（微生物学专业论文）劳盆地深海热液喷口沉积物中微生物群落结构研究.pdf

硕士学位论文摘要 摘要 劳盆地深海热液喷口热液流富含硫化物及高浓度的f e ，m n ，c u ， z n ，c d 和p b 等金属，此区域的地理化学特征及生物群落明显不同于 东太平洋洋脊( e p r ) ，大西洋中脊( ) 等研究较多的热液区域。 这一热液环境中存在多种电子供体( 硫化物，有机碳，c h 4 和f e ) 和 电子受体( 0 2 ，s 0 4 2 。和c 0 2 ) ，从而能够支持不同的自养和异养微生物 的生长繁殖。东劳扩张中心主要有六个活性热液活动区，这些区域的 地理化学特征和微生物群落特征沿扩张中心的南北轴呈现明显的变 化趋势。因此这一区域是研究微生物群落结构、功能与地理化学环境 条件间复杂关系的理想区域，且越来越受到关注。 本论文针对“大洋一号”环球科考船于2 0 0 7 年5 月采集于东劳 扩张中心五个深海热液喷口的沉积物样品，进行了微生物群落结构及 其重要功能群落结构的研究，并对劳盆地深海热液喷口区微生物群落 结构与环境因子之间的相互关系进行了初步探讨。 首先利用p c r d g g e 技术研究了五个热液沉积物中细菌和古菌 的多样性。d g g e 图谱分析表明不同沉积物样品中细菌和古菌1 6 s r r n a 基因的d g g e 条带数目和位置不完全相同，这说明不同深海热 液沉积物样品的细菌和古菌群落结构具有一定的差异性。鉴别出的细 菌序列主要归属于六个类群：0 【变形菌，丫一变形菌，6 变形菌，变 形菌，拟杆菌和硝化螺旋菌。其中变形菌中y 变形菌和0 【一变形菌占优 势。古菌序列主要归属于泉古菌和广古菌两大类群，且多数序列只与 深海热液环境或其他海洋环境中检测到的不可培养序列具有相似性。 古茵序列具体又可划分为m i s c e l l a n e o u sc r e n a r c h a e o t i cg r o u p ( m c g ) ，i 类泉古菌( m a r i n eg r o u pi ，m g i ) ，d e e p s e ah y d r o t h e n n a lv e n t 砌，) 懈彤办船d 细5 和6 ( d h 1 5 和d m 但6 ) 四个类群。主成分分析表 明，东劳扩张中心深海热液喷口沉积物中微生物群落结构的差异与环 境地理化学性状之间的不同有一定的关联性。 为了弥补d g g e 技术的缺陷，获得更多的序列信息和更完整的 群落组成，选择了在地理化学特征及d g g e 研究的群落组成中差异 最大的两个样品r 懈4 和r v d y - 5 进行1 6 sr r n a 基因的克隆文库 分析。两个细菌克隆文库中均鉴别出了d g g e 分析中检测到的丫一变 形菌，一变形菌，6 变形菌，0 【一变形菌，拟杆菌及硝化螺旋菌六个 硕士学位论文 摘要 细菌类群，但是这些类群在两个文库中所占比例不同，丫变形菌依旧 是两个沉积物中的优势细菌类群。另外，r v d y 4 b a 文库中还鉴别出 了浮霉菌，r 、，d v 5 b a 文库中还检测到浮霉菌和厚壁菌。古菌1 6 s 枞克隆文库中的序列主要分为以下几个类群：m i s c e l l a n e o u s c r e n a r c h a e o t i cg r o u p ( m c g ) ，i 类和i i i 类泉古菌( m g i ，m g i i i ) ， m a r i n eb e n t h i cg r o u pe ( m b g e ) 和p s l l 2 相关类群。这些序列与已 知的分离物种亲缘关系较远，说明这一环境中存在许多其他环境未曾 发现的新的微生物物种资源。利用荧光原位杂交技术，采用荧光标记 的细菌和古菌1 6 sr r n a 探针研究东劳扩张中心五个深海热液喷口位 点沉积物中细菌和古菌数量，其中样品r v d y - l ，r v d v 2 和r v d v 4 中细菌比例较高，样品r v d v 3 中细菌与古菌比例相当，而样品 r v d v 5 中古菌比例较高。这些结果表明，东劳扩张中心深海热液沉 积物中具有较高的细菌和古菌多样性，且不同样品中细菌和古菌比例 不同。 另外，采用p c r d g g e 及r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r 技术对五个 沉积物样品中亚硫酸盐还原酶b 亚单位基因( 幽馏) ，质粒型甲烷单 加氧酶a 亚单位基因( p 聊刎) ，甲基辅酶m 还原酶仅亚单位基因 ( 聊c 叫) 的多样性和丰富度进行了调查分析。结果表明，在东劳扩张 中心深海热液喷口沉积物环境中凼以p 聊洲，朋c 剃基因的多样性相当 丰富，且不同位点间存在一定差异。幽馏序列分为五簇，其中多数序 列为无法归类的序列。p m 卅序列与属于7 一变型菌门的i 型甲烷氧化 菌和属于a 一变型菌门的i i 型甲烷氧化菌相关，其中i 型甲烷氧化菌占 优势。朋c 棚序列与甲烷球菌目，甲烷八叠球菌目和一类无法分类的 类群密切相关。实时定量p c r 结果表明凼馏，p 朋鲥，所c 剃基因在 热液沉积物样品中含量较为丰富，其含量均在1 0 5 到1 0 6 拷贝克( 湿 重) 之间。c c a 分析表明水深，p h ，有机碳及酸溶性硫化物含量对 凼地，p 所以，m 洲基因的影响较大。研究结果表明在东劳扩张中心 深海热液喷口沉积物环境中存在微生物的硫酸盐还原，甲烷的氧化及 产生活动；且多数序列与数据库中己知的序列同源性较低，从而说明 这些沉积物中存在凼培，p m 州，朋洲基因的特有新资源。 关键词劳盆地深海热液喷口，种群多样性，功能基因，p c r 一变性梯 度凝胶电泳，实时荧光定量p c r 1 i 硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t t h el a ub a s i n d e e p s e ah y d r o t h e n n a l f i e l d s d i s p l a yu n i q u e g e o c h e m i c a la n db i o l o g i c c h a r a c t e r i s t i c sw i mh i 曲c o n c e n t r a t i o n so f s u l f i d e sa n dm e t a le l e m e n t ss u c ha sf e ，m n ，c u ，z n ，c da 1 1 dp bi n h y d r o t h e m a lf l u i d s w h i c ha r ed i s t i n c t 舶mh y d r o t h e h n a lv e n ts y s t e m s o ft h ee a s tp a c m c 砒s e ( e p r ) ，m i d a t l a n t i c 砒d g e ( m a r ) a n do t l e r w e l l - s t u d i e dv e n ts i t e s av 撕e 够o fp o t e n t i a le l e c t r o nd o n o r s ( s u l f i d e s ， o 喀a n i cc ，c h 4a n df e ) a n de l e c t r o na c c e p t o r s ( 0 2 ，s 0 4 厶a n dc 0 2 ) h a v e b e e ni d e n t i f i e di nt h e s ee n v i r o n m e n t s ，p o t e n t i a l l ys u p p o n i n gm eg r o w c h o fd i v e r s eh e t e r o t r o p h i ca n da u t o t r o p h i cp r o k a 巧o t e s t h e r ea r es i xa c t i v e v e m i n gf i e l d sw i t hl a 玛e 铲a d i e n t so fp h y s i c o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s a l o n gt h ee a s t e ml a us p r e a d i n gc e n t r e ( e l s c ) ，m a k i n gt h e mi d e a l l y s u i t e df o rc o m p a r a t i v es t i l d i e so nt h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e ng e o c h e m i c a l v a r i a b l e sa n dm i c r o b i a lc o m m u n i t ys t n l c t u r e sa n d 血n c t i o ni nd e e p - s e a h y d r o t h e r m a lv e n te n v i r o m n e n t s i nt h i sp a p e r ，m i c r o b i a lc o m m u n i t ys t n j c t u r e sa n ds e v e r a lm 句o r m n c t i o n a lc o m m u n i 够s t r u c t u r e sw e r es u r v e y e di nt h ef i v es e d i m e n t s a m p l e sc o l l e c t e df 如md e e p s e ah y d r o t h e 珊a lv e n t sa l o n gt h ee a s t e m l a us p r e a d i n gc e n t r ed u r i n gr o u n d - t h e 一、v o r l do c e a nr e s e a r c ho fd a y a n g y i h a o ( o c e a nn o 1 ) i nm a y2 0 0 7 f u n h e m o r e ，w et r i e dt oa n a l y z et h e r e l a t i o n s h i p sb e t w e e ne n v i r o m n e n tp a r 锄e t e r sa n dm i c r o b i a lc o m m u n i t ) r s t m c n l r e s f i r s t ，b a c t e r i aa n da r c h a e ad i v e r s 时i ns e d i m e n t s 矗o m 矗v ea c t i v e h y d r o t h e r n l a lf i e l d sa l o n ge l s cw a ss u e y e db yd e n a t u r e dg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s d g g ep r o f i l e sr e v e a l e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e si n b a n d i n gp a t t e m so f16 sr 】卧淞g e n e s ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tb a c t e 订aa n d a r c h a e ac o m m u n i t ys t n j c t u r e sd i f 诧r e d 锄o n gs e d i m e n ts 锄p l e s 行o mt h e f i v ed e e p s e ah y d r o t h e m a ls i t e s t h eb a c t e r i a ls e q u e n c e si d e n t i f i e dw e r e c l u s t e r e d i n t o s i x l i n e a g e s ， a sf o l l o w s ： 0 【一尸加纪d 6 口c 绍，砌， 1 - p r o t e o b q c t e r i c l ，一p r o t e o b n c t e r i 口，- p r o t e o b q c t e r i q ，b 口c t e r o i d e t e sa n d m 抛印施e t h e0 【- 尸，切劬6 口c 幼砌a n d 丫棚纪d 6 口c 幼缸w e r et h em o s t a b u n d a n tp h y l o g e n e t i cg r o u p s a r c h a e a ls e q u e n c e sw e r em a j o r l yg r o u p e d i i i 硕士学位论文 a b s t r a c t i n( ? ，p 刀口，? c 办口p d f 口a n d 砌唧，c 吻口p d 胞，a n dm o s to fw h i c hw e r eo n l v r e l a t e dt ou n c u l t u r e da r c h a e a lc l o n e sd e t e c t e d 岔o md e e p s e a h y d r o t h e m a lf i e l d sa n do t h e rm a r i n ee n v i r o n m e n t s a c c o r d i n gt o p r e v i o u ss t u d i e s ，t h ea r c h a e a lp h y l o t y p e sr e c o v e r e dw e r ea s s o c i a t e dw i 也 t h ef o l l o w i n g 舯u p s ：t 1 1 em i s c e l l a n e o u sc r e n a r c h a e o t i cg r o u p ( m c g ) ， m 2 u r i n eg r o u pi ( m g i ) ，d e e p - s e ah y d r o t h e m a lv e n te 甜，) 馏砌口p d 幻5a i l d 6 ( d 卜【v e 5a n dd 【v e 6 ) p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i ss h o w e dt h e d i f j e e r e n c e so fm i c r o b i a lc o m m u n i t vs 仃u c t u i e sw e r ea s s o c i a t e dw i t l l g e o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so fs e d i m e n t s 行o md e e p s e ah y d r o m e 眦a l v e n t sa l o n gt h ee l s ct oac e r t a i nd e g r e e c o n s i d e r i n gt h ed i s a d v a n t a g eo fd g g et e c h n i q u ea j l di no r d e rt 0 o b t a i nm o r es e q u e n c ei n f o m a t i o na n dm o r ec o m p l e t ec o m m u n i t y c o m p o s i t i o n ，s a m p l er v d v 4 a n dr v d y 5w i t hs i g n i f i c a n td i 虢r e n c e 、v e r ec h o s e na sar e p r e s e n t a t i v ef o rc l o n el i b r a e sa n a l y s i so f16 sr r n a g e n e s s i xb a c t e r i a l l i n e a g e s d e t e c t e di n t h ed g g e a n a l y s i s ， 叶p r o t e o b c i c t e r i q ， f p r o t e o b a c t e r i 口，p r o t e o b n c t e n n ，孓p r o t e o b a c t e r i a ， b 口c 纪加洗五甜a n d z 力幻s p 加卯，w e r ea l s of o u n di nt h et 、v ob a c t e “a l l i b r a r i e s a l t h o u g ht h ep r o p o i t i o n so ft h e s eg r o u p ss h o w e dd i f r e r e n c e ， 丫b 纪d 6 口c 纪r 励w e r et h em o s tp r o m i n e n tg r o u p si nt h et w ob a c t e r i a l l i b r a d e s a d d i t i o n a l l y ，i nr 厂d y 4 b ac l o n el i b r a r y 尸肠刀c 幻m 弦p 纪譬w a s i d e n t i f i e d ， a n di nr v d y = - 5 b ac l o n e l i b r a w 尸肠刀c 幻聊w p 绝，砒1 d n r 所耙“五鲻w e r ei d e n t i f i e d 16 sr r n as e q u e n c e si na r c h a e a lc l o n e l i b r a r i e sw e r em a i n l vd i v i d e di n t ot h em i s c e n a n e o u sc r e n a r c h a e o t i c g r o u p ( m c g ) ，m 撕n eg r o u pia n di i i ，m 撕n eb e n t h i cg r o u pe ( m b g e ) a n dp s l12 一r e l a t e dg r o u p t h e s es e q u e n c e sw e r eo n l yd i s t a n t l yr e l a t e dt o k n o w nc u l t u r e da r c h a e a ，w h i c hs u g g e s t e dt h e r ew e r es o m en o v e la n d u n i q u em i c r o b i a ls p e c i e sn o td i s c o v e r e di nt h eo t h e re n v i r o n m e n t s t h e n u m b e r so fb a c t e r i aa n da r c h a e ai i ld e e p s e ah y d r o t h e n n a ls e d i m e n t s w e r ee s t i m a t e db yn u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o nw i t hs p e c i f i cp r o b e s o f16 sr r n a t h ef i s hr e s u l t si n d i c a t e dt h es a m p l er 、厂d y 1 ，r v d y 2 a n dr v d v 4h a dah i 曲e rp r 叩o n i o no f b a c t 面a ；s 锄p l er 、厂d y 3h a da s i m i l a rp r o p o i r t i o no fb a c t e r i aa n da r c h a e a ；s 锄p l er v d v 5s h o w e da h i 曲e rp r o p o r t i o no fa r c h a e a t h e s er e s u l t sd e m o n s t r a 把dt h a tm e r ew a s a i v 硕士学位论文a b s t r a c t h i 曲d i v e r s i t ) ，o f b a c t e r i aa n da r c h a e ai nd e e p s e ah y d r o t h e r m a ls e d i m e n t s a l o n gt h ee l s c ，a n dm ep r o p o r t i o n so fb a c t e r i aa n da 1 c h a e a 、 ，r e r e o b v i o u s l yd i s t i n c ta m o n gt h ed i 仔e r e n ts 锄p l e s a d d i t i o n a l l y ，d i v e r s i t ) r a n da b u n d a n c eo fg e n e se n c o d i n gt 1 1 e p s u b u n i to ft h ed i s s i m i l a t o 珂s u l f i t er e d u c t a s e ( 出广b ) ，as u b u n i to ft h e p a r t i c u l a t em e t h a n em o n o x y g e n a s ep 聊d 么) a n dt h em e t h y lc o e n z ：) ，m em r e d u c t a s e ( 朋c 叫) i ns e d i m e n t s 仔o ml a ub a s i nd e e p s e ah y d r o t h e 咖a l v e n t sw e r ei n v e s t i g a t e db yp c r d g g ea 1 1 dr e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r a n a l y s i so fs e q u e n c e ss h o w e dt 1 1 a tt h e r ew e r eac o n s i d e r a b l ed i v e r s i t yo f 幽馏，p 朋。爿，腕c 叫i ns e d i m e n t s 丘o ml a ub a s i nd e e p s e ah y d r o t h e n l l a l v e n t s ，a n dt h e r ew e r ec e i r t a i nd i f r e r e n c e sa m o n gm ed i f f e r e n ts i t e s t h e 出厂bs e q u e n c e s _ w e r ed i v i d e di n t ot h ef i v ec l u s t e r s ，i nw h i c ht h em a i o r i 钾 o fs e q u e n c e sw e r eu n c l a s s i f l e d t h ep ，”o 爿s e q u e n c e sr e t “e v e d 仔o mt l l e h y d r o t h e m a lv e n t s i t e sw e r ef o u n dt ob er e l a t e dt ob o t h t i y p e i m e t h a n o t r o p h i cm e m b e r so ft h e 丫一p r o t e o b a c t e r i aa n dt y p ei io ft 1 1 e a p r o t e o b a c t e r i a ，a n dt l y p eim e t h a n o t r o p h sw e r ed o m i n a t e d t h e 聊c s e q u e n c e sw e r er e l a t e dt o 朋叠历口刀d c d c c a z 鲫，朋a 历口刀绷口砌口切 a n d “u n i d e n t m e dg r o u p t h er e s u l t so fr e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c rr e v e a l e d t h a tah i 曲a b u n d a n c eo f 出旭，p 忉刎a n d 垅c 硝g e n e se x i s t e di nl a u b a s i nh y d r o m e 瑚a lv e n ts e d i m e n t s ，a n dt h e i rq u a n t i t yw a sb e t w e e n10 5 a n d1o oc o p i e s 儋( 行e s hw e i g h t ) o fs e d i m e n t s c c aa n a l y s i ss h o w e dt h a t t h ew a t e r d e p t h ，p h ，o 娼a n i cc a r b o na n da c i dv o l a t i l e s u l 6 d eh a d c o n s i d e r a b l ei n n u e n c eo n 出，曰，p 聊。口，聊c ，彳g e n e s r e s u l t sd e m o n s t r a t e d m a t ，t h e r ee x i s t e dp o t e n t i a l l ys u l f a t er e d u c t i o n ，m e t h a n eo x i d a t i o na n d p r o d u c t i o na c t i v i t i e sd r i v e db ym i c r o o r g a n i s m si nd e e p s e ah y d r o t h e m a l e n v i r o m e n t sa l o n gt 1 1 ee l s c ；an u m b e ro fs e q u e n c e so b t a i n e di nt h e c o u r s eo ft h i ss t u d yh a do n l yal o ws i m i l a r i t yt ot h e s ek n o 、v ns e q u e n c e s o fc u l t i v a t e do 玛a n i s m si nt 1 1 ed a t a b a s e ，i n d i c a t i n gt h a tn o v e ll i n e a g e so f t h e s eg e n e so f 凼坦，册伪4 ，历c w e r ed e t e c t e di ns e d i m e n t s 仔o ml a u b a s i nd e e p s e ah y d r o t h e n n a lv e m s k e y w o r d sl a ub a s i nd e e p - s e ah y d r o t h e n n a lv e n t ，p 叩u l a t i o nd i v e r s i 劬 p c r - d g g e ，r e a l t i m eq u 枷i t a t i v ep c r v v i 硕士学位论文第一章绪论 1 1 深海热液喷口环境 第一章绪论 1 9 7 7 年在太平洋上的加拉帕戈斯群岛附近深2 5 0 0 米的深海热液区首次发现 了独立的生命体系，它被认为是海洋生物学研究领域中最为重大的发现之一【l ，2 1 。 自此，对深海热液喷口生物群落的调查研究吸引了无数科学家的眼球，成为了海 洋生物学研究领域的热点之一。三十余年来，随着海洋生物学研究技术方法的进 步，大量的深海热液喷口生物群落被相继发现【3 】，越来越多的喷口生物物种被分 离鉴定出来【4 5 ，6 ，7 一，从而改变了我们对深海热液环境的认识，极大的拓展了我 们的海洋生物学知识。 深海热液喷口是一种黑暗，低氧，高压，低营养以及富含硫化物的极端环境。 这里几乎没有阳光，且表层海洋生物光合作用产生的有机碳只有极少量能够到达 深海，因此形成了一类不依赖光合作用而是以微生物的化学合成为基础的独特生 态系统o 1 1 1 。通常热液喷口规模较小，中心温度极高( 有时会高达3 5 0 ) ，外 围水体温度较低( 一般 2 ) ，温度差异比较大，例如在喷口周围水温2 0 处 向外不到1m 的距离，水温便可降为2 。因此，独特的生态环境使深海热液喷 口周围的生物群落无论是在代谢上，生理上和分类上都极具多样性【1 2 】。其中又 以微生物的种类最为丰富，作用最为重要。另外，急剧变化的温度，p h 及化学 梯度赋予了深海热液微生物独特的生理生化特征，这些独特微生物资源的开发利 用对于现有菌种资源的补充和改善具有重要意义。 1 1 1 深海热液喷口环境的形成 目前，在太平洋，大西洋和印度洋水深8 0 0 到3 5 0 0 米的区域中已发现了2 0 0 多处热液喷口区( 图1 1 ) ，它们主要出现在地壳运动活跃的海洋区域【l 引，如大 洋中脊，弧后盆地和板内火山，其形成是地球板块构造的产物。大多数的海洋板 块被海洋中脊所分隔开来，这些洋中脊可深达6 0 0 0 0 千米。这些板块相互分离却 又紧密相连。因此，冰冷的海水就可沿着洋中脊系统的地壳裂缝向下渗透。在渗 透过程中，海水被逐渐加热，于是就产生了海水在地壳裂缝中的对流循环。在经 过复杂的循环之后，热液流就会向上喷射，与氧化性的低温海水相遇。这些热液 流偏酸性，具还原性且富含重金属( 包括铁，锰，锌，铜等) 及无机分子( 如 h 2 ，c h 4 ，h 2 s ，c 0 2 ，c o ) 。如果在喷射出来之前热液流就与冷海水混合，他们 硕士学位论文第一章绪论 的温度就会急剧下降( 约为1 0 4 0 ) 。这里就成了无脊椎动物的繁盛之所。如 果喷射之前没有与冷海水混合，热液流的温度就会高达3 5 0 甚至更高。当它们 喷射而出时，溶解于其中的矿物质元素与冷海水接触，就不断有金属硫化物沉淀 形成。这些沉积物沉积在海底，形成热液硫化物矿床，有时会形成高达1 0 15 米 的海底“黑烟囱”。在海水沿着洋中脊系统的地壳裂缝循环流动的过程中，地热 能被转化为化学能，储存在还原性的无机化合物中。这些化合物是由海水与高温 的裂缝岩石反应而形成的，通常由2 0 0 0 到3 0 0 0 米水深的海底喷口( 2 5 3 5 0 ) 喷涌而出，从而为喷口生物群落的繁盛提供了基本的物质条件。 1 2 护5 铲 8 铲1 5 0 f 2 0 9 矿6 0 ，-矿3 伊6 0 寺鲋 图1 1 全球主要热液喷口区域的分布图 f i g 1 - 1t h eg l o b a ld i s t r i b u t i o no fm a i nh y d r o t h e 丌n a lv e n tf i e l d s 1 1 2 深海热液喷口生物的能量来源 在热液喷口发现之前，只有化能自养型的硫氧化菌是海底的已知生物，但是 如此重要的生产者在当时并不被认为对海洋生态系统有什么特别的意义【12 1 。热 液喷口发现不久，硫化氢的生物氧化被推测为其能量来源【l3 1 。随后，大量实验 表明，喷口周围化学合成活动极其频繁，因此，普遍认为喷口生物生存所需的有 机碳源来源于化能合成细菌【4 1 。化能无机营养菌可通过喷口硫化物热液中的h 2 s ， s ，n h 4 ，f e 2 + 等还原型化学物质的氧化获得能量，并将c 0 2 合成为有机碳【5 ，14 1 。 正是这些细菌构成了深海热液喷口赖以生存的食物链的基础( 表1 1 ) 。 表1 1 热液喷口环境中潜在存在的化能无机营养菌及其电子来源 t a b l e1 一le l e c t r o ns o u r c e sa n d 妙p e so fc h e m o l i t h o t r o p h i cb a c t e r i ap o t e n t j a l l yo c c u r r i n ga t 硕士学位论文 第一章绪论 l l y d r o t h e 珊a lv e n t s 1 2 深海热液喷口微生物群落结构研究概况 起初，深海热液喷口的微生物多样性的研究主要局限于样品的显微描述及有 限物种的富集培养。随着分子生物学技术的进步和系统发育方法的发展，对于深 海热液喷口微生物多样性的认识有了大大的提高【5 1 。目前，越来越多的热液微生 物被成功的培养或鉴别出来。尽管如此，相对于热液喷口环境中极其丰富的微生 物资源来说，这些仅占一小部分，热液环境中还有大量的未知微生物资源有待进 一步的研究和开发利用【l5 i 。 1 2 - 1 深海热液喷口古菌 尽管在某些热液硫化烟囱中古菌可能仅占总细胞的较少一部分，但它们却是 烟囱结构某一特定部位微生物群落的主要组成成分【1 6 1 7 ，1 8 1 。例如，融a i 等利用 荧光定量p c r 和f i s h 技术研究发现印度洋中脊k a i r e i 热液区域的硫化烟囱内部 古菌比例将近达到1 0 0 1 1 9 j ；s c h r e n l ( 等的研究结果表明在胡德安富卡脊，古菌 约占活性硫化烟囱外壁结构中所有微生物的4 0 ，且古菌数量从烟囱的外壁向中 心部位呈逐渐递增的趋势【2 0 】。其他的研究也表明古茵多样性比预计的要高。由 做a i 和h o m 【o s h i 命名为“深海热液喷口广古菌类群”( d h v e g ) 的微生物在全 球深海喷口系统中估计均有分布【1 6 1 。这一类群可再分为两个亚类群，即d h v e 1 和d h v e 2 【2 。在几个深海热液环境的古菌1 6 sr i a 克隆文库中，d h v e g 占 克隆的绝大多数，其中d h v e 1 高达总克隆数的9 3 。 深海热液环境中的古菌主要包括泉古菌，广古菌和初古菌门三大类群【16 ，1 7 1 。 初古菌只在环境样品的1 6 sr i 埘a 文库中检测到，并未见有可培养菌株的报道。 事实上，可培养菌株在深海热液环境样品古菌克隆文库中的比例极小。热球菌目 3 硕士学位论文 第一章绪论 ( 砀e 朋d c c 口伽) 是热液喷口中最常被分离培养的超嗜古菌，这些微生物被认 为是海洋热泉生态系统中最主要的分解者【1 5 1 9 ，2 0 ，2 2 ，2 3 ，巩2 5 1 。它们是一类严格厌 氧，能够以酵母，蛋白胨，淀粉等做生长底物的异养微生物，还具有还原元素硫 的能力。据推测，在深海热液喷口，复杂的生物群落能为热球菌的生长繁殖提供 有机质，因此认为超嗜热的热球菌可能是热液喷口异养活动的良好指示者【1 5 ，2 6 1 。 甲烷八叠球菌目( 讹历a 刀d s 口憎砌口胁) 的产甲烷菌也经常能在克隆文库中检测到， 但是这类微生物至今还无法实现分离培养【2 0 ，2 2 1 。 广古菌门中，古丸菌属( 么砌口p 州d 6 螂) 的两个硫酸盐还原菌和几株产甲烷 菌( 利用c 0 2 和h 2 产生c h 4 ) 研究较多。与古丸菌亲缘关系较近的地丸菌属 ( g p 叫d 6 w ) 可利用f e 3 + 作为电子受体。甲烷球菌属( 胁历伽d c c 螂) 和甲烷 嗜热菌属( 胁历册叩吵珊) 是嗜热产甲烷菌的代表菌属唧，具有典型的高温生长 特性( 最适生长温度9 8 ，最高生长温度1 1 0 ) 。 泉古菌是深海热液喷口古菌的第二类群，这类微生物基本都是可代谢硫和含 硫化合物的超嗜热古菌。此类群中已有几个菌属的代表菌株从深海热液喷口环境 中成功的分离得到，如除硫菌属( d p s 够，厂d c d c c 螂) ，葡萄热菌属( & 印办y f d 肪p 删姗) ， 热网菌属( 毋，厂d 妣打“朋) 和火叶菌属( d 粕z d 6 螂) ，这些分离菌株均是严格厌氧 菌，但却表现为不同的代谢类型。延胡索酸火叶菌( 脚d 肠6 螂励脚f f ) 【2 8 l 是一 种能够在最高1 1 3 的温度下生长的深海热液喷口古菌( 最适生长温度1 0 6 ) ， 它能以硝酸盐，硫代硫酸盐为底物，可在微氧条件下生长。这是至今地球上已知 的最嗜热的微生物，更重要的是，它能在1 2 0 高压蒸汽灭菌锅中存活2 个小时。 由于骑行纳古菌( k 珂d 口似办口p 姗z 叼“f 幻瑚) 的发现，提出了一个新的古菌门： 纳古菌门( 切聆d 口阳办口p d 细) 【2 9 1 。批聊d 口彤办口p 扰所叼“泐瑚是一种与古菌乃印纪d c c 螂 胆c 驴c 搬密切关联的微小( 4 0 0 姗) 微生物。 1 2 2 深海热液喷口细菌 高达3 5 0 的喷口热液流的出现使微生物学家对深海热液喷口微生物的研 究主要集中在超嗜热古菌的研究上。然而，分子生物学技术的利用揭示了细菌群 落在深海热液喷口生境中的丰富度及重要性。其中变形菌又是细菌类群中较为 丰富，分布较为广泛的亚门1 2 0 ，3 0 1 。某些- 变形菌常与热液喷口的腹足动物共生【3 1 1 ， 有些甚至是蜗牛内共生菌1 3 2 ，3 3 】。尽管变形菌的分布极为普遍，但是由于其难 培养性，我们对这类微生物的生理生化特征却知之甚少。先前的研究认为变形 菌主要是微氧硫氧化菌【3 4 ，3 5 j 。最近的研究表明变形菌具有更丰富的代谢多样 性【2 5 ，3 0 ，3 6 ，3 7 ，3 8 ，3 9 ，绚 4 1 ，4 2 ，4 3 1 。研究表明，深海热液喷口- 变形菌主要由能以硝酸 盐，氧气，硫化合物为最终电子受体，从而氧化氢气和硫化合物的嗜中温或嗜热 4 硕士学位论文 第一章绪论 的化能无机营养菌组成【2 5 ，3 0 3 6 3 7 鲳，3 9 ，“，他4 1 ，4 2 4 3 1 。一般认为，- 变形菌不仅在深 海热液喷口的硫循环中发挥重要作用，而且还参与热液喷口的氢，氮，碳循环口o ， 4 3 4 4 1 o 产水菌目( 彳q “矿c 口胁) 是深海热液喷口化能无机营养型的另一代表类群， 它们所利用的电子受体和供体与一变形菌相似【4 5 4 6 1 。如变形菌一样，么g “步胁 亦普遍分布于全球的深海热液区域【1 5 她4 6 ，4 7 1 。由彳g “咖c 口胁高的生长温度可以 预测，这类微生物只可能发现于像活性硫化烟囱或喷口热液流等高温环境中f 2 1 2 5 4 7 ，4 8 】 o 深海热液喷口中已知的非光合细菌主要包括硬壁菌门( 兄嗍耙“泐) 疣微菌 门( 殆“c d 朋纪加6 缸) ，栖热菌( 砀p 删口胁) 和嗜胞菌屈挠杆菌拟杆菌 ( 9 f o p 昭口_ 刃p x f 6 口c 纶r i 踟c f e ，d f 虎s ，c f b ) 四类。圪r r ”c d ，l f c r d 6 蛔已分别从胡 德安富卡脊，东北太平洋脊和瓜伊马斯笳地的许多热液位点鉴别出来【2 2 ，3 5 1 。这 类细菌难于培养，研究者曾在7 0 的复合有机营养富集培养基中通过不断选择 培养获得了一株新的殆肋聊加6 衙菌株，但却无法稳定传代培养。 在深海热液喷口环境样品的克隆文库中还鉴别出一类属于绿弯菌门的绿色 非硫细菌f 2 2 ，3 1 ，例。深海热液喷口系统的地理化学特征为非光合作用的绿色非硫 细菌提供了合适的生境，比如在瓜伊马斯盆地，有机质通过热分解转换成了各种 石油碳氢化合物，包括不分枝烷烃，环烷烃，三萜，甾烷和芳香碳氢化合物，从 而为绿色非硫细菌的生长繁殖提供底物1 2 2 1 。 最近，一些研究利用功能基因的方法大大扩展了异化性硫酸盐还原菌( s l ) 的多样性【1 8 4 7 ，4 9 ，5 0 1 。研究者使用出刎b 基因为分子标尺，不仅扩展了s i 也的分 布和多样性，而且表明s r b 不仅分布于热液沉积物中还分布在活性硫化烟囱壁 中。另外，幽硝b 基因的系统发育调查还揭示了原先未被培养的和未被识别的潜 在s r b 的存在1 1 8 4 7 ，4 9 ，5 0 1 。这些s r b 对局部微环境的化学特征及矿化过程产生重 要影响，同时在深海热液喷口生态系统中硫化矿的沉积和变更中发挥重要作用 【5 1 1 。为了揭示硫酸盐还原菌在深海热液喷口发挥的潜在地理生物学作用，h o e k 和r e y s e n b a c h 调查了一株嗜热的，氢氧化硫酸盐还原菌在硫化烟囱的陡峭地理 化学梯度条件下是如何分馏硫同位素的。结果显示，分馏的程度主要依赖于环境 中氢气的浓度。在氢气有限的条件下，3 4 s 标记的硫化物只减少了原硫酸盐的4 。这个结果表明化学无机营养型的硫酸盐还原菌在深海热液喷口生物地球化学 循环中发挥重要作用。 像铁氧化菌一样的金属氧化菌是