（微生物学专业论文）高氧化还原电位铁硫蛋白铁硫簇结构稳定性的研究.pdf

硕士学位论文摘要 摘要 亚铁氧化酶是高氧化还原电位铁硫蛋白家族的成员之一，亚铁氧化 酶含有的铁硫簇中心，其作用主要是用于传递电子。在许多的文献报道， 保守的芳香族氨基酸可能对高氧化还原电位铁硫蛋白家族中铁硫簇的 稳定性有影响。在本文的研究中，通过定点突变，结果发现对铁硫簇的 稳定性t y r l o 是个非常关键的位点。在p h 3 5 的酸性条件下，肌1 0 ，p h e 2 6 和p h e 4 8 对铁硫簇的稳定性会造成重要的影响。而t r p 4 4 被包埋在铁硫 簇的疏水区域中心，没有直接参与影响铁硫簇的稳定性。即1 0 位点的 突变蛋白的分子结构模型显示研1 0 的芳香族氨基残基可能形成疏水域 来保护铁硫簇不受溶剂的影响。 高氧化还原电位铁硫蛋白( h i 曲p o t e n t i a li r o n s u l 矗】rp r o t e i n ) 是高氧 化还原电位铁硫蛋白家族中的成员之一，和亚铁氧化酶一样具有电子传 递功能，它是嗜酸氧化亚铁硫杆菌似c 砌砌面6 钟棚淞店m d 锨彪勉刀j ) 铁氧 化电子传递链的组分之一。我们通过定点突变构建了高氧化还原电位铁 硫蛋白的突变质粒y 1 5 f ，y 1 5 s ，f 3 1 s ，f 3 l y ，y 4 9 s ，y 4 9 f ，f 5 3 s ， f 5 3 y 。通过紫外可见结果证实了y 1 5 对于h i p i p 结合 4 f e - 4 s 的重要性。 关键词：嗜酸氧化亚铁硫杆菌、亚铁氧化酶、高氧化还原电位铁硫蛋 白、定点突变 堡主堂垡笙壅 摘要 一 ! ! = ! ：兰 i i a b s t r a c t t h ei r o no ) 【i d a s ei r op r o t e i l li sam e m b e ro fh i p i pf a m i l vw i t ht h e 【f e 4 s 4 】 c l u s t e rf o re l e c t i o n t l a n s f 毛i r 哇锄yr e p o r t sp r o p o s e dt h a tt h e c o n s e r v e da r o m a t i cr e s i d u e sm i g h tb er e s p o n s i b l ef o rt h e s t a b i l i t ! yo ft h e i r o n 。s u l 血rc l u s t e r 证h i p i p 1 1 1t h i s s t u d 弘1 订1ow a sf o u n dt ob eac r i t i c a l r e s i d u ef o rt h es t a b i l i t yo ft h e f e 4 s 4 】c l u s t e ra c c o r d i n gt o s i t e d i r e c t e d m u t a g e n e s i sr e s u l t s t y 订o ，p h e 2 6a n dp h e 4 8w e r ee s s e n t i a lf o rt h es t a b i l i t v o f t h e f e 4 s 4 c l u s t e ru n d e ra c i d i cc o n d i t i o n 1 r p 4 4w e i en o ti n v o l v e di nt h e s t a b i l i t yo ft h e 【f e 4 s 4 c l u s t e r m o l e c u l a rs t m c t i 玳m o d e l i n gf o rm eh m t a m t 弦1op r o t e i n sr e v e a l e dt h a tt h ea r o m a t i cg r o u po f1 姐1om a yf o n na h y d r o p h o b i cb a r r i e rt op r o t e c tm e f e 4 s 4 c l u s t e r 矗o ms o l v e n t t h eh i 曲p o t e n t i a li r o n s u l 如rp r o t e i n ( h i p i p ) 蠡o m 彳c 砒砌幻6 口c 川埘 弦力切铖彪幻脚w a sp r o p o s e dt ob ei 1 1 v o l v e di nt h ei r o nr e s p i r a t o 珂e l e c t r o n t r a n s p o r tc h a i ni na c i d i t h i o b a c i l l u s 衙o o x i d a n s u v - - ss c a n n i n ga n dc d f o rt 1 1 e p t e i nr e v e a l e dt h a t7 i 姐15 、v a si m p o r t a n tf o r 廿l es t a b i l i t yo ft h e f e 4 s 4 c l u s t e r 彳c 砌砌胁概讲淞枷砒嘲h n o x i d a s e ，t h eh i 曲 p o t e n t i a l i r o n s u l 允rp r o t e i n ，s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i s i i i 硕士学位论文第一章绪论 第一章绪论 嗜酸氧化亚铁硫杆菌似c 砌历面6 口c f 刀淞店，加似溉矾么肋阳似丸切砷是一种硫杆 菌属化能自养菌，属于革兰氏阴性菌，在生物冶金过程中起重要作用【l j 。么 屉肿似觑能量代谢途径具有多样性和复杂性的特点，其最主要的生物学特性就 是通过铁氧化系统把f e 2 + 氧化为f e ”，从中获得能量【2 3 】。么店，7 叼甜磁矶，铁氧化系 统主要靠氧化f e ( i i ) 成f e ( i i i ) 获得能量。不过，至今为止，关于彳尼舢嬲埘伽 内电子传递的机理仍没有定论，仍不能完全清晰解释其能量代谢途径【删。目前已 有不少的国家已经应用嗜酸氧化亚铁硫杆菌来提取铜、铀、金等，并已获得工业生 产，另外在煤脱硫、混合精矿分离和铝土矿脱硅等也应用比较广泛【n b 】。同时，嗜 酸氧化亚铁硫杆菌微用在生物冶金技术方面还在以下领域的研究也相当活跃，包括： ( 1 ) 金属的生物吸附与沉淀方面：有废水净化以及从废水中回收金属等；( 2 ) 在生 物浮选方面主要为微生物及其代谢产物做浮选剂；( 3 ) 在生物腐蚀方面含有：生物 腐蚀、多孔材料加工以及生物蚀刻等；( 4 ) 其余还包含有生物肥料和微生物絮凝剂 等。相对于亚铁氧化系统【1 4 2 6 1 ，硫氧化系统则是更加的复杂【2 7 3 8 1 ，很多问题的研究 还没有得到解决。 虽然么尼舢嬲砌瑚菌内电子传递的机理仍然没有定论，但是现在存在的几种 电子传递模型中，电子都是通过不同的途径从f e ( i i ) 到达细胞色素复合物【1 1 1 。 r a w l i n g s 在一些研究的基础上提出了亚铁氧化模型1 1 8 】，如图1 1 所示： n ，6 c n i n1 u ) 叠c i ds t a b k c o p ”rp m t e h 图l - 1r a w l i n g s d e 提出的亚铁氧化模型 f 培l lm o d c lo f i r o nm e t a b o l i cp r o c e 豁b yr a w l i n g s d e 硕士学位论文第一章绪论 1 1 铁硫簇的介绍 铁硫簇是一种普遍存在在生物体中最古老的物质之一，其最为主要的作用是作 为细胞氧化呼吸链的电子传递，光合作用的电子传递，在细菌固氮过程中电子传递 蛋白的辅助基团而参与电子传递【3 州1 。除此之外，铁硫簇在生物体内还有着其它方 面非常重要的功能，例如：催化作用，细胞的信号传导，基因的表达与调控，维持 酶的结构等功能。含有铁硫簇的蛋白，即为铁硫蛋白，是一类具有重要生物功能的 金属酶，其活性中心含有一个或者多个铁硫簇，铁硫簇的结构具有多样性，目前发 现与铁硫蛋白中铁配位的最常见的是半胱氨酸，通过巯基的作用对铁产生很强的亲 和力，但是，除了半胱氨酸外，还有其他的氨基酸可以与铁发生配位作用，例如用 组氨酸连接【2 f e 2 s 】或者【4 f e - 4 s 】，以及氧原子连接到【4 f e - 4 s 】与铁配位。这些铁原 子以高自旋f e 2 + ( 还原态) 或f e 3 + ( 氧化态) 的形式存在，因此，这些铁硫簇常常是 混合价化合物，具有铁磁性或者反铁磁性，并显示出复杂的自旋偶合的特征。正是 因为铁硫簇的这种很复杂的自旋偶合的相互作用，以及蛋白质的环境对它的调控作 用，使得含有铁硫簇的蛋白呈现出非常丰富的氧化还原的特性和催化的活性。 磁羚溶邻印一壹 旷一伊吣邻s 全o 一嘧 哪柙 s ( 珏) f 水v s 沁簇 协1 2 沁- 2 s l 簇 ( c ) 【4 孙4 s l 簇纳【7 f 参9 孓m o 】簇 图1 2 铁硫簇的结构类型图 f i g 1 - 2 鼬r u c t u r eo f t h ea c t i v ec e n t e ro f i r o n s u 疵rc l u s t e r 目前对于生物合成细菌的铁硫簇结构的研究，已经确定了的有三种系统，它们 分别为铁硫簇结构i s c 系统【4 5 - 4 8 】，固氮n i f 系统，及硫s u f 系统，而在这三个 系统中，i s c 系统对于f e - s 的生物合成有着更普遍的意义。在么乒肿弧胁瑚菌中， 其电子传递链中的电子转运蛋白的铁硫簇主要是由j s c 操纵子编码的一系列蛋白质 参与合成【4 钆5 ，如图卜3 所示。 2 硕士学位论文第一章绪论 图l - 3i s c 操纵子结构图 f i g u r el 一3 t h eo v e r a l is 打u c t u r eo fi s co p r e t o n 爿店舢似i 如刀j 中铁硫簇的组装是由括c 操纵了控制，它编码有四种蛋白质，分 别为提供铁离子的i s c a ，支架蛋白i s c u ，半胱氨酸脱硫酶i s c s 和阻遏蛋白i s c r ， 其中i s c s 具有依赖磷酸吡哆醛( p l p ) 的半胱氨酸脱硫酶的活性【5 2 - 5 4 1 。i s c u 的作用 是提供平台利于铁硫簇的合成，用来构建a p o 形式的成熟蛋白【5 5 5 9 1 。i s c a 的作用 虽然有争议，但是传统得理论一致认为i s c a 的作用是提供铁离了在铁硫簇的合成 中，因为有铁离子堆积在缺失i s c a 的菌株的线粒体内，从而使铁硫蛋白的浓度发生 明显的下降。有人对i s c a 合成 f e 2 s 2 】结构进行了一些生化实验【6 0 石2 1 。有推测认为 ec d ，i 中h i p i p 的 f e 4 s 4 结构的组装可能遵“i s c a s u ”途径，所以本实验室的成员 初步探讨和研究了彳店d 甜f 如 s 中h i p i p 的铁硫簇的组装过程，但其机殚仍不明 确。 1 2 铁硫蛋白 铁硫蛋自( i r o n s u l f u fp r o t e i n s ，f e sp r o t e i n ) 是一类含有f e s 发色基团的非血 红素蛋白，铁硫蛋白的相对分子质量都比较小。而在铁硫蛋白分予的中央结合的不 足血红素而是铁和硫，称为铁一硫中心( i r o n s u l f u rc e n t e r s ) 。最常见的是在蛋白质的中 央含有四个原了，其中的两个是铁，另外两个则是硫，称为 2 f e 2 s 】铁硫蛋白，或着在 蛋白质的中央含有八个原予，其中的四个为铁，另外四个则为硫，称为【4 f e 4 s 铁硫 蛋白，并且通过元素硫与蛋白质的! 胱氨酸残基相连，如图1 3 所尔。此外还有 3 f e 一4 s 等形式蛋白的存在，但是有人提出怀疑，认为 3 f e 一4 s 蛋白是由 4 f e 一4 s 蛋白在纯化的过程当中脱落一个铁原了而形成的，也就是说根据氧化还原中心的组 成和结构，铁硫蛋白通常分为i 大类：第一类是f e ( c y s ) 4 蛋白；第二类是 f e 2 s 2 木( c y s ) 4 蛋白；第三类是f e 4 s 4 水( c y s ) 4 蛋白。其中c y s 为半胱氨酸，s 称为 无机硫或活泼硫，在遇到无机酸的时侯无机硫或活泼硫则会变成h 2 s 被释放出来。 后来还发现含f e 3 s x 簇的铁硫蛋白，不过目前对它的了解还不是很多。 尽管在铁硫蛋白中有许多个铁原了的存在，似是在整个复合物中每一次只能接 3 硕：b 学位论文 第。一章绪论 受一个电予并且传递出一个电了，并且也是靠f e 3 + ( 氧化态) 和f e 2 + ( 还原态) 的状 态的循环变化来传递电予。不过一个分予的铁硫蛋白往往可以共传递大于一个电 了，比如说含 4 f e 一4 s 铁硫蛋白一共可以传递两个电子，在呼吸链中它多半与黄素 蛋白或者细胞色素b 结合。 铁硫蛋白中的硫又被称为酸易降解硫( a c i d i a b i l es u l f u r ) ，鉴定一个蛋白是二铁核 心还是四铁核心的重要方法就是测定蛋白当中的铁和酸易降解硫的含量。铁硫蛋白 纯化后往往不形成全酶，而需使用f e c l 3 和硫化物来重组铁硫核心具有多个铁硫核 心的蛋白的纯化非常闲难，目前在世界上只有极少的几例得以实现。 图l - 4 铁硫蛋白结构图 f i g 1 4s t r u c t u r eo ft h ei r o n - s u l f u rp r o t e i n s 铁硫蛋白广泛存在于植物、动物和微生物中。铁硫蛋白作为一种重要的电予载 体在牛命活动中起着非常重要的作用。它们往往具有比较低的氧还电位( m i d p o i n t p o t e n t i a l ) 。铁硫蛋白往往会呈现出褐色，进行紫外扫描在3 8 0 纳米左右具有较强的光 吸收，这些都足 4 f 、e 一4 s 簇的特点，所以鉴定铁硫蛋白的方法之一就是看纯化出来 的蛋白颜色，或者在紫外扫描中3 8 0 纳米左右的光吸收的强度。 4 硕士学位论文第一章绪论 1 2 1 植物型铁氧还蛋白 植物型铁氧还蛋白存在于绿色植物叶绿体及固氮菌中，其活性中心是一个含 有2 个f e 和2 个无机硫组成的 f e 2 s 2 簇合物，在光合作用过程中起着重要作用， 特别是和n a d p 氧化还原酶一起，在将n a d p 还原到n a d p h 过程中发挥作用。 目前有十多种已经测定的一级结构，以酸性氨基酸残基为主。其中五种不同来源的植 物型铁氧还蛋白的一级结构非常相似，一般都含有5 个位置完全相同的c y s ，f e 是 单电子传递体，电势羯一2 2 0 4 2 0m v ，比较容易还原。 1 2 24 f e 4 s 细菌铁氧还蛋白高氧化还原电位铁硫蛋白( p i p ) 的介绍 4 f e 4 s 铁氧还蛋白有两种：一种是含有1 个 f e 4 s 4 簇的耐热细菌铁氧还蛋白 ( 如b 叩川淞历p 册印加r p d 撇) ，另外一种是含有2 个 f e 4 s 4 簇的细菌型铁氧还 蛋白( 如聊幻c d 淞口p 妒门甜) 。在这些蛋白的活性中心的 f e 4 s 4 簇中每个铁离子 都与3 个无机硫和1 个半胱氨酸侧链的硫结合，构成近似四面体结构，而整个 f e 4 s 4 簇结构为近似立方体，如图卜1 所示。随着铁的氧化态价位的改变， f e 4 s 4 簇的立 方体结构也会发生变化。有结构和谱学数据显示，细菌铁氧还蛋白的氧化态和高氧 化还原电位铁硫蛋白的还原态是一致的。也就是说 f e 4 s 4 簇可以以三种状态存在： f e 4 s 4 + 、 f e 4 s 4 2 + 和 f e 4 s 4 3 + 。并且在天然蛋白中这三种状态都能够稳定得存 在，但是在合成的化合物模型中， f e 4 s 4 + 和 f e 4 s 4 3 + 这两种状态都很不稳定。 h i p i p 是高氧化还原电位铁硫蛋白组的成员之一，通常从紫色光合菌中得到、 是一类分子量在( 6 1 0 k d a ) 并含有【f e 4 s 4 】结构的小分子蛋白。h i p i p 的氧化还原电位 大约5 0 到4 5 0 毫安【6 3 1 。彳店肿d x 豇扬瑚一般通过作为终端电子受体从二价铁离子氧 化成三价铁离子的反应中获得能量【6 铀9 1 。h i p i p 具有电子传递的功能，因此有猜测 说h i p i p 可能是催化此有机体电子转导的第一步的蛋白，但是至今h i p i p 的电子转 导机理尚未明确【弛7 1 】。而在第二步反应中，电子被细胞色素c 5 5 2 经由细胞色素氧化 酵素传递给分子形态的氧。 大多数的h i p i p 是四聚体结构【7 2 】，但是月肋幽印打础甜聊鲥加甜姗，捃d 2h i p i p 结 构却是是单聚体，一些来源不同的h i p i p 蛋白质分子结构已通过x 射线晶体或核磁 共振、以及电子传递机制得以研究【7 3 - 7 引。其中来源于c v 砌甜聊，e c 如肠，口和 e 加锄砌妇的h i p i p 蛋白晶体结构已经解出【7 9 。8 1 】，如图1 5 所示。 5 硕士学位论文第常绪论 图1 5 e 厅口却 妇h i p i p 的活性位点图1 6 4 个与h i p i p 4 f e - 4 s 簇作用c y s t e i n e 及4 f e 4 s 簇 图卜5 是来源于e 厅口，d 砌如的h i p i p 蛋白分子结构的核心部分。有报道说t y r l 2 对细胞色素的物化性能调节方面起了非常关键的作用，t y r l 2 是一个非常重要的氨 基酸，t v r l 2 高度保守的存在于所有不同来源的h i p i p 中。另外在4 f e 4 s 簇的周 围还有6 个芳香氨基酸，如图1 5 所示，t 巾6 3 ，p h e 3 6 和p h e 5 3 是高度保守的氨基 酸，有文献推测，高度保守的芳香族氨基残基可能对铁硫簇的电子传递及稳定结构 方面起着重要的作用。 在h i p i p 晶体结构中还有一个比较突出的特征，就是活性氨基酸基团的s 原了 形成的氢键，发现存在4 对氢键。这些氢键的形成都对h i p i p 的氧化还原势产生重 要影响，如图1 6 所示。 图1 7 和图1 8 来源于c 甜加d 删聊h i p i p 和e c 甜d ，口幻h i p ip 中的t v r l 9 和 t ”16 与e 办口却乃，肠的h i p i pt y r l2 有着相似的作用，可能对电子传递与铁硫簇的 稳定性有关系。 6 硕- j 二学位论文第章绪论 图1 7 酒色着色菌分子结构图 f i gi - 7 s t r u c t u r eo fcv 加傩“坍h i p ip s h o w i n ga l lt h ea r o m a t i cs i d ec h a i n si nt h eh y d r o p h o b i cp o c k e ta n dt h ep r o x i m i t yo f t y r - 1 9t o s i 承5 2 t h e 【f e 4 s 4 】c lu s t e rc o r e 置 7 s e r 5 2 硕士学位论文 第一章绪论 图1 8 不同来源h i p i p 三维分子结构图 f i g1 8 c l o s e - u pv i e w so f t h em e t a lc l l l s t e rb i n d i n gp o c k e t sf o rt h e ( a ，t o p ) e v 口c 材d 肠把h i p i p ( c ，b o n o m ) c 加傩跏h i p l 只 图1 。9 是从酒色著色菌( c h r o m a t i u mv i o n o s u m ) 分离出的铁硫蛋白的分子结 构图，其蛋白的相对分子质量约96 0 0 。x 射线测定其分子含1 个f “s 4 宰( c y s ) 4 活性中心，如图1 7 。4 个f e 和4 个s 母交替连接形成立方烷结构，每个f e 再与1 个c y s 巯基硫结合。它的氧还电位高达+ 3 5 0m v ，因此称为高电位铁硫蛋白( h i 曲 p o t e n t i a li r o n - s u l p h u rp r o t e i n ，h i p i p ) 。 图1 9 酒色着色菌h i p i p 活性中心的结构 f i gl - 9 s 伽l c t u r eo fcy 加硼h i p i e 8 硕士学位论文第一章绪论 1 2 3 亚铁氧化酶的介绍( i m no x i d a s e ) 亚铁氧化酶( i m ) 亦即亚铁细胞色素c 5 5 2 氧化还原酶，i r 0 是一种可溶性铁硫 蛋白，属于高电位铁硫蛋白家族中的一员( h i 曲r e d o xp o t e n t i a l i r o n s u l 如rp r o t e i n s ， h i p i p ) 。i r 0 含有9 0 个氨基酸残基，其中有3 7 个残基为信号肽【8 3 】，其分子量为 6 3 k d a 【8 4 1 ，一般是由8 1 0 个相同的分子量为6 k d a 最小亚基组成，由于i r 0 的晶体结 构至今没有解析出来，其亚基数也就不能确定【8 5 1 ，但是它是高氧化还原电位铁硫蛋 白家族的成员，所以我们可以根据已测出来的h i p i p 的晶体结构来推测i r 0 的分子 结构，关于i r 0 的各种性质如表1 一l 所示：i r o 蛋白分子中还含有1 8 2 0 个铁原子和6 个无机硫原予【8 6 l ，在蛋白内部与4 个c y s 相互作用，形成一种独特的铁硫簇结构， 在f e 2 + 存在时可迅速使细胞色素c 5 5 2 还原。 a 尼舢甜池刃嚣凡j 中的亚铁氧化酶( i r o ) 与彳屉r 阳硝f 幽琊彳兀c 刀2 7 d 中的 h i p i p 的序列有非常高的相似性，并且都有类似的【4 f e 一4 s 】的结构。这种 4 f e 一4 s 】簇 结构具有很广泛的功能，因此对这种结构进行的深入的探讨与研究，将对我们进一 步了解亚铁氧化酶的电子传递以及催化机制很有重要的意义【8 7 】。本实验室的成员通 过不懈的努力研究，使么店肿以磁嬲凡。中亚铁氧化酶在e c d 疗中的成功表达， 并纯化出来，并且确定彳尼肿甜砌瑚凡。中亚铁氧化酶含有铁硫簇，而且有4 个 半胱氨酸参与铁硫簇的合成。然而亚铁氧化酶在电子传递中的作用我们还不是十分 的明确，需要进行更加深入的研究。 表1 1 亚铁氧化酶的各种性质 专有性质 吸收峰 还原态 氧化态 分子量( k d a ) 酶活性 酶失活性 最小单位 铁、硫含量( g 原子儋蛋白) 电位( v ) 晶o 5 ( v ) 9 2 8 2 ，3 8 2 2 8 2 ；3 8 2 ；4 5 6 6 6 6 3 2 6 6 2 ：6 4 f e 6 4 0 0 ：4 s 6 4 0 0 0 7 9 ( o 2 8 ) 1 6 5 0 0 + 0 6 3 3 硕士学位论文 第一章绪论 厶7 ，o ( v ) + o 3 5 7 1 3 课题的研究目的与研究内容 1 3 1 依据和目的 在a 向仰似姗中，能量代谢与电子传递机理及铁硫蛋白的铁硫簇组装机理 仍然不是很清楚： ( 1 ) 铁硫簇的生物合成对生物的能量代谢和生命活动有着重要意义，目前，对细菌 的铁硫簇的组装机理仍不。清楚 ( 2 ) 么力肿伽玩栅中亚铁氧化酶的作用不可忽视，但是a 店肿弧溉册铁和硫氧 化系统的电子转导机理尚未明确。 ( 3 ) 亚铁氧化酶活性位点的氨基酸中，y 1 0 ，f 2 6 ，w 4 4 和f 4 8 的作用有待于确定， 它们对i r o 中【4 f e - 4 s 】结构稳定性的影响有待研究。 ( 4 ) 高氧化还原电位铁硫蛋白酶活性位点的氨基酸中，y 1 5 ，f 3 l ，y 4 9 和f 5 3 的 作用有待于确定，它们对h i p i p 中【4 f e 一4 s 】结构稳定性的影响有待研究。 因此，我们想通过表达各种相关蛋白，以及定点突变技术对相关蛋白的保守位 点进行突变，结合其他生物学手段，以确定酶的作用机理、蛋白质与铁硫簇、蛋白 质与蛋白质之间相互作用过程中重要位点，从而解决： ( 1 ) 在点c d - ，中表达a 店册弧枷的亚铁氧化酶，高氧化还原电位铁硫蛋白的 突变体，为大量制备该种蛋白提供条件，为对其进一步的研究提供基础。 ( 2 ) 确定含苯环基团的氨基残基对铁硫簇稳定性的影响。 ( 3 ) 通过确定蛋白质与金属离子、蛋白质与蛋白质问相互作用机理，为最终揭示铁 氧化电子传递机理提供基础。 1 3 2 课题的创新性 1 本课题针对亚铁氧化酶氧化与h i p i p 在氧化还原电势和功能上的显著差异，通过 研究分析这一差异的原因。明确蛋白分子局部环境对铁硫中心产生的影响，揭示亚 铁氧化酶氧化与h i p i p 在氧化还原电对选择差异的结构基础，进而解决 4 f e 4 s 蛋白 在结构功能上的相关问题，具有较强的原始创作性。 l o 硕士学位论文第一章绪论 2 铁硫蛋白在细胞能量代谢期作用重要但研究相对较少。对亚铁硫化酶代表 4 f e 4 s 蛋白进行深入研究，明确铁硫簇和关键氨基酸的作用机理，揭示分子内电子传递机 制，对研究微生物的能量代谢和电子传递具有重要意义 1 3 3 论文的主要研究内容 根据以上的研究依据和目的，我们确定了以下几个方面的研究内容： ( 1 ) 彳乃舢甜玩删中亚铁氧化酶，高氧化还原电位铁硫蛋白各突变体蛋白的基因 克隆、表达以及纯化。 ( 2 ) 确定含苯环基团的氨基残基对铁硫簇稳定性所起的作用。 ( 3 ) 通过研究明确亚铁氧化酶氧化与h p i p 还原电位显著差异的分子结构 基础。 ( 4 ) 通过研究亚铁氧化酶与h i p i p 参与分子内电子传递的关键氨基酸位点，初步确 定这两种蛋白的分子内电子的传递机制。 1 3 4 论文课题受资助情况 本论文课题受以下项目资助： 国家自然科学基金项目( 3 0 0 9 0 0 2 4 ) 。 国家重点基础研究发展计划项目( 2 0 0 4 c b 6 1 9 2 0 4 ) 。 教育部博士点新教师基金项目( 2 0 0 8 0 5 3 3l0 3 4 ) 硕士学位论文 第二章实验材料和方法 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 第二章实验材料和方法 实验中，所运用到的嗜酸氧化亚铁硫杆菌( 彳c 磁铴如6 卯讲螂店，加甜渤嬲) 为标 准菌株a t c c2 3 2 7 0 和a 店，| 加甜眺脚心。首先，让原始菌株在含亚铁或元素硫的 能源培养基中进行传代的培养，再经过固体平板分离至少三次以上，接着驯化培养 在4 个月以上，所有驯化的菌株其亚铁氧化得周期缩短为4 8 小时左右。当细菌培养 物达到对数期的时候用孔径为o 2 2 岬的细菌滤膜进行过滤，或着离心用l 0 0 0 0 r p m 离心2 0 m i n 。这是获得的菌体可能是含有杂质的菌体，再用p h2 0 的硫酸溶液冲洗 3 次，去除细菌表面的铁沉淀物，最后得到的去铁细菌使其悬浮于无铁基础的培养 基中，便是实验研究所用到的菌种悬液。 2 1 2 培养基 2 1 2 1l b 培养基( 液固) l b 液态培养基：配置l l 的溶液， 称取胰蛋白胨( t r y p t o n e ) 1 0 9 、酵母提取物( y e a s t e x t r a c t ) 5 9 以及氯化钠( n a c l ) 1o g 。 另外根据经验值用n a o h 调节该培养基的p h ，使其达到7 4 ( 该p h 适合目前使 用最广的原核表达菌种e c d 乃的生长) l b 固体培养基： 1 配制：1 0 0 m l l b 培养基加入1 2 9 琼脂粉 2 加入氨苄青霉素：高压灭菌后，将融化的l b 固体培养基置与5 5 的水浴中，待培 养基温度降到5 5 时( 手可触摸) 加入氨苄青霉素，以免温度过高导致氨苄青霉素 的失效，加入后充分的摇匀。 3 倒板：般1 0 m l 倒1 个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外灯下照1 0 1 5 分钟，以便培养基凝固。 4 保存：用封口胶封边，并倒置放在4 保存，最好在一个月内使用。 1 2 硕士学位论文第二章实验材料和方法 2 1 2 2t b 培养基 组份浓度为1 2 ( 州) 2 4 ( 州) o 4 ( v ) 1 7 m m 7 2 m m 胰蛋白胨 酵母提取物 甘油 磷酸二氢钾 磷酸氢二钾 配制量为1 l 的配置方法： 1 配制磷酸盐缓冲液( 0 1 7 mk h 2 p 0 4 ，0 7 2 mk 2 h p 0 4 ) 1 0 0 m l 。 2 称胰蛋白胨( 研p t o n e ) 1 2 9 、酵母提取物( y e 叙e x n a c t ) 2 4 9 、甘油( g l y c e r o ) 4 m l ，置于1 l 烧杯中。 3 加入约8 0 0 m l 的去离子水，充分搅拌溶解。 4 加去离子水将培养基定容至9 0 0 m l 后，高温高压灭菌。 5 待溶液冷却到6 0 以下时，加入l o o m l 的上述灭菌得磷酸盐缓冲液。 6 4 保存。 2 1 2 3s o c 培养基 组份浓度：2 ( 哪胰蛋白胨( t u p t o n e ) ，o 5 ( w ，v ) 酵母提取物( y e a s t e x 仃a c t ) ，o 0 5 ( w v ) n a c l ，2 5m m k c l l om m m g c l2 ，2 0m m 葡萄糖 ( 舀u c o s e ) 。 配制方法： 1 配制lm 的舀u c o s e 溶液：将1 8g 的g l u c o s e 溶解在9 0m l 的去离子水中，定容 至l o om l ，用0 2 2 岬滤膜过滤除菌。 2 s o b 培养基：下列组分溶解在o 9 l 水中：蛋白胨2 0 9 ，酵母提取物5 9 ，氯化钠0 5 9 ，l m o l l 氯化钾2 5 m l 。定容至l l 。分成l o o m l 的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在 每1 0 0 m l 的小份中加入l m l 灭过菌的l m o l l 氯化镁。 3 向每1 0 0m ls o b 培养基中加入除菌的1m g l u c o s e 溶液2m i ，均匀混合。 4 4 保存。 2 1 3 质粒提取试剂 质粒提取试剂盒： e z 1 0 s p i nc o l 啪g e n o m i cd n al s o l a t i o nk i t 柱式质粒抽提试剂盒( 含有 1 3 硕士学位论文第二章实验材料和方法 s o l u t i o ni ，s o l u t i o ni i ，s o l u t i o ni i i ，w r a s h i n gs o i u t i o n ，e l u t i o nb u 疏r ) ，无水乙醇。 2 1 4 琼脂糖凝胶电泳 5 0 w 垣溶液1 2 瑚，g o l d e nv i e w 2u1 ，琼脂糖o 6 9 。 2 1 5 不连续体系s d s - 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 、5 x 样品缓冲液( 1 0 m 1 ) ：含有o 6 m 1 1 m o l l 的t r i s h c l q h 6 8 ) ，5 m l5 0 甘油，2 m l 1 0 的s d s ，0 5 m l 巯基乙醇，1 m j l 溴酚蓝，o 9 m l 蒸馏水。可在4 保存数周，或 在一2 0 保存数月。 2 、 3 0 的凝胶贮液：在通风橱中，称取丙烯酰胺3 0 9 ，甲叉双丙烯酰胺0 8 9 ，加重 蒸水溶解后，定容到l o o m l 。过滤后置棕色瓶中，4 保存，般可放置1 个月。 3 、 p h 8 9 的分离胶缓冲液：t r i s3 6 3 9 ，加l m o l lh c l4 8 m l ，加重蒸水8 0 m l 使其 溶解，调p h 8 9 ，定容至1 0 0 m l ，4 保存。 4 、 p h 6 7 的浓缩胶缓冲液：t r i s5 9 8 9 ，加1 m o l lh c l4 8 m l ，加重蒸水8 0 m l 使其 溶解，调p h 6 7 ，定容至1 0 0 m 1 ，4 保存。 5 、t e m e d ( 四乙基乙二胺) 原液 6 、l o 过硫酸铵：称取o 1g 的过硫酸铵，加入1m l 重蒸水使其溶解，最好使用新鲜 配制的。 7 、p h 8 3t h s 一甘氨酸电极缓冲液：称取喇s6 0 9 ，甘氨酸2 8 8 9 ，加蒸馏水约9 0 0 m l ， 调p h 8 3 后，用蒸馏水定容至l 0 0 0 m l 。置4 保存，临用前稀释1 0 倍。 8 、考马斯亮蓝g 2 5 0 染色液：称1 0 0 m g 考马斯亮蓝g 2 5 0 ，溶于2 0 0 m 1 蒸馏水中，慢 慢加入7 5 m l7 0 的过氯酸，最后补足水到2 5 0 m l ，搅拌l 小时，小孔滤纸过滤。 2 1 6s d s - p a g e 胶保存试剂及装置 胶保存液：4 0 甲醇，1 0 甘油，7 5 冰乙酸溶于蒸馏水中。 装置购自p r o m e g a ，包括胶保存膜及胶保存架。 1 4 硕士学位论文第二章实验材料和方法 2 1 7 蛋白亲和纯化试剂 2 1 7 1o 2 m o l lp h 7 4 磷酸盐缓冲液：称取5 2 2 5 9k 2 h p 0 4 ，1 3 6 1 9k h 2 p 0 4 定容 至2 0 0 m l 蒸馏水中，4 储存。 2 1 7 2s t a nb u 毹r ：称取n i s 0 4 1 3 1 4 2 5 9 ，加l o om lo 0 2m o l lp h 7 4 磷酸盐缓 冲液，o 5m o l l n a c l ，定容至1 0 0 0 m l 蒸馏水中，4 储存。 2 1 7 3w 如h i n gb u 腩r ：1 0 0m 1 的s t a nb u 腩r 中加入o 0 5m o l l 咪唑，4 储存。 2 1 7 4e l u t i o nb u 毹r ：1 0 0m l 的s t a nb u 疏r 中加入0 5m o l l 咪唑，4 储存。 2 1 7 5e d t a 洗脱液：1 0 0m l 的s t a nb u 仃e r 中加入0 0 5m o l le d t a ，4 储存。 h i t r a d 刑c h e a l t i n gh p 柱购自a m e r s h 锄，规格为l m l 所用试剂为化学纯，均购白天恒化学试剂公司，水都为双蒸水。 2 1 8 实验仪器与设备 表2 1 实验仪器与设备 i a b l e2 - 1e x p e r i m e n t a la p p a r a t u sa n de q u i p m e n t 名称型号生产厂家 p c r 仪 高速卧式离心机 冰箱 电热恒温鼓风干燥箱 暗箱式紫外透射仪 稳压稳流电泳仪 立式压力蒸汽灭菌器 隔水式恒温培养箱 空气浴振荡器 紫外分光光度计 园二色光谱仪 超级恒温水槽 m a s t e r c y c l e r g r a d i e n t t d i ，5 - a b c d 2 0 8 ，a d h g 9 0 7 0 a z f 9 0 d y y - 2 l y x 2 8 0 a g h p 9 0 5 0 h z q - c u v l 8 0 0 j a s c oj 8 1 0 d k b 5 0 1 a 1 5 德国e p p e n d o r 公司 上海安亭科学仪器厂 海尔股份有限公司 上海一恒科技有限公司 上海顾村电光仪器厂 北京市六一仪器厂 上海博讯实业有限医疗仪器厂 上海一恒科技有限公司 上海智成有限公司 岛津公司 j a s c o 公司 上海精宏实验设备有限公司 硕士学位论文 第二章实验材料和方法 2 2 实验方法 2 2 1 定点突变引物设计 2 2 1 1 亚铁氧化酶突变引物分别为： y 1 0 a f a g g c a g c g g t g c a a 至嚣冱c a g g a t a c a c c t a a y 1 0 a r t r a g g t g l 硝l t c c t g a g c t t g c a c c g c t g c c t y 1 0 f f a g g c a g c g g t g c a a 至c a g g a l 、a c a c c t a a y 1 0 f r ，r i a g g t g l ：a t c c t g 丛t t g c a c c g c t g c c t y 1 0 e f a g g c a g c g g t g caaq c a a g a t a c a c c t 气a y 1 0 e r t t a g g t g t a t c c t g t t c t t g c a c c g c t g c c t y 1 0 s f a g g c a g c g g t g c a a t c t c a g g a t a c a c ct f 气a y 1 0 s r t t a g g t g t a t c c t g a g a t t g c a c c g c t g c c t y 1 0 w r - f a g g c a g c g g t g c a a t g g c a g g a t a c a c c t a a y 1 0 w 二r t t a g g t g t a t c c t g c c a t t g c a c c g c t g c c t f 2 6 a f c a g t c t g t g c g c a g g c t a t t g c t c c a c a l a f 2 6 a r 1 a t g t g g a g caa t 鱼c t g c g c a c a g a c t g f 2 6 s f c a g t c t g t g c g c a g t c t a l v r g c t c c a c a r a 1 6 硕士学位论文第二章实验材料和方法 f 2 6 s r 1 胁t g t g g a g c a a t 钢队c t g c g c a c a g a c t g f 2 6 v f c a g t c t g t g c g c a g t a t a 丌g c t c c a c a l a f 2 6 y - r 1 r 汀g t g g a g c a a t 虹a c t g c g c a c a g a c t g f 2 6 w r - f c a g t c t g t g c g c a g t g g a t t g c t c c a c a i a f 2 6 w 二r 1 e 汀g t g g a g c a a t c c a c t g c g c a c a g a c t g w 4 4 a f t c a g c c c c a a t g g c g c g t g t g t a g c c t r t g w 4 4 a r c a a a g g c t a c a c a c g c g c c a t t g g g g c t g a w 4 4 s f t c a g c c c c a a t g g c t c t t g t g t a g c c t i t g w 4 4 s r ca a ag g c t a c a c a a g a g c c a 丌g g g g c t g a w 4 4 y _ f t c a g c c c c a a t g g c l 气兀g t g t a g c c t t t g w 4 4 y - r c a a a g g c t a c a c a 汀a g c c a t t g g g g c t g a w 4 4 f f t c a g c c c c a a t g g c l t t t g t g t a g c c t t t g w 4 4 f r c a a a g g c t a c a c aa aa g c c a 丌g g g g c t g a f 4 8 a f g c t g g t g t g t a g c c g c t g t t c c t a a g t c a g f 4 8 a r c t g a c t t a g g a a c a g c g g c t a c a c a c c a g c 1 7 硕士学位论文 第二章实验材料和方法 f 4 8 s f g c t g g t g t g t a g c c t