淬灭过 程的敏化剂的荧光强度之比( i o i ) 与淬灭剂q 的浓度【q 之间，动态淬灭 过程的荧光寿命之l t ( to t ) 与【q 】之间分别服从s t e r n v o l m e r 线性方程 ( 2 ) 和( 3 ) 1 3 3 ： io i = 1 + k q ( s ) 1 7 0 【q 】( 6 ) 甸t = 1 + k q ( d ) t o 【q 】 ( 7 ) 式中i o 、1 分别是加入q 前后荧光体的荧光强度值， to 、r 分别为加 入q 前后荧光寿命，k q ( s ) 和k q ( d ) 分别是稳态和动态淬灭速率常数，其 中s t e r n v o l m e r 常数k s v = k q to 由直线的斜率求得。如果荧光寿命不随 淬灭剂浓度而变化，则淬灭过程主要是基态敏化剂与淬灭剂间形成了基 态络合物而导致的静态淬灭过程：如果k q ( s ) u r a a d e 。 三尿苷u p 、脱氧尿苷d u r 及鸟苷等核苷对蛋白酶h s a 、b s a 的荧光淬灭作 用很强，并且也符合s t e m v o l m e r 线性方程。作用规律与上述一中核酸碱基 与蛋白酶的结论类似。作用大小顺序为g s u r d u r 。 2 5 核酸碱基及核苷对蛋白酶荧光淬灭的激发波长依赖性 在第四部分工作中，我们注意到核酸碱基及核苷对蛋白酶的荧光淬 灭还与激发波长入e x 有关。入c x 越小，淬灭作用越明显。例如t h y 对 h s a 、b s a 在入c x2 9 5n m 的k q 是3 0 0n m 的近5 倍，u r 对b s a 也近 似5 倍。由此我们设想这种淬灭作用可能与激发波长入c x 或发射波长 入c m 有关，因此我们进一步考察了水溶液中不同入e x 和不同入e m 条 件下对碱基及核苷淬灭蛋白酶的影响。 t o 胁呋学 蕾o n iu n i v e r s i t y 2 5 1 发射波长的变化对蛋白酶淬灭的影响 我们考察了在不同激发波长，不同发射波长条件下核酸碱基对蛋白酶的荧光 淬灭。以t h y 对h s a 的淬灭为例进行分析。表7 给出了淬灭的l ( q 数据。 表7 不同入e x 、入c m 时t h y h s a 作用k q 值 令 3 7 83 6 83 5 83 5 03 3 0 入“姗) 入钿( 献”1 矗1 ) 3 l o6 1 5 1 0 96 0 3 1 0 95 9 4 x1 0 97 0 9 1 0 97 8 9 x1 0 9 3 0 51 0 6 l o 埔1 0 4 x1 0 1 01 2 5 1 0 1 0 1 2 0 x1 0 加 1 1 1 1 0 m 3 0 02 6 8 1 0 加2 8 0 1 0 m2 8 7 1 0 m2 8 0 1 0 m2 7 8 x1 0 m 2 9 51 0 5x1 0 1 11 0 5 1 0 u1 0 4 1 0 n 0 9 9 1 0 儿0 9 7 1 0 2 9 05 4 5 1 0 1 15 3 3 1 0 1 15 4 5 1 0 5 2 7 x1 0 5 2 6 1 0 u 2 8 5 4 4 0 x1 0 1 24 1 3 1 0 埋4 6 6 x1 0 u4 6 6 1 0 1 25 8 7 x1 0 1 2 由表7 中数据可以看出，t h y 对h s a 的荧光淬灭常数l ( q 值在每个特定的 入e x 下随入c m 变化很小，可以认为与发射波长入e m 无关。 2 5 2 激发波长的变化对蛋白酶淬灭的影响 由表7 中数据可以看出，荧光淬灭常数l ( q 值虽然在每个特定的入e x 下随 入e m 变化很小，但对于不同入e x 时，k 值变化很大，相差最多达到了1 0 3 1 0 4 个数量级。由此我们考察了不同类别核酸碱基及核苷在不同激发波长入e x 下l ( q 值的变化情况。 2 l 冈腾云学 t o n o j iu n i v e r s i t y 硕士研究生学位论文j g _ - 萝 2 5 2 1 嘧啶类碱基对蛋白酶荧光淬灭的k q - 入o x 图 以尿嘧啶u r a 对人血清白蛋白h s a 的淬灭为例。激发波长入e x 在2 8 0 n m - 2 8 5n n l 范围内逐纳米扫描，在2 8 5n m - 3 1 0n m 范围内每隔5r i m 扫描，得不 n u r a 下i o i 值，数据见表8 。 表8 不同入e x 下u r a 对h s a 荧光淬灭数据 一 1 1 l2 2 23 3 34 4 4 5 5 5 3 l o1 1 3 6 1 1 9 01 2 5 01 2 8 21 3 0 4 3 0 51 0 6 51 1 3 81 1 7 91 2 4 5 1 2 9 4 3 0 01 0 6 01 1 4 01 1 7 01 2 4 31 3 1 2 2 9 51 1 0 81 。2 0 0l 。2 5 2 1 3 5 31 4 5 0 2 9 01 1 8 0 1 3 5 61 4 8 51 6 8 71 9 4 4 2 8 51 5 9 92 2 7 02 9 4 63 9 2 8 5 1 0 3 2 8 41 8 0 22 8 1 83 8 2 75 3 1 47 2 0 9 2 8 32 1 2 43 6 6 35 3 8 57 8 1 01 1 3 1 7 2 8 22 6 3 75 0 5 37 8 6 91 2 4 6 818 4 6 2 2 8 1 3 2 6 47 0 5l1 2 0 7 51 9 5153 0 9 1 2 2 8 0 4 3 4 91 0 9 2 11 8 51 43 2 9 4 951 8 4 0 由表8 数据，并根据s t e m v o l m e r 方程作图，求出不同入e x 下k 的值，数 据见表9 。 冈解苁等 t o n g j iu n 】 v e rs n y 表9u r a 对h s a 淬灭的l ( q 入联值 入c ) 【( n m )l ( q ( 1 0 9m s - 1 ) 2 8 0 1 8 8 0 2 8 11 0 9 0 2 8 26 2 8 2 8 33 6 6 2 8 42 1 4 2 8 5 1 3 9 2 9 02 9 9 2 9 51 3 5 3 0 09 7 6 3 0 59 0 9 3 l o6 8 9 由表9 中数据作l ( q 一入c x 曲线，如图1 2 所示。 c ，) 蔓 a o 又 叮 y 九以( n m ) 图1 2 u r a 对h s a 的k 一入e x 曲线 入e m = 3 4 5n l n 【h s a 】- 6 8 2 x1 0 6m o l l 冈胁吹学 t o n g j iu n i v e r s i t y 硕士研究生学位论文第二章 同理作出u r a 对b s a 和表1 0 、1 1 ，并作图，如图l3 、1 4 所示。 表1 0u r a 对b s a 荧光淬灭的k q - - 入e x 数据 入眈( n m )l ( q ( 1 0 1 0m 一s - 1 ) 2 8 0 1 8 0 2 8 l 9 0 1 4 2 8 2 5 2 8 5 2 8 32 9 9 4 2 8 41 8 9 3 2 8 51 2 5 2 9 0 2 4 2 9 5 o 9 1 8 3 0 00 7 2 2 3 0 50 6 3 5 3 1 00 1 8 5 表1 1 t h y 对h s a 荧光淬灭的l 【q 一入e x 数据 入o x ( n m ) l ( q0 0 9m 一s 。1 ) 2 8 54 4 6 0 2 9 0 5 4 5 2 9 5 1 0 4 3 0 0 2 8 7 3 0 5 1 2 5 3 l o5 9 4 2 4 冈湃云学 t o n g j iu n i v e r s n y f i 幻 t - - 生 印 。 爱 口 j c 图1 3u r a 对b s a 的k 一3 e x 曲线 入e m = 3 6 0n m 【b s a = 3 1 8 x1 0 - 6 m o f l 九懿( n m ) 图1 4 t h m 对h s a 的l ( q 一入e x 曲线 e m = 3 5 8n l n 【h s a 】= 7 1x1 0 - 6 m o l l 2 5 2 2 嘧啶类核苷对蛋白酶荧光淬灭的k q - 入e x 图 同2 5 2 1 中实验步骤，分别作出尿苷u r i d i n e 对b s a 、脱氧尿苷对b s a 的 荧光淬灭的l ( q 一入e x 数据，见表1 2 、13 ，并作曲线。如图15 、16 。 国默慰愚弧一嫩披 辫 表1 2u r i d i n e 对b s a 的l c q 一入e x 数据表 入戗( r i m )l 【q ( 1 0 9m 一s 。1 ) 2 8 05 8 7 0 2 8 15 8 6 0 2 8 25 8 l o 2 8 3 4 6 0 0 2 8 43 3 3 0 2 8 51 9 1 0 2 8 75 3 8 2 9 01 3 0 2 9 51 8 7 3 0 03 8 2 3 0 53 7 5 3 1 03 4 1 九一( n m ) 一 图1 5 u r i d i n e 对b s a 的l ( q - 入e x 曲线入e n l = 3 6 0n m 【b s a 】= 4 3 1 0 6m o