（耳鼻咽喉科学专业论文）海螵蛸作为软骨组织工程支架材料的应用基础研究.pdf

在职申请瑚士学位 中文摘要 接要 第一粼分海蝶蛸的窝间结构粼辫 匿懿了解并观察海燎嫱静空阕结橡。 方藏将脱籍海漂鹬讶残薄片，计箨孔骧率，献懋学帮羟攒嘏褫袋察萁空潮藜构。 结祟海螵蛸里一定规则的瞬格状，孔隙率为9 2 。 鳍论扶结梅上鼹察，海螵蛸祷含缨骢培养支絮瓣多魏骧簧求。 第二部分海螵蛸的生物糈容性研究 嚣熬了勰海螵蜷箨爻缀绥工程支綮麓生匏裙容拣。 方法崔金鬣背部凌节分掰堙霆簿蝶螭支絮和p g a ，在术詹l 、2 ，4 ，8 弱蕊察炎 瘫艇应和吸收情糯。 r r r 法分剐检测海螵蛸赢架对细胞增殖功能的影响。 缮果海螵蟥寒露i 、2 局霞少许潦巴缨憨漫溺，4 餍部分吸收，8 攥完全暖收， 炎藏细胞基奉潲邂，与p g a 戡：较无统计学麓异。m t t 测褥细施在海蝶螨支架 中增殖能力较强。 结论海嫖鹚搀荛缨爨支架其骞爨好靛生兹穗磐蛙。 繁三器务海蝶蛸襻隽软莒镭藏组纸芏糕 擞絮材辩酶俸静实验 目的研究海螵蛸作为新生兔腺共节软骨体外细胞培养支架材料的可行性。 方法淤缳努离鬟垒兔膝关节数雷缏悠，揍穆卡鑫裁瘩嫖螨嚣支架主凄葬，麸竞 学秽扫箍电镜蕊祭其亲承往秘对细旎豹啜瓣力。 结果软骨细胞能够在海螵蛸支粼上黏附j 申展瑚殖。 缝谂海螵蠖多毳交絮与获案绥鼹舆毒葭驽摇鸯瞧，霹嫠魏软嚣缓绥工程审赡蘩 胞熔荠支架。 l 关键词l 组织工糕，软骨细胞，海螵蜷，支絮 在职串请磺士学位樊文摘要 a b s t r a c t p a r t1s p a t i a ls t r u c t u r eo fc u t t l e b o n e o b j e c t i v e ：t oo b s e r v et h es p a t i a ls t r u c t u r eo fc u t t l e b o n e m e t h o d s ：t h ed e g r e a s e dc u t t l e b o n ew a ss l i c e da n de x a m n e dw i t hl i g h t m i c r o s c o p ea n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e t h ep o r o s i t yr a t ew a s c a l c u l a t e 也 础妓舷f ：m o r p h o l o g i c a ls t u d ys h o w e dr e g u l a rn e t w o r zt h ep o r o s i t yr a t e w a s9 勰 c o n c u 】s i o n ：t h es t r u c t u r eo fc u t t l e b o n ei ss u l t a b l ef o rc e l la d h e s i o n p a r t2b i o c o m p a t i b i l i t yo fc u t t l e b o n e o b j e c t i v e ：t os t u d yt h eb l o c o m p a t i b i l i t yo fc u t t l e b o n eu s e da ss c a f f o l d s i nc h o n d r o c y t ec u l t u r ef o rt i s s u ee n g i n e e r i n 孓 鞠强麟：t h em i c ew e r ep l a c e ds u b c u t a n e o u s l yw i t hc u t t l e b o n ea n d 烈ai n t h eb a c kt h ei n f l a m m a t o r yr e a c t i o na n da b s o r b i n gd e g r e eo fc u t t l e b o n e w e r ei n v e s t i g a t e da tl ，2 ，4a n d8w e e k sp o s t o p e r a t i o n t h ee f f e c to f c u t t l e b o n eo nc h o n d r o c y t ep r o h f e r a t i o nw a se x n m x n e db yw r ta s s a y r e s i n t ：o n l yaf e w1 ) r m p h o c y t e sw e r ei n f i l t r a t e da f t e rla n d2w e e k s c u t t l e b o n ew a sp a r t i a l l ya b s o r b e da f t e r4w e e k sa n df u l l yd e g r a d e da f t e r 8w e e k s c h o n d r o c y t e sp r 0 1 i f e r a t e dw e l lo nt h ec u t t l e b o n es c a f f o l 屯 c 0 n ( 默娼i o n ：c u t t l e b o n ee x h i b i t ss a t t s f a c t o r yb i o c o m p a t i b l l i t ya n dc a nb e u s e da ss u i t a b l et h r e e d i m e n s i o n a lp o r o u ss c a r f o l d p a r t3c a r t i l a g et i s s u ee n g i n e e r i n gi i t ht h ec u t t l e b o n ei nv i t r o o b j e c t l v e ：t oi n v e s t i g a t et h ef e a s i b i l i t yo fc u t t l e b o n ea sc e l lc u l t u r e s c a f f o l df o rt h r e e d i m e n s i o n a lg r o w t h o fn e w b o r nr a b b i ta r t i c u l a r c h o n d r o c y t ei nv i t r o 鞠强劂：c h o n d r o c y t e si s o l a t e df r o mn e w b o r nr a b b i ta r t i c u l a rc a r t x l a g e w e r es e e d e do nt h ec u t t l e b o n es c a f f o l d sa n di n c u b a t e d n l eh y d r o p h ili a t 鱼璺生透臻主兰竺 一l 簸! ! ! 至 砌a d 量薹e s i 0 8o fe h o n b o c y t e sw e r eo b s e r v e dw x t h1i g b tm l c r o s c o p e a n d s c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e r e s u l t ：c h o n d r o c y t e sw e r ea b l et oa d h e r e ，e x t e n da n dp r o l i f e r a t e o i lt h e c u t t l e b o n es c a f f o l d 。 c o n c l u s i o n ：p o r o u 8c u t t l e b o n e e x h x b i t sg o o dc o m p a t i b x l i t y w i t h c h e n d v o c y t e s a n dc a l lb eu s e da sc e l l c u l t u r es c a f f o l d f o rt l s s u e e n g l n e e r i n $ k e y 糊r d s lt i s s u ee n g i n e e r i n g ，c h o n d r o c y t e s ，c u t t l e b o n e ，s c a f f o l d 在职申请磁士学位 裁言 缀缓工程学是2 0 毽纪8 0 年代由 a n g e r 鞫v a c a n t i 首先提盘静n “。1 9 8 7 年，美国国家科学纂金会( n s f ) 在加利福尼溅的专家讨论会上首次提出了“组 织工撵”鲍概念，势明砖其定义：缀织工程是遂愿工程科学耨生鑫科学的原理秘 方法，觚狠本上了解正常稻病理豹螓乳动物豹缀织结构一功熊关系，并研究生物 学代替物以恢复、维持和改进组织功能。因此，组织工程的三大任务包括：1 ) 组织工程支架材料_ 籀细胞外基质蛰代物开发；2 ) 种子缨胞瞧葳磺究；3 ) 缀织工 程纯缀织对各种病攒缀织鲍替代研究。组织工稷支架材料是掰能与活体组织细脆 结合并熊植入生物体的材料。三维多孔的细胞支架不但起着决定新生组织太小的 作用，黧重要的是为缀胞豹增殖撼供营养、进行气体交换、撵除废纺的重簧作恶， 困诧组织工程嚣缩臌支架必须满怒一定兹要求“：l 无毒，蹙有良好豹生物檩容 性；2 必须具有生物可降解性：3 降解产物必须涎毒及良好的生物相容性；4 具 有良好加王性能；5 必须具有开放豹孔结构；6 嶷有良；好戆缨腿亲积性，逶会 缅胞黏附、增殖、扩增，并分泌繁质；7 必须舆有一定生秘力学；8 必须麓够耐 受消毒。而因为软骨支架对强度、韧度的特殊蒙求，成为研究的焦点之。 避想斡软骨缀级王程基质支絮应其鍪以下特性啪： ( 1 ) 、具有良好的嫩物梧容髋，在体舞培养眩冤细胞毒栏，植入体内盼界会引 起机体炎症和排斥反成。 ( 2 ) 、具毒三维立俸结梭，必须是高度多藐豹类饭泡沫妖，魏骧率达到9 0 戳 上，并裔很大的内袭辩积，这样躐有利于细胞的植入、黏酣，又有利于缩胞营养 成分的渗入和代谢产物的捧出。 ( 3 ) 、员寄生物可黪霆摹缝，支絮农缀织形藏逡攫孛逐渐被簿艇，薯虽苓影豌象 形成缎级的结拇和功能。同时还簧求其降解遮藏与细胞的增皴速度相匹配。 ( 4 ) ，具有良好的凝面活性，能促进细胞的黏附并为细胞禚其表面增殖掇供良 好戆微鳆：境。 ( s ) ，具有可塑毪，可被加工成所需要韵形状，并具有一定的机槭强度，在植 入体内厢的一定时间内仍可保持冀彤状，并使新形成的组织具有符合设计的外 形。 6 在职申礴硕士学位 隧翦已开发应用予软骨组织工程的生物材辩主要是化学含成的生物降解材 料，翔聚毳酸、聚怒基乙馥、及京钠的共聚谚1 ，( 1 ) 降解产物簇酸瞧，不利 于细胞生长；( 2 ) 商一定免疫原瞧；( 3 ) 价格昂贵，主要依靠进口。而其他材料 作为缌织工程技本巾细胞培养支絮也有报道，但各有缺点。如胶原，其凝大的 缺点魑祝械强度菱，不翮于承重隧豹软骨修复。由于组织工程孕育着广溺的应用 前景，斑物材料的谶一步开发和研究是推动组织工程发展的耍素之一。 采用不羼理化技术制备盼天然生物衍生糖辩其抗原饯较弱，并骞越好戆组 织亲耩健移亲稻力，天然的空豫络构大小形状缓掰，为软骨缁胞的黏融、蝣麓、分 化提供天然的三维空间结构。材料来源丰富，制作简便，并在功能适应性，缀织相 容性，生物降解琏及造伶等方瑟傀母人工合成拳孝誊萼。 a r n a u d 等踟采爝天然珊灞费携带骨髓成臀细胞藕b 瓣来修复软骨赣损，取 得良好效果。但是，珊瑚已经列为保护动物，来源有限。我们不仅想到和珊瑚有 籀似成分秘结构鲸海螵蛸。 我们发现资源率富、结构独特酌天然材料海螵蛸( c u t t l e b o n e ) 具有由甲 壳素( c h i t i n ) 、碳酸钙等分子预制的多层房架斌结构。而甲究素化学名称为8 一 ( t ，4 ) 一2 - 乙酸氯熬一2 脱氧一蕊莓耱。l a h i j i 等“”发现这类天然多聚耱有嗳 显碱梭，良好的生物耦容性和生物可簿解往。降解物无毒住，亦无免疫驻性，本 身具脊修复软骨缺损的潜能。能搿利用海螵蛸所具有的高度商序的生物基质，获 终组织工程中软骨缀戆墙莠支絮愁一个缀有意义戆漂题。 奉实验共分三个部分：1 海螵蛸的空闻结构观察：邋邋光、电镜观察了解 海螵蛸的空间结构魑否符合细胞熔养支架的多孔隙要求。2 海螺蛸的生物楣容 鳇研究：了勰海螵媾怒秀具有莛好瓣生秘栏容饯，失下一步实骏傲好准备。3 。海 螵蛸作为软骨细胞缀织工程支絮材料的体外实辘。 在职申请颂士学位第一韶分 第一部分海螵蛸螅空阕结梅观察 季l 囊 海螵蛸为乌贼科( s e p i i d e a ) 海洋无针乌贼s e p i e l l am a z n d i o n id e r o c h e b r u n e 或金乌贼s e p i ae s c u l e n t ah o y l e 的干燥穴壳，是一种剐啦的天然 矿物糖辩，资源及冀率富，我蘑潞海趣区魏案激产。成分为碳酸钙8 0 - - 8 5 ， 甲壳素6 7 ，及少照的磷酸锊、氯化钠、镁放。 从海螵蛸中提取鹃甲壳蠢( c h i t l n ) 近年来已在农业、量避、医药等众多领 域其蠢许多应用徐稳“”，箕牵译巍素与磷酸锈粉的混合戆僚为牙齿、曹壤充物 以用于临床，生物槲容性较好似1 。 出予海嫖蛸具鸯类似松覆夤黥唾眼结稳，鼹粳互贯通，密裁于密主擞鬻、细 胞进入，曾有学者将葜作为接骨材料阳，并获得成功。盘藏我们联想到利用海 螵蛸的特殊的网格结构，作为软骨细胞培养支架。 摇上赝述，本实骏涮备了应熙予软骨细胞壤菸的海螵蟥支架，并进行一系强 形态绪 訇方面的麓察。 一、材料和方法 1 1 楗瓣 新鲜海螵娲 1 2 实黢器材和试剂 茏水乙醇( 上海振兴仡工厂) 7 5 乙醇( 上海擐兴化工厂) 氯仿( 上海桃浦化工厂) 爨教镱和手本穗关器攘 籀籀电镜( 复盛大学医学院电镜室，h i t a c hs 5 2 0 ) 电予天平( 北京赛多利斯仪器系统有限公司，b s 2 2 4 s ) l 。3 海螵螭支絮参| 辩燕工 ( 1 ) 取新鲜海螺蛸，去除背、腹侧党部，在显徽镜下横断位切取 1 0 c m x1 0 c m 1 o c m 大小虑螵蛸块l o 块。及0 5 c m x 0 2 5 c m x 0 。0 5 c m 至0 。5c r u x 0 。5 c m x 0 0 5 c m 大奎鹰螵鹚跨霞l 1 ) 。 在职申请龋士学位 慧部分 ( 2 ，海媛蟪片脱脂脱蛋白处理 7 5 乙醇，4 8 h 。 无水乙醇i ，4 8 h 。 无水乙醇t i ，4 8 h 。 氯仿i ，7 2h 。 氯仿n ，7 2h 。 1 。4 魏黢率的爨定 精确称量i o 决簿螵蛸块予燎前后的质量w a l 一o 和 b l 一1 0 觅表l 。计算 平均值w 8 、1 l b 。 袈l 。海螵媾予燥蓦螽蕨堂 测得平均值w a = 1 3 3 8 9 、髓= o 4 2 0 9 孔隙率计算公式为 p o r o s i t y = ( 觏一w b ) p v l xt 0 0 ( 1 一1 ) w a ，劝分别代畿千燥前后制晶的平均质量；p 为纯水结冰后密度，p = i 1 0 3 k g m 3 ；v 1 代表冻干材斟的表观体积，v l = o 。l w 。 1 5 囊絮躯光学芰缀镶褒察 采用n i k o n 光学慰微镜对备制好的海螵蛸赢架进行观察弗摄影。 1 6 支絮的扫描电镜蕊察 露蝶爨片表蘑骥金惹逶孬接攥毫镜麓察。涮霪魏骧太小。 二、络聚 2 1 大体观察 藜懿海螵媾隽瓷爨色，手瀑、长霹麓存羧嚣为镦黄( 謦l 一2 ) 。海蝶蝼分为 壳部和体部。壳部分内壳和外壳，外壳质硬、椒糙，内壳表馘平滑。体部璺肉眼 可见的多孔状夕 观，纹理清晰，质地轻，脆性较大。新鲜鸯螵蛸微孔内含水，含 瘩薪鳟海蝶鹅不荔耱爱，努办器鼯螽为淀汐榉攀感。篪承乎缀簿嫖媾荔簿装， 在职申请硕士学位第一帮分 外力聪醛后为粉末榉手感。海蝶蛸横断面为层状结构( 图l 一3 ) 2 2 海螵鹚静毳潦翠 支架浸入溶剂( 水) 后增加的体积即孔隙的体积即w a - w b ，冻干材料的表 观体积为v l ，孔隙攀鼯： p o r o s i t y = ( w a 一秘) p v l 1 0 0 多 ( i - - i ) 按l l 方法测得海螵蛸孔隙率为9 2 2 3 光学显徽镜观察 支絮觅平行支鼗，籀邻支桎褥是与之稳交撵歹 j 的，j 、鬃络构，壁较薄。支柱与 小粱相间排列构成规则的壁龛样网格结构( 图1 - - 4 ) 。 2 4 织籀电子显徽镜瀛察 支校与小粱样络枣弩所构残豹熬象样两格结构更为明显，支柱与，j 、粱表灏欠光 滑，并熙现出分层的扳层结构。平均孔径为0 2 0 0 9 m m 2 ( 圈l 一5 ) 。 三、讨论 不篱是合残材料还是天然材料，理想豹软骨细胞支架在结构上要求其商三维 立体结构，必须是尚度多孔的类似泡沫状，孔隙率达到9 0 以上，才能有很大的 蠹表露彀，这撵既鸯零j 予细胞的德入、黏瞻，又蠢摹l 于细胞罄葬成分的渗入窝代 落产秘的排击脚”。 材料的空间结构( 包括孔隙结构、孔隙率、孔隙大小、孔蹙结构等) 分为3 个等级，良好：具蠢多琵性，戮睬搴离，孑l 黢樱互交逶，大小均匀适度；审等： 具有多张性，毽孔隙帮低或孔隙交通不良或过火过小；差：凳多孔往或孔稼掇少。 一般认为软骨组织工程支架要求孔隙率达9 0 以上，孔径越过0 2 n 时会降低 材料强度，嚣小于0 1 瓣对软骨长入受限。恧海嫖蛸具有天然、规则的壁燕撵隧 格结构，经测得孔骧率为9 2 ，警均孔径为0 2x o 0 9 皿瞰2 。不论从孔踩率还是 从孔径太小来看，海蠓蛸的天然网格结构具有合适细胞生长的孔隙，较大的内表 面积，蠢到予细胞戆攘入及细胞营菸成分的渗入。 西、绪论 从结构上观察，海螵蛸符合软骨细胞培养支架的多孔隙熏求。 在职率请颂士学位第二部分 第二部分澎螵蜻的生物襁容性研究 弓 言 缀织工程学研究对支架材料疆求的一个黛要内容是：支架必须具有良好的 生物棱容性，在体雏培养时无纲臆毒性，植入体内对不会寻 越枫俸炎症秽撩斥反 应。辩前，匡内井科学家主要致力高分子合成材料聚羟基忍酸( p o l y g l y c o l l c a c i d ，p g a ) 、聚乳酸( p o l y l a c t z ca c i d ，p l a ) 及二者的共聚体的研究，倔在临 床研究中发现，p g a 、p l a 及它假的共聚体可譬l 起l # 特异瞧冤蘸蛙炎症豹发生率 达8 “”；还有研究袋骧，在具肖免疫功麓的螓乳动物体肉耩入p g a 螽胃弓f 起强 烈的炎瘾反应，最终导致组织工糕化组织吸收r l s - - 4 。 霸j 鞋：，在将舞螵蛸作荛软鸯缀胞支架时，必须考虑到嫩物艇容瞧。我 臻l 过支黧鹃体内埋置试验和体并缨臌毒佳实验，对其生物耜容性进行评价。 实验一海螵蛸体内蠼景试验 一、毒| 辩与方法 l 、材料 1 1 标本制备 实验缰麟繁一部分惫蠓旗制釜。 对照组标本为p g a 1 2 出生一月龄的昆明小鼠1 8 只，体重1 5 9 - - 1 6 9 ( 复恩大学医学院动物 实验中心) 。 1 3 手术器械殿显微镜 1 4盐酸氯胺酮( 1 0 0 r a g m l ，上海中西药业股份有敝公司) 2 、方法 簸酸氯藏酮( 1 0 0 m g m i ) 腹腔注射麻醉，剪开小鼠背部皮肤，1 2 必左右 皮下各埋晷海螵蛸块，对照组6 只皮下埋置p g a ，埋置块犬小为0 5 c m 0 5 c = x 文0 5 c = 。于l 、2 、4 、8 w 取材，骰零撬疆絷雹鼹察炎症爱应帮攘蓐反液。 彼据陋染色搿炎症细胞的浸润程度分级，每高倍镜视野炎症细胞 1 5 0 个 为+ + 十， 0 0 5 ) 表2 皮下移植炎瘢反应结栗 在职申请硕士学位第二部分 实验二海螵蛸体外细胞毒性实验 一、材料与方法 i 、材料 1 1 标本制备 同第一部分海螵蛸制各。 1 2 种子细胞 人骨髓基质干细胞( 上海胸科医院肿瘤研究所基础研究室专利号 z l 0 1 1 3 2 1 8 4 9 ) 1 3 试剂 d m e m 培养液( g l b c o ) 胎牛血清( f b s ，g 1 b c o ) 四甲基偶氮唑盐( m t t ，s i g m a ) 二甲基亚砜( d 1 6 s o ，s i g m a ) 1 4 实验器材 y j 一8 7 5 医用净化工作台( 苏州净化设备厂) c 0 2 培养箱( h e r a e u se l e c t r o n z c ，g e r m a n y ) d g 3 0 2 a 型酶联免疫检测仪( 旺r u s ，u s a ) 9 6 孔培养板 1 5 m l 一次性离心管 2 、方法 海螵蛸支架经蒸馏水加热预湿，按d m e m 培养液( 含l o f b s ) 与海螵蛸支 架外表面积之比为l o m l c m 2 加入培养液，于3 7 下静置2 4 小时，制备浸提液。 将其一半用培养液稀释成5 0 浓度。 取人骨髓基质干细胞用d m e m 培养液( 含1 0 f b s ) 释成1 1 0 4 个细胞m l o 接种于三块9 6 孔培养板上，每组5 孔，每孔1 0 0 p i ，置于5 - - 氧化碳细胞培养 箱，3 7 ( 2 、9 5 空气，1 0 0 湿度下培养2 4 h ，弃原培养液，空白对照( a 组) 加 新配制的d m e m 培养液( 含l o f b s ) 1 0 0 p 1 。实验组分别加5 0 ( b 组) 和1 0 0 ( c 组) 的浸提液，置于、5 二氧化碳细胞培养箱中继续培养。于2 、4 、7 在职申请硕士学位 第二部分 天各取出一块培养板，每孔加入5 m g m l 的m t t 2 0 斗i ，继续培养4 l ，倒出培养液， 再加l o o p l d m s 0 ，振荡l o m n 。 酶联免疫检测仪以4 9 0 h m 波长测吸收值。 通过下式计算相对增值率( r g r ) 。r g r = ( 实验组吸光值对照组吸光值) x 1 0 0 ，然后根据r 6 r 值按以下标准评定出材料毒性分级2 ”。 评分相对增值率 评分相对增值率 o 级 1 0 0 3 级2 5 4 9 l 级7 5 9 9 4 级 l - - 2 4 2 级5 0 一7 4 5 级0 3 、统计学方法 应用m i c r o s o f te x c e l5 0 统计软件包进行检验，对实验结果进行t 分析。 二、结果 实验结果见表3 ，经统计学分析，培养2 、4 、7 天，a 、b 、c 三组均无显著 性差异( p o 0 5 ) 。 表3 体外细胞毒性实验结果 组2 d 吸光值4 d 吸光值 6 d 吸光值 别x+sr g r评分x + - sr g r评分x + s r g r 评分 a 组0 1 4 2 + - 0 0 0 6 1 0 000 3 9 2 + - 0 0 1 1 1 0 000 5 9 9 + - 0 0 2 01 0 00 b 组0 1 4 8 + 0 0 0 41 0 400 4 1 9 + _ 0 0 2 51 0 70 0 6 5 3 + - 0 0 3 11 0 90 c 组0 1 4 5 士0 0 0 41 0 200 4 4 3 + - 0 0 1 2 1 1 300 6 8 9 + - 0 0 4 31 1 50 i - _ _ _ - _ - _ _ - _ - - _ _ _ _ _ - _ - - - _ _ l _ - - _ - _ _ _ _ - - - - - _ - l l _ i _ l l _ _ - _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ - - - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - - _ - - l _ - _ - _ - - l _ _ _ _ w 三、讨论 国际标准化组织( i s o ) 认为，生物相容性是指生命体组织对生命材料产生反 应的一种性能，一般是指材料与宿主之间的相容陛。生物相容性是一项评价生物 替代材料重要、基本的指标，评价生物材料生物相容性的两大原则为：生物安全 性和生物功能性。生物安全性是指生物材料对机体的损害陛，包括对组织的细胞 毒性和致畸性，和机体对生物材料的排斥反应。生物材料对宿主来说是异物，宿 主必定产生免疫应答或排斥反应。生物材料的功能性是指生物材料对宿主机体组 织细胞功能的影响，包括材料对细胞黏附、扩散、增殖及细胞生物合成功能的影 在驭率请颟士学盈 第二部分 响。 谬徐荬方法主要畜两静：俸蠹壤毽法帮钵岁 纲魏壤养法。蓊者将挂辩穰入宿 主体内，观察机体对材料的反应；后者通过材料与细胞在体外共同培养，评价细 胞在材料表面黏附、生长和增殪。本实验通过以上实验评价海螵蛸的组织捆容性 蠢缩稳耨客毪。 虽然海螵蛸与软骨组织起源不同，前者起源于软体动物，而后者起源于脊椎 动物。倪海螵蛸经脱脂脱蛋白后，其抗原性大为降低。刘艺脚1 等在接骨灾验中 穆海螺娟骨貘下移穰，发现海蝶螭舆有蹇静静缀织穗窖毪。a l l m a n ”等磷究袭臻， 脱细胞基质所引起反应是急性炎癜反应，其主鬻细胞成分是中性粒细胞，所引起 的免疫反应是t h 2 介露的免疫反成，说明脱细臌基质植入后研以避免移植免疫反 应。零安验将海漂媾每p 6 a 分裂壤穰入，l 、鬣鸳酃皮下，术瑟l 髑后缢织擎瀑示材 料周围炎症细胞增多但无异物巨细胞反应，术肟2 周后炎憔反应渐轻，术后4 周材料嫩现松解现象，术后1 2 周藤材辩已被吸收，周围结缔组织替代。祗对照 缰p g a 是一释成熬豹组织工程擘毒| 辩，与乏襁魄在奉囊验中无统诗学差异 ( p 0 0 5 ) 。说明了海螵蛸具有很低的免疫原性，同时也合乎了组织工程支架作 为“l 晒肘支架”的要求“1 ，为软嚣组织在l 黝寒应用创造了条件。 醒w 法于1 9 8 3 年由m o s r o a n n 提出，该法擞作筒摹，结莱一幕了然，疲瑶广 泛。原域是利用活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的m t t 还原成难溶性蓝 紫色甲瓒，并沉积残细胞中，经二甲基亚磺完众溶鳃后选择波长4 9 0 r ，农酶联 免疫捡测仅上测啜汔度餐。在一定缩瑰数蕊鬻内，筐与警瓒形成量成正毙， 间接反应了活细胞的数量。本实骏将细胞与海螺蛸浸提液进彳亍复合培养，用m 订 检测体外缨胞增殖熊力，与对照缀糨魄无显著性差别( p o 0 5 ) 但随着培棼对阕 延长，锫缀细胞数量明显增加，爱波了细胞不新增殖豹能力；嗣对显示了材瓣无 明显细胞毒性。 三、绩论 簿螵蛸具有良好的组绥穗容键，是一种理想的可吸收、辩解的材瓣。 在职审请硕士学位第三部分 第三部分海螵蛸作为软骨细胞组织工程 支架奉| 餐戆傣辨实验 一、材料与方法 1 1 试j i l 鞭隧培养液( g i b c o ) 胎牛血清( f b s ，g i b c o ) i i 型胶原酶( c o ll a g e n a s ei i ，s i g m a ) 簇蛋自酶 t r y p s i n ，s i g m a ) i i a n k 7 s 液 1 2 实验器材 ￥j - - 8 7 5 医鼹洚纯工作台( 棼娜净纯设舔f - ) c 0 2 培养箱( h e r a e u se l e c t r o n i c ，g e r m a n y ) 黻s h 水浴振荡器( 上海思尔达科学仪器有限公司) 8 0 0 墅离心沉淀瑟( 上毒手术器械厂) 相差显微镜( o l y m p u st o k y o ，l a p a n ) 招攒电镜( 复曼大学医学院电镜室，h i t a c h $ 5 2 0 ) 天平 6 子l 培养板 次睦进口过滤器 1 5 m l 一次性离心管 手术器械 1 。3 常用试剂配制 0 2 胶原酶 l 胶原酶l il o o m g h a n k s 渡 5 踟l 黧温下轻轻瓣动至完全溶解，调整蝉为7 o 一7 4 之简，4 c 冰箱过掇，一 次性过滤器抽滤除菌，用1 5 m l 一次性离心管5 m 1 分装，放- - 2 0 。c 保存，用前溶 解。 话一 在职申请硕士学位第三部分 1 4 标本备制 同第一部分海螵蛸备制。将支架置于6 孔培养板内。 1 5 软骨细胞分离 ( 1 ) 取1 周龄实验用新西兰白兔。处死后，用碘伏消毒5 分钟，移入超净台 内。用手术刀切开皮肤，完全暴露髓、膝关节软骨，从关节软骨处削下约0 0 5 c m 厚的软骨片，收集于h a n k 7 s 液中。 ( 2 ) 将上述收集的软骨组织用h a n k 7 s 液冲洗2 遍，剪成1 0 m m x1 o 衄 1 0 r a m 左右的组织块，移入装有5 m l 浓度为0 2 i i 型胶原酶的离心管，3 7 水浴箱，消化，每3 0 r a n 观察一次，约1 h 后消化液开始变混浊，相差显微镜观 察有单细胞溢出：4 h 肉眼见组织块消化成絮状。然后用吸量管轻轻分散细胞， 再将细胞悬液通过孔径为4 5 妇的尼龙网滤器，以1 5 0 0 r m l n 离心5 m n ，弃去 上清液，沉淀用h a n k 7 s 液重新悬浮，重复离心2 遍，得软骨细胞用0 2 台 酚蓝染色计算活细胞率，结果活细胞率大于9 0 。分离的软骨细胞用2 0 胎牛 血清的d m e m 培养液悬浮。 ( 3 ) 将细胞悬掖接种于培养板上，置于5 二氧化碳细胞培养箱，3 7 、9 5 空气，1 0 0 湿度下培养。第三天换2 3 培养液，以后隔日更换培养液( 每次 更换原液的2 3 ) 。 每日置于倒置相差显微镜观察。 ( 4 ) 两周后培养皿内加入0 5 胰蛋白酶消化1 0 r a i n ，加入1 0 f b s 的d 皿m 液终止酶反应，以1 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，弃去上清液，沉淀用h a n k 7 s 液重新 悬浮，重复离心2 遍， ( 5 ) 软骨细胞以5 t o m l 密度接种于预湿海螵蛸支架上，置于5 - - 氧化 碳细胞培养箱，3 7 、9 5 空气，1 0 0 湿度下培养。第三天换2 3 培养液，以 后隔日更换培养液( 每次更换原液的2 3 ) 。 1 6 倒置相差显微镜观察 软骨细胞接种于支架上后，每日于倒置相差显微镜下观察细胞在生物支架 中的生长、增殖、基质分泌和细胞形态变化情况，持续观察2 周。 1 7 扫描电子显微镜观察 在职申请硕士学位 第三部分 培养l 周、2 周后分别取软骨细胞一海螵蛸复合物的标本，置于3 戊二醛 溶液中，4 。c 下固定1 2 h ；分别用3 0 、5 0 、7 0 、8 0 、9 0 、9 5 、1 0 0 乙醇脱水，每种浓度使用两次，每次1 5 m i n ，离子喷射仪表面喷金，进行扫描 电镜观察。 二、 结果 2 1 倒置相差显微镜观察 第二天细胞贴壁，呈梭型( 图3 1 ) ，5 7 天左右细胞向外伸出突起逐渐 形成多角形( 图3 - - 2 ) 。7 一l o 天左右软骨细胞铺满培养皿底面并形成细胞单层， 细胞形态逐渐变成类圆型，此时的细胞开始分泌细胞外基质，可以观察到每个细 胞周围都存在着具有明显折光特点的细胞外基质( 图3 3 ) 。 2 2 倒置相差显微镜观察支架一细胞复合体 预湿海螵蛸支架接种细胞悬液后，细胞迅速均匀地扩散到支架空隙内，单 个或呈团状附在支架表面及孔隙中( 图3 - - 4 ) 。2 天后晃动培养皿细胞团无飘动， 散落在培养皿底部的细胞较少。随着培养时间的延长，2 周后细胞逐渐布满整个 支架空隙，并有基质分泌，呈蜘蛛网样分布于支架之中( 图3 5 ) 。 2 2 扫描电子显微镜观察 复合体体外培养1 周，软骨细胞扁平，呈纺锤型、三角形或不规则型黏附在 海螵蛸支架表面，形态饱满，细胞相互交接( 图3 6 ) ，在与支架接触部位伸出 伪足，形成“鸭蹼”状黏附( 图3 7 ) ；2 周后，软骨细胞明显较前增多，相互 之间融合成片，单层分布，沿规则壁龛结构聚集生长，并大量分泌基质，覆盖于 支架表面( 图3 - - 8 ) 。 三、讨论 在本实验研究中，我们首次尝试选择晦螵蛸作为软骨细胞培养的支架材料， 对软骨细胞一支架复合体进行体外培养观察。实验中为改善海螵蛸支架的亲水 性，对其进行了预湿处理。研究结果发现预湿海螵蛸支架接种细胞悬液后，细胞 迅速均匀的扩散到支架空隙中( 图3 - - 9 ) ，而不预湿的海螵蛸支架接种细胞后呈 半球形，缓慢渗入支架中( 图3 1 0 ) 。2 d 后晃动培养皿细胞团无飘动，皿底仅 有少量细胞黏附，证明支架对细胞有很好的黏附性。 在职申请硕士学位 第三部分 本文考察了关节软骨细胞在甲壳素网中的生长情况。1 。关节软骨细胞在甲 壳素基材中的生长特点与在壳聚糖基支架材料上有很大不同。甲壳素网格中附着 的软骨细胞呈扁平状，而壳聚糖基支架材料上附着的软骨细胞呈球形。与本实验 结果相符。原因是甲壳素基材表面正电荷的影响，有利于带副电荷细胞的吸附。 s h e l t o n 等”1 在研究聚合物表面电荷状况与迁移成骨细胞之间关系时证实，带 正电荷的材料表面与细胞膜之间是紧密吸附的，细胞形态呈扁平；而带负电荷的 材料表面则与细胞膜之间出现明显的间隙，一些情况下细胞呈“站立”( s t a n d o f f ) 状。软骨细胞在每螵蛸材料上生长状况良好，可能与正负电荷相吸有关。 此外，软骨细胞适宜在弱碱环境中生长，而海螵蛸中的主要成分碳酸钙和甲壳素 以及甲壳素的分解产物均呈弱碱性。适宜软骨细胞生长。 细胞支架复合物体外培养期闻基质产生情况是评价软骨细胞功能的指标之 一。能否在较短时间内使细胞达到一定密度，是关节软骨细胞最终能否存活并分 泌细胞外基质的关键问题”1 故而细胞首先在材料表面生长有两方面的因素：一 是软骨细胞在植入基材后受重力作用，底部细胞密度较高，二是支架材料给细胞 提供足够的响应，促进细胞及早黏附汹1 。本实验中复合物在体外培养期间基质 产生旺盛，说明软骨细胞较好的发挥了功能。 四、结论 天然壁龛样网格结构的海螵蛸支架提供的三维空间有利于软骨细胞的生长、 分裂、增殖及软骨基质的形成，预湿惠螵蛸支架是软骨细胞良好的体外培养支架。 原代培养的新生兔关节软骨细胞可以作为软骨细胞组织工程的种子细胞。 在职申请硕士学位全文包结 全文总结 软骨细胞的再生和自修复能力极其有限，一旦损伤很难自身修复哪。3 “，因 此，组织工程修复软骨缺损被寄予厚望。组织工程是目前医学科学新发展的前沿 学科，组织工程的核心包括种子细胞和支架材料两个方面。目前对软骨、骨组织 工程中支架材料的选择尚有分歧，如何寻找到理想的组织工程支架材料己成为软 骨和骨组织工程研究中迫切需要解决的问题。目前应用于骨组织工程的支架材 料种类繁多，国内外学者作了许多有益的尝试。理想的组织工程支架材料应具有 生物相容性、生物可降解性、多孔性等特点，以利于细胞粘附、生长，增殖和 分化，并形成功能性组织。 目前用于软骨和骨组织工程的支架材料大体分为3 大类：天然有机高分子材 料，人工合成商分子有机物和无机材料。无机材料在物理形状、多孔性和复合成 骨能力等方面，可能更具优越性。 海螵蛸具有来源丰富、造价低廉、并有天然的网格孑l 隙结构系统。将海螵蛸 脱脂脱蛋白处理后，通过以上实验观察，我们初步了解了海螵蛸的三维空间结构， 具有一定大小的孔径和孔强度的开放型多孔结构，而且各方向的孔径相同，及其 得孔率为9 2 ，适合细胞黏附、生长。在生物相容 生研究中发现海螵蛸具有良 好的组织相容性、可降解及无细胞毒陛。通过晦螵蛸支架与软骨细胞体外培养进 一步证明了该支架适合软骨细胞生长，海螵蛸支架可作为软骨细胞良好的体外培 养支架。有作者把每螵蛸浸泡于自体骨髓细胞悬液中吸附细胞，再在二氧化碳培 养箱内培养2 4 小时后植入体内，研究结果显示海螵蛸吸附骨髓细胞后，其成骨 能力非常有限，并认为海螵蛸不宜作为骨髓吸附的载体1 。我们认为海螵蛸吸 附骨髓细胞成骨能力差的主要原因并不在于海螵蛸本身，因为海螵蛸亲水眭差， 浸泡于自体骨髓细胞悬液中，水和细胞较难进入海螵蛸微孔内，这必然影响骨髓 细胞成骨能力。我们通过反复探索发现湿化每螵蛸滴加细胞悬液后，水和细胞能 很快进入细胞内，这是我们成功的关键，我们认为海螵蛸是软骨细胞悬体外培养 的良好支架。 同时我们建立了消化分离、体外培养新生兔关节软骨的方法，通过对细胞生 长行为、形态学研究，观察到家兔软骨细胞体外生长较为旺盛，培养板内培养两 一2 0 在职申请硕士学位 全文总结 周即可成膜并继续生长，基本保持软骨细胞形态学特点，并具有分泌细胞基质的 作用，可以作为软骨细胞组织工程种子细胞使用。 但是，天然生物衍生材料的可塑陛差，在大规模生产过程中会出现质量难以 控制等缺点，且目前的处理方法尚不完善，对其制备及性能控制还待进一步研究。 在职申请硕士学位参考文献 参考文献 1 、m i k ea g ，t h o r s e na j ，c z e r w o n k al a ，e ta 1 p r e p a r a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o n o fp o l y ( l - a c l d ) f o a m j p o l y m e r ，1 9 9 4 ，3 5 ( 6 ) ： 1 0 6 8 - 1 0 7 7 2 、m 1 k ea g ，s a r a k i n o sg ，l y m a nm d ，e ta 1 s a g i t t a lr a m u so s t e o t o m sf i x e d w i t hb i o d e g r a d a b l es c r e w s ：ap r e l l m n a r yr e p o r t j jc e l l ub t o c h a m ， 1 9 9 4 5 6 ( 4 ) ：1 9 2 1 9 5 3 、p u e l a c h e r 霄c ，w i s s e rj ，v a c a n t ic a ，e ta 1 t e m p o r o m a n d l b u l a rj o i n t d i s cr e p l a c e m e n tm a d eb yt i s s u e e n g i n e e r e dg r o w t ho fc a r t i l a g e j j o r a lm a x i1l o f a cs u r g ，1 9 9 4 ，5 2 ：l1 7 2 一l1 7 7 4 、z h a n gl l ，d e n gx m ，z h a os j ，e ta 1 b i o d e g r a d a b l ep o l y m e rb l e n d so f p o l y ( 3 - h y d r o x y b u t y r a t e ) a n ds t a r c h a c e t a t e j p o l y mi n t 1 9 9 7 4 4 ：1 0 4 1 1 0 5 、z h a n gl l ，d e n gx m ，z h a os j ，e ta 1 b i o d e g r a d a b l ep o l y m e rbl e n d so f p o l y ( 3 - h y d r o x y b u t y r a t e ) a n dh y d r o x y e t h y lc e l l u l o s ea c e t a t e j p 0 1 y m e r 1 9 9 7 3 8 ：6 0 0 1 6 0 0 7 6 、z h a n gl l ，d e n g ，z h a os j ，e ta 1 b i o d e g r a d a b l ep o l y m e rb l e n d so f p o l y ( 3 一h y d r o x y b u t y r a t e ) a n dp o l y ( d l l a c t i d e ) c