生物转化的类型和机制.ppt

生物转化的类型和机制,第一节生物转化的定义与研究内容第二节生物转化的基本类型一、还原反应二、氧化反应三、水解反应四、转移和裂合反应第三节参与药物制备过程重要反应酶类的作用机制一、脂肪酶二、环氧化物水解酶三、糖苷化酶,第一节生物转化的定义与研究内容,生物转化的含义更强调的是：用微生物或酶来进行药物合成（或其他有机合成）过程中的某一步或几步反应，而那些直接来源于微生物的代谢产物是微生物进行“从头到尾”的合成过程。,在许多国外文献中经常能够看到的描述这种技术的名词有：,microbialtransformation;microbialconversion;BiotransformationBioconversionBiocatalysisenzymation等。,微生物(酶)转化是有机化学反应中的一个特殊的分支,微生物转化的本质是某种微生物将一种物质（底物）转化成为另一种物质（产物）的过程，这一过程是由某种微生物产生的一种或几种特殊的胞外或胞内酶作为生物催化剂进行的一种或几种化学反应，简言之，即为一种利用微生物酶或微生物本身的合成技术。,微生物(酶)转化是有机化学反应中的一个特殊的分支,这些具有生物催化剂作用的酶大多数对其微生物的生命过程也是必需的，但在微生物转化过程中，这些酶仅作为生物催化剂用于化学反应。由于微生物产生的这些能够被用于化学反应的大多数生物催化剂不仅能够利用自身的底物及其类似物，且有时对外源添加的底物也具有同样的催化作用，即能催化非天然的反应（unnaturalreactions）。,在研究一个微生物（或酶）转化过程时，需要考虑的问题,所用转化底物的选择；所用微生物对不同底物转化能力的考察、转化路线或转化反应的选择等；其中最主要的是寻找适合于所设计转化过程的微生物，以及如何来提高这种微生物的转化能力，即提高这种酶活力；再则是发现一种新的酶或一种新的反应以便为设计一个新的微生物转化过程提供一条线索。,用于转化的微生物或酶的多样性,用于微生物转化的菌株或酶的筛选的范围应该尽可能地广，因为至目前为止已经发现了3000余种能够催化各种化学反应的酶，其中有些酶的催化效果比化学催化剂好；另外，微生物的多样性和其生理生化特性的多样性（它们能够修饰和降解许许多多有机化合物），使我们有可能找到某种微生物或酶来催化某种特定的和所期望的化学反应。,第二节生物转化的基本类型一、还原反应,脱氢酶被广泛地用于醛和酮羰基以及烯烃碳-碳双键的还原，这种生物转化反应可使潜手性底物转化为手性产物，如图所示。面包酵母醇脱氢酶和马肝醇脱氢酶能催化酮不对称还原，其还原产物仲醇的对映体过量率接近100%。,脱氢酶催化的还原反应,生物转化中常用的一些脱氢酶,二、氧化反应,氧化反应是向有机化合物分子中引入功能基团的重要反应之一。生物催化的氧化反应主要由三大类酶：单加氧酶、双加氧酶和氧化酶，它们所催化的反应如图所示。,二、氧化反应,单加氧酶和双加氧酶直接在底物分子中加氧，而氧化酶是催化底物脱氢，脱下的氢再与氧结合生成水或过氧化氢。脱氢酶与氧化酶相似，也是催化底物脱氢，但它催化脱下的氢与氧化态NAD(P)+结合，而不是与氧结合，这是两者的主要区别。氧化反应表面上看是加氧或脱氢，其本质是电子的得失。单加氧酶、双加氧酶和氧化酶是催化底物氧化失去电子，并将电子交给氧，即氧是电子受体；脱氢酶催化底物失去电子，它将电子交给NAD(P)+，然后还原型NAD(P)H再通过呼吸链或NAD(P)H氧化酶将电子最终交给氧并生成水。,生物催化的氧化反应类型,1、单加氧酶催化的氧化反应,单加氧酶（mono-oxygenases）可以使氧分子（O2）中的一个氧原子加入到底物分子中，另一个氧原子使还原型NADH或NADPH氧化并产生水（H2O）。单加氧酶在生物催化的手性合成中有着重要的应用，图所示为该酶催化的一些反应类型。,单加氧酶所催化的一些反应类型,羟化反应是一类重要的氧化反应,碳氢化合物中非活泼的CH键的羟化是一种非常有用的生物转化反应，传统的有机化学合成方法几乎不能进行这样直接的羟化反应。但很多微生物能够直接进行烷烃和芳香烃的羟化反应，其中工业化应用最为广泛的是甾体的羟化反应。,环氧化反应,手性环氧化合物是一种重要的手性合成前体，可与多种亲核试剂反应产生重要的中间体。单加氧酶催化的烯烃环氧化反应可用于制备小分子环氧化合物，其中有些产物是传统的化学方法所不能制备的。另外，由单加氧酶催化的硫醚的氧化反应也是非常重要的，已经发现了很多能够催化这类反应的微生物。,拜尔-维利格反应（Baeyer-Villiger）,由单加氧酶催化的另一个非常重要的反应就是拜尔-维利格反应（Baeyer-Villiger）。该反应是指利用过氧羧酸氧化酮生成酯或内酯，这是一个具有很高应用价值的有机合成反应。,2、双加氧酶催化的氧化反应,双加氧酶（dioxygenases），有称双氧酶，能催化氧分子中的两个氧原子加入到一个底物分子中。这类酶一般含有紧密结合的铁原子，如血红素铁，其催化的典型反应有以下三种（如图所示）。,双加氧酶催化的氧化反应,双加氧酶催化的氧化反应,双加氧酶催化的反应有烯烃的氢过氧化反应。烯烃可被一种双加氧酶-脂氧酶氧化为脂质氢过氧化物，其对细胞具有毒性，并能引起病变。脂质氢过氧化物能被过氧化物酶还原为醇。大豆脂氧酶能够催化天然的亚油酸的氧化并不有很高选择性，同时对非天然的底物也能够进行同样的催化反应。,过氧化物酶,过氧化物酶能够催化过氧化氢化许多芳香族胺或酚类化合物，也有的过氧化物酶能够用于特定构型仲醇的制备。同样，由于过氧化酶的立体选择性，此酶还可用于消旋体氢过氧化物的拆分。双加氧酶在能够用于制备顺式环状二醇和顺式环状连二醇，这些手性化合物具有很多的用途。,3、氧化酶和脱氢酶的催化反应,氧化酶催化电子转移到分子氧中，以氧作为电子受体，最终生成水或过氧化氢。氧化酶有黄素蛋白氧化酶（氨基酸氧化酶、葡萄糖氧化酶）、金属黄素蛋白氧化酶（醛氧化酶）和血红素蛋白氧化酶（过氧化氢酶、过氧化物酶）等。其中有些具有重要的应用价值。,脱氢酶,可以催化氧化和还原双向可逆反应，一般以催化还原反应为主，但根据需要设计反应条件可以使还原反应转化为氧化反应。脱氢酶能够催化多元醇分子中的某一羟基区域选择性氧化，而化学方法需要对多元醇中的其他羟基进行保护和脱保护的反应。另外，某些脱氢酶能够催化消旋体醇对映体选择性地氧化而用于拆分。,三、水解反应,水解酶（hydrolases，EC3.x.x.x）是最常用的生物催化剂，占生物催化反应用酶的65%左右。它们能够水解酯、酰胺、蛋白质、核酸、多糖、环氧化物和腈等化合物，这些反应的形式如图所示。其中酯酶、脂肪酶和蛋白酶是生物催化手性合成中最常用的水解酶。,生物催化的水解反应的类型,1、酯水解,用于酯水解的酯酶有猪肝酯酶、微生物酯酶（苦草杆菌、产氨短杆菌、凝结芽孢杆菌、豆酱比赤氏酵母和黑根霉等）、具有酯酶活性的蛋白酶（-胰凝乳蛋白酶、苦草杆菌蛋白酶、青霉素酰化酶、米曲霉蛋白酶和灰色链霉菌蛋白酶等），以及脂肪酶（猪胰腺脂肪酶、假丝酵母属脂肪酶、假单胞菌属脂肪酶毛霉属脂肪酶等）。,2、环氧化物水解,环氧化物是一类重要的有机化合物，是许多生物活性物质合成的原料。环氧化物水解酶能够催化环氧化物进行区域或对映选择性水解，从而通过生物拆分法制备所需构型的环氧化物。生物催化的烯烃环氧化反应也能够直接制备光学纯的环氧化物。用于生物转化的环氧化物水解酶有肝微粒体环氧化物水解酶和微生物环氧化物水解酶。,3、腈水解,含有腈基的有机化合物是一类重要的原料。天然腈存在于植物、真菌、细菌、藻类、海绵、昆虫甚至哺乳动物中。腈水解可通过腈水解酶和腈水合酶两种不同的酶来实现。脂肪族腈一般先在腈水合酶催化下生成相应的酰胺，然后再经过酰胺酶或蛋白酶水解为羧酸。芳香族、杂环和不饱和脂肪腈一般被腈水解酶直接水解产生羧酸，而不形成中间体酰胺。,4、酰胺水解,多肽和蛋白质是由氨基酸通过酰胺键（肽键）相互连接形成的大分子。L-氨基酸被广泛用于医药、食品和手性合成中。近年来，一些非天然D-氨基酸被用作手性化合物合成的前体，D苯苷氨酸、D-对羟基苯苷氨酸是-内酰胺类抗生素的常用侧链。,4、酰胺水解,氨基酸制备一般有微生物发酵法、化学合成法和酶法三种。其中用酶法合成对映体纯氨基酸主要有如图所示的三种方法：水解酶催化消旋体拆分；裂合酶催化不对称氨加成；脱氢酶催化不对称还原胺化反应。,酶法制备L-氨基酸的三种方法,工业上常用的酰胺水解酶有：,酰胺酶（amidase）又称氨基肽酶，其能催化消旋体氨基酸酰胺选择性水解生成L-氨基酸；氨基酰化酶（acylase），其能选择性地催化L-N-酰基氨基酸水解，如这类酶能够催化消旋体N-乙酰色氨酸和N-乙酰苯丙氨酸水解拆分制备L-苯丙氨酸和L-色氨酸；乙内酰脲酶俗称海因酶，这类酶在体内负责催化嘧啶碱基代谢中二氢嘧啶环的水解开环反应，故又称二氢嘧啶酶，常用的海因酶与酰胺酶和酰化酶不同，它优先水解D-型对映体，属D-海因酶；内酰胺酶，其可用于消旋体内酰胺的水解拆分，这些单一对映体的产物是合成很多生理活性物质的重要中间体。,四、转移和裂合反应,在生物催化中最为常用的酶为氧化还原酶和水解酶，其在催化手性合成反应中约占90%左右。然而，其他四大类酶转移酶、裂合酶、异构酶和连接酶（合成酶）在生物催化中也有着重要的应用，它们能催化CC、CN、CO以及C=C和C=O等化学键的生成或裂解反应。,1、转移反应,转移酶（transferases，EC2.x.x.x）是一类常见的生物催化剂，它所催化的转移反应如下式所示。这类酶催化的底物有氨基酸、酮酸、核苷酸和糖等化合物，其中糖基转移酶已被用来制备新型的糖。XY+Z转移酶X+ZY,糖苷化酶（glycosidses）,糖苷化酶能催化糖苷键的水解，故又称糖水解酶（glycohydrolases）。该酶不需要任何辅酶，是真正的水解酶。这种水解酶有两种类型：外糖苷化酶和内糖苷化酶，前者仅水解末端糖苷键，后者可水解糖链中部的糖苷键。由糖苷化酶水解的逆反应可用于糖苷的合成，利用游离单糖作为底物直接进行糖苷合成反应称为直接糖基化，这是一个热力学控制的反应。由于反应的平衡常数有利于水解反应，因此必须采用高浓度的单糖和亲核试剂，反应产率一般很低，产物为粘稠糖浆。,2、裂合反应,裂合酶（lyases，EC4.x.x.x）能催化一种化合物裂为两种化合物或其逆反应。这类酶包括醛缩酶、水合酶和脱羧酶等。裂合酶在工业生产中有着重要的应用，它们能催化CC、CN和CO等键的裂合和生成，有时还伴随双键的形成。裂合酶的逆反应也有很高的工业应用价值，如工业上应用苯丙氨酸氨裂解酶和天冬氨酸酶催化合成L-苯丙氨酸和L-天冬氨酸。,醛缩酶,醛缩酶（aldolases）能催化不对称CC键的形成，并能使分子延长23个碳单位，对有机合成极为有用。该酶常用于糖的合成，如氨基糖、硫代糖和二糖类似物的合成。醛缩酶的底物专一性不高，能催化多种底物反应。,转酮醇酶,转酮醇酶（transketolase）以Mg2+和焦磷酸硫胺素（TPP）为辅酶，催化羟甲基酮基从一个磷酸酮糖分子转移到另一个磷酸醛糖分子中，该酶催化醛糖链立体选择性地延伸两个碳单位，她是很有前途的生物催化剂。偶姻反应（acyloinreactions）是指两个分子醛缩合形成酮醇的反应，如两分子丁醛缩合形成丁偶姻（C3H7-CHOHCOC3H7）。,3、加成和消去反应,裂合酶还可以催化小分子化合物如水和气恼不对称加成到C=C双键，以及氢氰酸加成到C=O键上。由醇腈酶（oxynitrilase）催化的氰醇反应所生成的手性氰醇，是合成除虫菊酯类沙虫剂的醇基部分。,3、加成和消去反应,这类酶催化反应还包括：水和氨的加成反应（如利用不同的微生物细胞能够对不同取代的碳碳双键进行加水反应，具有很好的手性合成应用前景）、Michael加成反应、卤化反应和脱卤素反应等。,第三节参与药物制备过程重要反应的酶类及作用机制,已经研究和应用了各种各样的微生物来源酶于有关药物制备和其他精细化学品的制备，特别是在消旋体的拆分、不对称合成，以及其他复杂化学反应中的应用。尽管经典的化学反应都能够实现这些过程，但用于酶催化反应的微生物资源的可再生性、反应过程的环境友好性，以及其他化学反应无法比拟的优越性，愈来愈多化学反应将被酶促反应所取代。这些酶类参与的反应涉及到如下几个方面。,1、生物催化拆分,生物催化拆分（biocatalyticresolutions），即为利用酶对对映异构体中的一种手性分子具有特异性的催化作用，而对对映异构体中的另一种手性分子不起作用这样的特性，将具有催化特异性的一种对映异构体转化为所希望的对映体纯的产物/中间体。至今为止，在生物催化拆分中使用最多的是水解酶。,1、生物催化拆分,从经济的角度看，利用水解酶进行拆分是不合算的，因为从理论上讲，其最高得率仅为50。这一不足从理论上讲，通过有效地结合外消旋化可以来弥补。这种通过外消旋化来得到单一对映体的方法，即为动态动力学拆分（dynamickineticresolution）。外消旋化可以自发进行，如乙内酰脲；也可以通过改变反应条件，如pH和温度；或者通过使用外消旋酶来进行。,2、对映体会聚转化,另外一条能够得到100%对映体转化收率的不同路线是对映体会聚转化（enantioconvergenttransformations），即或是利用两种对映体互补的酶进行不同区域特异性的转化，或是结合使用酶催化和化学催化的方法，使得到100%的转化收率。前一种方法的适用范围不广，后一种方法已经在（R）-Nifenalol（硝苯洛尔）的制备过程中获得了成功，其利用环氧化物水解酶催化和硫酸催化相结合的方法（如图所示）。,利用化学-酶水解对-硝基苯乙烯氧化物对映体会聚合成（R）-Nifenalol的途径,3、去对称化反应,利用不同的水解酶或水合酶进行去对称化（desymmetrization），是一种非常有效的特异性反应。一个对称的前手性分子，利用某一种特定的酶促仅对分子中的一个功能基团进行生物转化，最终得到一个所期望的手性分子，这就是去对称化。图所示为美国Schering-Plough公司利用脂肪酶，对2-取代-1,3-丙二醇进行去对称化转化，最终得到合成抗真菌药物SCH1048的关键手性中间体。,利用脂肪酶对2-取代-1,3-丙二醇进行去对称化的转化反应,4、不对称合成,相对于生物催化拆分，用于生物催化不对称合成的底物是一种前手性前体，其通过对映体加成反应，可以被转化为所期望的光学活性化合物。与去对称化反应相似，这些反应具有产生定量收率的所期望的光学活性化合物。参与药物制备过程重要反应的酶的种类很多，以下就脂肪酶、环氧化物水解酶和糖苷化酶的作用机制及有关内容作一阐述。,一、脂肪酶,很多细菌能够产生脂肪酶。脂肪酶既能够水解长链酰基甘油，也能够合成长链酰基甘油（如图所示）。由于脂肪酶所催化的水解反应和合成反应都具有区域选择性（regioselectivity）和对映体选择性（enantioselectivity），因此，该酶已被作为重要的立体选择性生物催化剂，用于有机化学合成。,（一）脂肪酶的定义,脂肪酶的简单定义为：催化长链酰基甘油水解（或合成）的羧基酯酶（carboxylesterase）；如果以三油酰甘油酯（trioleoylglycerol）为标准底物时，水解含有酰基链长大于10个碳原子的甘油酯时，往往被称之为脂肪酶（lipase），如果当以三丁酸甘油酯为标准底物时，水解含有小于10个碳原子的甘油酯时，往往被称之为酯酶（esterase）。但应该注意的是，这些脂肪酶往往具有优先水解酯酶底物。另外一种更为容易的理解的含义是：对于含大的手性羧酸和小的醇的酯，其水解或酯交换由酯酶催化，而对由小的羧酸和大的手性醇构成的酯，则由脂肪酶催化，如图所示。,脂肪酶和酯酶催化的酯水解反应,已经实现商业化的一些微生物来源的脂肪酶,细菌脂肪酶的三维结构和催化机制,典型的/水解酶折叠,铜绿假单胞菌脂肪酶的结构,脂肪酶的催化机制,1、亲核丝氨酸残基的活化，其活化过程一方面来自于被邻近的组氨酸，另一方面来自于受丝氨酸中O-作用的底物羧基碳原子的亲核进攻；2、被活化的丝氨酸与底物中的羧基碳结合，形成一个过度态的四元中间体，这个中间体由于两个肽中的NH基团与O-的作用而使其稳定，组氨酸在这一过程中提供一个质子给底物中要离去的醇基上；3、共价中间体（“酰化酶”）的形成，底物中的酸部分与酶中丝氨酸残基形成酯键，周围的水分子被邻近的组氨酸活化，结果是OH-对共价中间体中的羧基碳原子进行亲核进攻；4、组氨酸残基提供一个质子给活化的丝氨酸残基中的氧原子，使丝氨酸与酰基化部分的酯键断裂，释放酰基化产物。,脂肪酶的催化机制,亲核试剂捕捉酶分子活性部位形成酰基/酶复合物的过程,脂肪酶进行酯水解和酯合成的过程（a）：不溶性酯的水解（b）：涉及到不溶性生物催化剂、溶于有机溶媒的酰化基和底物的转酯反应,图显示了该酶的活性部位：底物基团与酶结合的三个结合袋，以及位于结合袋周围的氨基酸残基。如图所示：飞镖形的活性部位被分为一个大大的疏水沟，其可以恰如其分地容纳sn-3酰基链；一个可以嵌入抑制剂的醇部分，其可以再被分为一个可以容纳sn-2部分的疏水/亲水袋，（由于sn-2结合袋对底物结合的交互作用最密切，因此，这可能是决定酶立体选择性的优先因素），和一个较小的可以容纳sn-1链的结合袋。范德华力是维持以上底物中这些基团与酶结合的主要作用。另外，sn-2链中的酯氧原子与活性部位组氨酸的NE2原子之间的氢键，对固定抑制剂的位置具有重要的作用。,一些由微生物来源的脂肪酶催化潜手性化合物成为单一异构体的反应种类,脂肪酶应用受到限制的因素,1）对映体选择性还不够高；2）酶的活性受到限制；3）酶难以循环使用；4）利用脂肪酶进行动力学拆分制备单一异构体的最高得率为50%。,限制因素的突破方法,1）利用体外进化技术改造酶提高对映体选择性；2）研究固定化技术提高酶在有机溶剂中的活性和稳定性；3）研究循环技术使酶能够反复使用；4）研究动力学拆分使酶能够进行对映体转换的催化反应。,以钯碳为第二种催化剂，使S-构型化合物外消旋化；用来源于C.antarctica的脂肪酶对外消旋体苯乙胺进行立体选择性酰化反应的动力学拆分过程,一些利用脂肪酶制备药物关键中间体的实例,二、环氧化物水解酶（一）环氧化物水解酶的定义和作用,环氧化物水解酶催化一份水分子加入到环氧化物分子中的环氧乙烷部分，形成相应的1-2二醇。这种酶广泛地存在于自然界中，如植物、昆虫、细菌、真菌和哺乳动物等。除了这种酶在不同的生物体内具有独特的功能外，环氧化物的酶触反应代表了这一类酶具有重要的生物化学作用，因为：在很多具有生物活性作用的非生物合成化合物的降解过程中，发现很多中间产物为环氧化物；另外，环氧化物结构中的环氧乙烷部分由于其具有亲电子作用，而具有很强的化学反应性，它有可能与很多生物亲核物质进行反应。,环氧化物水解酶的种类,目前已经发现了5种这样的酶：可溶性（也称为胞质）环氧化物水解酶（solubleepoxidehydrolases，sEH）、微粒体环氧化物水解酶(microsomalepoxidehydrolases，mEH)、白三烯A4环氧化物水解酶(leukotrieneA4hydrolases，LTA4H)、胆固醇环氧化物水解酶以及hepoxilin水解酶。,一些微生物环氧化物水解酶对映体选择性地水解外消旋体环氧化物的实例,（二）环氧化物水解酶的作用机理和结构特征,除了对哺乳类的微粒体环氧化物水解酶（mEH）的作用机理有所深入研究外，对其他有关的这类酶的作用机理几乎没有什么研究，但可以认为，这类酶的作用机理应该是相近的。一般认为，mEH通过反式（trans）进攻环氧乙烷来水解环氧化物，这一亲核进攻主要在立体位置上位于纸平面后的碳原子上进行。利用取代基不同对水解速率变化的效应研究，以及动力学溶剂同位素研究，结果支持这一假设。还有一种普遍可以接受的反应机理是：先通过酶分子中的专一的组氨酸残基来活化水分子，然后由被活化了的水分子直接进攻环氧化物中的环结构部分。,环氧化物水解酶催化环氧化物水解的一般过程,AgrobacteriumradiobaterAD1环氧化物水解酶的催化机理,在大多数情况下，较为暴露的碳原子被优先受到攻击，因此，k1k2、k4k3。,环氧化物水解酶生物转化的四种途径,（三）环氧化物水解酶的底物特异性,1、单取代环氧化物；2、苯乙烯氧化物型的环氧化物；3、双取代环氧化物。,带有各种不同取代基的环氧化物,三、糖苷化酶与糖基转移酶,寡糖、糖脂、糖肽、糖蛋白、蛋白聚糖以及其他一些含糖化合物在生物体内具有广泛的生理作用，特别是不少含糖化合物具有特殊的药理活性，从而激发了药物研究工作者的研究热情，使之成为当今药物开发研究的一个重要分支。,三、糖苷化酶与糖基转移酶,目前很多已经应用的微生物药物都是糖苷化合物，如具有抗菌、抗虫、免疫调节、除草和生长调节等生物活性的大环内酯类糖苷化合物，以及蒽环类抗肿瘤抗生素等。尽管通过化学合成的方法可以形成特异性的糖苷键，但其区域专一性或立体专一性合成的效率往往是低下的，而利用酶或微生物进行转化的方法来合成各种糖苷键，是近年来一个新的研究领域。,糖基转移酶,生物催化糖苷键的酶包括两个大类，即糖基转移酶（glycosyltransferase）和糖苷化酶（glycosidase）。在一个合适的反应系统中，前者可以有效地和选择性地催化供体上的糖残基转移到受体分子上，从而形成新的糖苷化合物。利用糖基转移酶催化生成糖苷化合物的优点是较高的转化率和选择性，但其缺点是需要有一个比较复杂的提供糖基的供体，且该基团对酶来说具有很大的隐蔽性。,糖苷化酶,相反，利用糖苷化酶催化反应，能够催化比较简单的糖基供体，甚至在某些条件下，可以直接