（有机化学专业论文）星型聚乙二醇的合成研究.pdf

摘要 天然或重组的未经任何修饰的多肽类药物易引起机体的免疫 反应，而且在体内的半衰期短，这样就减弱了这类药物的临床效 果，大大限制了它们的应用，但经修饰剂修饰后，药物性质发生 改变：( 1 ) 减弱或消除免疫原性、抗原性；( 2 ) 增加药物的溶解性和 稳定性，延长药物在体内的半衰期。目前用的修饰剂很多，其中 单甲氧基聚乙二醇r m p e g ) 就是一种非常重要的修饰剂，通过了美 国f d a 认证，具有很好的生物相容性。m p e g 作为修饰剂，分子 量越大，修饰效果越好，目前常用的是单链m p e g 衍生物修饰剂， 由于m p e g 制备技术原因，分子量不能做得很大，本文采用星型 分子结构，通过数条m p e g 链做大分子量。 本文选择的m p e g 的分子量为7 5 0 、5 0 0 0 。用分子量为7 5 0 的m p e g 合成了混合有两条m p e g 链和一条m p e g 链的赖氨酸 型分子，其分子量为1 2 4 0 ；混合有三条m p e g 链、鼹条m p e g 链和一条m p e g 链的t r i s 型分子，其分子量为2 1 8 8 ；合成的环 糊精型分子中所含最多m p e g 链数至小有1 0 条，产物是含有各 种链数的混合物，分子量为9 9 2 0 。用分子量为5 0 0 0 的m p e g 合 成了混合有两条m p e g 链和一条m p e g 链的赖氨酸型分子，分子 量为7 4 4 0 ；混合有三条m p e g 链、两条m p e g 链和一条m p e g 链的t r i s 型分子，分子量为9 2 3 0 。采用f t - i r 、元素分析、 1 h 。n m r 、l c m s d 、凝固点降低法测分子量等方法对其组成、结 构、分子量进行分析表征。 关键词：修饰剂，单甲氧基聚乙二醇，星型分子 a b s t r a c t t h ec l i n i c i m p a c t o f p h a r m i cp e p t i d e w i t h o u tm o d i f i c a t i o ni s w e a k e n e db e c a u s ep h a r m i cp e p t i d ei si m m u n et ot h eb o d y ，t h e r e f o r e t h eu s eo fp h a r m i c p e p t i d ei sl i m i t e d h o w e v e r ，i ts h o u l db ee f f i c i e n t i fi ti sm o d i f i e dw i t h m o n o m e i h o x y p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ，w h i c h p a s s e s t h ea t t e s t a t i o no ff d ao f a m e r i c a ：( 1 ) i m m u n i t y a n d a n t i g e n i t y o f p h a r m i cp e p t i d e a r e a v o i d e d ( 2 ) d i s s o l u t i o n a n d s t a b i l i t yi n c r e a s e ( 3 ) t h e h a l fl i f ei s p r o l o n g e d i t i ss h o w nt h a t m o l e c u l a rw e i g h to fm p e g i sl a r g e ra n di ti sm o r ee f f i c i e n t a n dt h e s i n g l em p e g i s c o m m o n l yu s e da sm o d i f i c a t o r yr e a g e n tp r e s e n t l y ， b e c a u s eo fs y n t h e t i c a lt e c h n o l o g ym o l e c u l a r w e i g h to fm p e g c o u l d n o tb em a d et ob e l a r g e r i n t h i s d i s s e r t a t i o n ，s t a rt y p em o l e c u l e s w i t hs e v e r a lm p e gc h a i n sa r es y n t h e s i z e d i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，m o l e c u l a rw e i g h to fm p e gi s7 5 0 a n d5 0 0 0 t h em o l e c u l a rw e i g h to f l y s i n ec o n j u g a t e dw i t h d o u b l em p e g 7 5 0 c h a i n sa n ds i n g l em p e gc h a i ni s 1 2 4 0 ；t h em o l e c u l a rw e i g h to f t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n ec o n j u g a t e d w i t ht h r e e m p e g 7 5 0 c h a i n s ，d o u b l em p e g 7 5 0c h a i n sa n ds i n g l em p e gc h a i ni s 2 1 8 8 ； t h em o l e c u l a r w e i g h t o fd e x t r i n c o n j u g a t e d w i t ha tl e a s tt e n m p e g 7 5 0c h a i n si s9 9 2 0 t h em o l e c u l a rw e i g h to fl y s i n ec o n j u g a t e d w i t hd o u b l em p e g s 0 0 0c h a i n sa n d s i n g l em p e g s 0 0 0c h a i ni s 7 4 4 0 t h em o l e c u l a r w e i g h t o f t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e c o n j u g a t e dw i t h t h r e em p e g s o o oc h a i n s ，d o u b l em p e g 5 0 0 0c h a i n s a n d s i n g l em p e g s o o o c h a i ni s9 2 3 0 t h e c o m p o u n d s a r e c h a r a c t e r i z e db yf t - i r ，e l e m e n ta n a l y s i s ，1 h n m ra n dl c m s dt o i n v e s t i g a t e t h em o l e c u l a r c o m p o s i t i o n a n d s t r u c t u r e ，m o l e c u l a r w e i g h t k e yw o r d s ：m o d i f i c a t o r yr e a g e n t ，m o n o m e t h o x y p o l y ( e t h y l e n e g l y c 0 1 ) ，s t a rt y p em o l e c u l e l l 1 1聚乙二醇 1 前言 1 1 1 概述 聚乙二醇( p e g ) 也叫聚乙二醇醚【m 1 ，是一种水溶性聚合物， 一端为甲基的是单甲氧基聚乙二醇( m p e g ) ，后者在反应中不会发 生交联，在作修饰用途时，是更常用的。其分子结构式如图1 1 。 h o 一( c h 2 c h 2 0 ) 。一c h 2 c h 2 一o hc h 3 一o 一( c h z c h 2 0 ) 。一c h 2 c h 2 一o h p e gm p e g 图1 1 聚乙二醇( p e g ) 与单甲氧基聚乙二醇( m p e g ) 的结构简式 f i g 。1 1s t r u c t u r ef o r m u l a o fp e ga n dm p e g 它是由环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成而制得【引。商业上作为纯 品化合物的最大分子是三缩四乙二醇一j ，更大分子的因其蒸气压 太小，无法蒸馏分离，因此只能得到不同分子量的混合物i5 1 ，根 据分子量的大小不同，聚乙二醇物理形态可以从白色粘稠液体( 分 子量2 0 0 7 0 0 ) 到蜡质半固体f 分子量1 0 0 0 2 0 0 0 ) 直到坚硬的蜡状固 体( 分子量3 0 0 0 2 0 0 0 0 ) 。聚乙二醇产品以平均分子量来分类，如 p e g 4 0 0 ，其聚合度为8 - 9 ；p e g 1 0 0 0 ，聚合度为2 2 2 3 ；p e g 。2 0 0 0 ， 聚合度为4 5 ：p e g 6 0 0 0 ，聚合度为1 3 6 t 郇。 1 1 2 性质 1 。1 2 1 聚乙二醇的溶解性 聚乙二醇易溶于水和一些普通的有机溶剂。液体聚乙二醇可 以任何比例与水混溶，而固体聚乙二醇则只有有限的溶解度，但 即使是分子量最大的，在水中的溶解度大于5 0 t 7 - 1 0 。 1 1 2 2 相容性 聚乙二醇的许多宝贵的性能都来自它与许多物质的相容性。 一。般说，它对极性的物质显示最大的相容性，对低极性的物质则 1 相容性小【l 1 1 2 3 吸湿 生 较低分子量的聚乙二醇有能从大气中吸收并保存水分的能 力，并具有增塑作用，在工业中可以作为许多亲水性物质的湿润 剂。各种级别的聚乙二醇的相对吸湿性或对水的保持能力随分子 量增大而迅速下降。这是因为分子量增大，减小了末端羟基对整 个性质的影响。 1 1 2 4 化学性质 聚乙二醇在正常条件下是很稳定的，但是在1 2 0 或更高温 度下能与空气中的氧发生氧化作用。聚乙二醇的任何分解产物都 是挥发i 生的，不会生成硬壳状或粘泥状的沉积物。聚乙二醇分子 链，不论其长度如何，实际上是在两端带有羟基的二醇。因此他 们能发生所有表征脂肪组羟基的化学反应，如醣化反应，氰乙基 化反应等【 1 。 1 。1 2 5 毒性 聚乙二醇是一种温和、低毒的物质。这可以用任何方式的动 物实验和多年来在人类所摄取的物品中广泛用来证明。在美国， 联邦食品药物和化妆品条例的食品添加剂增补条例中，批准把食 物化学品药典级的聚乙二醇直接或间接用作食品添加剂，但用量 不要超过产生预期效果的计量【1 3 。4 1 。 1 2 用于修饰的p e g 的种类 根据文献报道 1 5 1 ，用于蛋白质修饰的p e gn - 7 以分为以下九类： 亲核p e g 、亲电活化p e g 、p e g 顺丁烯二酰亚胺【1 引、异双功能, p e g 、 生物素- p e g 、丙烯酸和甲基丙烯酸p e g 、硅烷p e g 、p e g 磷脂、 链状p e g 的介绍。以下是对这九类p e g 以及常用代表的p e g 的介绍。 1 2 1 亲核p e g 类 1 2 1 1p e g - o - c h 2 c h 2 一n h 2 2 带有伯胺的p e g 用处很广。p e g 末端的伯胺对酰基的反应性比 羟基的更活泼，p e g o c h 2 c h 2 一n h 2 还可以进行胺还原反应。它的 活泼性提供了种可通过稳定的连接剂( 带氨基的化合物、尿烷、 仲胺) 将其它分子连接到p e g 上的方法。 1 2 1 2p e g s h 含有巯基的p e g 能形成双硫键、能酯化和烷基化硫醇键是弱 亲核性的，因而能通过与卤代烷或硫酸酷发生取代反应消去。 p e g s h 特别适合与蛋白质或脂质体反应 1 7 - 2 1 】。 1 2 2 亲电活化的p e g 亲电活化的p e g 2 2 1 通常指的是具有亲电基团，能与氨基( 如：赖 氨酸) 和亲电试剂反应的p e g 衍生物。这类p e g 被广泛用来向蛋白 质、脂质体、可溶性和不可溶性的聚合物添加p e g 基团。一端具有 甲基的p e g 特别重要，因为这类p e g 的反应产物不会发生交联( 应该 注意，大部分m p e g 具有微量的乙二醇) 。反应通常使得目标分子连 接上多个p e g 。例如s p a p e g ，s b a p e g 我们必须根据p e g 衍生 物的水解稳定性、衍生物的活性、修饰后的产物稳定性、毒性、抗 原性等方面来选择合适的p e g 衍生物【2 3 1 。 1 2 2 1 酯活化的p e g 嗽一吼吼善。爹 o p e g 。0 c h 2 c h 2 c h 2 。c “。0 。n k 扩 s b a p e g 以p e g 丙酸琥珀酰亚胺酯( p e gs u c c i n i m i d y lp r o p i o n a t e ， s p a 。p e g ) 【2 4 1 、p e g q - 酸琥珀酰亚胺酯( p e gs u c c i m i d y lb u t a n o a t e ， s b a p e g ) 为代表的p e g 羧酸n 羟基琥珀酰亚胺酯2 引，它们是在将 p e g 偶联到蛋白质时，使用得最频繁的p e g 衍生物。 3 丁二酸一p e g 酯琥珀酰亚胺酯，( p e gs u c c i n i m i d y l s u c c i n a t e ， s s p e g ) 1 2 6 o oo 火 p e g o c c h 2 c h 2 一c o n 、i 扩 s s p e g 乙酸p e g 琥珀酰亚胺酯r s u c c i n i m i d y l e s t e ro f c a r b o x y m e h y l a t e dp e g ，s c m p e g ) 2 7 1 哪一o - 吼善。箩 1 2 2 2 亲电活化p e g 9 p e g o c o n 、旷n b t c p e g 甲酸p e g 三唑苯酯( b e n z o t r i a z o t ec a r b o n a t eo fp e g ，b t c p e g l b t c p e g 的活性l l p e g 琥珀酰亚胺酯的活性低，能跟肽和氨基酸的 氨基反应，条件温和，反应时间短 2 s , 2 9 。 1 2 2 3p e g 缩水甘油醚( p e g f l y c i d y le i t h e r ，p e o x p e g ) p e g o c h 2 且 p e o x p e g 4 户e g o c h 。么 + p r o i e i n - - n h 。 o h i p e g o c h 2 一c h c h 2 一n h p r o t e i n 环氧基的亲电活性中等，在大部分情况下能在较高的p h 条件下 进行偶联。它们能与氨基、羟基、硫醇反应，能通过p e g 一间隔臂 将酶固定。但是，应该注意到，环氧基的活性比n h s 酯的活性明显 低很多，反应生成的键( 仲氨) 稳定，这有利于亲和固定化酶的制备。 与伯氨反应生成仲氨，这样蛋白质修饰过程不会改变电性。 1 2 2 4p e g o 一羰基眯唑( p e g o x y c a r b o n y l i m i d a z o l e ) 嘲一。一岂0 一。一d c d i p e g 羰基眯唑基活化的p e g ( c d i p e g ) 3 0 捌1 通过脲烷键与氨基酸 共价连接。这类p e g 可以用来修饰小分子的药物，以及用来制备p e g 涂层的脂质体的m p e g 磷酸酰基乙醇胺。c d i p e g 的缺点是活性不 如n h s 高。 c d i p e g+ r n h 2 p e g 0 2 c - n h - r 1 2 2 5p e g 羰基硝基苯 o p e g - o - - c “- - o - ( 囝, , ) - n 0 2 n p c p e g p e g 5 6 j 羰基硝基苯3 3 f p e gp - n i t r o p h e n y lc a r b o n a t e s ，n p c - p e g ) 也可以与胺反应。同羰基咪唑基活化的p e g 一样，n p c p e g 通过脲 烷键连接，可以与蛋白质、肽、氨基酸以及其他生物分子反应。 n p c p e g 中的羰基与蛋白质的反应活性比p e g 0 羰基眯唑中羰基 的活性高。 5 1 2 2 6p e g 一醛- ( p e g a l d e h y d e ) o p e g 一0 一c h 2 c h 2 c h a l d p e g p e g c h o +r n h 2 + n a c n b h 3 p h6 7 p e g c h 2 一n h r 6 2 4 h 带有醛基的p e g 在氰基硼氢化钠存在的条件下1 3 4 ) ，与伯氨进行 氨还原反应。与其它的亲电基团不一样，醛只与氨反应。尽管p e g 醛的活性比n h s 酯的活性低，但是反应条件温和( p h 6 9 5 ， 6 - 2 4 h o u r s ) 。p e g 醛轭合物还有一个特征：可以通过氨基酸分析法对 它的水解产物的赖氨酸进行定量。p e g 醛可以和乙烯醇的羟基反应 生成乙缩醛键。丙醛衍生物在一般介质中比乙醛衍生物稳定。 1 2 2 7p e g 异氰酸( p e g o c h 2 n = c = o ，简称n c 0 一p e g ) p e g o c h 2 c h 2 一n ：c = o+r o h ，p e g o c h 2 c h 2 - - n h c 0 2 r p e g o c h 2 c h 2 一n = c = o+r n h 2 +p e g o c h 2 c h 2 一n h c o n h 只 异氰酸p e g l 3 5 1 能通过脲烷键将醇连接起来反应可以在有机 溶剂中以三乙胺为催化剂进行，也可以在碱性条件下在水相进行。 与氨的反应速度也很快。应注意到，由于p e g 胺与新合成的异氰酸 反应所以会有一些二聚体生成。 1 2 3p e g 顺丁烯二酰亚胺( p e g - m a l e i m i d e ，m a l - p e g ) 眦一o m a l p e g 6 瞄一一s h 一隅一p 连接有顺丁烯二酰亚胺 3 6 , 3 7 1 的p e g 在蛋白质修饰中非常有用， 因为m a l p e g 能选择性地与含巯基的肽反应。反应中可能会发生 酰胺键断裂。 1 2 4 正吡啶基二硫- p e g ( p e g o r t h o p y r i d e d i s u l f i d e ，o p s s p e g ) 嗽一s - s 彳飞 n _ 0 p s s p e g o p s s p e g- ld t t p e g s h o 尸s s p e g 上p r o l e i r 卜- 一s h p h 7 o p s s p e g 【3 8 】容易与巯基反应，还可以与二硫基反应。 o p s s p e g 修饰的蛋白质也会在还原剂如二硫代苏糖( d t t ) 作用 下，反向进行解离。o p s s p e g 可以与d t t 反应制备p e g s h ，成 为亲核修饰剂【3 9 1 。 1 2 5 异双功能p e g 异双功能p e g 衍生物( 4o 】广泛用作大分子交联剂或作为两个不 同部分的间臂。异双功能p e g 除了两个相异的功能团，本身p e g 能 提供水溶性、生物相容性、柔性：而且两个功能团有很大的选择性。 有义献报道，合成了有酶活性的脱辅基酶蛋白为功能团的p e g 、固 相肽合成的接枝聚合物的载体、目标导向的聚合物药物。 1 2 5 1 胺酸类 例如：h o p e g n h 2 ，h o p e g c o o h ，h c l 一h 2 n p e g c o o h 4 1 , 4 2 7 1 2 5 2f m o c s f i 叔丁氧羰基类( f m o ca n d t - b o c p r o t e c t e da m i n e s ) t - b o c 保护基4 3 州1 可以用三氟乙酸( t n ) 轻易除去。 女：h o p e g n h t b o c ，t - b o c n h p e g c 0 2 n h s ，t - b o c n h p e g n h 2 ， f m o c 。n h p e g c 0 2 一n h s 1 2 5 3 荧光一p e g n h s 这类p e g 可以用荧光法检测，例如：n h s 顺丁烯亚胺 ( n h s m a l e i m i d e ) 年n n h s 一乙烯砜( n h s v i n y l s u l f o n e ) 4 7 i 毗一罐一peg-rc-i1 。一 il 、 洲z 3 洲一i 一卜弋一 o n h s v 一 v p h 8 c h 2 = c h s 0 2 一p e g c 0 2 n h s +r 1 一n h 2 c h 2 = c h s 0 2 一p e g c o n h r p h 7 - r 2 s c h 2 一c h 2 一s 0 2 一p e g c o n h 只 r 2 一s h 乙烯砜和顺丁烯亚胺基团在p h 7 环境中选择性地与巯基反应， 在p h 值更高一些的环境中与氨基反应，但是速度慢。另外，乙烯砜 基团不易水解：而顺丁烯亚胺对水有些活性。n h s 酯基对胺基有 很高的活性，但是在水环境中不稳定。通过先将n h s v s p e g 和 n h s m a l p e g 胺基连接在n h s 酯上 4 8 , 4 9 】，随后连接上巯基，这样 它们可以用作修饰剂。n h s v s p e g 的优点是乙烯砜的水解稳定性 使得很容易进行第二步反应。 1 2 6 生物素p e g b j 。t j 卜p e g c 0 2 - - n h s 工r n h 2 。卜b j o t 卜p e g r r a v i d i n r p e g - - b i o t i n ：a v i d i n - - r 8 火y。 一 一盼呻 州 。_ | 耋 一心步叫 n 生物素【5 5 3 】和抗生索蛋白有很好的生物功能，p e g 水溶性好、 无毒，可以作为连接臂。连接上p e g 可以增加非水溶性分子的溶解 度，减少免疫原性【1 4 1 。抗生素蛋白是多价的，一分子抗生素可以连 接多分子的p e g 。 1 2 7 丙烯酸和甲基丙烯酸p e g ，( p e ga c r y l a t ea n dm e t h a c r y l a t e ) c h 2 = c h c 0 2 一p e g c 0 2 一n h s ，p e g 一0 2 c c h = c h 2 ，p e g 0 2 c c ( c h 3 ) = c h 2 ，丙烯酸一p e g 矛f l 甲基丙烯酸p e g o b 通过乙烯系聚合作用 和共聚作用制备具有生物功能的接枝聚合物和交联物。这些物质具 有抗蛋白质和细胞吸附性，并且断裂产物无毒i 5 4 - 5 8 1 。 1 2 8 硅烷p e g 阼卜s i ( 0 洲2 洲3 。+ 一r 洲斗一s li - - o - s f 加饿g 硅烷化 5 9 , 6 0 1 提供了一种修饰玻璃和金属的方法，将p e g ) j i 到玻 璃和金属的表面上，可以控制毛细管电泳的电渗和蛋白质吸附的方 法。p e g 三甲基氧硅烷提供了一种一步进行p e g 表面改性的方法。 1 2 9p e g 磷脂 磷脂可以用于药物的缓释剂和药物的选择性释放剂。但是磷 脂，特别是大的磷脂在体内很快被清除。研究发现，在磷脂上接p e g 可以提高磷脂在血清中的寿命。在脂质体接上p e g 的方法有两种： 用p e g 磷脂形成脂质体，另一个方法是将有胺基的脂质体与适当活 化的p e g 反应【6 1 6 4 1 。 1 2 1 0 链状p e g 按链结构形状的不同，聚乙二醇衍生物有线形、星形和梳形。 线形聚乙二醇衍生物只包含一个聚乙二醇线形结构单元。星形聚乙 二醇衍生物中包含若干个呈辐射状的聚乙二醇结构单元。其结构一 般为 i x 一( c h 2 c h 2 0 ) 。 a z ，【( c h 2 c h 2 0 ) 。o h b ，x 可以是胺基【6 5 1 、羟基6 引、 q 羧基f 67 1 、醛基f 68 1 、巯基f 6 9 1 、氯素和环氧化物1 7 0 3 等；z 可以是酰胺、 氨基甲酸酯和酯类等；m 、n 一般为1 0 2 0 0 0 ，a 一般为1 5 ；b 一般为 1 1 0 0 。星形的p e g 一般只有一个相对活泼性较高的端基，这个活性 端基可以在p e g 的一端，也可以在z 上。聚乙二醇与马来酸酐等化 合物形成的共聚物具有多个反应位点，呈现梳形结构，因而被称为 梳形聚乙二醇衍生物，结构如图所示。 ffii - - - - - - l c is l 1 3p e g 的应用 1 3 1 生化分离方面的应用 p e g 被人们广泛地用于生化分离，如双水相萃取。由于p e g 对 蛋白质的保护效应，它己经被广泛用于生化分离中，特别是蛋白质 的双水相萃取中1 7 1 7 2 】。 1 3 2 药物合成及保健药品等方面的应用 蛋白质共价偶联上p e g 后，活性丧失较小，呈现出非免疫原性、 非抗原性以及在血清中的半保留时间延长，故已经被大量用于药物 合成、化妆品、保健药品，p e g p r o t e i n ( p e g 化的p r o t e i n ) 已被批准 用于人体临床实验，f d a 批准用于体内服用 7 3 , 7 4 】。 在医药上有用的p e g 修饰的蛋白质据不完全统计，己修饰过的 酶类有2 7 种，他们是：l 一天冬酰胺酶，谷氨酰胺酶一天冬酰胺酶，过 氧化氢酶，尿激酶，胰蛋白酶链激酶，精氨酸酶，核糖核酸酶， 酰苷脱氨酶等【7 5 】。 p e g 除了进行分子修饰，还可以进行表面涂层，形成保护性的 生物相容性的涂层。这些应用包括动脉替换、诊断设备和血液接触 设备的p e g 涂层。在区带毛细管电泳中，用p e g 对毛细管涂层，可 控制蛋白质的吸附并提供一种控制电渗的关键技术。 p e g p r o t e i n s 除了在上述医药和分离方面的应用外，在生物技 术方面还有其他应用，特别值得指出的是p e g 偶联可引起p e g 化的 1 0 酶在无水有机溶剂( 如无水氯仿) 中的溶解性。p e g 的另一个应用是 通过p e g 偶联剂连接结合位点和催化位点以合成人工酶【7 6 , 7 7 l ，在这 应用中，因p e g 偶联的长度、亲水性而显示出其重要性。u r a b e 及o k a d a 将其应用在半合成氧化酶的制备中。在y o s h i n a g a ，y s h i d a s a g a w a 以及o h k u b 的相关性工作中，他们将具有催化活性的金属卟 啉复合物偶联至f j p e g 修饰的牛f 清白蛋白( p e g m o d i f i e db s a ) 得到 了杂化的、在有机介质中具有活性的催化剂。他们指出了杂化的 ( h u b r i d ) 半合成酶的概念包括以下两个部分：一种无催化活性的 蛋白质；有催化活性的非蛋白金属复合物( c o m p l e x ) ；通常蛋白质 含有渗水微区，能捕有机化合物，因此蛋白质上引入对某一反应有 催化活性的合适的功能团后，就使蛋白变成为一种既可结合反应物 又能催化特定反应的杂合物。在p e g 制各中，可在聚合物和蛋白质 ( p r o t e i n ，p r ) 之间插入一个氨基酸，此时氨基酸作为手臂( s p a c ea r m ) 。 这种类型的手臂可因所引入的氨基酸的性质的不同而呈现不同的 优点。例如蛋白质中很少含有色氨酸( t r y p t o p h a n ) ，引入它后，它 的很强的荧光可用来研究紧靠聚合物的水一蛋白质( w a t e r p r o t e i n ) 界 面的微环境。另外，使用具有放射性的氨基酸作手臂可用来制造用 于药动力学实验的产品。最后，双功能氨基酸( 例如赖氨酸) 可以将 二倍的m p e g 弓l 入蛋白质的表面，从而使阻碍抗体接近的阻力更大。 在反应的最后，未反应的m p e g 在蛋白质纯化的最后一步通过凝胶 过滤从修饰后的m p e g p r 中去除。 1 3 3p e g 脂质体 脂质体可以用于药物缓释剂和选择性释放剂，但是容易被巨噬 细胞所吞噬，体内的停留时间短。连接上p e g 后，可以降低脂质体 被巨噬细胞吞噬的速度 7 8 1 。 1 3 4p e g 作为分子与分子或分子与表面的连接剂 p e g 具有亲水性、生物相容性，良好的化学特性是用作分子一 分子、分子表面的理想的连接剂。这种连接技术对下一代的药物 非常重要。研究表明，用p e g 做为连接剂可以制各高活性药物【7 9 1 。 1 3 5 生物聚合物的合成 肽、低聚核苷酸和低聚糖这三种生物低聚物可以在p e g 水溶性 载体上制备。p e g 低聚物沉淀，可以被分离出来。这种制各低聚物 的方法的优点是：出错的可能性更小，反应速度快，可以进行大规 模的处理。这种方法得到进一步改进：将p e g 链接在固体聚苯乙烯 微粒上，这样既可以利用固相合成，又可以利用液相合成。 1 3 6 基于p e g 的水凝胶 多功能的p e g 可以通过多种方法进行交联来制备水凝胶。这些 水凝胶的用处很多，其中重要的用途是药物缓释剂和创伤的敷料。 除了以一f ：的用途，p e g 还广泛用于塑料和橡胶、表面活性剂、涂料 和油墨工业、洗涤剂、造纸、纺织、皮革、食品加工、木材加工、 陶瓷加工、电镀、金属加工、照相器材、农业、粘结剂等行业【8 0 】。 1 4p e g 修饰工艺中的注意要点 ( 1 ) 一般选择分子量为5 0 0 2 0 0 0 0 的p e g 作为修饰剂，应用甲氧基聚 乙二醇常能获得更好的效果 8 1 8 4 | ； ， ( 2 ) 蛋白质分子上被p e g 修饰的某几个氨基酸残基可能与蛋白质活 性有关，所以要尽量选择对酶活影响小的修饰方法【8 5 胡7 】； ( 3 ) 修饰的最后结果不仅与所用的活化剂有关，而且还与反应物配 比、p e g 分子量有关。调节反应体系中活化p e g 量能够控制酶分子 的修饰程度。一般当活化p e g 酶的反应配比为1 5 5 0 ：1 ( 摩尔比) 时， 修饰后至少可保留1 5 的酶活性，最多可达4 0 以上 8 8 , 8 9 l 。 f 4 ) 在多数情况下，酶的抗原性随着分子表面的自由氨基被p e g 修 饰而降低，当酶分子上5 0 以上自由氨基参与修饰反应后，酶就几 乎失去了抗原性，但是酶的活性也常常随着被修饰自由氨基数增加 而下降【9 0 1 。 1 2 2 1引言 2 分子量为7 5 0 的m p e g 星型分子的合成 m p e g 修饰的蛋白药物的药代动力学性质与m p e g 相对 分子量有关，分子量越大，药代动力学性质越好【9 ，而药物的生 物活性则刚好相反。分子量过大，修饰后的蛋白药物与受体的亲 和力较低，生物活性下降【92 。，选择m p e g 的相对分子量需要综合 考虑生活性和药代动力学两方面的因素。理想的m p e g 修物饰剂 的相对分子量为2 0 0 0 2 0 0 0 0 9 3 】。本文选择m p e g 的相对分子量为 7 5 0 ，合成了含两条m p e g 链的赖氨酸型分子( m 。= 1 8 1 0 ) ，含三条 m p e g 链的t r i s 型分子( m 。= 2 7 2 0 ) 及二十一条m p e g 链的环糊精 型分子f m 。= 1 8 6 4 8 ) 。下面分别进行讨论。 2 2含两条m p e g 链的赖氨酸型分子的制备 2 2 1 试验试剂及仪器设备 实验中所使用的溶剂，如二氯甲烷、无水乙醇、乙醚、二氧 六环等，在使用前都进行了干燥处理，以除去溶剂中的少量水分。 实验中所采用主要试剂和原料的来源、纯化过程及其主要的 物理、化学性质如下： 乙醚( e t h y le t h e r ，c h 3 c h 2 0 c h 2 c h 3 ，m = 7 4 ) ：无色透明液体， 沸点为3 4 6 ，易挥发。湖南科仪公司，分析纯。干燥：制备无 水乙醚时，先用氯化钙干燥数天，过滤后，加入钠丝。反复地加 入钠丝直到钠的光泽不变为止。 二氧环己烷( d i o x a n e ，c 4 h 6 0 2 ，m = 8 8 ) ：无色透明液体，沸点 为1 0 1 ，和水可任意混溶。湖南科仪公司，分析纯。干燥：向 二氧环己烷中按重量加入1 0 的浓盐酸煮沸回流3 小时，并慢慢 通入氮气流。然后分出水相，在水相中加入固体氢氧化钾振摇， 过滤后加入钠，煮沸回流一小时，蒸馏后，二氧环己烷中加入钠 丝贮藏之。 二甲基甲酰胺( d i m e t h y l f o r a m i d e ，c 3 h 7 n o ，m = 7 3 ) ：无色透明 液体，沸点1 5 3 ，可以和水及大多数有机溶剂混溶。湖南化玻 1 3 公司，分析纯。干燥：将2 5 0 克二甲基甲酰胺，3 0 克苯和1 2 克 水的混合物进行分馏，首先蒸出苯、水、胺以及氨，然后真空蒸 馏，便蒸出很纯的二甲基甲酰胺。 二氯甲烷( c a r b o nd i c h l o r i d e ，c h 2 c 1 2 , m = 8 5 ) - 无色透明液体， 易挥发，沸点为4 0 c ，有麻醉作用，损害神经系统。湖南科仪公 司，分析纯。干燥：二氯甲烷依次用酸、碱和水洗涤，加入无水 碳酸钾干燥，然后进行蒸馏。 q ：i 醇( m e t h a n o l ，c h 4 0 ，m = 3 2 ) ：无色透明液体，易挥发，沸点 6 4 7 ，损伤神经，引起视力障碍和失明。湖南师范大学试剂厂， 分析纯干燥。干燥：每e f l 醇中加入5 克镁屑，反应停止后，煮沸 回流2 3 小时，然后进行蒸馏即得到无水甲醇。 乙醇( e t h a n o l ，c 2 h 6 0 ，m = 4 6 ) ：无色透明液体，易挥发，沸点 7 6 。湖南师范大学试剂厂，分析纯干燥。干燥：加无水硫酸镁 干燥数天，过滤，蒸馏即得无水乙醇。 毗啶( p y r a d i n e ，c 5 h 5 n ，m = 7 9 ) ：无色透明液体，沸点为1 1 5 6 ，有吸湿性，能与水、酒精以及乙醚混溶。对皮肤有刺激作用， 吸入吡啶蒸气可出现头晕、恶心和肝肾损害。湖南科仪公司，分 析纯。干燥：毗啶用氢氧化钾干燥，经过一个良好的分馏柱进行蒸 馏，收集1 1 4 1 1 6 馏分。 单甲氧基聚乙二醇( m o n o m e c h o x y l p o l y e t h y l e n eg l y c o l ， m = 7 5 0 ) ：室温为无色粘稠液体，有吸湿性，用作原料。a c o r s 公司，分析纯。 赖氨酸( l y s i n e ，c 6 h 1 3 0 2 n 2 ，m = 1 3 1 ) ：淡黄色粉末，用作原料。 上海陆都化学试剂厂，分析纯。 对甲苯磺酰氯( t s c l ，c 7 h 7 s 0 2 c i ，m = 1 9 0 5 ) ：无色晶体，易吸 潮，置空气中冒自雾，湖南科仪公司，分析纯。 三羟甲基氨基甲烷( t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ， c 4 h 1 1 n 0 3 ，m = 1 2 1 ) ：白色晶体，a c o r s 公司，分析纯。 环糊精( d e x t r i n ，m = 1 1 3 4 ) ，白色固体，湖南科仪公司，分析 纯。 主要的仪器设备如下 磁力搅拌加热器巩义市英峪予华仪器厂 1 4 真空泵 烘箱 气流干燥器 电子天平 冰箱 真空干燥箱 超声波振荡清洁器 红外光谱仪 液质联用仪 核磁共振仪 元素分析仪 2 2 2制备方法 羧基化p e g 的制备： 巩义市英峪予华仪器厂 上海市实验仪器总厂 巩义市英峪予华仪器厂 长沙湘平科技有限公司 海尔有限公司 上海市实验仪器总厂 上海必能信超声有限公司 n i c o l e tm a n g n ai r 一5 5 0 型 a g i l e n t1 1 0 0s e r i e sl c - m s d v a r i a i n n o v a ，3 0 0 美国p e 2 4 0 0 1 1 型c h n 元素分析仪 仑l _ c m 。o 卜9 暮小o t s m 。扣咿呲卫悯卜淞。h 。h 赖氨酸型分子的合成： c o o h + h 2 n 、户h n h 2 卜枷 i 几可h n 心器敝勺纣叶飞讹 2 2 2 1 氨基化p e g 的制备 m p e g 的端羟基的活泼性不好，通常把羟基变成活泼性更高 1 5 轸。 劣 洲 k 枷扣 的基团，如对甲苯磺酸酯、氨基、羧基、醛基等 9 4 , 9 5 ，这些功能 化基团的引入扩大了聚乙二醇的应用范围，使它在有机合成、多 肽合成、高分子合成及药物的缓释、靶向施药等方面均具有广阔 的应用前景。以下是几种制各氨基化p e g 的方法【9 6 j ： n ) 氨合成法 b u c k m a n n 和j o h a n s s o n 用溴化聚乙二醇( p e g b r ) 作为原料 通过两种途径来合成聚乙二醇胺( p e g n h 2 7 , 9 8 ) ： p e g b ，+ h 2 n ( c h 2 ) s n h 2 p e g h n n ：h 2 ) b n h 2 ( 2 ) 盖布瑞尔合成法 m u t t e r ，g e c k e l e r 和c i u f f a r i n 用经典的盖布瑞尔合成法【9 9 】得 到了p e g n h 2 m 。o 卜枷o t 。 n h 2 。n h 2 m 。o 夺一守齐、n h 2 ( 3 ) 叠氮还原法 z a l i p s k y 用n a n 3 与氯化p e g 反应合成了的p e g - n h 2 的产率 达到了8 0 ，是一种较好的合成方法。不会引起链的断裂f 9 引。 n a n 3 d m f p e g - c i 二一p e g - - n h 2 h 2p d ce t o h 本文采用第二种方法合成了氨基化的p e g 。 单甲氧基聚乙二醇对甲苯磺酸酯( m p e g 0 t s ) 的合成1 9 6 ： 称取单甲氧基聚乙二醇( m p e g 7 5 0l o m m 0 1 ) 7 5 9 置于2 5 0 m i 三颈烧瓶中，加入5 0 m l 二氯甲烷( c h 2 c 1 2 ) ，再加入7 5 m l 三乙胺 ( e t 3 n 5 0 m m 0 1 ) 和9 5 9 对甲苯磺酰氯( t s c i ，5 0 m m 0 1 ) t - 3 8 温度下 1 6 搅拌反应4 h ，待反应完全后，在5 0 。c 下，旋转蒸发浓缩溶液。加 无水乙醚沉淀洗涤固体，弃去不要，往滤液中加2 0 0 m l 水， 1 0 0 m l c h 2 c 1 2 萃取，浓缩溶液至原来的2 3 ，停止加热，静止数天， 得到粘稠状液体，即产品，反复溶解、萃取几次。最后得到产物 重为8 7 9 ，产率9 7 7 。 氨基化m p e g ( m p e g n h 2 ) 的合成： 称取m p e g 7 5 0 - o t s 5 4 9 ( 6 m m 0 1 ) 溶于3 0 m l 二甲基甲酰胺 ( d m f ) ，加入邻苯二甲酰亚胺钾盐，在n 2 保护下，1 2 0 反应4 小时。减压蒸发除去溶剂，将残留物溶于5 0 m l 无水乙醇，加4 0 m l 水合肼，回流反应4 小时，旋转蒸发除去溶剂，将残留物溶于 5 0 m l c h 2 c 1 2 ，过滤除去不溶物，再将滤液旋转蒸发除去溶剂，用 无水乙醚沉淀，得到白色固体，纯化处理，得到产品2 5 9 ，产 率为5 5 6 。 2 2 2 2 羧基化m p e g 的制备 单甲氧基聚乙二醇羧基化后，可以提高m p e g 的反应性，以 下是几种制备羧基化m p e g