（农业昆虫与害虫防治专业论文）抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫Helicoverpa+armigera（Hubner）乙酰胆碱酯酶诱导作用的研究.pdf

抗胆碱酯酶剂噩致死剂量对棉铃虫h e l i c o v e r p aa 圳i g e , a ( h t l b n c r ) 乙酰胆碱酯酶诱导作用的研究中文摘要本文以棉铃虫h e l i c o v e r p ac l r m i g e r a ( h 0 b n e r ) 敏感品系( s s h ) 为对象，系统研究了抗胭碱酯酶剂亚致死剂量对乙酰胆碱酯酶( a c h e ) 的诱导作用，并对棉铃虫a c h e 进行了部分纯化，初步研究了棉铃虫对杀虫药剂耐性的分子机制。具体结果如下：1 选用3 种抗胆碱酯酶剂亚致死剂量( l d l o ) 处理棉铃虫3 龄幼虫2 4h 后，测定存活幼虫对辛硫磷、马拉硫磷、灭多威、溴氰菊酯和高效氯氰菊酯5 种杀虫药剂敏感度的变化。结果显示不同抗胆碱酯酶剂的诱导作用不同，导致棉铃虫对不同杀虫药莉教感度的变化存在差异。2 辛硫磷亚致死剂量( l d i o ) 诱导棉铃虫1 4 4h 内，a c h e 活性下降，对底物( a t c h ) 的亲和力在箕诱导的4 8h 内无明显变化。马拉硫磷和灭多威l d j o 剂量诱导对槔铃虫a c h e 活性诱导增加效应较为明显，但4 8h 内对底物的亲和力却明显降低。在对照组值明显升高的7 2 1 2 0 h 内，3 个处理组k 。值同本组其他时间段疋，值相比无明显变化，3 辛硫磷不同剂量对棉铃虫幼虫a c h e 比活力存在一定的抑制作用；马拉硫磷和灭；威对a c h e 的诱导则是随着剂量的增加，存在先抑制后诱导增加的作用。相同剂量下，灭多威的诱导增加效应较马拉硫磷明显。4 辛硫磷l d 】o 剂量连续诱导棉铃虫4 代，对a c h e 比活力和。作用表现为先抑制后诱导增加，但变化幅度较小。马拉硫磷和灭多威l d l o 剂量诱导棉铃虫幼虫两代后，对乙酰胆碱酯酶的诱导作用不明显。长期诱导过程中，三种药剂l d l d 剂量均明显影响昆虫生长发育。5 比较研究了棉铃虫两个敏感品系( s s - n 和s s h ) 羽i 一个抗性种群( 山东| j f | 谷，r r - y ) 对3 种抗胆碱酯酶剂的耐药性，同s s - n 品系相比，r r - y 对辛硫磷、马拉硫磷羊灭多威的抗性分别为7 ，1 3 和2 0 倍。同s s ，h 胎系相比s s n 品系对三种药剂更敏感。动力学研究表明棉铃虫3 个品系a c h e 的比活力和。没有显著差异，而a c h e 对底物a t c h 的亲和力( 五。) r r - y 却显著低于敏感品系。采用r t - p c r 技术从棉铃虫成虫头部克隆了a c h e 基因片段并制备探针进行s o u t h e r n 杂交，证明在有机磷和氨基甲酸酯抗性棉铃虫中不存在乙酰胆碱酯酶基因的扩增。对抗胆碱酯酶剂亚致死卉j j 量各处理组a c h e s o u f l e m 杂交表明，在亚致死剂量处理后，对a c h e 活性的诱导j 乍用不是由于乙酰胆碱酯酶基因的扩增。6 抗胆碱酯酶剂亚致死剂量处理2 4h 后。对棉铃虫a c h e 的密度梯度离心结果显示，处理前后a c h e 活性分布的变化在各梯度层差异显著，可能是由于抗胆碱酯酶剂亚致死剂量处理使棉铃虫a c h e 分子型的亚基结合发生改变造成的。棉铃虫对照及处理组a c h e 不同分子型敏感度的研究表明，对毒扁豆碱及灭多威抑制均相对敏感的5 3sa c h e 和只对毒扁豆碱的抑制相对敏感的8 , 7sa c h e ，处理后其l 值与对照相比明显升高，预示抗胆碱酯酶剂亚致死剂量引起的a c h e 活性和对底物亲和力的改变，可能是某些分子型分布比例及其对抑制剂敏感的a c h e 分子型敏感度发生改变的综合效应。7 采用c e a 亲和层析法对棉铃虫a c h e 进行分离纯化，通过s e p h a d e xg 2 5 、s e p h a d e xg 2 0 0凝胶层析及c e a 亲和层析，得到纯化倍数为2 0 6 倍的棉铃虫a c h e ，纯化效率为3 0 。关键词；乙酰胆碱酯酶。抗胆碱酯酶剂，亚致死剂量，诱导。棉铃虫抗胆碱酯酶荆亚致死剂量对棉铃虫h e l t c o v e r p aa r m i g e r a ( h u b n e o z , 酰胆碱酯酶诱导作用的研究! ! ! 自! ! ! ! ! e ! ! ! ! j 皇! ! ! ! 目皇! ! ! 自目e ! ! ! ! ! | 目! 曼! ! j ! ! ! ! ! 目e ! ! ! 曼, i ! ! ! ! ! 目! ! ! 皇f r o mt h r e es t r a i n sb yt h em e t h o do fr t - p c ra m p l i f i c a t i o na n dt h e r ew a so n en u c l e o t i d ea c i dd i f f e r e n tb e t w e e nr r - ya n ds u s c c p t i b l es t r a i n s ，w h i c hr e s u l t e di nn oa m i n oa c i dm u t a t i o n 1 h i sp a r to fa c h eg e n ew a su s e da sap r o b et op e r f o r ms o u t h e r nb l o t ，r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sn og e n ea m p l i f i c a t i o ni nr e s i s t a n tc o t t o nb o l l w o r m s o u t h e r nb l o t a l s oi n d i c a t e dt h a tt h e r ew a sn og e n ea m p l i f i c a t i o ni nc o t t o nb o l l w o r mt r e a t e db yt h r e es u b l e t h a ld o s e so f a n t i c h o l i n e s t e r a s ea g e n t sa n do t h e ri n d u c t i o nm e c h a n i s m sm a yb ei ne x i s t e n c e 6 s u c r o s ed e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o ns h o w e dt h a tt h e r ew a ss i g n i f i c a n td i f f e r e n td i s t r i b u t i o no fa c h ea c t i v i t yi ns a m p l eg r a d i e n t , 5 g r a d i e n ta n d2 0 0 , 4g r a d i e n tw i t ht h et r e a t e db yp h o x i m m e t h o m y la n dm a l a t h i o nr e s p e c t i v e l ya t2 4ha f t e ri n d u c t i o no f s u b l e t h a ld o s e so f a n t i c h o l i n e s t e r a s ea g e n 乜t h ea c h es e n s i t i v i t yo f d i f f e r e n ti s o f o r m sw a si n a s t i g a t e df r o mc o t t o nb o l l w o r mt r e a t e db yl d i 0a n t i c h o l i n e s t e r a s e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e1 5 0 v a l u eo f 5 3sa c h e ，w h i c hw a ss e n s i t i v et ob o t he s e r i n ea n dm e t h o m y l ，i n c r e a s e dt o2 0 - 3 3 0 - f o l dw h i l et h ei s ov a l u eo f 8 7sa c h e ，w h i c hw a ss e n s i t i v eo n l yt oe s e r i n e ，u p - t o1 0 -1 2 3 一f o l dc o m p a r i s o nw i t ht h ec o n t r 0 1 i ts u g g e s t e dt h a ti n d u c t i o nb yt h es u b l e t h a ld o s e sm a yc a u s et h ec h a n g e so f d i s t r i b u t i o n ，b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e sa n dt h es e n s i t i v i t yo f a c h et oi r t h i b i t o r s 7 t h ec e aa f f i n i t yc h r o m a t o g m p b yw a sa d o p t e dt op u r i f ya c h ef r o mt h eh e a do f c o t t o nb o l l w o r m b yu s i n gg e lf i l t r a t o no ns e p h a d e xg - 2 5 ，s e p h a d e xg - 2 0 0a n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yo n3 - e a r b o x y p h e n y le t h y l d i m e t h y la m m o n i u m ( c e a ) ，t h ee x t e n to fp u r i f i c a t i o nr e a c h e da b o u t2 0 6 f o l d sw i t hr e c o v e r i e so f 3 0 k e yw o r d s ：a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ，a n t i c h o l i n e s t e r a s ea g e n t s ，s u b l e t h a ld o s e s ，i n d u c t i o n ，h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ( h c i b n e 0独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名侈改时间：2 0 0 3 年5 月2 0 日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议)时闯：2 0 0 3 年5 月2 0 目时间：2 0 0 3 年5 月2 5 日第一章文献综述抗胆碱酯酶剂亚致死剂量对棉铃虫h e l i c o v e r p aa r m i g e r a( h i i b n e r ) y , 酰胆碱酯酶诱导作用的研究第一章文献综述第一节乙酰胆碱酯酶研究概况乙酰胆碱酯酶( a c h e ，e c 3 1 1 7 ) 属于水解酶。除在神经传递过程中执行重要的生理功能外，也是有机磷和氨基甲酸酯类杀虫药剂作用的靶标酶。在正常情况下，神经冲动传导到突触前膜会释放乙酰胆硪a c h ) ，释放于突触间隙的a c h 一部分会和突触后膜上的乙酰胆碱受体( a c h r ) 结合，使膜的通透 生发生改变，产生兴旮i 生突触后电位( e x c i t a t o r y p o s t a y n a t i c p o t e n t i a l ，e p s p ) ，信号得以传导。信号传导后，a c h 必须马上脱离受体，否则受体被占领而无法继续进行神经传导。从受体上分离出来的和未与a c h r 结合的a c h 也必须除去，否则其积累会持续刺激受体，造成去极化阻断。神经递质a c h 分子的水解主要靠a c h e 来完成，首先a c h e 同底物a c h 形成可逆的复合体( 局) 然后在活性部位的丝氨酸上发生不可逆的乙酰化( k 2 ) ，释放胆碱，最后去乙酰化( 妫) 释放乙酸，形成游离的a c h e ，再开始一个新的循环，整个过程是相当快的。如果乙酰胆碱酯酶被某种杀虫药剂抑制，就会使酶磷酰化或氨基甲酰化，钝化酶的活性使之不能水解a c h 。造成这种神经递质的积累而持续刺激a c h r ，最终造成神经阻塞。乙酰胆碱酯酶作为酯酶家族中的重要一类，广泛存在于自然界的生物中。动物中a c h e 是神经传导中重要神经递质a c h 的水解酶主要存在于胆碱激性突触的突触前膜、突触后膜及突触间隙。在高等植物中，a c h e 可能参与植物代谢、生长和发育及与膜透性有关的生理过程的调控，并参与植物与植物、细胞与细胞之间的相互作用其主要存在于质膜或细胞壁上( 王恒彬等，1 9 9 9 ) 。同样在多种细菌、真菌、低等植物中也发现了a c h e 。人体中存在乙酰胆碱酯酶和丁酰腿碱酯酶两类胆碱酯酶。胆碱激性突触在人记眨中的重要作用是在本世纪7 0 年代被证实的( c r o w & g r o v e - w h i t e ，1 9 7 3 ) ，同时发现胆碱乙酰基转移酶和乙酰胆碱酯酶可有效控制阿尔茨海默病( a l z j a e i m e r s d i s e a s e ，a d ) ( d a v i s e t a l ，1 9 7 8 ) ，到目前为止，胆碱酯酶抑制剂仍是对阿尔茨海默病有效的主要治疗药物。由于a c h e 广泛的分布、复杂面重要的作用及与昆虫抗药性的关系，一直是毒理学家、生物化学家和医学家们感兴趣的研究领域之一，尤其是在药物代谢和抗性机理的研究中引起了广泛的关注。1 胆碱酯酶及a c h e 的研究历史胆碱酯酶( c h o l i n e s t e r a s e ，c h e ) 是一类丝氨酸水解酶。同其他丝氨酸水解酶相比，在活性中心丝氨酸周围有一个共同的五肽序列。并在胆碱酯酶和甲状腺球蛋白的羧基端区之间具有明显的序列同源性。根据最适底物，胆碱酯酶主要可以分为两类( s l i v e r ，1 9 7 4 ) ，但这种分类并不是绝对的。中国农业大学博士学位论文目前认为，在动物体内至少存缸阿类胆碱酯酶：乙酰胆碱酯酶义称真胆碱脯酶和j 酰j 日碱酯酶( b u c h e ) 又称假胍碱哺酶。这两类j | j ；l 碱哺酶都能被有机磷和氯基甲酸酯抑制，过量底物对a c h e有抑制作川，而对8 u c h e 无抑制作川。j i 沦是a c h e 还是8 u c h e 都是以六种_ ：同人小的异构体存在( m a s s o u l i e b o o ，t 9 8 2 ) ，同时，二者的基冈结构、氨基酸序列及空间三维构牲均显示了很高的同源性。而且月哪啦酯酶抵基酸序列与果蝇羽l 其他昆虫、部分真菌、及哺乳动物中的多种水自￥酶均波现一致性。乙酰胆碱酯酶、乙酰胆碱、h u 碱乙酰基转移酶和乙酰叭碱受体神：功能上相j ：芙联，称之为 h 碱激性突触。其中a c h e 的f i j f 究始i r 二十1 f i ：纪初，l o e w i n a v r a t i l ( 1 9 2 6 ) 实验发现有一类物质可被毒扁豆碱抑制， ：可以通过增加a c h 的蟥而延k 这种物质的作川。1 9 3 2 年，s t e d m a ne t 口 从马缸清中分离出这可以分解a c h 的酶，命名为胆碱酯酶。在二十世纪 七- t 年代，主要魁对a c h e 功能及生理生化特性的研究；八十年代，研究主要集巾在酶的分予，h 乖i 结构：其后，荚j ：a c h e 的研究，在酶的纯化、基i 州结构羽i 表逃及害虫分子抗约性等办呖都取榭了较人的进腱。1 9 6 4 年s m i s s a e r t 首先在棉红蜘蛛( t e t r a n y c h u a u r t i c a e ) 中发现一个变构的a c h e 对杀虫约刺的敏感度降低。在昆虫中，发现对杀虫药剂 产生抗性与变构的a c h e 有关足以：1 9 6 8 年，s c h u n t n e r & r o u l s t o n 观察剑存澳人利弧抗性铜绿蝇( l u c i l i c ac q g r i n a ) l p 二嗪农拥i 制5 0 a c h e 所需要的叫间要比敏感品系的长，随后义在其他抗性昆 - i v 。p 发现a c h e 的敏感应降低，至此人们确定a c h e 与抗性有关。1 9 9 1 年，s u a a m a ne t a 首次报道了电鳎a c h e 催化q f 基品体x 射线衍射图渚。1 9 8 0 年g r e e n s p a ne t a l 利部分非整侣性及诱变技术研究发明在粟蝇中只有一个旗冈编码a c h e 。随后h a l l s p i e r e ( 1 9 8 6 ) 及f o u m i e r e a ( 1 9 8 9 ) 克隆了这个基冈) f ：体外表达证实了这个丛p q 编码a c h e ( f o u m i e re t a l ，1 9 9 2 b ) 。2a c h e 的组织分布在人体内，a c h e 除主要分布j ：神经肌肉组织外，还存在1 ：人红血球、m 小板、巨噬细胞及血消中。中枢及外周神经系统帕a c h e 和a c h r 一起参与完成神经神经及神经肌肉突触之间动作电位的传递，a c h e 主要位1 ：突触后腆邻近胆碱受体( g i l e s ，1 9 9 7 ) 。其他动物巾a c h e 主要分布】：神经系统，脊椎动物的红血球带l 肌肉中也富俞a c h e 。已有的研究表明，往动物的中枢神经系统中，昆虫的a c h e 含姑远比脊椎动物半寓( m e t c a l f & m a r c h ，1 9 5 0 ) 。昆虫a c h e 主要分布在神经索，神经元年i f 中枢神经系统中( p i c h o n ，1 9 7 4 ：h a l l k a n k e l 1 9 7 6 ) 。存烈翅目比虫中，人部分a c h e酶活性集中在头部，约i _ 总活性的6 5 9 0 ，其余集中在胸部( m e l a n s o ne t a l ，1 9 8 5 ) 。x u b u l l( 1 9 9 4 ) 的研究表明骚扰角蝇头部a c h ei i i8 5 ，胸部i 吁1 2 而股部仅l i l3 。黼希武掷( 1 9 9 8 )的试验表叫棉铃虫幼虫和成虫体1 1 j 均以头部a c l l e 活性最高，a c h e 在成虫羽i 幼虫头、胸、腹部的话性分布分别是7 8 2 、3 9 、17 9 和9 0 3 、6 5 、3 2 。通常认为，在l 6 虫的神经年肌肉问的信号传递不是舭碱激性的，骨储肌纤维受兴奋和抑制两种类型的神经支配( h o y l e ，1 9 7 4 ) ，这两种突触部位从理沧上讲小庶禽有a c h e 。但是，b o o t h & l e e( 1 9 7 1 ) 在蟋蜱体躯的所彳肌肉巾都发现了a c h e 的存在农明在神经一肌肉连接处可能也存在胆碱激性突触。t o u t a n t ( 1 9 8 9 ) 在蜜蜂的骨骼肌提取物中发现了a c h e 的活性升川细织化学结合毒胸一2 一第一章文献综述豆碱抑制法证明存在于肌肉纤维核中。在黄粉甲( t e n e b r i om o l i t o r ) 雄虫附腺肌层的细胞内也发现了a c h e ，并证明和神经分布无关( l e n o i r - r o u s s e a u x g a u t r o n ，1 9 8 7 ) 。此外，在昆虫的血淋巴( c h a d w i c k ，1 9 6 3 ) 、肌细胞( l e ee ta t ，1 9 7 3 ) 、核膜、肌质肉( b o o t he l 廿f ，1 9 7 5 ) 中也发现有a c h e 分布。上述事实说明a c h e 不仅存在于昆虫的中枢神经系统中，也存在于其他的组织器官。由a c h e 的分布推测，其功能可能不只限于传统上公认的水解胆碱激性突触的a c h 。有机磷和氨基甲酸酯类杀虫药剂则既可抑制胆碱激性突触的a c h e ，还能抑制其它部位的a c h e 。3a c h e 催化部位及晶体结构传统观点认为a c h e 活性部位由酯动部位和阴离子部位两部分组成。酯动部位含有一个由丝氨酸的羟基构成的酸性作用点和一个由组氨酸咪唑环构成的碱性作用点，两者通过氢键结合，增强了丝氨酸羟基的亲核活性，使之易于与a c h 的羰基碳原子结合作用；阴离子部位至少含一个羧基，可能来自谷氨酸或天冬氨酸，能以静电吸引a c h 的季铵阳离子基团( n a c h m a n s o h n w i l s o n ，1 9 5 1 ) 。a c h e 水解a c h 的基本过程可分为三个步骤：首先乙酰胆碱分子结构中带正电荷的季铵阳离子头，以静电引力与胆碱酯酶的阴离子部位相结合；同时乙酰胆碱分子中的羰基碳与胆碱酯酶酯解部位的丝氨酸的羟基以共价键形式结合，形成乙酰胆碱和胆碱酯酶的复合物；其次乙酰胆碱与胆碱酯酶复合物裂解成胆碱和乙酰化胆碱酯酶；最后乙酰化胆碱酯酶迅速水解，分离出乙酸，酶的活性恢复( 图1 - 1 1 ) 。但实际上a c h e 的作用机理远比此复杂，例如目前认为a c h e 具有催化三联体( s u s s m a ne la 1 ，1 9 9 1 ) 、胆碱结合位点( r a d i ce ta t 1 9 9 2 ) 、酰基口袋、氧阴离子洞、外周阴离子部位等多个功能位点，这些功能位点以不同的方式与不同的化合物相互作用( r a d i oe t a l ，1 9 9 3 ) 。叩儿乙酰胆碱吣人姗e 十。乙酰化胆碱酯酶胆碱十犷十a c l i e乙酸复活的胆碱酯酶图1 - 1 i 胆碱酯酶水解乙酰胆碱过程的示意图f i g 1 - 1 一ls k e t c hm a po f c h o l i n e s t e r a s eh y d r o l y s ea c e t y l c h o l i n e1 9 9 1 年s u s s m a n 甜缸首次报道了电鳐( t o r p e d o c a l i f o r n i c a ) 掣j a c h e 催化亚基晶体x 射线衍射图谱( 图1 1 - 2 所示) 。传静中国农业大学博士学位论文囤l - l - 2 电鳐a c h e 单体3 d 圈( s u s s m l m 矗a l 1 9 9 1 )f i g 1 - 1 - 2 如s t r u c t u r eo f u c e t y k h o l i n e s t e r a s ei nz o r 邵a oc a o m c a圈中球棍状结构代表a c h e 话性中心a b 冉”耻d s t i c k m o d e l 虹世k 捌w 鲥k o f 暂哟4 曲d b 酬蛐该催化亚基是由1 4 个螺旋与1 2 个1 3 折叠组成的大小为4 5n m x 6 0 r i m 6 5 n m 的椭球形分子，n 螺旋和d 折叠在晶体中的含量分别为1 5 、3 0 。, ，b 折叠位于椭球形分子的中央，n 螺旋将其包围。a c h e 的晶体形式是有糖酯锚的同源二聚体，唯一的链间二硫键与羧基端的c y s s a 7 有关。立体结构分析显示a c h e 分子结构最显著的特点是在球形分子的表面有一向内凹陷的深而窄的谷( g o r g e ) 谷深达2n m 儿乎是酶分子的一半，近谷底部逐渐拓宽( 图1 1 3 a ) 。田l - l - 3 活性部位谷区和醋动部位的三联体f i g 1 - 1 3t h ea c t i v es i t eg o r g eo f a c h ea n dat i t a l y t j ct r i a di ne s t e r u t i c( f r o mh t t p ：w w w w e t z m a n n a c i l s t r u c t u r a l b i o l o g y l a g e q s u u m a n w e b p a g e t j k u r t j l s _ g r o u p h t m l )a c h e 活性中心的催化三联体( c a t a l y t i ct r i a d ) s e t2 0 0 、g l u3 2 7 和h i s4 4 0 均位于谷内( 图1 - 1 3 b )4 第一章文献综述因此这个谷又被称为活性位点谷区( a c t i v es i t eg o r g e ) 。通过序列同源性比较以及氨基酸定点突变分析分别确定g l u3 2 7 和h i s4 4 0 参与了a c h 的催化水解。活性位点s e r2 0 0 的羟基位置大约位于谷底向上0 4n m ，靠近a c h 的羰基碳原子，羰基的氧则应通过氢原子结合到g l u1 9 9 、t y r1 2 1 和或a l a2 0 1 位的两个酰胺骨架上( s h a f f e r m a n ，1 9 9 2 ) 。而焦克芳等( 1 9 9 8 ) 通过计算机模拟研究t c a c h e与a c h 相互作用，认为催化三联体可能由丝氨酸、组氨酸和色氨酸组成，谷氨酸则在促进质子转移过程中起重要作用。a c h e 活性中心与底物的结合部位由t r p8 4 、t y r3 3 0 ( 或p h e3 3 0 ) 、t y r4 4 2 与g l u1 9 9 构成，3个芳香族氨基酸残基中任何一个定点突变都能显著降低底物与a c h e 的亲和力以及酶的活性。研究表明，十烷双胺( d e c a m e t h o n i u m ，d e c a ) 的三甲基铵与t r p8 4 的吲哚环为3 点接触，t r p8 4 在所有已知的胆碱酯酶氨基酸序列中都是保守的，如果t r p8 4 被a l a 取代会导致a c h e 的催化活性降低并不能与e d r o p h o n i u m ( e d r ) 结合( s h a f f e r m a ne t a ，1 9 9 2 ) ，而活性的丧失对于四价底物是有选择性的，这说明四价铵与吲哚环的相互作用对稳定酶底物和酶一抑制剂复合体是非常重要的。a c h e 这一片段中的第二个芳香簇氨基酸残基一3 3 0 位的t y r 并不是保守的。而是p h e 或t y r ，3 3 0位氮基酸的芳香环同样对稳定酶一底物复合体也是很重要的，但3 3 0 位氨基酸的定点突变对a c h催化水解影响很小。t y r 4 4 2 与胆碱结合位点表面的形成有关，g l u1 9 9 所带的电荷对于该区域结合胆碱也有稳定性作用( r a d i c e t a ，1 9 9 2 ) 。另外一个阴离子部位，即外周阴离子部位，由色氨酸或酪氨酸等芳香族氨基酸组成，在与芳香基底物结合中起重要作用( b e r g n a n n e t a l ，1 9 5 0 ) 。分子外表面近谷的入口处主要由一些带负电的氨基酸t y r 7 0 、耐r 1 2 1 、t r p 2 7 9 和a s p 7 2 组成，这些带负电的氨基酸组成了a c h e 的外周阴离子位点( p e r i p h e r a la n i o n i cs i t e ，p a s ) 。d e c a 和p r o p i d i u m 等化合物与p a s 有很高的亲和力，这些配基结合于p a s 后，通过变构影响酶活性中心与底物或其它配基的亲和性。氨基酸定点突变研究表明，不同的配基结合于p a s 的位置不同，但所有配基的结合位点中均包括a s p 7 2 和t r p 2 7 9 ，这两个氨基酸的突变均能影响l u 月t 艰与p a s 的2 合( g i b n e ye la 1 ，1 9 9 0 ) 。4a c h e 的抑制齐9a c h e 除了和l 常的生珂f 底物 俞外也能和许多其他 构类似的底物结含，人多数不m 常f j 底物与a c h e 结合后，会降低酶对a c h 的降解，即对酶产生抑制。胆碱酯酶的抑制剂包括可逆性抑制和不可逆性抑制，前者是通过竞争性的阻止底物到达酶的活性部位而抑制乙酰胆碱酯酶，如他可林t a c r i n e 和腾喜龙e d r o p h o n i u m ；厉者则是通过与a c h e b 动部位丝氪酸共价结合丽降解了酶的催化活性，如p r o p i d i u m 和加拉删g a l l a m i n e 。分子结构式如图1 - l - 4所示。最早认识并广泛应用的a c i l e 抑制剂是自然界中存在的一种生物碱一毒扁豆碱( p h y s o s t i g m i n e ，依色林，e s e r i n e ) 。它能使活性部位丝氨酸残基氨基甲酰化而大大延迟酶的水解作用，使酶老化失去活性。从a c h e 对底物的水解机制可以推测出，任何一个能够取代a c h 季铵离子的化合物，如n - 苯基三甲铵、n 一甲基吡啶黠、n 一甲基喹啉铺和n 甲基丫啶鼢等，都可以和阴离子中国农业大学博士学位论文部位结合，是潜在的a c h e 抑制剂( e i d e f r a w i ，1 9 8 5 ) 。a c h e 有几类外周阴离子部位( 空间异构部位) ，可以同各种化合物结合。d 部位可以与c a 2 + 和癸烷双铵结合：y 部位可与a l ”结合( m a r q u i sl e r r i c k ，1 9 8 2 ) 。他可林帅们夕南一、腾喜龙p r o p i d i u m加拉朋囤1 1 _ 4 四种胆碱醋酶抑制剂的分子结构式f i g 1 - i - 4m o l e c u l ef o r m u l ao f t h ei n h i b i t i o n so f c h e农业生产中用于害虫防治的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫药剂都可以通过抑制昆虫体内的乙酰胆碱酯酶，影响突触部位神经冲动的传导而导致昆虫死亡。有机磷酸酯和氨基甲酸酯类药剂与a c h e酯动部位丝氨酸羧基的共价结合后，由于磷酰或氨基甲酰部分在酶的酯动部位解离速度非常缓慢，使酶无法恢复活性，而抑制a c h e 活性，有时也称为酸转移抑制剂。在a c h e 活性测定过程中起终止反应作用的毒扁豆碱也属于该类化合物。有机磷化合物通过磷原子的亲电子作用使有机磷与a c h e 丝氨酸的羟基结合，使a c h e 磷酰化。与磷原子相连的取代基吸电子性越强，化合物的抑制能力越强，但是，如果磷原子的亲电子性过强，会使化合物不稳定容易水解。有机磷实际上是以半底物的形式和酶反应形成一个磷酰化酶衍生物，类似于酶和底物反应时形成乙酰化酶。但是，和乙酰化酶相比，磷酰化酶和水反应的反应速率非常缓慢。氨基甲酸酯则可以和a c h e 形成氨基甲酰化酶衍生物。氮基甲酰化酶恢复的速度( 硒) 要比磷酸化酶快。和被称为不可逆抑制的有机磷化合物相比，氨基甲酸酯是一类可逆的抑制剂。在医学上应用的a c h e 抑制剂主要包括他可林( t a c r i n e ) 及其类似物、氨基甲酸酯类、生物碱类、卞基呱啶类、有机磷酸酯以及香豆衍生素等。研究表明a c h e 在分子水平上对抑制剂的敏感度与生物的遗传背景有关，不同科、属、种以及家族的生物的a c h e 对抑制剂的敏感度不同。有效的抑制剂是与乙酰胆碱a c h 相似程度高、与a c h e 活化位点匹配并且能为酶的水解反应提供最佳分子一6 第一章文献综述靶标的化合物。因此，好的抑制剂必须与乙酰胆碱酯酶具有高度的亲和性，亲和程度越高，需要的抑制剂浓度越低。5a c l l e 的分子型从各种组织和器官中分离纯化的a c h e 具有多种分子型，这些是在亚基组成、分子量、托克氏( s t o k e s ) 半径、沉降系数、糖蛋白组成、等电点、水解特性及酶转换数上有差异的一组酶，称之为a c h e 的同工酶( s i l v e r ，1 9 7 4 ；g o r d o ne l a l ，1 9 7 8 ：m a s s o u l i e & d o n ，1 9 8 2 ) 。可以利用不同分子型沉降系数的差别，采用蔗糖密度梯度超速离心技术加以分离( s a e z - v a l e r o e l a l ，1 9 9 3 ) 。a c h e 的所有分子型都是单基因编码的，通过改变m r n a 的加工和翻译后的修饰形成结构分支( 图1 1 5 ，t a y l o r e t a l ，1 9 9 3 ) 。骸稍函辩硭-e i p ，墨3e r 5e 6仉lk & 幸l 毒2 o 卫12 噩3 - 23 - 6 o | 1卜_ + 卜- 叫_ d 卜h哳群e l m 遴e 玉2 遍型黼e l酪戡、写| ，。酗圈1 1 _ 5 电鳐和哺乳动物a c h e 基因结构( t a y l o re t 以，1 9 9 3 )f i g 1 - 1 - 5 a c h e g e n es | r u c t u mo f t o r p e d o c a l i f o r n i c aa n d m a m m a l生物体内有六种a c h e 分子型：球形催化亚基的单体( g1 ) 、二聚体( g2 ) 和四聚体( g4 )以及与胶质样尾亚基连接的不对称四聚体( a 4 ) 、八聚体( a8 ) 、十二聚体( a1 2 ) ( 图1 1 6 ，s i l m a n& f u t e r m a n ， 9 8 7 ；m a s s o u l i ee la , ，1 9 9 1 ) 。在球状a c h e 分子型中，叉包括疏水型和亲水型。亲水分子能自由溶解于溶液中，疏水分子除含有酶催化亚基外，还在羧基末端含有一疏水结构域，并通过该疏水结构域将酶分子锚定于神经膜上，又称为两性分子型( r o s e n b e r r y ，1 9 8 5 ) 。果蝇、电鳐的电器官和哺乳动物红血球的两性g2 型a c h e 具有一个糖磷脂酰肌醇的锚通过乙醇胺与催化亚基c 末端连接( m a s s o u l i e ，1 9 8 8 ) 。7 -中国农业大学博士学位论文g 1图1 - 1 - 6 a c h e 的分子型( 仿s i l m a n f u t e r m a n ，1 9 8 7 )f i g 1 - 1 - 6t h ea s y m m e t r i ca n dg l o b u l a r 向r m so f a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e在不同物种，甚至同一物种不同组织内，a c h e 分子型因各组织执行功能的不同而有很大的差别。在鸡的快颤动( 船t - m i c c h ) 肌肉组织中几乎只存在a1 2 型的a c h e ，然而慢紧张( s l o wt o n i c )肌肉组织中则主要含有的是球状二聚体g2 型a c h e ( s i l m a ne a ，1 9 7 8 ) 。不同组成比例的肌纤维，a c h e 的不对称型和球状a c h e 含量也随之不同( l y l e se t a l ，1 9 8 2 ) 这一现象在某些哺乳动物组织肌肉中也存在( b a m a r de t a l ，1 9 8 4 ) 。在脊椎动物神经肌肉连接处主要存在的是不对称十二聚体和八聚体a c h e ，同时还有少量球状a c h e ( v i g n ye td 1 9 7 8 ) 。在哺乳动物中枢神经系统，尾部疏水性a c h e 是最主要的分子形式( m a s s o u l i ee ta 1 ，1 9 9 3 ) 。在哺乳动物脑中，a c h e 主要以球形催化亚基四聚体g 4 ( 1 0s ) 及少量单体( gi ) 形式共同存在( b a r a t e t 缸，1 9 8 0 ；r i e g e re l a l ，1 9 8 0 ；g r a s s ie a ，1 9 8 2 ：m a s s o u l i e & b o n 1 9 8 2 ) 。在昆虫体内，a c h e 分子类型相对简单，主要以球装的g 型为主，大多数为6 7s ，其次为5s ，可分为四种分子型，以糖酯锚固定在膜上的两性单体和二聚体及无糖酯锚的亲水单体和二聚体。其中两性的二聚体是昆虫a c h e 存在的主要形式，其余三种分子型含量很低。( t o u t a n te t a l ，1 9 8 9 ) 。t o u t a n t ( 1 9 8 9 ) 通过对粉蝶、黄粉甲、家蝇和果蝇a c h e 的研究，认为在上述昆虫中没有与脊椎动物中胶原蛋白尾型a c h e 有关的成分。d u d a i ( 1 9 7 7 ) 在果蝇中观察到了一个沉降系数为1 6s的a c h e 组分这种1 6s 型很有可能是两性g2 型的寡聚合体。是果蝇a c h e 的一个特征性成分。a r p a g a u se t a l , ( 1 9 8 8 ) 对黑腹果蝇整个发育过程中a c h e 的分子型进行研究得到：在不同发育阶段，a c h e 都以与膜结合的两性二聚体催化亚基为主要存在形式；幼虫和蛹前期也可以检测到两性g1型a c h e ，这种g1 型具有糖酯锚对磷脂酰基醇一磷脂酶c ( p i p l c ) 的降解是敏感的，并有可能是两性g2 型的前体：另外亲水二聚体和单体a c h e 两种分子型虽然量很少，但在所有的粗酶液中都有存在。f o u m i e r e t a l , ( 1 9 8 8 ) 证实果蝇的a c h e 是由一个5 5 k d a 和一个1 6 k d a 的非共价键结合的亚基组成，二硫键断裂显示两个5 5k d a 多肽在天然二聚体a c h e 中是连在一起的。用两个n 一和一8 ：辏h魄e v第一章文献综述c - 端a c h e 序列的抗体作w 醅t e m b l o t s ，结果表明5 5k d a 和1 6 k d a 多肽是由a c e 基因座位编码的同一前体蛋白经酶解产生的。a c h e 是一个双亲性蛋白，该蛋白通过糖脂锚( g l y c o l i p i da n c h o r ) 与神经胆碱激性突触膜相连，从而形成g2 型，糖脂锚位于5 5k d a 多肽c 末端，1 6k d a 和5 5k d a 的多肽的结合对a c h e 活性是很重要的。因为位于1 6k d a 多肽n 末端的氨基酸序列的保守程度，在果蝇和脊椎动物a c h e 之间是非常高的：而且在人b u c h e1 3 0 位置的天冬氨酸突变( 在果蝇1 6k d a多肽中也含有) 还会导致蛋白失活。对马铃薯甲虫( l e p t i n o t a r s a d e c e m l i n e a t a ) 的研究表明，a c h e以两种分子型存在，亲水型二聚体占9 2 ，两性单体占8 ，这两类分子型的分子量和等电点相同( z h u & c l a r k ，1 9 9 4 ) 。6a c h e 的基因结构目前已从电鳐、果蝇、蚊、鼠、鸡、鸟等生物体内克隆了a c h e 催化亚基的e d n a ，这些c d n a均编码一个长度约为5 3 5 个氨基酸的多肽链。该多肽链在脊椎动物和无脊椎动物问均表现了很高的同源性( m a s s o u l i e ，1 9 9 3 ) 。b e n d e r 耵甜( 1 9 8 3 ) 从果蝇中克隆了一段基因，该基因已知含有a c e 。h a l le ta t ( 1 9 8 8 ) 从分子水平上对果蝇的a c ee d n a 进行克隆和测序，证明a c e 基因是编码a c h e的基因。据此得到了昆虫的第一个a c h e 基因。同一生物的不同a c h e 分子，其分子大小、形状、溶解性等理化性质上都存在差异，但这些不周的酶分子却具有相同的底物催化特性，其原因在_ 丁ia c h e 氨基端的氨基酸序列在不同酶分子之间完全相同。该相同的氨基酸序列包含了a c h e 完成其催化功能所必须的所有氨基酸残基。因此，该段相同的氨基酸序列也叫做a c h e 的催化亚基。与催化亚基羧基端连接的不同结构域决定着酶分子的类型和酶分子的理化特性。遗传分析表明，在脊椎动物及大多数无脊椎动物体内。均只存在单个a c e ，其a c h e 均由单个a c e 编码( t a y l o r ，1 9 9 4 ；m a s s o u l i e 1 9 9 3 ) 。但在线虫c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s基因组中却发现了三个a c e ，其编码的酶对抑制剂的敏感度和对底物的催化特性各不相同，其中任何一个a c e 单独表达即能满足线虫生存及活动的需要( a r p a g a u se l a l ，1 9 9 4 ) 。m a l c o l me t 以( 1 9 9 8 )从一个不敏感a c h e 为主要抗性机制的尖音库蚊品系中，克隆得到一个a c h e 基因a c e x ，该基因与斯氏按蚊具有9 3 同源性。连锁分析表明，a c e x 位于染色体i 上，而与抗性相关编码a c h e l 的a ，位点