（分析化学专业论文）几种药物小分子与蛋白质作用的光谱研究.pdf

摘要 在生物体中，蛋白质是必不可少的生命物质，在生命的运动和发 展延续中起着重要作用。血清白蛋白是体内含量最丰富的运输蛋白质， 有许多重要的生理学和药理学功能，能与药物结合，起到存储和转运 作用，随着医药学和生命科学的发展，研究小分子，尤其是药物和具 有生物活性的小分子与蛋白质的相互作用机理，对药代动力学的认识 和开发新药有极其重要的意义，是目前生命科学、化学和临床医学中 共同关注和感兴趣的课题之一。本文在他人工作的基础上，综合利用 荧光光谱、紫外可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱研究了小分子 药物与蛋白质的相互作用，主要内容如下： 1 、在概述药物小分子与生物大分子相互作用的研究手段、研究内 容的基础上，提出了本文研究的立题思想。 2 、用荧光光谱、紫外可见吸收光谱和傅里叶变换红外光谱技术 研究了生理条件下呋苄西林钠( f b s ) 与牛血清白蛋e t ( b s a ) 的结合反 应。发现f b s 对b s a 有较强的相互作用，f b s 对b s a 内源荧光有 猝灭作用，按照s t e m v o l m e r 方程和双对数方程分析处理实验数据， 得到不同温度下f b s 与b s a 结合反应的结合常数及结合位点数，常 温( 2 6 ) 时分别为1 0 4 1 0 4l m o l j 和1 0 9 ，红外光谱表明了f b s 与b s a 之间的相互作用影响了牛血清白蛋白的二级结构，使其构象 发生了变化。 3 、用多种光谱技术研究了生理条件下川陈皮素( n o b ) 与牛血 清白蛋白( b s a ) 的相互作用及热力学特征。实验表明，n o b 与b s a 有较强的结合作用且荧光猝灭为静态猝灭。按照s t e m v o l m e r 方程和 双对数方程分析处理实验数据得出不同温度下n o b 与b s a 的的结合 反应的结合常数和结合位点数，在常温( 2 9 4k ) 时分别为3 2 5 1 0 4 l m o l j 和1 2 4 。运用紫外光谱得到常温下n o b 与b s a 的结合常数 2 7 3 1 0 4l m o l ，与通过荧光光谱得到的结合常数相近，热力学参 数h ，s 分别为5 5 9 1k j m o l 2 7 6 5j m o l - i k - i , 表明其主要作用力 类型为疏水力，在实验中用参比法得出b s a 荧光量子产率为0 0 7 4 ， 根据f o r s t e r 非辐射能量转移机制测得n o b 与b s a 能量转移效率与 结合距离分别为0 2 7 4n m 和1 7 6n m ，同步荧光光谱研究发现川陈皮 素对牛血清白蛋白构象几乎没有影响。 4 、用多种光谱技术研究了生理条件下石杉碱甲( h a ) 与人血清白 蛋e i ( h s a ) 的相互作用。结果表明：h a 对h s a 的荧光有较强的猝灭 作用，其荧光猝灭为静态猝灭过程，其作用机制属能量转移机制。从 荧光猝灭结果求得不同温度下反应的结合常数k ，随反应温度上升k 值下降。由反应焓变、嫡变，确定它们间的结合主要是静电引力。依 据非辐射能量转移机理，求出了其结合位置和能量转移效率。 关键词：相互作用，蛋白质，药物小分子，荧光光谱，紫外光谱，红 外光谱 a b s t r a c t t h ep r o t e i ni se s s e n t i a lf o rt h el i f ep r o c e s sa n dp l a y sa ni m p o r t a n t r o l ei nm e t a b o l i z i n go fc e l l s s e r u ma l b u m i ni st h em o s ta b u n d a n tp r o t e i n i nt h eb o d y a si t sc o m b i n a t i o nw i t hd r u g s ，s e r u ma l b u m i nh a sm a n y i m p o r t a n tp l a y s i o l o g i c a l f u n c t i o n sa n dp h a r m a c o l o g y t h e r e f o r e ，t h e d e v e l o p m e n to fs m a l lm o l e c u l er e s e a r c h ，p a r t i c u l a r l yt h er e s e a r c ho nt h e i n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo fb e t w e e no fas m a l lm o l e c u l ew i t hb i o l o g i c a l a c t i v i t ya n dp r o t e i ni sv e r yi m p o r t a n tf o rt h ed e v e l o p m e n to fn e w m e d i c i n e s a n di ti sa l s oat o p i co fc o m m o nc o n c e r na n di n t e r e s ti nl i f e s c i e n c e s ，c h e m i c a la n dc l i n i c a l b a s e do nt h ew o r ko fo u rp r e d e c e s s o r s ， t h ei n t e r a c tm e c h a n i s mo fb e t w e e ns m a l lm o l e c u l ed r u g sa n d p r o t e i na n d t h ee f f e c to fd r u g so n p o r t i o n w e r es t u d i e db y u s i n gf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y ，u v v i s i b l ea b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ，a n df o u r i e rt r a n s f o r m i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y t h es t u d i e si nt h i st h e s i sa r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： 1 t h em e t h o d ss u c ha su v - v i s ，f t i ra n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y w e r eu s e df o rr e s e a r c h ，t h r o u g hw h i c ht h er e a c t i o n sb e t w e e nm e d i c i n e a n dp r o t e i na n dt h ep r o g r e s si np h a r m a c e u t i c a la n a l y s i si nr e c e n ty e a r s w e r er e v i e w e d a n dt h ei d e ao ft h es t u d yw a sp r o p o s e d 2 t h eb i n d i n gr e a c t i o n sb e t w e e nf u r b e n i c i l l i ns o d i u m ( f b s ) a n d l l i b o v i n es e i u m a l b u m i n ( b s a ) u n d e rp h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o nw a s i n v e s t i g a t e d w i t hf l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y ，u v - v i s i b l ea b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p ya n df o u r i e rt r a n s f o r mi n f r a r e ds p e c t r o s c o p y t h er e s u l t s s h o w e dt h a tas t r o n gi n t e r a c t i o no ff b sw i t hb s aw a sf o u n da n dt h e f l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gf u n c t i o no ff bst ob s aw a so b s e r v e d t h e b i n d i n gc o n s t a n t sa n db i n d i n gs i t e so ff b sa n db s au n d e rd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e sw e r eo b t a i n e d w i t hs t e m - v o l m e re q u a t i o na n dd o u b l e l o g a r i t h m i ce q u a t i o na n a l y s i s ，w h i c hi s1 0 4 10 4lm o l 1a n d1 0 9a t r o o mt e m p e r a t u r e ( 2 6 ) ，r e s p e c t i v e l y i n f r a r e ds p e c t r as h o w e dt h a tt h e s e c o n d a r ys t r u c t u r ew a sc h a n g e db yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nf b sa n d b s a 3 t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nh u m a ns e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n dn o b i l e t i n ( n o b ) a n di t st h e r m o d y n a m i cc h a r a c t e r i s t i c sw e r ei n v e s t i g a t e db y m u l t i - s p e c t r o s c o p yi np h y s i o l o g i c a lm e d i u m t h er e s u l t ss h o w e dt h a t n o bc o u l dq u e n c ht h ef l u o r e s c e n c eo fb s aw i t has t a t i c q u e n c h i n g m e c h a n i s m t h ea p p a r e n tb i n d i n gc o n s t a n ta n dt h en u m b e ro fb i n d i n g s i t e sw e r ee s t i m a t e da s3 2 5 10 4lm o l a n d1 2 4f o rb s a n o ba t2 9 4 kw i t hs t e r n - v o l m e re q u a t i o na n dd o u b l el o g a r i t h m i ce q u a t i o na n a l y s i s t h eb i n d i n gc o n s t a n to fn o ba n db s aw a se s t i m a t e da s2 7 3 10 4l m o l a tr o o mt e m p e r a t u r eu s i n gu vs p e c t r a ，w h i c hi ss i m i l a rt ot h a t o b t a i n e db yf l u o r e s c e n c ea n a l y s i s ，w h i l et h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s a ha n da sw e r ee s t i m a t e da s5 5 9 1k j m o l a n d2 7 6 5j m o l k 一， w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ei n t e r a c t i o nf o r c eo ft h en o ba n db s ai st h e m a i nh y d r o p h o b i cf o r c e t h ef l u o r e s c e n c eq u a n t u my i e l do fb s aw a s c a l c u l a t e da s0 0 7 4u s i n gr e f e r e n c em e t h o d a c c o r d i n gt of o r s t e rt h e o r y ， t h ee n e r g yt r a n s f e re f f i c i e n c ya n dt h ei n t e r a c t i o nd i s t a n c eo fb s aa n d n o bw e r eg i v e na s0 2 7 4a n d1 7 6n i l l s y n c h r o n o u sf l u o r e s c e n c e s p e c t r ao fh s ai n d i c a t e dt h a tt h ec o n f o r m a t i o n so fb s aw e r en o t c h a n g e di np r e s e n c eo fn o b 4 m u l t i p l es p e c t r o s c o p e sw e r ee m p l o y e dt oi n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nh u p e r z i n ea ( h a ) a n dh s ai np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s a s t r o n gf l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gp h e n o m e n ao fh s ab yh a w a so b s e r v e d t h er e s e a r c hr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei n t e r a c t i o ni sas t a t i c q u e n c h i n g p r o c e s sc o n c o m i t a n c ew i t he n e r g yt r a n s f e r t h eb i n d i n gc o n s t a n t sa n d b i n d i n gs i t e ( k ) a td i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sw e r ei n v e s t i g a t e da n dt h e r e s u l t ss h o w e dt h a tt h ev a l u eo fkd e c r e a s e dw i t ht h ei n c r e a s eo ft h e t e m p e r a t u r e t h e i n t e r a c t i o nf o r c eb e t w e e nh aa n dh s ac a nb e d e t e r m i n e da se l e c t r o s t a t i ca t t r a c t i o nf o r c eb a s e do nt h ec h a n g e so f r e a c t i o n e n t h a l p y a n d e n t r o p y t h e d i s t a n c ea n d e n e r g y t r a n s f e r e f f i c i e n c yw e r ea l s oc a l c u l a t e db a s e do ni r r a d i a t i v ee n e r g yt r a n s f e r m e c h a n i s m k e yw o r d s ：i n t e r a c t i o n ，p r o t e i n ，d r u g ，f l u o r e s c e n c es p e c t r a ，u l t r a v i o l e t s p e c t r u m , i n f r a r e ds p e c t r u m v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的 研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：楠葬r 锾 钞g 年 j 月刁日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 i 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密嘭 ( 请在以上相应方框内打“ ) q卅多 罗 s 卜 潍彬 期期 几种药物小分子与蛋白质作用的光谱研究 第一章绪论 蛋白质是生物体中极为重要的生命物质，在生命的运动和发展 中起着关键作用，从整体上维持了生物体新陈代谢活动的进行，是生 物性状的直接表达者。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白， 在蛋白质与药物小分子化合物相互作用的研究中，血清白蛋白是目前 研究中最广泛的一种蛋白质，它能在体内与许多内源性物质及药物小 分子迅速、可逆地结合，很快达到动态平衡，各种药物与血清蛋白的 结合是非特异性的，具有饱和性和竞争抑制性，并具有多个结合部位， 且其数目是未知的，在结合过程中，蛋白质分子也往往发生构象变化。 血清白蛋白分子与药物小分子间相互作用也影响到药物的最大作用 强度、作用幅度以及作用时间。所以生命科学、化学、药学及临床医 学对于有关蛋白质的各类研究十分重视，其研究成果在临床治疗以及 药物的药效学和药动学上具有重要意义。了解药物与蛋白质的结合程 度、结合部位、结合力、结合位数，建立结合的体外模型，不仅对于 揭示体内药物动力学问题、指导临床合理用药具有一定意义，而且为 药物分子设计与筛选、开发新药等提供重要指导。 分子光谱是指分子能级之间跃迁形成的发射光谱和吸收光谱。分 子光谱非常丰富，可分为纯转动光谱、振动转动光谱带和电子光谱 带。分子的纯转动光谱由分子转动能级之间的跃迁产生，分布在远红 外波段，通常用于观测吸收光谱；振动转动光谱带由不同振动能级 湖南师范大学高校教师在职硕十学位论文 上的各转动能级之间跃迁产生，是一些密集的谱线，分布在近红外波 段，通常用于观测吸收光谱；电子光谱带由不同电子态上不同振动和 不同转动能级之间的跃迁产生，可分成许多带，分布在可见或紫外波 段，可用于观测发射光谱。非极性分子由于不存在电偶极矩，没有转 动光谱和振动转动光谱带，只有极性分子才有这类光谱带( 蛋白质是 有机极性大分子物质) 。分子光谱是提供分子内部信息的主要途径， 因而根据蛋白质的分子光谱可以确定其分子的转动惯量、分子的键长 和键强度以及分子离解能等许多性质，从而可推测蛋白质分子的结 构。 利用分子光谱进行分析的方法统称分子光谱分析法。分子光谱分 析法主要有( 1 ) 紫外一可见吸收光谱法( u v - v i s ) ；( 2 ) 红外吸收光谱法 ( i r ) ；( 3 ) 激光拉曼光谱法( l r s ) ；( 4 ) 核磁共振波谱法( n m r ) ；( 5 ) 电子 自旋共振波普法( e p r ) ；( 6 ) 分子荧光光谱法( m f s ) ；( 7 ) 分子磷光光谱 法( m p s ) ；( 8 ) 分子转动光谱法【1 1 。 早在2 0 世纪3 0 年代，就对分子间弱相互作用力进行了大量的研 究，而在此后的很长一段时间内对它的研究进展缓慢。近年来，随着 超分子化学研究的深入，对分子间弱相互作用本质的研究引起世界科 学界的极大关注。一般认为分子间的弱相互作用力主要有范德华力、 氢键作用以及堆砌作用力等几种形式。研究分子间弱相互作用的手段 主要包括x 晶体衍射、核磁共振、质谱、圆二色谱、荧光光谱以及 分子吸收光谱法。 本章重点介绍利用紫外光谱法、红外光谱法和分子荧光光谱法研 几种药物小分子与蛋白质作用的光谱研究 究蛋白质和药物小分子的相互作用。 1 1 蛋白质的结构 蛋白质( s 0 所谓功能基因组，俗称后基因组- ) 是基因的表达产物， 是生命活动的执行者，是生物体的基础物质之一，在生命过程中起着 极其重要的作用。蛋白质与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、 物质运转、遗传、进化等都有密切关系。血清白蛋e t ( s e r u ma l b u m i n ) 是人和动物体内血浆中含量最丰富的蛋白质，它不仅是维持血浆渗透 压的主要力量，在生理上还参与多种内源、外源性物质( 如金属离子、 脂肪酸、氨基酸、代谢物、胆红素、酶、药物和激素等) 的存储和转 运【2 1 ，是一种含有多种基团的生物大分子，分子量在6 6 0 0 0 左右。 人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 是血浆中最丰富的蛋白 质，在人体内起着重要的贮存和运输作用，它是由2 0 种l 氨基酸( 实 一际上是1 9 种氨基酸和1 种亚氨基酸合成的多聚体) 。h s a 的分子量为 6 6 5 0 0 ，由5 8 5 个氨基酸残基组成，其氨基酸序列包括17 个二硫桥， 一个单独的半胱氨酸残基( c y s 3 4 ) 和一个色氨酸残基( t r p 2 1 4 ) 。h s a 的三维结构在1 9 9 2 年由h e 和c a r t e r 3 1 用结晶谱学确定：h s a 由三个 结构相似的功能域( d o m a i ni 、i i 、i i i ) 组成，每一个能域又包含两个相 似的螺旋结构的亚域( s u b d o m a i na 和s u b d o m a i nb ) ，六个亚域聚集在 一起，形成一个不对称的心形分子。分子有约6 7 的螺旋结构，其余 则为转角及伸展肽链。每个功能域主要有1 0 个螺旋结构( h l h l o ) ， 其中h 1 h 4 和h 7 h 1 0 分别构成了亚域a 和b 的相似的主要部 分，亚域a 还包括另外的两个反平行螺旋h 5 和h 6 ，亚域b 则还包括 湖南师范大学高校教师在职硕十学位论文 n 端的一段伸展肽链，亚域i a i b 、i i a i i b 、i i i a i i i b 间的连接，则 分别是l y s l 0 6 至g l u l l 9 ，g l u 2 9 2 至v a l 3 1 5 ，g l u 4 9 2 至a l a 5 1 1 的三 段伸展肽链。整个h s a 分子内共有1 7 个二硫键，主要分布于a 螺旋 之间，除亚域a 中h 1 和h 3 间二硫键缺失外，各亚域的二硫键分布 相似。有了对h s a 及其键合位点三维结构的清楚认识之后，药物和 h s a 相互作用机制的研究也更加活跃和深刻。 牛血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，b s a ) 结构与h s a 相似，分 子量相近，二者的氨基酸序列高度相似，且不同氨基酸均为保守性替 换。b s a 的等电点为4 7 ，分子量为6 7 0 0 0 ，是一种典型的球状蛋白， 性质比较稳定，且b s a 价廉易得，因此人们常用b s a 代替h s a 来 进行蛋白质小分子结合实验。 2 2 紫外光谱法在研究蛋白质和小分子相互作用中的应用 在蛋白质分子中某些氨基酸残基尤其是芳香氨基酸残基和许多 小分子中都会有生色团，在紫外光谱中能产生吸收峰，一般在2 1 0n m 处的峰是肽键的强吸收峰，2 8 0n l l 处的峰是酪氨酸、色氨酸以及苯 丙氨酸残基中共轭双键的吸收峰，根据峰形和峰位的变化即可判定小 分子是否与蛋白质发生作用4 1 。因此，可利用小分子与生物大分子结 合前后，两者之一的吸收光谱的变化来判断小分子与蛋白质等之间是 否存在相互作用，并得到作用方式【5 。6 】、热力学参数等信息，还可以 进一步研究实验条件对热力学参数的影响。蛋白质与一些小分子配体 结合后其分子结构发生了一定的变化，相应地出现了吸收峰位移或谱 峰宽度变化，据此可研究蛋白质与小分子间的结合强弱和结合机理 几种药物小分子与蛋白质作用的光谱研究 阴。王亚俐等嗍利用光谱法研究了苯甲酸钠与b s a 的体外相互作用。 苯甲酸钠的加入使得b s a 紫外吸收光谱中2 1 0n m 处的峰值逐渐降 低，峰位红移。表明，苯甲酸钠的加入使b s a 主链构象发生变化， 即螺旋结构变松散。朱兵等【9 1 利用紫外示差光谱法对稀土离子与乳铁 蛋白的结合进行了研究，结果表明，t b 3 + 与e u 3 + 可特异性地结合在脱 铁乳铁蛋白的两个f e 3 + 结合部位，但并不能从已经结合铁的乳铁蛋白 中把铁置换出来。周妍娇等【1 0 1 利用紫外光谱以及圆二色谱对金属硫蛋 白及其结构域突变体进行了研究，表明，结构域之间存在相互作用， 并且影响其与金属离子的结合。魏晓芳等研究了p h2 3 1 1 3 的 范围内b s a 芳香氨基酸残基微环境的变化，研究结果表明，碱诱导 蛋白质分子空间构象充分伸展，将更多的疏水性氨基酸残基暴露于溶 剂中。俞英等旧用分光光度法对酸性品红与b s a 的作用机理进行了 r t 研究，认为两者主要是通过酸性品红中的。s 0 3 2 与b s a 中的n h 靠静 电引力而结合，在此基础上进一步测定和计算了结合参数，同时分析 了实验条件对表观结合常数k c ，每分子蛋白质上结合配体分子数n ， ，表观摩尔吸光系数a e ，s a n d e l l 灵敏度指数s 的影响。高峰等利用 紫外可见( u v n i s ) 光谱法研究了小分子染料灿烂甲酚蓝( b c b ) 与小 牛胸腺d n a ( c td n a ) 的相互作用，得出d n a 在低浓度时，b c b 能 结合d n a 形成1 ：1 的化合物，结合常数为4 3 1 0 4l m o l 一，d n a 与b c b 的主要结合方式是“静电作用 方式；而在较高浓度时，则变 成“嵌入作用”方式。由于紫外可见光谱所反映的信息量有限，必要时 可以结合其它的光谱学方法。 湖南师范大学高校教师在职硕十学位论文 蛋白质的定量所使用的方法多种多样，其中用小分子作为光谱探 针测定蛋白质以其简便、灵敏等优点而被广泛应用。如染料探针可用 于辨别蛋白质分子中氨基的状态、蛋白质分子的活性区，可检测p m o l 级的蛋白质；稀土离子探针可用于研究蛋白质分子与金属离子结合部 位的结构类型，给出蛋白质分子构象及构象动力学信息。目前利用紫 外光谱法对蛋白质与探针小分子的作用机制开展了广泛的研究。胡秋 娈等【1 4 】利用光谱法研究了b s a 与硝酸偶氮的反应。在硝酸偶氮体系 加入b s a 后，硝酸偶氮的光谱特征变化表明，硝酸偶氮和b s a 生成 了非共价键复合物，带负电荷的硝酸偶氮与带正电荷的蛋白质分子主 要以静电引力结合。李娜【博】也利用紫外分光光度法对偶氮类染料与蛋 白质的相互作用进行了研究，对二者的作用机制有了进一步的认识和 了解。蛋白质吸光探针尽管研究得较早，已得到广泛的应用，但是， 这类探针反应的作用机理迄今仍不很清楚，即对于光谱探针小分子和 蛋白质分子的相互作用的了解并不是太透彻。所以深入开展蛋白质的 光谱探针理论研究，对于深刻理解其反应实质，实现从感性认识到理 性认识的飞跃，指导改进蛋白质的分析方法，实现与生命科学、临床 医学的发展相适应，均有着重要的意义。 1 3 红外光谱法在研究蛋白质与药物小分子作用方面的应用 红外光谱是研究小分子药物与血清白蛋白相互作用的新方法，它 可以从蛋白质二级结构变化的层次来探讨其结构与功能的关系。蛋白 质二级结构( 如0 【螺旋、p - 折叠、p 一转角等) 的酰胺i 带、i i 带伸缩振 动在红外光谱图谱上表现为特征性的吸收峰。从实验测得的红外光谱 几种药物小分子与蛋白质作用的光谱研究 是真实光谱与仪器线性函数卷积的结果，卷积降低了光谱的分辨率而 使谱带宽大。去除这个线性函数的影响称为解卷积或去卷积，可以提 高光谱的表观分辨率，从而可将重叠的谱带分解成各个子谱带，达到 分峰的目的。运用傅里叶自解卷积将重叠的酰胺i 带分成数个单峰， 从而定量获取二级结构含量的信息，因此傅里叶变换红外光谱( f t i r - ) 可以测定蛋白质在各种条件下二级结构的变化情况。对各峰的指认目 前尚无统一的标准，根据仪器、使用方法的不同，所指认的结果略有 不同，较公认的对酰胺i 带中各子峰的指认是：波数在1 6 5 0 1 6 5 8 c m 1 范围的峰面积代表q 一螺旋的含量，1 6 2 0 1 6 4 0c m 。处是p 结 构的含量。傅里叶自转积和二阶导数光谱的应用，大大提高了红外光 谱的分辨率，从而能有效地用于蛋白质热变性、溶剂变性、化学变性、 化学修饰、配基结合和个别氨基酸残基替换所引起的微小构象变化的 分析，成为揭示蛋白质构象变化的重要工具【1 6 】。和其他方法相比，傅 里叶红外光谱法不受分子量大小、光散射的影响，较适用于研究生物 状态下的蛋白质结构。 谢孟峡等 1 刀运用蛋白质红外光谱酰氨i i i 带和酰氨i 带结合的方 法对人血清白蛋白与p 1 ，2 ，3 ，4 ，6 五0 倍酰d - 葡萄糖( p g g ) 作用后 二级结构的变化进行了定量分析，结果表明随着药物浓度增加，p g g 和h s a 之间的相互作用主要使h s a 的二级结构发生了g t 螺旋向1 3 转角和无规则卷曲结构的转化。刘媛等【1 8 1 应用衰减全反射傅里叶变换 红外光谱研究了中草药三七总皂甙对b s a 溶液构象的影响，实验表 明随着三七总皂甙浓度增加，蛋白质分子结构逐渐发生了由螺旋向折 湖南师范大学高校教师在职硕十学位论文 叠的转化。谢孟峡等研究了4 、5 、7 三羟基二氢黄酮与h s a 相互 作用方式。z h o u 等【2 0 1 研究了聚二烯丙基氯化铵( p d d a ) 与d n a 的作 用，证明p d d a 与d n a 分子中的碱基和磷酸基发生了作用， d n a p d d a 复合物的形成导致d n a 二级结构构象发生了变化。傅 晓红等 2 l 】利用f t i r 技术对胆碱脱氢酶( c d h ) 处于非底物合状态以及 与底物作用过程中c d h 的二级结构的变化进了研究。童义平等【2 2 1 利 用傅里叶红外光谱法研究了b s a 及其水溶液的红外光谱，通过对其 酰胺i 带进行傅里叶自转积谱分析，为其及部分水溶液中的二级结构 构象进了指认。结果表明，b s a 水溶液状态与固态时的二级结构不 同的，随着溶液浓度的降低，酰胺i 带二级结构峰存在明显的位移现 象，说明溶液中水对蛋白质结构链上的氢键产生影响，从而造成了蛋 白质二级结构构象的变化。周瑞明等【2 3 】利用红外光谱法研究鸡蛋白的 二级结构中氢键的存在及它对维持蛋白质二级结构的空间构象所具 有的作用。外来离子的加入会使二级结构的氢键受到一定程度的破 坏，n h 和c = o 相对反式排列构象减少，而顺式构象增多，从而从 红外光谱分析推断，蛋白质的二级结构是由于氢键的存在而维持起空 间构象的稳定性。 1 4 分子荧光光谱法在研究蛋白质与药物小分子作用中的应用 蛋白质之所以能够发出荧光，是因为蛋白质中存在三种芳香族氨 基酸，即：色氨酸f f r p ) 、酪氨酸( t y r ) 和苯丙氨酸( p h e ) ，能发出内源 荧光。这些氨基酸具有不同的结构，它们的荧光强度比为1 0 0 t9 ：o 5 。 因此，大多数情况下，可以认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸 几种药物小分子与蛋白质作用的光谱研究 残基的贡献，而且含色氨酸残基的蛋白质的天然变化直接反映了蛋白 质中色氨酸残基本身和周围的变化。通常2 8 5n m 激发时，蛋白质中 色氨酸残基和酪氨酸残基均有贡献；3 0 0n m 激发时，只有色氨酸残 基有贡献。色氨酸残基和苯丙氨酸残基由于其侧链基团不同，而有不 同的光谱，其最大波长分别为3 4 8 、3 0 3 和2 8 2n m 。由于这些氨基酸 残基的荧光性质受环境影响非常大且对环境变化非常敏感，所以蛋白 质的内源荧光是一种有用的探针，可用来检测芳香族氨基酸残基所处 的微环境及其变化。 荧光光谱法( f l u o r e s c e n ts p e c t r u m ) 是研究生物大分子与小分子、 离子相互作用的重要手段之一。关于荧光猝灭法，其理论可参见 l a k o w i c z 2 4 1 及陈国珍【2 5 】的有关论著。荧光猝灭法可分为动态猝灭和静 态猝灭两种方式【2 6 1 。易平贵等【2 7 】应用荧光光谱法研究了水溶液中亚甲 基蓝与b s a 间的结合反应，讨论了亚甲基蓝对蛋白质内源荧光的猝灭 机理。范哲锋掣2 8 1 在碱性介质中，以稀土离子与色氨酸形成离子缔合 型异配位络合物使色氨酸的荧光猝灭，建立了稀土离子与色氨酸配合 物的分子模型并对其荧光猝灭机理进行了探讨。冯玉英等【2 9 】应用荧光 光谱法研究了肌红蛋( f e p p m b ) 的活性中心铁卟啉与铜离子的相互作 用。结果表明：肌红蛋白中的铁在水溶液中可被铜离子取代，形成铜 卟啉化合物( c u p p m b ) ，产生荧光猝灭，并且随着体系中铜离子量的 增加，其相互作用增强。文献 3 0 - 3 1 】则报道了抗生素类药物与血清白蛋 白结合的作用模式。近年来荧光光谱法也用于中草药中有效成分与蛋 白质相互作用的研究 3 2 - 3 5 】，得出一些有益的结论。 湖南师范大学高校教师在职硕十学位论文 随着药物的加入，h s a 或b s a 的荧光强度有规律的降低，研究蛋 白质的荧光猝灭过程就能得到小分子与蛋白质作用的结合常数、作用 区域及位置信息【3 6 1 。王群等【3 7 】利用荧光光谱法研究了重组人内皮抑素 ( r h e s ) 与中药有效成分芦荟大黄素( a e ) 的相互作用机制，求得两者的 结合常数。探讨了a e 对r h e s 蛋白荧光的猝灭机理以及二者之间的相 互作用。卢继新等 3 8 - 3 9 1 研究了在金属离子存在下甲氨喋呤、巯嘌呤与 血清白蛋白间的相互作用，研究表明金属离子存在使药物与血清白蛋 白之间的结合增强、结合位点数发生改变。 根据荧光光谱和吸收光谱可获得药物与h a s ( 或b s a ) 的结合位点 数，及药物与h s a 、b s a 上色氨酸残基的距离，根据反应焓变、熵 变确定它们之间的相互作用力【柏1 。张勇等【4 1 1 利用荧光猝灭法研究了丝 裂霉素与b s a 以及金属离子间的相互作用，结果表明b s a 与丝裂霉素 的结合常数k h s a = 1 6 4 1 0 4m o l l 、k b s a = 1 8 9 1 0 4m o l l ，f e 3 + 、 z n 2 + 、m 9 2 + 存在使结合常数降低，c u 2 + 使结合常数增大。丝裂霉素与 b s a 的结合位点数为l ，丝裂霉素距色氨酸残基距离r h s a = 4 2 4n m ， r b s a = 3 7 6n m 。它们之间的相互作用力为疏水作用力。 再依据f o r s t e r n p , 量转移机制可求出配体受体间的结合距离r 及 能量转移效率e ，这使该法的应用十分广泛【4 2 删。肖厚荣等应用荧 光光谱研究了水杨酸与b s a 分子间的相互作用。研究表明：水杨酸对 b s a i 为源荧光的猝灭机制属于静态碎灭，并求得猝灭常数、结合常数、 结合位点数以及结合距离和能量转移效率。玄光善等【删以荧光光谱法 研究乙酞水杨酸禾i j b s a 分子间的相互作用。研究表明乙酞水杨酸可猝 几种药物小分子与蛋白质作用的光谱研究 灭b s a 的荧光，两者之间由静电引力形成稳定的复合物并发生能量转 移。 另外根据发射波长的移动可以判断蛋白质构象的变化。黄波等4 7 】 研究了阿霉素与b s a 结合作用，结果表明阿霉素的加入使b s a 的构象 发生了变化。文献【4 8 】研究了氯丙嗪和氯高铁红素与b s a 的相互作用， 结果表明氯高铁红素可以增强氯丙嗪对的b s a 猝灭作用，使b s a 的 构象发生变化。李乐军等【4 9 1 利用同步荧光光谱和拉曼光谱研究了脉冲 电场与b s a 的相互作用。同步荧光光谱研究表明：脉冲电场对b s a 的发 射荧光光谱强度产生影响，降低了处于其活性部位的色氨酸和酪氨酸 残基的发射荧光强度，猝灭了两种芳香族氨基酸的内源荧光。祁超等 【5 0 1 利用m e s o 四( a ，a ，a ，a 0 苯乙酰苯) 卟啉与其单克隆抗体1 f 2 结合后，产生显著的增色效应，来反映卟啉与抗体之间刚性紧密的结 合。用同步荧光光谱结合荧光猝灭法，推测抗体抗原结合部位的芳香 族氨基酸主要为色氨酸和酪氨酸，并求得卟啉与抗体的结合比和解离 常数。 对有些物质可利用其对某一特定体系的荧光猝灭作用而进行定 量测定。何华等川以荧光光谱研究了洛美沙星一t b 3 + 配合物与b s a 的 相互作用，建立了一种不受共存物质干扰的检测白蛋白的简便方法， 检测限为n g 级。实验发现：t b 3 + 与b s a 以非共价形式结合，导致蛋白 质构象改变，淬灭了色氨酸残基( 3 4 2n m ) 的荧光，并使荧光峰位移( 4 3 2 n m ) 。庞志功等【5 2 】利用苦参碱和氧化苦参碱对荧光试剂乙酸乙烯酯的 定量猝灭作用，建立了测定苦参碱和氧化苦参碱的荧光分析方法。杜 湖南师范大学高校教师在职硕十学位论文 黎明等【5 3 1 研究了氯苯胺酸与洛美沙星、环丙沙星、诺氟沙星发生的荷 移反应，并对这4 种物质进行了定量分析。 1 5 本文构想 本论文在总结他人工作的基础上，综合各种实验技术的利弊，以 荧光光谱技术为主，结合u v v i s 矛i j f t i r a t r 技术，研究模拟生理条 件下药物与血清白蛋白的相互作用。 研究抗绿脓杆菌的抗生素酰脲类半合成广谱青霉素呋苄西林钠 ( f u r b e n i c i l l i ns o d i u mf b s ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 之间的相互作用，探 索其与b s a 的作用方式和结合模式以及测定其结合位点以及结合常 数，同时研究呋苄西林钠对牛血清白蛋白的二级结构的影响，考察其 构象发生的变化；并通过考察植物提取黄酮类化合物川陈皮素 ( n o b i l e t i nn o b ) 与牛血清白蛋白的相互作用，以得到其作用的动力学 参数和热力学参数以及作用方式；通过研究生理条件下石杉碱甲 ( h u p e r z i n eah a ) 与人血清白蛋白( h s a ) 的相互作用，探讨其作用机 理。 几种药物小分子与蛋白质作用的光谱研究 第二章光度法研究呋苄西林钠与牛血清白蛋白的作用 药物进入人体都要通过血浆的储存和运输到达身体的各个部位 从而发生药理作用，血清蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，因此， 研究药物小分子与蛋白质等生物大分子相互作用机理具有重大意义。 呋苄西林钠( f u r b e n i c i l l i ns o d i u m ) 又名呋布西林钠，是酰脲类半 合成广谱青霉素，分子结构如图2 1 。呋苄西林钠与大肠杆菌、绿脓 杆菌呈多位点结合，且结合作用较强，对大肠杆菌p b p 2 和p b p 3 有 高度亲和力，对绿脓杆菌p b p l a 、p b p 2 、p b p 3 的亲和力优于哌拉西 林，对p b p 2 、p b p 3 的亲和力，明显超过第三代头孢哌酮，对绿脓杆 菌具有高度活性，外膜穿透力强，是最有应用价值的抗绿脓杆菌的抗 - 生素 5 4 - 5 5 】。 图2 - 1呋苄西林钠分子结构式 f i g u r e2 - 15 c n l r eo ff u r b e n i c i l l i ns o d i u m 为探索呋苄西林钠与蛋白质分子的作用机理，本文应用紫外光谱 法( u v o v i s ) 、分子荧光光谱法和傅里叶衰减全反射( f t i r a t r ) 光谱法 1 3 薏 湖南师范大学