（内科学专业论文）流式细胞仪检测胞浆内抗原mpo的实验和临床研究.pdf

复旦大学硕士生论文 流式细胞仪检测胞浆内抗原m p o 的实验和临床研究 摘要 目的：评价流式细胞仪( f c m ) 检测胞浆内抗原m p o 的方法，探讨实验中各因素 对检测结果的影响；初步评价c d 3 4 + m p o + c d 4 5 一水“表现型在监测急性粒单系 白血病微小残留病( m r d ) o 的意义和价值。 方法：三染色一流式细胞仪( f c m ) 分析 结果： 1 以髓系细胞株h l 一6 0 为检测标本，用f c m 检测胞浆内抗原m p o 。 在f c m 上以f s c s s c 设门，以f s c s s c 平均荧光指数( m f i ) 相对荧光指数 ( r f i ) 为评测指标；经比较，f a c s 、f i x p e r m 、f i x a t i o n p e r m e a b i l i z a t i o n 三种破膜剂中，f a c s 破膜剂对细胞的f s c s s c 影响最小，r f i 明显高于其他两 种。同时通过比较其他实验条件( 破膜时间，标本放置时间，不同荧光标记) 对 结果的影响，提出f c m 检测胞浆内抗原m p o 的建议方案。 2 检测4 1 例急性白血病患者，评价m p o ，其他髓系标志c d l 3c d l 4 c d l 5c d 3 3c d l l 7l y s o z y m e 以及c d 3 4 + m p o + c d 4 5 。m ”表现型在急性白血病 中的表达情况。结果表明胞浆内抗原m p o 对急性粒单系白血病具有高敏感性和 特异性，c d 3 4 在急性白血病中有高表达，且c d 3 4 + m p o + c d 4 5 叫“”表现型在急 性粒单系白血病中高表达，而淋系白血病中未见表达。检测2 0 例正常入骨髓标 本，c d 3 4 + m p o + c d 4 5 叫“表现型在正常人骨髓中低表达，仅为1 0 。左右。提 出c d 3 4 + m p o + c d 4 5 刊沛大于1 0 - 4 为急性粒单系白血病m r d 的检出标准。 3 建立急性白血病微小残留病( m r d ) 的细胞模型，采用多参数流式细 胞仪( m d f c m ) 方法和a p a a p 方法分别检测，表明m d f c m 法比a p a a p 法 敏感，前者检测精度可达1 0 一。并以c d 3 4 + m p o + c d 4 5 _ 坩沛为监测指标，监测 7 例急性粒单系白血病患者，显示与传统细胞形态学监测相比，该方法具有更高 的敏感性，更可提早提示复发。 讨论： 本实验通过对髓系细胞株h l 一6 0 来检测胞浆内抗原m p o ，比较不同破膜 复旦大学硕士生论文 剂和其他不同实验条件对实验结果的影响，尝试系统评价f c m 检测胞浆内抗原 m p o 的基本实验方法，并提出f c m 检测的推荐方案。与以往文献报告采用临床 患者检测不同，本文采用h l 一6 0 细胞株作为研究对象，细胞株各细胞之间具有 齐同性，克服了临床样本之间的差异以及自血病抗原表达的异质性如抗原表达缺 失，抗原表达不同步等，使实验结果更为可信。据我们的实验结果，提出f c m 检测胞浆内抗原m p o 的推荐方法如下：样本放置时间在室温下应小于2 4 小时。 调整样本细胞数为1 0 1 09 l ：取1 0 0 u l 置于f a l c o n 管中，加入f a c s 破膜剂1 5 0 0 u l ，振荡混匀，避光反应1 5 分钟；加入p b s 2 m l ，3 0 0 g 离心5 分钟，弃 上清；加入p e 标记的m p 0 2 0 u l ，振荡混匀后避光反应3 0 分钟左右：加入p b s 2 m l ， 3 0 0 g 离心5 分钟，弃上清；加入p b s 2 m l ，2 0 0 g 离心5 分钟，弃上清；加入 p b s 0 5 m l 重悬浮。分别以空白管( 未加抗体) 调整电压，相应阴性对照管划定 阴性细胞区域，然后检测标本阳性细胞比例、平均荧光强度算术均值( m f i ) 和 平均荧光强度几何均值( m f i g e o ) ，计算相对荧光指数r f i 和r f i g e o 。 检测急性白血病微小残留病( m i m ) 的指标应在急性白血病中高表达，而在 正常人骨髓中低表达或不表达。临床4 1 例急性白血病的免疫表型分析显示，m p o 对急性粒单系白血病具有较高的系列特异性，2 4 例急性粒单系白血病中2 3 例表现 为m p o 阳性，达到9 5 8 。c d 3 4 作为干祖细胞标志，在白血病细胞表面常有较 高表达，本实验显示4 1 例急性白血病中，3 6 例表达c d 3 4 ，达到8 7 8 。c d 4 5 s s c 比起传统的f s c s s c 设门可以更好的显示白血病幼稚细胞群。因此我们推测由 c d 3 4 、m p o 和c d 4 5 组合而成的表现型应该在急性粒单系白血病中有较高的表 达。临床病例检测表明c d 3 4 + m p o + c d 4 5 叫m “表现型在急性粒单系白血病中有较 高的系列特异性，阳性率达到8 0 左右。在正常人骨髓细胞中，c d 3 4 + m p o + c d 4 5 一m “只有极低表达，约1 0 一5 左右。表明c d 3 4 + m p o + c d 4 5 一棚j “确可作为检测微小 残留病m r d 的理想指标。在用c d 3 4 + m p o + c d 4 5 州“表达的h l - 6 0 细胞株建立 的微小残留病细胞模型上，比较m d f c m 方法检测c d 3 4 + m p o + c d 4 5 1 “与免 疫组化方法( a p a a p 法) ，虽然a p a a p 法可以将形态学和免疫特征相结合，有直 观、形象的特点，但其敏感性较m d f c m 差2 3 个数量级，m d f c m 可以达到 1 0 一，而a p a a p 法仅有1 0 一1 0 一。因此流式细胞仪在检测微小残留病时具有更 高的灵敏度，作为检测m r d 方法，比a p a a p 法更适合。本实验遂利用 复旦火学硕士生论文 c d 3 4 + m p o + c d 4 5 一“来监测急性粒单系白血病患者的微小残留病( m r d ) ，m r d 的检出标准定为1 0 。检测7 例c d 3 4 + m p o + c d 4 5 “小”表现型的a m l 患者，显 示随着化疗的进行，该表现型细胞逐渐减少。发现二例患者在白血病复发前 c d 3 4 + 艄p o + c d 4 5 刊”阳性细胞增多，提示m r d 扩大；一例患者在完全缓解期 间该表现型消失，但在一月后，再次出现该表现型，其m r d 复发比临床形态学检 测到自血病复发提早约9 0 天左右。由于目前国内外没有相应资料来借鉴，因此在 临床应用中，需要进一步积累病例，总结经验。 关键词：流式细胞术f c mm p o微小残留病( m r d ) 复旦大学硕士生论文 l a b o r a t o r y a n dc l i n i c a lr e s e a r c ho f c y t o p l a s m i ca n t i g e nm p o d e t e c t i o n b y f l o w c y t o m e t r y ( f c m ) a b s t r a c t o b j e c t i v e ： t oe v a l u a t et h em e t h o d o f d e t e c t i n gc y t o p l a s m i c a n t i g e n m p o b y f l o w c y t o m e t r y ( f c m ) a n ds t u d yt h em e t h o d o l o g i c a lf a c t o r sa f f e c t i n gf l o wc y t o m e t r i c a n a l y s i s p r e l i m i n a r i l y a s s e s st h ec l i n i c a lv a l u eo f c d 3 4 * m p o + c d 4 5 一m i ” i m m u n o p h e n t o t y p ef o ri m m u n o l o g i c a ld e t e c t i o no f m i n i m a lr e s i d u a ld i s e a s ei na c u t e m y e l o i d l e u k e m i a m e t h o d s ： t h r e ec o l o ri m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n gf l o w c y t o m e t r i ca n a l y s i s r e s u i t s ： 1 t a k em y e l o i dc e l ll i n eh l 一6 0a st h em o d e l ，g a t et h ec e l lo nf s c s s c a c q u i s i t i o n d o t p l o ti nf c m ，u s e f s cs s ca n da s e m i q u a n t i t a t i v ei n d e x - - r e l a t i v ef l u o r e s c e n c e i n d e x ( r f n a s r e s u l t s t h r e e c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e p e r m e a b i l i z a t i o n f i x a t i o n s o l u t i o n sw e r e c o m p a r e d ：f a c s 、f i x & p e r m 、f i x a t i o n & p e r m e a b i l i z a t i o n t h er e s u l t s s h o w e df a c s p e r m e a b i l i z a t i o nh a dm i n o re f f e c t0 nt h el i g h ts c a t t e rp a t t e r n so ft h e t e s t dc e l ls a m p l e s ，a n dt h ep e r c e n t a g eo f c y t o p l a s m i ca n t i g e nm p op o s i t i v ec e l l sa n d r f lw e r es i g n i f i c a n th i g h e r t h a nt h eo t h e rt w o b ys t u d i n gt h eo t h e rm e t h o d o l o g i c a l f a c t o r sa f f e c t i n gf l o w c y t o m e t f i ca n a l y s i s ，t h i sm e t h o dw a ss y s t a m l ye v a l u a t e d 2 f o r t y - o n ea d u l t sa c u t el e u k e m i ac a s e sw e r ed e t e e t d m p oc o m p a r e dw i t ho t h e r m y e l o i dl i n a g em a r k e r ss u c ha sc d l l 7c d l 3c d 3 3c d l 4c d l 5 l y s o z y m e ， r e s u l t ss h o w e dm p ow a st h em o s ts e n s i t i v ea n ds p e c i f i cm a r k e ri nt h ed i a g o n o s i so f a c u t em y e l o i dl e u k e m i a c d 3 4 + m p o + c d 4 5 - d j ”p h e n o t y p ew a s h i g h l ye x p r e s s e di n a c u t em y e l o i d l e u k e m i a ，i tw a s n o t e x p r e s s e d i na c u t el y m p h o b l a s t i c l e u k e m i a t w e n t y n o r m a lb o n em a r r o ww a s d e t e c t e d ，f l o wc y t o m e t f i c a n a l y s i s s h o w e d c d 3 4 + m p o + c d 4 5 - d i mp h e n o t y p ew a sv e r y l o w l ye x p r e s s e d i nn o r m a lb o n e m a r r o w s , j u s ta b o u t1 0 3 w i t hac e l lm o d e lo fm i n i m a lr e s i d u a ld i s e a s e ，t h es e n s i t i v i t yo ff c m a n a l y s i sw a s 4 复旦大学硕士生论文 d e t e c t e d i tc o u l dr e a c ht h el e v e lo f1 p e r1 0 5c e l l s t a k ec d 3 4 + m p o + c d 4 5 一，d ”a s m r dd e t e c t i o ni n d e x ，7a c u t em y e l o i di e u k e m i ap a t i e n t sw e r ed e t e c t e d 。r e s u l t s s h o w e dl e u k e m i ac e l lp o p u l a t i o ni n c r e a s i n gc o u l db em o n i t o r e db e f o r em o r p h o l o g i c a l c o n f i r m a t i o no f b m r e l a p s e ， d i s c u s s i o n ： w et o o km y e l o i dc e l ll i n eh l 一6 0a st h em o d e li nt h i sa s s a y ，t r y e dt or e e v a l u a t e t h ef l o wc y t o m e t r i cd e t e c t i o no fc y t o p l a s m i ca n t i g e nm p o b yc o m p a r i n gd i f f e r e n t p e r r n e a b i l i z a t i o n sa n do t h e rd i f f e r e n tm e t h o d o l o g i c a lf a c t o r s w i t ham r d c e l lm o d e l ， w e c o m p a r e d d i f f e r e n tm e t h o d sd e t e c t i n gm p o ，f c mm e t h o da n da p a a p m e t h o d s o w ek n e wf c mm e t h o dw a sm o r es e n s i t i v et h a na p a a p m e t h o d ，t h ef o r m e rc a nd e t e c t 1 p e r1 0 5c e l l s a n a l y s i s i n gc l i n i c a la c u t el e u k e m i ai m r n u n o p h e n o t y p ed a t a s , w ek n e w c d 3 4 + m p o + c d 4 5 一m ”w a sas p e c i f i cl i n a g em a r k e ri na c u t el e u k e m i a w et r i e dt o u s e c d 3 4 + n v i p o + c d 4 5 7 曲”p h e n o t y p e d e t e c tt h em i n i m a lr e s i d u a ld i s e a s e ( m r d ) i na m l p a t i e n t s s ow e c o u l dc o n c l u d et h a tf l o wc y t o m e t r i cd e t e c t i o no f c y t o p l a s m i c a n t i g e nm p ow a sv e r yi m p o r t a n t i nl e u k e m i ai m m u m o p h e n t y p i n ga n dm i n i m a l r e s i d u a ld i s e a s e d e t e c t i n g k e y w o r d s ： f l o wc y t o m e t r y ( f c m ) m p om i n i m a lr e s i d u a ld i s e a s e ( m r d ) 5 复旦大学硕士生论文 第一部分 影响f c m 检测胞浆内抗原m p o 因素的再评估 引言 髓过氧化物酶( m y o l o i d p e r o x i d a s em p o ) 为中性粒细胞内嗜苯胺蓝颗粒 的主要成分，常用的组织化学染色法是对其酶活性进行检测，用免疫标记法是对 m p o 蛋白的抗原性进行检测。m p o 的前体，约8 0 k d ，进一步合成后变成酶的活性 部分，具有a ：1 3 ：结构，所用m p o 抗体不仅可结合酶前体，亦可结合活性酶的n 链，因此免疫标记法与组织化学染色法相比检测的灵敏度更大“3 。 检测胞浆内抗原m p o 的方法常采用免疫标记法，主要有a p a a p 法和流式细胞 仪法。m p o 是一种胞浆内抗原，仅在胞浆内表达，与一般膜抗原检测方法有所不 同，需进行透膜处理。流式细胞仪检测胞浆抗原起于8 0 年代，当时主要用来检 测胞核末端脱氧核苷酸转移酶( t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s et d t ) “3 。8 0 年代末，开始采用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法( a p a a p ) 检测胞浆内抗原 m p o ”1 。到9 。年代初，才开始出现用流式细胞仪检测胞浆内抗原m p o 的临床研究 报告“。 在f c m 检测胞浆内抗原m p o 应用中，对同一白血病患者多次重复检测，m p o 的表达经常出现阳性结果不稳定，其阳性细胞百分比和荧光强度都有较大的变化 ”。这可能与同一病例在不同病程阶段抗原表达的异质性如抗原丢失，抗原表 达强度不同步等有关。已往的研究报告中对流式细胞仪检测方法评估的检测对象 是采用临床病例，由于临床病例本身的变异和差别，对实验结果影响较大，难以 得出比较客观的结论“”。为使检测对象齐同，以更好的对该方法作出评价，本 实验与以往报告的研究不同，采用了髓系细胞株h l 一6 0 细胞作为研究对象，对流 式细胞仪检测结果的各影响因素，如各种破膜剂的差异，标本放置时间和不同荧 光标记的抗体等，进行了系统的再评估，希望为规范目前流式细胞仪检测方法提 供实验资料。 6 复旦火学硕士生论文 实验目的：以h l 一6 0 细胞株为细胞模型，采用不同破膜剂和不同实验条件，系 统评价流式细胞仪检测胞浆内抗原m p o 的实验方法。 材料与方法： 1 主要试剂与仪器 1 1 主要试剂： 1 1 1 i l l 一6 0 细胞株：由王钦红博士提供 1 1 2m p o f i t cm p o p e ：购于d a k o 公司，由联科公司代理 1 1 3 破膜剂：f a c s f i x & p e r m f i x a t i o n & p e r m e a b i l i z a t i o n 1 ，1 ，4 缓冲液：p b s + 0 1 叠氮钠 1 1 5p i 染料：购予d a k o 公司，由联科公司代理 1 2 主要仪器： 流式细胞仪：型号f a c s c a n 美国b e c t o n d i c k i n s o n 公司产品 离心机：型号u n i v e r s a l1 6 漩涡混合器 超净操作台 试管：f a l c o n 试管，1 2 x 7 5 m m 微量加样器和加样管：2 0 # 1 ，2 0 0 , 1 无菌过滤器：直径2 5 m m ，孔径o 。2 # m 2 方法与步骤： 2 1 基本步骤： 取h l 一6 0 细胞。p b s 洗涤离心两遍后，细胞计数。调整细胞数约为1 0 x 1 09 ，l ；取1 0 0 u l 细胞置于f a l c o n 管中，加入f a c s 破膜剂l x5 0 0 u l ，振荡混 匀，避光反应一定时间；加入p b s 2 m l ，3 0 0 g 离心5 分钟，弃上清；加入单抗 2 0 u l ，振荡，混匀后避光反应3 0 分钟左右：加入p b s 2 m l ，3 0 0 x g 离心5 分钟， 弃上清；加入p b s 2 m l ，2 0 0 x g 离心5 分钟，弃上清；加入p b s 0 5 m l 重悬浮， 准备上机。 取h l 6 0 细胞，p b s 洗涤离心两遍后，细胞计数。调整细胞数为1 0 x1 09 l ； 7 复旦大学硕士生论文 取1 0 0 u l 细胞置于f a l c o n 管中，加入f i x & p e r m 或f i x a t i o n & p e r m e a b i l i z a t i o n a 液1 0 0 u l ，振荡混匀，避光反应1 0 - - 1 5 分钟；加入p b s 2 m l ，3 0 0 x g 离心5 分 钟，弃上清；加入f i x p e r m 或f i x a t i o n p e r m e a b i l i z a t i o n b 液1 0 0 u l ，同时加 入单抗2 0 u l 振荡，混匀后避光反应一定时间；加入p b s 2 m l ，3 0 0 g 离心5 分 钟，弃上清；加入p b s 2 m l ，2 0 0 g 离心5 分钟，弃上清；d 1 2 , p b s 0 5 m l 重悬 浮，准备上机。 2 2 流式细胞仪的检测 2 2 1 设门：在检测时，在流式细胞仪的f s c s s c ( 前向散射一侧向散射) 点 图上框取h l 一6 0 细胞群。 2 2 2m p o - f i t c 的检测：分别以空白管( 未加抗体) 调整电压，阴性对照 管( 小鼠i g g - - f i t c ) 划定阴性细胞区域，然后检测标本阳性细胞比例、平 均荧光强度算术均值( m f i ) 和平均荧光强度几何均值( m f i g e o ) 。 2 2 3m p o p e 的检测：分别以空白管( 未加抗体) 调整电压，阴性对照管 ( 小鼠i g g ，- - p e ) 划定阴性细胞区域，然后检测标本阳性细胞比例、平均荧 光强度算术均值( m f i ) 和平均荧光强度几何均值( m f i g e o ) 。 2 2 4 结果评价： 对f s c ，s s c 的影响； 阳性细胞比例； 平均荧光强度； 相对荧光指数( i 江i ) ( 阳性比例平均荧光强度一空白或阴性对照阳性 比例空白或阴性对照平均荧光强度) 2 3 实验条件的确立 2 3 1 不同破膜剂对实验的影响 f a c s f i x p e n n f i x a t i o n & p e r m e a b i l i z a t j o n 2 3 2 不同破膜时间对实验的影响 51 0 1 52 0 2 5 分钟 复旦大学硕l 生论文 2 , 3 3 标本放置时间对实验结果的影响，同时检测p i 了解细胞死亡情况 即刻1 2 h2 4 h 4 8 h 2 3 4 不同荧光标记单克隆抗体对实验结果的影响 m p o f i t c m p o - p e 统计： 流式细胞仪参数用c e l l q u e s t 软件获取。所有数据建库采用e x c e l2 0 0 0 软件。 所有数据分析应用s p s s1 0 0 统计软件包进行，结果以均数标准差来表示。正 态分布数据采用t 检验、配对t 检验和方差分祈，非正态分布数据采用非参数 检验。 结果： 1 流式细胞仪检测h l - 6 0 的点图分析 图上h l 6 0 细胞聚集成一群。 图1h l - 6 0 细胞的s s c f s c 散射点图 9 复旦大学硕十生论文 2 不同破膜剂对实验结果的影响 本实验采用了临床上常用的三种破膜剂，分别为f a c s f i x & p e m a f i x a t i o n p e r m e a b i t i z a t i o n 。经比较在检测m p o 中，f a c s 破膜剂对细胞s s c 和 f s c 影响最小，荧光强度和阳性百分比皆比较高。 表1 三种破膜剂的s s c f s c 值比较表 图2 三种破膜剂的s s c f s c 值直方图显示 复旦大学硕士生论文 表2 三种破膜剂对f c m 检测胞浆内抗原m p o 的阳性细胞，荧光强度的影响 + 表示组间p 值小于0 0 5 ，在统计学上有显著性差异 图3 直方图显示阳性细胞 图4 直方图显示相对荧光指数r f i 复旦大学硕士生论文 3 不同破膜时间对实验结果的影响 表3f a c s 破膜剂在不同破膜时间对检测结果的影响 + 表示组间p 值小于o 0 5 ，在统计学上有显著性差异 表4f i x p e n n 破膜荆在不同破膜时间对检测结果的影响 + 表示组间p 值小于0 0 5 ，在统计学上有显著性差异 表5f i x a t i o n & p e r m e a b i l i z a t i o n 破膜剂在不同破膜时间对检测结果的影响 + 表示组间p 值小于o ，0 5 ，在统计学上有显著性差异 1 2 复旦大学硕士生论文 图5 三种破膜剂在不同破膜时间下对检测结果m p o 阳性细胞的影响。 表明随着破膜时间的延长，阳性细胞百分比以及荧光强度都有逐渐的增强， 说明细胞的破膜效果在逐渐增加；破膜时间在1 5 分钟以上，其破膜效果已无明 显差异。 4 标本不同放置时间对实验的影响 结果显示标本放置在室温下1 2 小时内，检测的阳性细胞百分比和r f i 无明显差异，而超过2 4 小时后与前者有显著性差异。而p i 染色的阳性细胞 比例在2 4 小时后明显的增加，表明细胞死亡的比例明显增多。 表6 标本不同放置时间下对检测结果的影响 复旦大学硕士生论文 图6 标本不同放置时间下对检测结果m p o 抗原的阳性细胞的影响 表7 标本不同放置时间下，表达p i 的阳性细胞百分比和荧光强度的变化 图7 标本不同放置时间下，表达p i 的阳性细胞百分比的变化 1 4 复旦大学硕士生论文 5 不同荧光标记的a n t i - - m p o 抗体对实验结果的影响 表8 f i t c 和p e 标记的抗m p o 抗体对f c m 检测胞浆内抗原m p o 的 阳性细胞。荧光强度的影响 图8 f i t c 和p e 标记的抗m p o 抗体对f c m 检测胞浆内抗原m p o 的 相对荧光指数的影响 结果显示p e 荧光染料标记的m p o 抗体与f i t c 标记的m p o 抗体比较，在 阳性细胞百分比上无明显差异，但在荧光强度上p e 标记的明显要高于f i t c 标 记的，因此两者在r f i 上具有显著性差异。 复旦大学硕士生论文 讨论：流式细胞仪检测胞浆内抗原m p o ，虽然已开展多年，但其检测结果在各 大实验室差异较大，波动幅度大，究其原因除了临床资料本身复杂性外，可能主 要是与破膜剂的选择或标本保存时间及不同荧光标记的抗体有关。本实验利用髓 系细胞株h l 一6 0 来研究不同破膜剂对检测胞浆内抗原m p o 的影响，由于检测对 象是克隆性生长的白血病细胞株，比较一致，可以比较客观的反映各种破膜剂存 在的差异。好的透膜剂要保持细胞完整和颗粒不变的同时，使细胞膜通透，使抗 体进入胞浆与胞浆抗原充分结合“4 。1 “。f a c s 破膜剂，较之其余两种破膜剂，对 f s cs s c 影响最小，而在流式细胞仪检测参数中，f s c 反映的是细胞的大小，s s c 反映的是细胞颗粒的多少，对f s c 和s s c 影响小就意味着f a c s 破膜剂作用过的 细胞在保持细胞完整和颗粒不变方面最好；f a c s 破膜剂作用过的h i p 0 抗原染色， 阳性细胞百分比和荧光强度明显高于其他两种破膜剂，即透膜效果最佳；且f a c s 破膜剂破膜过程较为简单，一步完成；另两种破膜剂破膜时均需先进行a 液固 定，固定完全后b 液进行细胞的破膜，耗时费力。最近国内有文献报道在检测 m p o 过程中，f a c s 破膜剂为最好选择，其结论与我们一致“。虽然在检测m p o 时f a c s 破膜剂明显占优，但在检测其他胞浆内抗原指标如胞浆c d 3 ，胞浆免疫 球蛋白时，国外文献报道f i xa n d p e n n 破膜剂为最佳选择，国内尚未见相应报道 “7 1 。是否因为国外的检测对象疾病基础不同所致，或不同抗原需要不同的破膜 剂，尚需进一步选择多种细胞株，以评价在不同破膜剂条件下多种胞浆内抗原的 测定效果。采用h l 6 0 细胞株进行m p o 检测，对不同破膜剂的优劣作系统分析， 国内外均未见相应报道。 本实验测定了三种破膜剂在不同时间下的破膜效果，当破膜过程在1 5 分钟 左右时，破膜效果已达到9 5 以上，而破膜时间再长至2 5 分钟，在统计学上已 无明显差异。三种破膜剂在破膜时间方面均在1 5 分钟左右达到临床检测要求； 小于1 5 分钟，其破膜效果都有明显的不足，对检测结果的影响相当明显。故检 测胞浆内抗原必须透膜充分，要有充分的透膜时间，且时间一般需在1 5 分钟以 上，但如果破膜时间过长，可引起细胞过分通透，从而导致细胞肿胀，细胞死亡。 在流式细胞仪点图中死亡细胞堆积于点图下方，影响细胞内真实的抗原表达。我 们的统计结果晟示，在破膜时间1 5 分钟已可达到最佳效果，这样可尽量缩短整 个实验的流程时间。 复旦大学硕士生论文 同时，本实验还就样本在体外放置的时间对实验结果的影响作了比较。结果 发现室温下样本放置1 2 小时内，结果无明显差异；随着样本放置时问超过1 2 小时，样本检测的荧光强度逐渐减少，且随着放置时间的延长，阳性细胞百分比 和荧光强度逐渐减b b 。估计随着放置时间的延长，h l 一6 0 细胞可能逐渐死亡。p i 测定证实在流式细胞仪上逐渐分成两群，有一群细胞高表达，证实部分细胞已经 死亡。随着放置时间的延长，p i 标记的细胞百分比逐渐增多。因此我们的结果 提示，样本放置在室温下时，至多1 2 小时内应对其进行处理，至2 4 小时以后白 血病细胞已出现部分死亡，势必将影响实验结果的正确性。 本实验还评价了f i t c 和p e 荧光标记的m p o 抗体在实验结果的影响。发现 p e 荧光标记的m p o 抗体在荧光强度上明显优于f i t c 荧光，可能是由于p e 荧 光激发光的频率不同，不容易受到h l 一6 0 细胞的自发荧光或一些菲特异性荧光 的干扰，因此在检测中效果明显好于f i t c 荧光标记的m p o 检测结果。因此推 荐在条件允许的情况下，尽可能的选用p e 荧光的a n t i - - m p o 抗体。 从本实验的结果中，我们提出了流式细胞仪检测m p o 的推荐方法，具体 如下： 1 调整样本细胞数为1 0x 1 09 1 ；取1 0 0 u l 置于f a l c o n 管中，加入f a c s 破 膜剂1 5 0 0 u l ，振荡混匀，避光反应1 5 分钟；加入p b s 2 m l ，3 0 0 x g 离心5 分钟，弃上清；加入m p 0 2 0 u l ，振荡混匀后避光反应3 0 分钟左右；加入 p b s 2 m l ，3 0 0 x g 离心5 分钟，弃上清；加入p b s 2 m l ，2 0 0 x g 离心5 分钟， 弃上清；加入p b s 0 5 m l 重悬浮，准备上机 2 标本必须当天完成检测 3 可能的情况下尽量采用p e 标记的m p o 抗体 4 分别以空白管( 未加抗体) 调整电压，相应阴性对照管划定阴性细胞区域， 然后检测标本阳性细胞比例、平均荧光强度算术均值( m f i ) 和平均荧光强度几 何均值( m f i g e o ) 阳性细胞比例= m p o 阳性细胞比例一空白对照阳性细胞比例 阳性细胞m f i = m p o 阳性细胞比例阳性细胞m f i 一空白对照阳性细胞比 例阳性细胞m f i 阳性细胞r f i g e o = m p o 阳性细胞比例x 阳性细胞m f i g e o - - 空白对照阳性细 胞比例x 阳性细胞m f i g e o 复旦大学硕士生论文 参考文献 1 。n a g a i ，k 。，h 。s o h d a ，e ta 1 ( 1 9 9 5 ) ”u s e f u l n e s so fi m m u n o c y t o c h e m i 哪f o r p h e n o t y p i c a la n a l y s i so fa c u t el e u k e m i a ；i m p r o v e df i x a t i o np r o c e d u r ea n d c o m p a r a t i v es t u d yw i t hf l o wc y t o m e t r y ”l e u kl y m p h o m a 16 ( 3 - 4 ) ：3 19 2 7 2 s t a p e r ，c o r t e n b a c hi c 。a d m i r a ml g ，k e r rj m ，e ta l ( 19 8 8 ) f l o wc y t o m e t r i c d e t e c t i o no ft e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s ea n do t h e ri n t r a c e l l u l a r a n t i g e n i nc o m b i n a t i o nw i t hm e m b r a n e a n t i g e n i na c u t e l y m p h a t i c j e u k e m i a b l o o d 7 2 ：16 3 9 - 16 4 4 3 n a k a s e ，k ，m s a r t o r e ta l ，( 19 9 8 ) ”d e t e c t i o no fm y e l o p e r o x i d a s eb y f l o w c y t o m e t r yi na c u t el e u k e m i a ”c y t o m e t r y3 4 ( 4 ) ：1 9 8 - 2 0 2 4 t a y 。s p ，s k c h e o n g e ta 1 ( 1 9 9 8 ) ”f l o wc y t o m e t r i ca n a l y s i s o f i n t r a c e l l u l a rm y e l o p e r o x i d a s ed i s t i n g u i s h e sl y m p h o c y t e s ，m o n o c y t e sa n d g r a n u l o c y t e s ”m a l a y sjp a t h o l2 0 ( 2 ) ：9 1 4 5 n g u y e n p l ，i o l s z a k ，e ta 1 ( 1 9 9 8 ) ”m y e l o p e r o x i d a s e d e t e c t i o n b y t h r e e c o l o rf l o w c y t o m e t r y a n d b ye n z y m ec y t o c h e m i s t r y i nt h e c l a s s i f i c a t i o no fa c u t el e u k e m i a ”a mjc l i np a t h o l110 ( 2 ) ：16 3 - 9 6 i m a m u r a ，n ( 19 9 8 ) “s e n s i t i v ed e t e c t i o nt e c h n i q u eo fm y e l o p e r o x i d a s e p r e c u r s o rp r o t e i nb yf l o wc y t o m e t r yw i t h m o n o c l o n a la n t i b o d i e s ”a mj h e m a t o l5 8 ( 3 ) ：2 4 1 - 3 7 k o n i k o v a ，e 。m g l a s o v a ，e ta 1 ( 1 9 9 8 ) ”i n t r a c e l l u l a rm a r k e r si n a c u t e m y e l o i dl e u k e m i ad i a g n o s i s ”n e o p l a s m a4 5 ( 5 ) ：2 8 2 - 9 1 8 g r o e n e v e l d 。k ，j g t em a r v e l d e ，e ta 1 ( 1 9 9 6 ) ”f l o wc y t o m e t r i cd e t e c t i o n o fi n t r a c e l l u l a ra n t i g e n sf o ri m m u n o p h e n o t y p i n go fn o r m a la n dm a l i g n a n t l e u k o c y t e s ”l e u k e m i a1 0 ( 8 ) ：1 3 8 3 9 9 k n a p p 。w 。h s t r o b l ，e ta 1 ( 19 9 4 ) ”f l o w c y t o m e t r i ca n a l y s i s o f c e l l - s u r f a c ea n di n t r a c e l l u l a ra n t i g e n si nl e u k e m i ad i a g n o s i s ”c y t o m e t r y 18 ( 4 ) ：1 8 7 - 9 8 1 0 f a r a h a t n d v a nd e rp l a s e ta 1 ( 1 9 9 4 ) ”d e m o n s t r a t i o no fc y t o p l a s m i c a n dn u c l e a ra n t i g e n si na c u t el e u k a e m i au s i n gf l o wc y t o m e t r y ”jc l i n 】8 复旦大学硕士生论文 p a t h o l4 7 ( 9 ) ：8 4 3 9 11 k a w a i s z z h a ，e ta 1 ( 19 9 3 ) ” a n a l y s i so f c y t o p l a s m i ca n t i g e n si na c u t e l e u k e m i ab yf l o wc y t o m e t r y ”r i n s h ok e t s u e k i3 4 ( 11 ：13 2 0 1 2 d r a c h ，d ，j d r a c h ，e ta 1 ( 1 9 9 3 ) ”f l o w c y t o m e t r i c d e t e c t i o no f c y t o p l a s m i ca n t i g e n s i na c u t e l e u k e