（微生物学专业论文）液相基因芯片检测食源性病原菌方法的研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t o n ep a i r so fs p e c i f i co l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r sa n dp r o b e sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n g t ot h e2 3 sr d n a g e n eo fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，t h ei a pg e n eo f l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ， a n dt h ei p a hg e n eo fs h i g e l l ns p p r e s p e c t i v e l yt oe s t a b l i s ham e t h o df o rd i a g n o s i n g t h r e ef o o d b o m ep a t h o g e n i cb a c t e r i as i m u l t a n e o u s l yb yl i q u i dg e n ec h i p s t h em u l t i p l e p c rr e a c t i o ns y s t e mw e r ee s t a b l i s h e da n do p t i m i z e d ，a c q u i r i n gt h et a r g e tf r a g m e n t 谢t l l t h es i z e so f2 4 6 b p ，ll2 b p ，17 4 b p ，w h i c hh a v e9 7 ，9 8 a n d9 5 i d e n t i t i e sf o r s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，s h i g e l l as p p ，a n dl i s t e r i am o n o c y t o g e n e s , r e s p e c t i v e l y , a s c o m p a r e dw i mt h o s ep u b l i s h e d t h eo p f m a i z e dh y b r i d i z a t i o nc o n d i t i o nb e t w e e nt h e t a r g e ts e g m e n ta n dt h ec o u p l e dm i c r o s p h e r e sw e r e5 4 * ( 2f o r2 5 m i n t h ep r o d u c t sw e r e d e t e c t e di nal u m i n e x10 0s u s p e n s i o na r r a ys y s t e m t h ed e t e c t i n gs e n s i t i v i t yo f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，l i s t e r i am o n o c y t o g e n e sa n ds h i g e 砌s p p w e r e3 8c f u m l ， 4 4 c f u m la n d2 1c f u m l ，r e s p e c t i v e l y t h ec o r r e s p o n d i n gd e t e c t i n gs e n s i t i v i t i e si n p c rs y s t e m sw e r e3 8 0c f u m l ，4 7 0c f u m l ，a n d2 4 0c f u m lw h i c hw e r e10t i m e s l e s ss e n s i t i v et h a nt h o s ei nl i q u i d g e n e c h i ps y s t e m b a s e do nt h er e s u l t sa b o v e ，t h i s s t u d ye s t a b l i s h e di n i t i a l l y t h el i q u i d - g e n e c h i pm e t h o df o rd e t e c t i n gt h ef o o d - b o m e p a t h o g e n s w eh e r er e p o r t am o r ee f f i c i e n ta n dr e l i a b l em e t h o df o rf o o d b o m e p a t h o g e n i cb a c t e r i a , w h i c hw i l lh a v eag o o dp r o s p e c t k e yw o r d s ：l i q u i dg e n ec h i p ；s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ；l i s t e r i am o n o c y t e s ；s h i g e l l as p p i i - 1 2 2 酶联免疫法检测6 1 2 3 分子生物学方法的检测6 1 2 4 液相芯片方法的检测8 l - 3 本研究的目的与意义1 l 第2 章多重p c r 方法的建立1 2 2 1 材料1 2 2 1 1 主要仪器及设备1 2 2 1 2 菌种1 3 2 1 3 试剂及配制1 3 2 2 方法1 4 2 2 1 引物、探针的设计与合成1 4 2 2 2 菌种的培养与d n a 模板制备1 4 2 2 3 单重p c r 扩增条件优化一1 6 2 2 4 多重p c r 扩增条件优化一1 7 2 2 5p c r 产物琼脂糖凝胶电泳片段纯化与测序1 9 2 - 3 结果与分析2 0 2 3 1 三种致病菌引物和探针设计结果2 0 黑龙江大学硕士学位论文 _ - - ；i i ；a 暑；i ；i i ；i ；i 宣i 昌j 宣i 皇；i ；薯j 宣 2 3 2 单重p c r 扩增结果2 l 2 3 3 多重p c r 扩增结果2 2 2 z l 讨论2 6 2 5 小结3 0 第3 章液相基因芯片检测方法的建立3 2 3 1 材料3 2 3 1 1 菌种3 2 3 1 2 主要试剂及耗材3 2 3 1 3 主要仪器及设备3 3 3 1 4 主要溶液的配制3 3 3 2 方法3 4 3 2 1 微球与探针的藕联3 4 3 2 2 微球与探针交联效率的验证3 5 3 2 3 液相基因芯片对致病菌杂交条件的优化3 6 3 2 4 液相基因芯片对目的菌检测3 6 3 2 5 检测的特异性试验3 7 3 2 6 检测的重复性试验3 8 3 2 7 检测的灵敏度试验3 8 3 2 8 结果判定3 8 3 3 结果3 9 3 3 1 微球与探针藕联结果3 9 3 3 2 液相基因芯片对致病菌杂交条件优化及检测结果3 9 3 3 3 检测的特异性结果4 2 3 3 4 检测的重复性结果4 3 3 3 5 多重液相基因芯片杂交检测的灵敏度结果4 5 3 4 讨论4 5 3 5 小结4 8 i v 目录 结论4 9 参考文献。5 0 附录5 9 致谢7 1 独创性声明7 2 v 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 食源性致病菌的研究背景 食品卫生与安全问题是人们关注的热点，随着人民生活的提高，消费者对食 品卫生提出了更高的标准，致病菌对人类的危害也更加引起重视。食品中需检测 的致病菌的种类越来越多，样品的数量也会越来越大，而金黄色葡萄球菌，单核 增生李斯特菌，志贺氏菌是食品安全标准中规定的常检验的病原菌，下面针对研 究中的病原微生物的基本特征及其流行病学进行概述。 1 1 1 致病菌的病原学基本特征 1 1 1 1 金黄色葡萄球菌 、 金黄色葡萄球菌形态为球形，直径0 8 9 m 左右，无芽胞、大多数无荚膜、无 鞭毛，不能运动，革兰氏染色阳性( 如图1 1 ) 。需氧或兼性厌氧，最适生长温度 为3 7 ，最适生长p h 为7 4 ；平板上菌落较厚、有光泽、圆形凸起，直径l 一2 m m ， 耐盐性强，能在含1 0 - - - - 1 5 的n a c l 肉汤培养基中生长，血平板菌落周围形成透 明的溶血环；可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气，甲基红反应阳 性，v p 反应弱阳性。金黄色葡萄球菌抵抗力较强，即使加热煮沸1 2 小时，仍 会构成对人体健康的危害。 图1 1 金黄色葡萄球菌显微镜形态( 摘取网络) f i g 1 一lm i c r o s c o p i cm o r p h o l o g yo f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s 1 一 黑龙江大学硕士学位论文 1 1 1 2 志贺氏菌属 志贺氏菌( s h f g d l as p p ) 的形态与一般肠道杆菌无明显区别( 如图1 2 ) ，长 约2 3 1 m a ，宽o 5 0 7 岬。不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。需氧或兼 性厌氧。营养要求不高，能在普通培养基上生长，最适温度为3 7 ，最适p h 为 6 4 7 8 。3 7 培养1 8 - - - 2 4 小时后茵落呈圆形、微凸、光滑湿润、无色、半透明、 边缘整齐的革兰氏阴性菌，v p 实验阴性，不分解尿素，不形成硫化氢，不能利 用硫酸盐作为碳源。宋氏志贺菌菌落一般较大，不透明，并常出现扁平的粗糙型 菌落。在液体培养基中呈均匀浑浊生长，无菌膜形成n 】志贺氏菌属细菌的抗原 结构由菌体抗原( o ) 及表面抗原) 组成。主要有特异性抗原、群特异性抗原和表 面抗原( k 抗原) 三种妲1 。抵抗力以宋内氏菌最强，福氏菌次之，志贺氏菌最弱。 图l - 2 志贺氏菌的显微形态( 捅取网络) f i g 1 - 2m i c r o s c o p i cm o r p h o l o g yo f s h i g e l l as p p 1 1 1 3 单核增生李斯特菌 单核增生李斯特菌( l i s t c r i am o n o e y t o g e n e s ) 在病原学上作为一种人畜共患 和食源性疾病的致病菌已得到世界范围普遍的公认，目前，该菌被列为w h o 食 品安全工作计划重点检测的食源性疾病菌之一。该菌呈杆菌或球菌状态( 如图 1 3 ) ，大小为0 4 - 0 5 1 u n ，革兰氏染色阳性，无芽胞，不形成荚膜，生长在2 0 5 0 。c 时，具周身鞭毛，有运动性；单增李斯特菌最适生长在含有c 0 2 的微需氧环 境中，该菌属兼性厌氧；在肉汤培养集中生长呈杆状，球杆状，链状等多种形态， 2 第1 苹绪论 最适生长温度为3 0 3 7 ；该菌对营养要求不高，在普通培养基中可生长，但 在血清或全血琼脂培养基上生长更好，血琼脂平板上的菌落小而圆，凸起且光滑， 直径1 - 一2 m m ，周围有一窄小的p 溶血环，卵育4 8 h 后更清晰可见。单增李斯特 菌不产生内毒素，可产生一种溶血作用的外毒素，致病性强，该菌为一种胞内菌， 侵犯宿主后被巨噬细胞吞噬，并在其中寄生繁殖。可引起全世界范围内人畜共患 和食源性疾病的致病菌铷。李斯特菌属内共有7 种菌，其中，单增李斯特菌和绵 羊李斯特菌被认为是引起动物和人类李斯特菌病的主要致病菌。该菌主要存在 于动物性食品( 尤其是奶制品) 中嘲，可引起脑膜炎、败血症和孕妇流产，新生 儿、老年人和免疫缺陷病人是易感人群。该菌在4 c 的环境中仍可生长繁殖，是 冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此，在食品卫生微生物检验中，必 须加以重视。 图l - 3 单核李斯特菌电镜显微形态( 捅取网络) f i g 1 - 3m o r p h o l o g yo fl i s t e r i am o n o c y t o g e n e so b s e r v e du n d e re l e c t r o n i cm i c r o s c o p e 1 1 2 致病菌的流行病学及危害 病原微生物污染是影响我国食品卫生和安全的主要因素之一，其中金黄色葡 萄球菌、单增李斯特菌和志贺氏菌是常见的食源性致病菌。 1 1 2 1 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌大多存在于变色、变质、有异昧的食物中。金黄色葡萄球菌 黑龙江大学硕士学位论文 引起的食物中毒主要是由其在繁殖过程中分泌到菌体外的肠毒素引起的。轻微感 染会在皮肤上长疮和丘疹，局部化脓感染，严重的则也可引起肺炎、伪膜性肠炎、 心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，因而，食品受其污染的机会很多，由 金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。病发期多见于春夏季节， 金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：a 溶血毒素： 外毒素，分a 、d 、丫、6 四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和 坏死；b 杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；c 血浆凝固酶：当金黄色葡 萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻 碍吞噬细胞的吞噬作用嘲。 1 1 2 2 志贺氏菌 志贺氏菌属侵袭性致病菌，致病性主要由毒力质粒介导m ，侵袭性质粒抗原 h 基因i p a h 以多个拷贝形式同时存在于质粒和染色体上嘲。只需1 0 个病菌进入， 就有可能致病，是人类细菌性痢疾中最常见的病原菌，在我国大多数细菌性痢疾疾 病大都是由志贺氏菌引起的。据估计，志贺氏细菌性痢疾每年会有1 6 ，4 7 0 万例病 例，导致1 1 0 万人死亡，在所有发病人数中有6 9 是不满5 岁的儿童嘲。志贺氏 菌的致病作用，主要是侵袭力、茵体内毒素及个别菌株产生的外毒素。志贺氏菌 一般不侵犯其它组织，偶尔可引起败血症。目前认为不论是产生外毒素的还是只 有内毒素的志贺氏菌，必须侵入肠壁才能致病。毒素作用于肠壁植物神经，使肠道 功能紊乱，肠蠕动失调，从而发生腹痛、痢疾等症状n 町。因此，对粘膜组织的侵 袭力是决定致病力的主要因素n u 。志贺氏菌病发后有一定的免疫力，但免疫期短， 也不稳定，这可能因本菌属菌型众多，相互间无交叉免疫性的原因。 1 1 2 3 单核增生李斯特菌 单增李斯特菌在自然界中分布广泛，土壤、河水、污泥、青贮饲料中均可存 在，也可寄生于昆虫、水产品体内，还能存在于人和动物的胃肠道中。经口感染 是单增李斯特菌最常见的传播途径，人主要是通过食用污染的奶及奶制品、肉类 食品等动物性食品而患李斯特菌病。世界卫生组织( w h o ) 关于单增李斯特菌食 第1 章绪论 物中毒的报告中指出，4 8 的水产品，5 1 0 的奶及其制品，3 0 以上的 肉制品，1 5 以上的家禽均被该菌污染n 幻。胡桂华等人n 3 3 抽检了沈阳地区3 0 0 份 食品中单增李斯特菌的污染情况，检出率为1 2 。付萍等人在对1 2 个省7 类食 品的单增李斯特菌调查结果表明，生肉的污染率为1 5 3 ，熟肉制品0 4 7 ，乳 0 7 2 ，乳制品0 5 2 ，水产品0 1 9 n 钔。食品中存在的单增李斯特菌对人类的安 全具有较大威胁。自2 0 世纪9 0 年代以来，国内外许多专家学者都做了该菌在食 品中污染的调查研究n 目。 单增李斯特菌能够致病是由于其产生多个毒力因子，其中转录调节子基因 p r f a 编码的蛋白为多个毒力因子的调节物，将其用于单增李斯特菌的特异性p c r 检测n 钔。李斯特菌溶解素0 ( l i s t e r i o l y s i o n0 ，l l o ) 是由h l y 基因编码的h l y 蛋 白，是一种孔形成毒素，破坏吞噬体、促进茵体进入胞液，是细菌得以在胞液内 增殖的先决条件，是主要的毒力因子，它的缺失将会导致细菌毒力的全部丧失。 另外，l l o 还参与单增李斯特菌致病性有关的其它反应，有人发现，用该菌感染 鼠脾脏和骨髓的树突状细胞，可导致细胞的凋亡；不产生l l o 的单增李斯特菌突 变体不能诱导细胞的凋亡，而提纯的l l o 可引起这种程序性控制的细胞死亡n 刀。 1 2 食源性致病菌检测的现状与发展趋势 食品中污染的病原菌是引起食源性疾病的主要因素之一，快速检测与鉴定食 品中病原菌对控制疾病的发生有着至关重要的作用。目前病原菌的检测主要依靠 常规的富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等繁 琐的传统方法检测。近年来，随着生物化学、免疫学、分子生物学的不断发展， 一些新的方法手段逐渐应用于食品微生物检测。目前金黄色葡萄球菌、单增李斯 特菌、志贺氏菌的检测方法主要有国标法、酶联免疫检测分析方法、d n a 探针技 术和聚合酶链式反应( p c r ) 法。现将国内外有关食源性病原菌的检测技术综述 如下。 黑龙江大学硕士学位论文 、1 2 1 常规生物学检测 目前国家标准检测方法大多采用常规的生化反应、血清学鉴定呻1 。该方法检 验程序复杂，实验条件要求较高，致使基层实验室无力开展此项工作。翟凡等人 研制了单增李斯特菌鉴别培养基，在2 5 c 环境培养，可在基层实验室推广n 们。封 幼玲等用v i t e k 微生物自动分析仪对单增李斯特菌进行快速鉴定，对分纯后的菌 株能在7 - 1 4 h 小时获得结果，大大缩短了鉴定时间它的优点是准确率较高， 但是该方法具有以下明显的缺点：检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多，检测 过程复杂，其灵敏度也受杂菌干扰的一定影响，存在一定的假阴性，而且无法对 人工难以培养的病原细菌进行检测，已远远不能满足现代检测要求。 1 2 2 酶联免疫法检测 酶联免疫法( e n z y m e 1 i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y , l l i s a ) 的基本原理是将抗 原或抗体结合在固相载体上，检测时将待检样品和酶标抗体或抗原与固相载体表 面吸附的抗原或抗体发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分， 然后加酶的作用底物催化显色。对金黄色葡萄球菌的免疫学检测主要依靠对其产 生肠毒素的检测。s u 等人采用双抗法检测金黄色葡萄球菌肠毒素，灵敏度可达 o 1 0 5 p g ：l 胁1 。李红云等人采用生物素一链亲素系统放大的双抗夹心定量检测血浆 及组织中金黄色葡萄球菌肠毒素，使敏感度显著升高，可达0 0 7 8 9 9 l 池1 。 1 2 3 分子生物学方法的检测 自然界的每一物种都有其完全不同它物种高度保守的核酸( d n a 或r n a ) 序 列。随着分子生物学和生物信息学的发展，陆续发现了一些病原菌保守的核酸序 列，可以利用它作为检测的靶点。在此基础上建立了众多的检测技术，聚合酶链 式反应、实时荧光检测技术和固相基因芯片方法。 。 1 2 3 1 聚合酶链式反应 p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 即聚合酶链式反应，是一种体外扩增d n a 第1 章绪论 的技术，在短时间内扩增出大量具有特异性的d n a 片段，可以快速、特异、灵 敏、高效的扩增病原微生物基因的新技术。自1 9 8 7 年完成自动操作装置后，近年 来已得到广泛的应用。国内外已经建立了单增李斯特茵的检测方法黜。p c r 检 测方法对金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌，志贺氏菌特有的基因序列进行引 物设计，通过引物与目标d n a 特异性结合检测致病菌。p c r 法检测食物和临床 标本中的单增李斯特菌的研究已取得实质性的进展。姜永强等人在应用p c r 方法 对单增李斯特菌进行检定的基础上，用微孔板杂交法检测单增李斯特菌溶血素编 码基因h l y a 片段，使特异性和敏感性大大提高，通过化学抽提的方法制备模板， 可较好地避免食物成分的抑制嘲。 相对于传统方法检测，p c r 方法检测的突出优点是灵敏度更高，检测时间短， 可以直接检测病原菌的核酸。但是该方法也有一些缺点，特异性不高，易产生非 特异扩增；极易导致p c r 产物污染未检测的样本，出现假阳性；p c r 产物电泳 检测容易接触剧毒物质，如强致癌物质溴化乙锭正b ) ，对操作人员的安全构成威 胁。 1 2 3 2 实时荧光检测技术 实时荧光p c r 检测技术( r e a l - t i m ef l u r e s e e n tp c r ) 是将液相杂交技术和荧光探 针引入常规中，通过实时检测每一个循环扩增产物相对应的荧光信号，来实现样 品( 如病原菌) 的定性和定量检测。实时荧光p c r 技术可分为两大类：( 1 ) 荧光标 记探针，如t a q m a n 探针、分子信标等，这些探针都包含两个荧光基团，一个是 发射荧光的基团，另一个是碎灭基团。它们是基于荧光共振能量迁移原理而工作 的，当两个荧光基团靠近时，发光基团会将受激发产生的能量转移到相邻的碎灭 基团上，这样通过测定标记在探针上的荧光信号变化就可以反应扩增产物的数量 变化。( 2 ) 双链d n a 特异的荧光染料，常用的有s y b rg r e e n 和l cg r e e n 删。这 些染料可以结合到双链d n a 中，结合之后荧光信号大大增强，p c r 扩增过程中 每一循环的产物都能与它结合，因此通过测定荧光信号来反应p c r 产物的量嘲。 实时荧光p c r 检测的优点：易于自动化，杜绝了产物污染；避免放射性物质或凝 胶电泳染色时的溴化乙锭的污染和危害；实时检测，准确性和重现性均优于常规 黑龙江大学硕士学位论文 p c r 髓刀。另外，荧光p c r 的仪器及试剂成本相对较高是自身的缺点汹1 。 1 2 3 3 固相基因芯片 固相基因芯片是在一微小的基片( 硅片、玻片、尼龙膜) 表面固定大量的特 异性的寡合酸探针，再与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过激光共聚焦 扫描完成信号的检测，可以在同一时间内平行分析大量的基因一1 。靳连群等运 用寡核苷酸微阵列技术，同时快速检测了沙门氏菌、单核增生李斯特菌、金黄色 葡萄球菌、变形杆菌、蜡样芽胞杆菌、志贺氏菌等1 1 个菌属的常见肠道病原菌， 检测特异性高达9 6 2 嘣3 1 1 。此方法的优点是高通量、自动化程度高、快速，但成 本相对高，样品制备比较复杂，在一定程度上限制了基因芯片技术在食品检测中 的应用。 1 2 4 液相芯片方法的检测 液相芯片是一个多功能的液相分析平台，其有机整合了微球荧光染色技术、激 光技术、应用流体学、孔内定标技术，高速数字信号处理和数据分析系统集中了 分子生物学、免疫学、高分子化学、激光物理学、微流体学、计算机科学等多门 学科使得l u m i n e x 悬浮芯片技术的检测得到了前所未有的发展。l u m i n e x 液相芯 片在国外研究较成熟，应用范围也较广，在国内主要将该技术用于微生物检验、 临床检验和诊断，将液相基因芯片应用于农药、兽药分析等领域正在尝试。液相 芯片具有重现性好、灵敏度高、线性范围宽、检测迅速、高通量等优点，正在成 为科研及临床的重要检测平台1 。 1 2 4 1 液态芯片的原理 液态芯片也称悬浮芯片，是美国l u m i n e x 公司开发的多功能多指标同步分析 ( f l e x i b l em u l t i - a n a l y t ep r o m m g ，) 【1 儿心) 技术嘲，l u m i n e x 公司于19 9 7 年利用其独 创的c x m a p ，技术，向市场推出了一种开放式的生物芯片平台一l u m i n e x l o o ( 如图 1 4 ，1 5 ) 。 x m a p ”技术的建立主要基于流式荧光技术，该技术的核心是把5 6 “m 的聚苯乙烯小球用两种荧光素( 红色和橙色两种荧光素，每种分成有1 0 个浓度梯 度) 进行染色，调节两种荧光染料的比例由此获得1 0 0 种不同荧光编码的微球， 第1 章绪论 当微球被6 3 5 n m 激光激发后，能发射6 5 8 n m 和7 3 2 n m 的荧光，比较二者发射光 的比率，就可以将1 0 0 种微球区分开来，在不同颜色的微球( 或称为荧光编码微球) 表面共价交联上针对特定检测物的探针，抗原或抗体。这样每种微球就可以代表 一种检测物，应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，在一个反应孔内可 以同时完成多达1 0 0 种不同的生物学反应。再加入微量样本，将溶液中可溶性的 待测物质通过生物分子之间的特异性亲和反应结合在类似细胞大小的微球上，和 带有第三种荧光素的报告分子反应，反应后，采用9 6 孔板进行进样，i 朋m i n e x 啪 激光流式仪自动将反应液吸入蠕动泵，在鞘液的作用下，单排分布的微球逐个通 过激光检测系统进行检测。该系统采用两束相互交叉的激光测定微球，红色激光 用来激发微球本身的荧光，鉴定微球的编码起到定性的作用，绿色激光检测微球上 报告分子( 绿色荧光染料) 的荧光强度从而对反应进行定量艄力。两束激光的交 叉点既是被检测微球所在位置，这就能确保定性、定量的是同一个微球。基于微 球基质的独特性，可以对不同的目的分子同时检测。检测的数据经电脑统计处理 后可以直接用来判断结果。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测 速度极快，每秒可读取2 0 0 0 0 个微球。利用激光检测技术和特别设计的自动校正 和校验工具，样品检测的重复性可以达到9 5 以上，动态范围很宽，可以达到 0 2 一- - 3 2 0 0 0 p g m l ，样品间差异，板间差异和系统间差异控制在1 0 以下，超过了 普通的e l i s a ，与w e s t e r n 印记技术类似。 图1 - 4 悬浮芯片系统的组 成 图1 - 5 悬浮芯片技术系统的组成。从图可见，该系 统由四大部分组成，按顺时针方向依次为生物大分 子、色标微球、微流体和光学系统、计算机信号处 理系统：中间部分为l t m i n e x 瑚悬浮芯片系统实物 黑龙江大学硕士学位论文 1 2 4 2 液湘基因芯片技术的应用 国外已经将液相芯片技术用于关键生物分子( 如抗原、抗体、细胞因子、磷 酸化蛋白等) 的表达或活动水平变化、d n a 序列测定、单核苷酸多态性( s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ，s n p ) 分析、基因突变和基因表达、抗癌药物筛选等研究， 并逐步用于临床诊断。对病原微生物的分子检测广泛应用于公共卫生，水质监控 和食品工业等领域，包括检测细菌，病毒和真菌等病原体。d u n b a rs a 等用直接 杂交法对和食品病原性疾病有关的细菌病原体进行多通道定量检测，他们设计了 通用引物，扩增出含有能特异性区分大肠埃希氏菌、沙门氏菌、单核增生李斯特 菌基因序列中2 3 sr d n a 的一个区域，这一方法能准确和特异性地鉴别每种细菌， 能检测1 0 7 - 1 0 8 拷贝的扩增靶分子，相当于p c r 反应中1 0 3 大肠埃希氏菌、沙 门氏菌和单核增生李斯特菌的基因组拷贝嘲。 1 2 4 3 液相基因芯片的前景展望 液相芯片技术具有许多其它技术无法比拟的优点，但也存在着一些缺陷，不 能在线监测待测样品中靶标物的浓度或监测不到样品中靶标物同微球上探针的结 合情况，这也是液相基因芯片与大多数光纤、s p r 、压电等以采集物理信号为主的 生物传感器相比的劣势。另外，多元液相反应条件的优化与匹配、同一反应体系 中交叉反应的抑制与消除也需研究者待以研究。在检测核酸时悬浮芯片同样需对 p c r 产物进行处理，增加了产生交叉污染的概率。液相基因芯片与基因芯片尽管 具高通量的能力，但由于受p c r 多重能力的限制，在一定程度上使其高通量的能 力受到限制。目前，国内使用的微球产品全部依赖进口啪1 。尽管如此，目前液相基 因芯片技术已经通过美国f d a 认证，最基础的操作平台已经形成，并且已有商业化 的彩色微球及配套的检测系统销售，实验者不必再做大量投资用于前期研发。现 在市面上已有成套的试剂盒，研究者可以根据实验设计安排直接使用试剂盒。随 着科学技术的不断深入、计算机分析软件功能的日益强大和实践操作经验的不断 丰富，相信在不久的未来液相芯片会成为检测的重要方法之一。 第1 章绪论 1 3 本研究的目的与意义 食品是人类赖以生存和发展的物质基础，而食品安全问题是关系到人类健康 和国计民生的重大问题，其中食源性疾病是食品安全领域面临的主要问题。目前 对这些病原菌的检测，主要依赖于传统的细菌学培养方法，包括对样品前增菌、 选择性增菌、生化试验、动物试验等过程，一般需要一周才能报告结果。检测方 法繁琐，费时耗力，难以满足当今经济全球化情况下食品快速流通的需要。我国 已加入w t o ，食品国际贸易量日益增多，研究开发简便快速、灵敏特异的食源 性病原菌的检测技术迫在眉睫。 本论文通过生物信息学、分子生物学等方法设计、分析、筛选和合成特异性 引物和核酸探针，并通过多重p c r 扩增，建立三种病原菌x m a p 液态基因芯片 检测方法，并验证该方法的特异性和灵敏性。建立的液相基因芯片多重快速检测 方法，及早预见病原菌传播、预防食物中毒、减少食源性疾病事件的发生具有十 分重大的意义。 黑龙江大学硕士学位论文 第2 章多重p c r 方法的建立 多重p c r ( m u l t i p l e xp c r ) ，又称多重引物p c r 或复合p c r ，是在常规p c r 方法的基础上发展起来的新技术，它是在同一p c r 反应体系里加上两对以上引 物，分别扩增不同的模板，得到不同的目的片段。因而，引物间的配对及竞争性 扩增等均影响多重p c r 的扩增效果。其反应原理、反应试剂和操作过程与一般 p c r 相同，既保留了常规方法的特异性、敏感性，又减少了操作步骤及试剂用量， 可以在同一反应中检测多种致病菌的特异基因。 本研究通过对食源性致病菌多重p c r 特异性引物设计，建立和优化多重p c r 反应体系，检测常见的三种食源性致病菌。通过研究单重p c r 反应，分别建立了 检测三种菌的单重方法，在系统摸索优化反应条件和扩增体系的基础上，建立三 重p c r 扩增方法，并验证此方法的灵敏度和特异性。 2 1 材料 2 1 1 主要仪器及设备 凝胶成交系统i m a g eq u a n t 3 0 0 水平电泳仪b g 6 0 0 生物安全柜h f s a f e - 1 5 0 0 型 电子天平p l 3 0 0 2 纯水仪p v r e l a bc l a s s i c b c d - 2 5 4 ( k k 2 5 v 7 0 t i ) 电冰箱 梯度p c r 仪2 2 3 3 1 h a m b u r g c e n t r i f u g em 2 3 高速低温离心机 s t e 砒m a j 真空灭菌锅 移液枪 美国g eh e a lt h c a r e e 广州新化 上海力申科学仪器厂 梅特勒托利多仪器有限公司 美国p a l l 公司 博西华家用电器有限公司 德国e p p e n d o r f 公司 德国j o u a n 公司 德国m m m 公司 德国e p p e n d o r f 公司 第2 章多重p c r 方法的建立 d u 6 4 0 核酸蛋白分析仪 紫外可见分光光度计7 5 2 型 精密p h 计p h s 3 c 2 1 2 菌种 美国b a c k m a n 公司 上海光谱仪器有限公司 上海双赢科学仪器有限公司 本试验所用标准菌株为：福氏志贺菌( s h i g e l l af l e x n e r i ) 、金黄色葡萄球菌 ( s t a p h y l o c o c c u $ a u r e u s ) 和单增李斯特氏杆菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ) ，均为黑 龙江出入境检验检疫中心微生物实验室收藏保存的标准菌株( 见表2 1 ) 。 表2 - 1 实验中使用的菌株 t a b l e 2 1b a c t e r i a ls t r a i n su s e di nt h i ss t u d y 2 1 3 试剂及配制 细菌基因组d n a 提取试剂盒( t l 蝌g e n 试剂盒) ，购白天根生化科技( 北 京) 有限公司；t a k a r at a q ( 5 u i t l ) ，10 x p c rb u f f e r ( m 9 2 + p i u s ) ，d n t pm i x t u r e ( 各 2 5 m m ) ，上下游引物( 各lo p m ) ，6 x l o a d i n gb u f f e r ，d l 2 ，0 0 0 d n am a r k e r ，购自 大连宝生物工程( 大连) 有限公司；b i o w e s t a g a r o s e ；溴化乙锭( e b ) ，赛 百盛生物科技有限公司；医用酒精，齐齐哈尔市鹤城消毒厂。 黑龙江大学硕士学位论文 试验中配制的试剂如下： ( 1 ) 营养肉汤培养基：牛肉浸膏1 0 9 ，酵母浸膏2 0 9 ，蛋白胨5 o g ，氯化钠 5 0 9 ，p h 值7 4 。 ( 2 ) 2 琼脂糖凝胶：取1 9 琼脂糖凝胶加入5 0 m l 的ix t a e 溶液，微波炉加 热融化使琼脂糖充分溶解，冷却至6 0 加2 5 此溴化乙锭( e b ) 。 ( 3 ) 6 x l o d i n gb u f f e r ：0 2 5 溴酚蓝，4 0 蔗糖水溶液。 ( 4 ) 引物试剂的配制：各引物粉剂开盖前1 2 ，0 0 0 r r a i n3 m i n 离心，然后溶于 一定量的无菌水中，使其终浓度为1 0 0 p m 保存液，- 2 0 冰箱保存备用。使用时 用无菌水稀释至1 0 p m 。 ( 5 ) 5 0 0 m l1 0 x t a e 电泳缓冲保存液：t r i s 碱( 三羟甲基氨基甲烷) 2 4 2 9 ，1 7 4 m o l l 冰乙酸5 7 1 m l ，乙二胺四乙酸二钠( e d t a ) 3 7 2 2 9 ，补水到5 0 0 m l 。使 用时再将保存液稀释到l x t a e 。 2 2 方法 2 2 1 引物、探针的设计与合成 本论文所使用的引物和探针及其修饰，阳性对照及其修饰均由上海超世生物 工程有限公司合成。从g e n b a n k 数据库中获得的三种目的菌的基因使用d n a m a n 、 p r i m e rp r e m i e r5 0 、o l i 9 0 6 0 软件设计特异性探针和引物，为了减少杂交的空间位 阻，在合成探针时，需在探针的5 末端添加一段由6 个t 组成的连接臂，引物设 计时尽量减少同一体系中各引物之间的发夹结构、错配和二聚体。为了保证检测 结果的平均荧光强度值，对上游引物进行生物素标记。 2 2 2 菌种的培养与d n a 模板制备 2 2 2 1 菌种的培养 分别取已活化的金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏茵、福氏志贺氏菌接种于新 第2 章多重p c r 方法的建立 鲜无菌营养肉汤培养基中，3 6 c 培养2 4 h 至对数期。分光光度计测得o d 6 0 0 约为 0 4 时，按1 0 0 1 0 遗梯度进行l o 倍稀释，取最后3 个梯度的稀释菌液涂布平板。 每个平板涂1 0 m l ，每个稀释度各涂3 个平板，3 6 培养过夜后计数。 2 2 2 2 细菌基因组d n a 提取 使用t i a n g e n 细菌基因组d n a 提取试剂盒( 离心柱形) ，按照说明书上操 作步骤进行d n a 基因组提取。 ( 1 ) 取细菌培养液l m l ，1 0 ，0 0 0 r p m 离心1 m i n ，尽量吸净上清液； ( 2 ) 向菌体沉淀中加入2 0 0 此缓冲液g a ，振荡至菌体彻底悬浮。( 对于金黄 色葡萄球菌，单增李斯特菌等革兰氏染色阳性菌，直接加入溶茵酶进行破壁处理， 具体方法为：加入1 8 0 u l 缓冲液( 2 0 r a mr i f f s ，p h 8 0 ；2 m mn a - e d t a ；1 2 t r i t o n ； 终浓度为2 0 m m 的溶菌酶) 3 7 4 c 处理3 0 m i n 以上。) ( 3 ) 向每管中加入2 0 儿蛋白酶k 溶液，混匀； ( 4 ) 加入2 2 0 r t l 缓冲液g b ，振荡1 5 s ，7 0 。c 放置1 0 m i n ，溶液变清亮，瞬时 离心以去除管盖内壁水珠。( 注：加入缓冲液g b 时可能产生白色沉淀，一般7 0 会消失，不会影响后续实验，如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致 提取d n a 量少和提取出的d n a 不纯； ( 5 ) 加入2 2 0 i _ t l 无水乙醇，充分振荡混匀1 5 s ，此时可能会出现絮状沉淀，瞬 时离心以去除管盖内壁水珠； ( 6 ) 将上步骤所得到的溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱c b 3 中( 吸附柱放 入收集管) ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉废液将吸附柱c b 3 放入收集管中； ( 7 ) 向吸附柱c b 3 中加入5 0 0 1 x l 缓冲液g d ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉废液 将吸附柱c b 3 放入收集管中； ( 8 ) 向吸附柱c b 3 中加入7 0 0 t l 漂洗液p w ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉废液 将吸附柱c b 3 放入收集管中； ( 9 ) 向吸附柱c b 3 中加入5 0 0 p l 漂洗液p w ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心3 0 s ，倒掉废液， 将吸附柱c b 3 放入收集管中； ( 1 0 ) 将吸附柱c b 3 放回收集管中，1 2 ，0 0 0 r p m 离心2 r a i n ，倒掉废液。将吸附 1 5 黑龙江大学硕士学位论文 柱c b 3 置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液； ( 1 1 ) 将吸附柱c b 3 转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 5 0 2 0 0 此洗脱缓冲液t e ，室温放置2 - - - 5 m i n ，1 2 ，0 0 0 r p m 离心2 m i n ，将溶液收 集到离心管中。 2 2 3 单重p c r 扩增条件优化 分别以单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌基因组d n a 作为p c r 扩 增模板，用设计好的引物对p c r 反应条件进行优化，单重p c r 初始反应体系及 条件见表2 - 2 ，表2 3 。 表2 - 2 单重p c r 初始反应体系( 5 0