（植物学专业论文）濒危植物桫椤（cyathcaceae）pod同工酶比较及其分离纯化和性质的研究.pdf

濒危植物桫椤p o dj 司丁酶的比较及批分离纯化、性质的研究 濒危植物桫椤p o d 同工酶的比较 及其分离纯化、性质的研究 摘要 专业：植物学 研究方向：植物生物化学 指导教师：唐云明研究生：叶林奇 桫椤科( c y a t h c a c e a e ) 植物是地球上最古老的蕨类植物在地球上已有2 亿多年的历 业，i + i 生代侏罗纪时j 纠生艮繁茂但由丁第四纪冰川的侵袭，桫椤的生存受到严重影响， 分布范闱大大缩小。幸存的桫椤数量十分有限，在国家重点保护野生植物名录中，己 被国家列为一级保护植物。 国内外对桫椤科植物己开展了较多的研究，多数集中在生态学、解剖学、繁殖生物学 以及核型研究等方面。本文拟对从重庆市涪陵区江东磨盘沟桫椤林保护区采集的桫椤币i 齿 叶黑桫椤的p o d 同j i ：酶以及p 0 0 的分离纯化及动力学性质进行研究，为迸一步保护珍稀 濒危的桫椤种类，有效地利用常见的桫椤资源提供科学依据。 过氧化物酶 p e r o x i d a s e ，p o d ，e c l 11 1 7 ( x ) 】是广泛存在于各种动物、植物利微 生物体内的、其结构和作j = l = f 机理并不完全相同的一类含血红素的氧化酶，一般含有铁或铜 笆金属离子。其功能t 璎彳保护细饱免受彳丁谁的过氧化物损卉：负贺h ? o ! 的消除：细胞 应激高氧化环境压力提供保护；在术质紊的生物降解中起重要作用；参与细胞壮平生妖素 台成；组织愈伤：与超氧化物歧化酶( s o d ) 相互协调配合，消除过剩的臼由基，使植物 体内的自由基维持在一个动态的正常水平以提高植物的抗逆性等等。现将研究结果报告 如卜： l ，桫椤过氧化物酶同上酶比较研究 ( i ) 桫椤与齿叶黑桫椤的过氧化物酶同酶的酶谱比较 电泳幽谱表明桫椤与齿叶黑桫椤的过氧化物酶同i ：酶带有明显筹异；住p o d 酶活性 上也有较大差异( 桫椤p o d 活性为1 5 。6 活性单但，齿州黑桫椤p o d 活性为6 4 8 活性单 位) 。 ( 2 ) 涪陵城区江东磨盘沟不同居群桫椤p o d 同：1 1 酶比较研究 不同居群桫椤样品的p o d 同1 ：酶酶谱筹异不人。不论是酶带数目、带刑、还是迁移率 都表现出相似的特点，这说明这些桫椤虽然是从不同的地点采集的，但相距并不远，并没 有山现明显的种群分化，只是属- 丁不同的牛态刑。 2 齿则黑桫椤p o d 的分离纯化与性质研究 ( 1 ) 分离纯化 濒危植物桫椤p o di 埘t 酶的比较驶其分离纯化、性质的研究 齿叶黑桫椤叶片提取液经过硫酸铵盐析、透析、d e a e 一琼脂糖凝胶柱层析和s e d h a c r y i s - 2 0 0 凝胶柱层析分离得到纯化的p o d ，其纯化倍数为2 6 2 9 ，同收率为2 7 0 4 。 ( 2 ) 基本性质研究 通过s d s ：p a g e 法测得p o d 的分子量为4 3 ，0 0 0d 。通过i e f p a g e 法测得p o d 的等 电点为4 5 5 。齿叶黑桫椤p o d 最适p h 在4 左右。最适温度在4 5 左右。k m 值在最适温 度4 5 ( 3 ，最适p h4 的条件r 为0 0 7 m o l l 。 关键词：桫椤( c y a t h c a c e a e ) ；过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，p o d ) ；同工酶( i s o z y m e ) ： 分离纯化；性质研究 濒危植物桫椤p o di 闭t 酶的比较及1 e 分离纯化、性质的研究 i s o z y m esc o m p a r i s o n ，p u r i f i c a t l o na n dp r o o e r t i e ss t u d yo f p e r o x i d a s e sf r o mt h ee n d a n g e r e ds p e c i e sc y a t h c a c e a e a b s t r a c t m a j o r ：b o t a n y d i r e c t i o n ：p l a n tb i o c h e m i s t r y t u t o r ：t a n gy u n - m i n g m a s t e rs t u d e n t ：y el i n q i c y a t h c a c e a ep l a n t sa r et h eo l d e s tf e r n s t h e r ea r eo v e rt w o h u n d r e d m i l l i o n y e a r so nt h ee a r t h t h e yd e v e l o p e dl u x r i a n t l yd u r i n gj u r a s s i ci nm e s o z o i c t h ea t t a c k o ft h eq u a t e r n a r yg l a c i e rh a dl e dt ot h e i rs u r v i v a lc r i s iss e r i o u s l ys ot h a tt h e i r d i s t r i b u t i o na r e a sa n dq u a n t i t i e sh a dr e d u t e dg r e a t l ya n dt h e yh a db e e ne n t e r e d i nt h e1 i s t a ss e n i o rg r a d e c o n s e r v a ti o np l a n t s t h e r eh a v eb e e nm o r eb i o l o g i cs t u d yo nc y a t h c a c e a ep l a n t si nh o m ea n da b r o a d i nr e c e n t yd e c a d e s ，w h i c hh a v ec o n c e n t r a t e dm o s t l yo ne c o l o g y ，a n a t o m y ，b r e e d b i o l o g ya n dt h ek a r y o t y p er e s e a r c h i n ge t c t h et h e s i sp l a n e dt os t u d yo np o dis o z y m e a n dp o d sp u r i f i c a t i o n ，k i n e t i cc h a r a c t e r so fa l s o p h i l as p i n u l o s a ( h o o k ) t r y o n ) a n dg y m n o # ) h a e r ad e n t i c u l a t uc o l l e c t e df i 0 1 1 1t h cc o n s c lv t t t i n n 【lu “s 【 【10 e t l t c ，“t 4 1 6 f o r e s ta tj i a n g d o n gm o p a ng u l l yl o c a l t e df u l i n gd i s t r i c t i n c h o n g q i n g m u n i c i p a l ，i no r d e rt op r o v i d es c i e n c eb a s i sf o rf u r t h e rp r o t e c t i n ge n d a n g e r e d c y a t h c a c e a ep l a n t sa n du s i n ge f f e c t i v e l yt h e m p e r o x i d a s e p o d ，e c l 1 1 1 7 ( x ) i s a no x i d a s e t h a tc o n t a i n sah e m ep r o s t h e t i c g r o u pa n dm e t a li o n ss u c ha si r o no rc o p p e ra n dh a v en o ti d e n t i c a ls t r u c t u r ea n d c a t a l y t i cm e c h a n i s m ，w h i c he x i t se x t e n s i v e l yi ne v e r y 1i v i n gc r e a t u r el i k e a n i m a l ，p l a n ta n dm i c r o o r g a n n i s m i ts e r v e san u m b e ro fd i f f e r e n tf u n c t i o n s ，s u c h a sp r o t e c t i n gc e l lf r o mt h ed a m a g eo fp o i s o n o u sp e r o x i d ：e l i m i n a t i n gh y d r o g e n p e r o x i d e ：p l a y i n gai m p o r t a n tr o l ei nt h eb i o l o g i c a ld e g r a d a t i o no f 】i g n i n ：b e e n c o n c e r n i n gw i t hc e l lw a l la n dg r o w t h h o r m o n es y n t h e s i s ，r e c o v e r y i n gt is s u e d a m a g e ；c o o p e r a t i n gw i t hs o de a c ho t h e re l i m i n a t i n gs u p e r f l u o u sf r e er a d i c a la n d m a i n t a i n i n gi t i nan o r m a ld y n a m i cl e v e li nv i v os o a s t oe n h a n c ev e g e t a b l e r e s i s t a n tc a p a b i l i t yi nb a de n v i r o n m e n t ，e t c i c o m p a r i s o ns t u d yo np e r o x i d a s e ( p o d ) f r o mc y a t h c a c e a ep i a n ls 6 濒危植物桫椤p o d 同工酶的比较及其分离纯化、性质的研究 1 、c o m p a r i s o ns t u d yo nt h es p e c t r ao fp e r o x i d a s ei s o z y m ef r o ma l s o p h i l as p i n u l o s a ( h o o k ，) t r y o n ) a n dg y m n o s p h a e r ad e n t i c u l a t a t h es p e c t r ao fp e r o x i d a s ei s o z y m ef r o ma l s o p h i l as p i n u l o s a ( h o o k ) t r y o n ) a n d g y m n o s p h a e r a d e n t i c u l a t ai n d i c a t st h a tb o t h e l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n s a r e d i f f e r e n te v i d e n c e l y ：s oa r ep o da c t i v i t i e s “b o p h i l a s p i n u l o s ap o da c t i v i t i e s i s l 56 u 。g y m n o s p h a e r a d e n t i c u l a t ap o da c t i v i t i e si s6 4 8u ) 2 c o m p a r i s o ns t u d yo nt h es p e c t r ao fp e r o x i d a s ei s o z y m ef r o md i f f e r e n tp o p u l a t i o n l o c a l t e dj i a n g d o n gm o p a ng u l l yo ff u l i n gd i s t r i c ti nc h o n g q i n gm u n i c i p a l t h ee l e c t r o p h o r e s i sp a t t e r n so fp e r o x i d a s ei s o z y m ef r o md i f f e r e n tp o p u l a t i o n o fs a m p l ea r en o td i f f e r e n tt o o i nt h ee l e c t r o p h o r e s i sb a n d s n u m b e r ，f i g u r ea n d m i g r a t i o nr a t e ，t h e ya l ls h o ws i m i f a rc h a r a c t e r i s t i c i td e m o n s t r a t e st h a tt h e s e c y a t h c a c e a ep l a n t sa r en o ts od i s t a n tt h o u g ht h e yw e r ec o il e t t e df r o md i f f e r e n t p l a c e sa n dt h e yd i d n + ta p p e a rt h ee v i d e n c ep o p u l a t i o np o l a r i z a t i o n t h e ya r eo n l y d i f f e r e n te c o t y p e i i s e p a r a t ea n dp u r i f yo fg y m n o s p h a e r ad e n t i c u l a t ap o d 1 s e p a r a t ea n dp u r i f y g y m n o s p h a e r a d e n t i c u l a t ap o di ss e p a r a t e da n dp u r i f i e df r o ma b s t r a c t i n gl i q u o r o f g y m n o s p h a e r ad e n t i c u l a t a l e a v e s t h r o u g hs a l t i n gp r e c i p i t a i o n ，d i a l y s i s ， d e a e s e p h a r o s ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h y ， s e p h a c r y ls - 2 0 0g e lf i l t r a t i o nc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y p u r i f i e dt i m e so fp o di s2 6 2 9a n dr e c o v e r yi a2 7 0 4 2 t h em o l e c u l a rw e i g h tsm e n s u r a t i o n d e t e r m i n e db ys d s p a g ec o l u m n ，t h em o l e c u l a rw e i g h to fp o di sa p p r o x i m a t e l y 4 3 ，0 0 0d a l t o n 3 i s o e l e c t r i cp o i n t sm e n s u r a t i o n d e t e r m i n e db yi e 卜p a g e i s o e l e c t r i cp o i n to fp o di s4 5 5 4 p a r tn a t u r es t u d y t h em o s ta d a p t i r ep ao fp o di sa b o u t4 t h em o s ta d a p t i v et e m p e r a t u r ep ho fp o di sa b o u t4 5 。c t h ev a l u eo fp o dk mi s0 o t m o l li nt h ec o n d i t i o no f4 5 a n dp h4 k e yw o r d s ：c y a t h c a c e a ea l s o p h i l as p i n u l o s a ( h o o k ：) t r y o n ) ；g y m n o s p h a e r ad e n t i c u l a t a p e r o x i d a s e ：i s o z y m e ；c o m p a r s i o n ：s e p a r a t ea n dp u r i f y ：p r o p e r t i e s 濒危植物桫拶p o di 刊7 - 酶的比较驶j c 分离纯化、件质的w 究 第一部分文献综述 过氧化物酶 p e r o x i d a s e ，p o d e c l 1 i j ，7 ( x ) 】是j r 泛存在丁各种动物、植物平j j 微 生物体内的、其结构和作用机理并不完全相同的一类含血红素的氧化酶，一般含有铁或铜 等金属离子。它上要催化由过氧化氢蛾有机过氧化物参与的各种( 有机或无机) 还原荆 的氧化反应： r h 2 + h 2 0 2 - 2 h 2 0 + r 反席过程可简单描述为1 2 1 ： e +h 2 0 2 一一c o m p o u n d i c o m p o u n di + a h 2 一一一c o m p o u n di i + a h c o m p o u n di i + a h 】一一e + a h 即：过氧化物酶经过两电子氧化而成为化台物l ，血红素辅基转变为n 阻j 离子基团。 随后化台物l 经过单电子还原成化台物o 化台物i 雨j f 也合物i i 都是冗有催化活性的中间 化合物。部有一个f e o 结构，并存在丁有机基团中，这种有机基团或者是氮基酸残基，或 者是卟啉。 p o d 分子耸范闱3 5 0 0 0 1 0 0 0 0 0 。基丁- 序列相似性比较分析，可将含血红素p o d 划分 成两个p o d 超家族( s u p e r f a m ij y ) 。一个由真菌、细凶和植物来源的p o d 编成：另一个则 由动物来游的p o d 组成，如甲状腺过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶等。 目前对丁真凿、植物和细菌来源的p o d 的研究已经拓宽到儿十种，依来源不同，可 将植物p o d 超家族内的成员迸一步门为三类f 4 i ：l 类是胞内刑p o d ，包括酵母细胞色素c 过氧化物酶( c c p ，位于线粒体电子传递链中的一种可溶性酶蛋白，土要保护细饱免受有毒 的过氧化物损害) ，抗坏血酸过氧化物酶( a p ，主要存住丁高等植物的丌1 绿体和胞液中，负 责h 2 0 2 的清除) ，和细菌来源的触酶过氧化物酶( 同时兼冗过氧化氢酶和p o d 两种活力， 为细胞应激高氧化环境压力提供保护) ：j j 类p o d 是爿源_ r 真菌的胞外刑p o d ，包括各种 真菌产生的小索过氧化物酶( l i p s ) l l 锰过氧化物( m n p s ) ，在小质素的生物降解中起重要作 川：川类p o d 是米源丁高等植物的分泌刑p o d ，参与多种不同的生理功能，如细胞举的 台成：组织愈伤：生k 素合成与代谢：与超氧化物歧化酶( s o d ) 相互协调配合清除过 剩的自由基使植物体内的白由基维持在一个动态的止常水平，以提高植物的抗逆性等。 8 0 年代初，研究得到了第一个p o d c c p 的x 一射线晶体结构，很k 时间内有关p o d 的结构及功能研究一直以c c p 的品体结构为基础近年来相继义获得了多个不同种类及 米源的p o d 品体结构。包括来自a r t h r o m y c e sr a m o s u s 和c o p r i n u sc i n e r e u s 的p o d ，采口 p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 的l i p 雨lm n p ，以及米臼豌豆胞质p o d 。多序列比较分析表 明，尽管这些p o d 之间的序列同源性较小( 2 0 ) ，但其一级结构的折营方式却是高度保 一8 濒危 直物桫椤p o d 同t 酶的比较及儿分离纯化、性质的研究 守的。p o d 分子由两个不同的结构域组成，中间包埋着血红素辅基，结构域部分由1 0 1 1 个o - 螺旋组成，螺旋之间由环区和转角连接，很少有0 折替结构。结构域中存在儿个保 守的g l y 和p r o 残基决定着蛋白质主链骨架的止确走向和蛋白分子的柔性，而由a s p 7 和a r g ”2 ( l i p ) 残基构成的深埘犁盐桥是所有p o d 中部存在的保守结构，这种盐桥结构的土 要作用是稳定两结构域之间的妖环结构。 i 类p o d 分子中不存在二硫键，也不含糖基侧链和c a ”；而l f 、i i i 类p o d 均含有二 硫键其位置虽有差异，但数量基本相同( 4 5 个) ，赋予了p o d 分子高度的刚性结构。另 外。l i 类和i i i 类p o d 分子中还含有两个c a ”己由x 射线晶体结构确定了其结合位点。 i i 类和i i i 类p o d 在其分子表面还都具有程度不同的糖基化侧链，其具体的生物学功 能有待深入研究。真菌米源的p o d 中除l i p 的一个同i 酶组分外，其余的都不含有丁v r 残基，这不同丁其他p o d ( i ，i i 类) 。尽管存在上述差异，但不同p o d 家族的酶分子却都 有相似的分子折叠模式。 从植物中获得的过氧化物酶如辣根过氧化物酶、细胞色素c 过氧化物酶等，其研究u ，追溯 刮1 8 0 9 年朋愈刨树脂为底物进行的颜色反麻但直别一个1 廿：纪之后才开展此酶的分离年命 名。已知的催化反麻底物超过2 0 0 种，以及多种过氧化物和辅助冈子。迄今研究虽深入的 首推辣根过氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，h r p ) i5 “。甲在1 9 4 0 年，t h o r e l l 即川电泳力 法从部分纯化的辣根组织中医分山2 种不同的h r p 之后此酶住植物l l 二常和麻激反应代谢 中发抨重要作川而受到j 泛大注，并对此酶进 i 了人昔研究，涉及此酶的种类、等电点、 氨基酸组成千序列、生理功能，以及基冈表达和凋控的分子机制臀。迄今此酶作为一种商 品化试剂也广泛用丁- 免疫组织化学、电镜技术、酶联反应和免疫印迹等生物学研究，计成 为重要的诊断试剂。 1 1 植物p o d 的类型划分和组织定位 按不同的标准可将植物物p o d 划分成不同类型根据等电点人小可分为酸性或阴离子 ( p l 7 0 ) 3 种p o d 。 根据催化底物特性可分为愈创小酚p o d 、谷j 甘肽p o d 丰i 抗蛳、血酸p o d 等。 根据植物来源不同可分为辣根p o d 、需茄p o d 、花生p o d 等等。 根据结合状态可分为可溶态、离子结台态乖 共价结合态p o d 或细胞罐结合态。 根据所分离酶的生理功能则可分之为小质索p o d 、抗坏血酸p o d 、伸展崔向p o d 、 n a d hp o d 、i a a 氧化酶、酚氧化鸶、细胞色素cp o d 和谷胱卡 脑p o d 等。 根据表达方式可分为结构组成型p o d 和诱导表达刑p o d ，其中麻力诱导表达p o d 的 类型包括损伤诱导型、病菌诱导型、激素( 乙烯，a b a 等) 诱导刑、温度、盐胁迪等诱导型。 从研究角度看，近些年来多数涉及对阴离子口l 离子和中性p o d 的不同分子特性、生理功能、 血消学笑系及基因表达调控的比较研究上。 9 濒危植物桫椤p o dl 可t 酶的比较及j e 分离纯化、性质的研究 不同种类的p o d 及其同工酶存在明显的组织和器官专化性，其中抗上1 i 血酸p o d 分别 存在于叶绿体和细胞质内。二者在组成、结构、底物专化性亲和力及在纯化过程中的稳定 性上有筹异。术质素p o d 多存在丁细胞艟内许多p o d 可存在丁细胞膜、细胞器、细胞 质及质外体内。根据其组织专化性常称为线粒体p o d 、n t 。绿体( 类囊体) p o d 、液泡p o d 、 胞间和胞内p o d 等。 1 2p o d 的分子结构特点 p o d 为一人类有共同活性的酶，多数p o d 含f e ( i l i ) 一原卟啉i v 辅基，是一种由单 一肽链与卟啉( p r o t o p o r p h y r i nl x ) 构成的血红索蛋向( h e m o p r o t e i n ) ，脱辅基蛋白分子 ( a p o p r o t e i n ) 须与血红素结合才构成全酶( h o l o e n z y m e ) 。血红索( 铁卟啉) 的基本结构成分是 由吡咯组成的卟吩，带上侧链后形成卟啉，再和一分子铁构成铁卟啉化合物即为向红素。 关血红素衍生物的变化均在卟啉环的侧链上进行。血红素作为p o d 的辅基，在这类酶蛋白 中是电于传递反麻的载体。p o d 中以辣根过氧化物酶( h r p ，h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ) 的结 构帚l 作州机理研究得较为透彻，在含铁p o d 中也有代表性。 h r p 为结合了氧化血红素的糖蛋白。除f e 外每分子中还含有两个c a ”。肽链由3 0 8 个氦基酸组成。另有8 个糖链“i 分子质颦的1 8 分划与】3 、5 7 、15 8 、1 8 6 、1 9 8 、2 1 4 、 2 5 5 年2 6 8 位的a s n 残基连接，它们分布在分子表面。肽链n 末端为一个吡咯烷酮羧基所 封闭，c 一末端为s e r 。不同来源的同类刑p o d 的氨基酸组成相似，这类p o d 的活性中心 除f e ( 1 1 1 ) 原卟啉i x 基本结构外。轴向配体一个是h i s “的咪唑氮，另一个位置是空的( 也 可能有水分子疏松配何) ，由此可使得f e 早s = 5 2 的高白旋态。该空位与和它相对的h i s 的咪唑基共同起调控铁的反麻性的作_ l i j ，有实验证明h i s n l h 或火去质子成通过氢键与底 物结合。这一解质子作川可能在使p o d 稳定在高氧化态中起干 - 川。 血红素在p o d 中有五种相关的氧化态：f e ( 1 1 ) p o d 、f e ( 1 l l p o d 、c o m l 、c o m l l 和 c o m l l l 。c o m l 和c o m l l 分别是原酶火去2 个和1 个电子形成的，它们的形式氧化态都是 f e ( i v ) c o m l 中的铁警f e ( i v ) = o 结构。住铁氧离子中，铁铲低臼旋d 4 构型，而且很可能 有s = 1 ( 两个术成对电子) ；而轴向零场分裂d 为3 0 一6 0 c m 1 。整个c o r a l 则以人刚离子 白由基形式存在。从这一设想出发，p o d 与h2 0 ! 作州彤成中间物c o m l 时反应为： h e m e f f e ( 川) ( p o d 十h 2 0 2 0 h e m e o = f e ( t v ) - r 一】( c o m l ) 十h ! o 。其中铁的形式氧化数 为4 ，卟啉环形成有单电子的刚离子基( r 一) 。上述反应过样如图1 所示。尢是h 2 0 2 对 f e ( 1 1 1 p o d 的向核性进攻使h 2 0 2 火去一个质子变成h o j ，而把a s p 4 3 的羧酸根被质子化。 同时h o ：与f e ( 川) 配位，而a r g 的呱基通过氢键使这种配位稳定化。然f f ；彳羧基转动使其羟 基逼近h 2 0 1 的0 氧原子，后者从羧基获得氢生成水而离士羧基利胍基复原p o d 则变 】0 ， 濒危植物桫椤p o d 同工酶的比较及其分离纯化、性质的研究 成含f e ( i v ) = o 的中间复合物c o m l 。c o m l l 是由c o m l 再与一个底物a h 作用形成的，它 的有效氧化数在c o m l 与p o d 原型之间，其形成过程可设想为( r 一) f e ( i v = o 与底物a h 作用时获得一个带一个电子的氢原子的反应，所以此时底物变成自由基a 。 夕h = ，c 吣，：l ：l 一 。 弋p h ， 毒，。 ，1 i h 界 l 藏 幽1p o d 复合物i 形成机制 f i g1f o r m a t i o nm e c h a n i s mo f p e r o x i d a s ec o m p l e xi 参与植物p o d 血红素的合成部位可能象动物一样是在线粒体上。h r p 与氯 p o d ( c h l o r o p e r o x i d a s e ) 的血红素在结构上存在筹异。前者为咪唑轴配体( m i d a z o la x i a l l i g a n d ) 。带电荷和极性结构，有利丁。一。键的裂解，相对较远的卟啉铁避免了氧代转移反 应，暴露的边缘促进了电子转移反应：而后者则为硫化轴配体( t h i o l a t ea x i a ll i g a n d ) ，其活 性反应特性介于细胞色素p - 4 5 0 和h r p 之间。但也发现细菌的氯p o d 不需卧啉和金属离 子即可催化产生抗真菌化台物h y p o h a l i t e s 和p e r e r a c e t i ca c i d 。 多数植物p o d 能与碳水化合物结合成为糖基化蛋白，而植物抗= 1 、血酸p o d 和真菌细 胞色素cp o d 及高等动物p o d 则无碳水化台物成分。多数h r p 同1 酶都岔有l5 一1 7 的碳水化合物，少数同、【酶仅含有7 的碳水化合物。糖基化有避免蛋白酶降解和稳定 酶蛋白构象的功效。糖基化发生位点在高尔基体上。糖基化碳水化合物的结构与相同结构 和特点的酶蛋自结合会产生类似同f ：酶现象。 p o d 蛋白的分子量约为3 5 k d 1 0 0 k d 左右，约由3 0 0 个以上的氨基酸残基组成。其中 存在酸碱催化域( a c i d b a s ec a t a l y s i sd o m a i n ) 和血红素结合区域( 1 i g a n do fh e m e ) ，常含8 个 、 胱氢酸、2 个葡萄糖胺、约8 个糖和2 - 6 个糖基化位点、一个原高铁血红素( p r o t o h e m a t i n ) 和2 个钙离子、n 端为吡咯烷酮碳酸、c 端为精氨酸或丝氮酸【0 5 i 。但抗坏血酸p o d 和细 胞色素p o d 缺少相应的、 胱氨酸残基等电点范围在p 1 3 5 1 0 之间。此酶钝化温度为 9 5 1 0 0 ，时间1 0 m i n 以上，在酶粗提液中p o d 的热钝化- 温度往往与加热时间譬为非线性 关系。这与不同热稳定性的p o d 存在有关。某些同i 酶在p h l 0 ，甚至个别同i ：酶在p i l l 4 时仍具有9 0 的活性。从白腐菌( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o p o r i u m ) 分离的左磷酸化的术质索 p o d 不影响以藜芦醇为底物的催化反应。 ，憎漕 艮疆 ，矿。 卢，令 大； 濒危植物桫椤p o d 同工酶的比较及其分离纯化、性质的研究 1 3 p o d 的催化反应机理和动力学研究 在p o d 的催化反应机理和动力学研究中主要是对辣根过氧化物酶研究较多。 辣根过氧化物酶( h o l s e m d i s hp e r o x i d a s e ，简称h r p ) 很长时间以米一直被人们认为是 一种在较高温度一卜- 也比较稳定的酶。d u n f o r d 等人推测，这种性质可能是和与酶相连的碳 水化合物有关。 在h 2 q 存在时，h r p 能催化苯酚、苯胺及其取代物的聚合反应。h r p 常以标记物的 形式在免疫分析、分子的酶法分析等方面也有广泛用途。 a n d e r s o n 等人刚动力磁场效应研究了h r p 的中间化合物，认为h r p 循环反应的立体 结构可用f 图表示。 n c h s l 窆+ 呐式 入 宅一c 譬 图2 辣根过氧化物酶的催化循环 f i g2c a t a l y t i cc y c l eo f h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e 首先由p o d 与h 2 0 2 反应生成复合物i ( c o m l ) ，这相当丁失去2 个电子，c o m l 含有一 个f e ( i v ) = o 中心和一个有机阳离子自由基( r 一) ，该自由基依酶种类和来源不同或定位予 血红素或定位丁蛋向质多肽链中：随后，c o r a l 氧化一分子外源底物，得一氢原子和l 一电 子，产生底物自由基( a ) 和c o m l l 而有机日f 离子自由基( r “) 则被还原为原初态，接着 c o r a l 被另分子外源底物还原为初始态形式f e ( 1 1 ) ，但义形成一个( a ) ；晟后，两个a 或结台形成a 。或歧化为a ：+ a 。h 。 1 3 1h r p 的( 水相体系) 反应动力学 h r p 与h 2 0 2 反应，首先形成化合物i 。化合物l 的形成速率是1o 1 07 2 o 1 0 m o l s ，与扩散控制的速率相接近。p h 值与速率的关系说明p h 值在5 9 之间， 化合物l 的形成速率xi 与值无芙。化合物l 的结构中的o 来自丁0 2 中的两个氧原于， 然后化合物i 经过单电子还原形成化合物1 1 这一过程的表现二二级速率常数2 因底物的 不同而不同：化合物【l 与底物可继续反应得到h r p 表观二级速率常数t ，也囡底物不同而 1 2 z f 咆奄 濒危植物桫椤p o d 同工酶的比较及其分离纯化、性质的研究 变化。 在选择过氧化物酶催化反应的合适底物时，应从两方面考虑：一是有合适的空间结构， 有利于和酶活性中心结合；二是有较强的还原性。动力学研究表明，底物被化合物f 氧化 的速率要比被化合物i l 氧化的速率高1 0 1 0 0 倍。在逆反应中也可观察到相似的趋势。即由 化台物j l 氧化产生化台物i 的速率比由h r p 氧化产生成化合物1 1 的速率高。 1 3 2 底物浓度的影响 h r p ( 在c t b a 反相胶束体系中) 的活力依赖丁胶束内部水相中溶解的底物浓度，且 酶活力受到过高浓度的h 2 0 2 的抑制。h r p 在水相胶束体系中比在有机溶剂中的催化效率 更高，但与底物的亲和力低。 1 3 3 温度和p h 值的影响 在一定温度范围内随着温度升高酶在胶束体系中的活力逐渐增大，且最适温度也 提高。例如在tr t o r ix 1 0 0 、c t a b 水相胶束中h r p 催化联苯胺的最适反应温度分别为 6 5 c 和5 5 c ，均高丁- 缓冲溶液的最适温度4 0 。 p h 值也是影响酶反应的一个重要因素。p h 值决定着酶表面的离子状态，而表面的离 子状态义与酶的活性密切相关。c h a n g 等人发现，p h 值由7 变为1 0 时，h r p 的化合物 活性点( 第六配体) 的键长缩小。 1 4p o d 的分离、纯化和鉴定 对于酶蛋向，p o d 可以用常规酶抽提和纯化方法加以分离和纯化，包括硫酸铵沉淀或 丙酮沉淀。透析、阴离子和阳离子交换枉层析、凝放过滤以及各种电泳技术分离和鉴定。 抽提_ 1 j 缓冲液多为磷酸盐、醋酸盐、t r i s c l 或t r i s ，m e s 缓冲液：p h 值范同在5 5 7 5 之间。 抽提液中常加入二硫苏搪醇( d t t ) 或2 巯基乙醇、抗坏血酸等抗氧化剂，不溶性聚乙烯吡 咯烷酮可除酚类物质，加入苯甲磺酰氟( p m s f ) 抑制蛋白降解，片j 牛血清白蛋白( b s a ) 等稳 定蛋白等。但也有研究报道抗坏血酸、二硫苏糖醇( d t t ) 和2 巯基乙醇能钝化p o d 和破坏 其肽链结构其中抗坏血酸和d t t 可使韩国分离的h r p 裂解产生3 0 k d 、2 3 k d 和1 8 k d 的无活性的片段。8 0 饱和度的硫酸铵足以沉淀植物组织中的人部分p o d 酶蛋白，丙酮沉 淀法对p o d 酶活性影响也不大。羧甲基( c m ) 纤维素等日i 离子交换剂_ 手i id e a e 纤维素等阴 离子交换荆常被用来分离和纯化刖离子和阴离子p o d ，s e p h a d e xg 系列和s e p h a c r y l 系列 凝胶过滤介质也被广泛用于p o d 的分离和纯化，此外m o n o s 柱。p h e n y ls u p e r o s e 等也被 用于此酶的纯化。用拌刀豆凝集素a ( c o n c a n a v a l i n a l 柱与糖蚩白的亲合特性，可以将p o d 与非糖基化蚩自加以分离，井= i js h i f t 试剂加以鉴定。需要特别注意的是与愈创小酚p o d 相比，抗坏血酸p o d 很不稳定。尤其是在缺乏电子受体的情况卜更不稳定，如在无抗坏血 酸时，叶绿体内的p o d 半衰期低于3 0 s ，p - c h l o r o m e r c ur i b e n z o a t e 也可使此酶失活。因而 在测定此p o d 时必须加入抗坏血酸：因为愈伤木酚p o d 与h 2 0 2 产生的酚和羟基自由 1 3 濒危植物桫椤p o d 同t 酶的比较及其分离纯化、性质的研究 基能迅速氧化抗坏血酸故需要通过凝胶过滤或透析去除低分子干扰物质。m i y a k a 等的研 究结果显示当抗坏血酸浓度在微摩尔水平范围内时此酶会迅速失活，其原因是此浓度的 抗坏血酸自身氧此反应产生了纳摩尔水平的h 2 0 2 认而导致血卟啉中间体的降解。 为了分离不同结合态的p o d ，可采用低浓度的缓冲液( o 0 2 珈，i m m o l l ) 抽提可溶态组 分。而采用高盐缓冲液( 1 3 m o l 几n a c l 或k c i 或3 m o l ll i c i ，或o 2 o 4 m o l lc a c l 2 ) 抽 提离子结合态p o d ，用2 5 ( p v ) 果胶酶和o 5 纤维素酶( p v ) g f 2 0 c 处理植物组织残渣， 可抽提与细胞壁共价结合的p o d 。_ i = j 高效液相色谱可以纯化p o d 多肽片段。纯化后的样 品可用于氨基酸组成分析和序列测定及指纹图谱分析。 根据p o d 血红素蛋自具有4 0 3 n m ( h e m e 吸收峰) 和2 8 0 n m2 个吸收蜂的特姓，可_ jr z 值( 来源于德文r e i n h e i t z a h l ，常作为一些氧化酶的纯度指标。其定义为在同一浓度的酶溶液 的o d 4 0 3 n m 2 8 0 n m 比值) 来判断p o d 纯度。但不同的同i 酶具有不同的r z 值。l e e 报 道i a a 可诱导h r p 光谱吸收峰从4 0 3 n m 短暂跳跃到4 1 8 n m ，8 r a i n 逐渐降低据此推测 h r p 参与摧化i a a 降解，可能形成了h r p 中间体。各种电泳分离技术不仅可用于分离和 鉴定p o d 同1 酶，也可以用作鉴定酶蛋白纯度的方法。非变性的酸性和碱性p a g e ，可分 别刚来分析毋- i 离子和阴离子p o d 同一酶。等电聚焦( i e f ) 可t 【 j 来分离、纯化利鉴定不周等 电点的同工酶，而制备i e f ( p r c p a r a t i v ei e f ) 可用于大量纯化p o d 。s d s p a g e 则可丁_ 测定 纯化酶蛋白的分子量和鉴定酶纯度。将电泳和免疫技术结合的w e s t e r nb l o t 则州丁同r 酶 的免疫特性分析。但值得注意的是，在离体条件下p o d 活性的结果并不一定完全代表此 酶在原位的情况。分离和纯化酶