（分析化学专业论文）二茂铁衍生物的电化学性质及在生物传感中的应用.pdf

摘要 摘要 生物传感器在临床医学、环境和食品工业等方面都有重要应用，并以其体 积小、选择性好、灵敏度高、检测快速方便、成本低和容易实现实时在线活体 检测等优点，成为当前研究的热点之一。生物传感器以生物活性单元( 如酶、 抗体、核酸、细胞等) 作为生物敏感基元，对目标物具有高度选择性的检测器。 将生物活性单元制成敏感膜，同时又要保持生物活性单元的固有特性，是生物 传感器研究的关键问题。为了提高传感器的灵敏度和稳定性，电子媒介体广泛 用于在生物活性单元与电极间传递电子，通过检测媒介体电流的变化实现底物 的检测。电子媒介体的引入，不仅降低了天然氧浓度的影响，提高了测定的灵 敏度，还加速了电极反应，而且，采用氧化还原电位较低的电子介体，还可降 低工作电位，减少干扰物的影响。二茂铁及其衍生物是小分子电子媒介体，具 有高度富电子的夹心结构，热稳定性好，电化学活性和生理活性高，广泛应用 于高灵敏生物传感器的构建。但该类传感器也存在缺点，如介体会发生部分溶 解或因扩散而离开电极表面导致介体流失，从而影响了传感器的稳定性和使用 寿命。因此，如何将二茂铁及其衍生物固定到基体电极表面，并保持其活性， 是二茂铁及其衍生物修饰电极研究和开发中的重要工作。本文在二茂铁及其衍 生物在电极表面的固定化，生物活性分子的固定方法以及新型生物传感界面的 构建等方面进行了探索和研究。主要开展了以下几方面工作： 1 采用简单、可控的原位还原法，利用荷正电的p e i 与羧基化的m w n t s 之间的静电吸引作用，将p e i 吸附于m w n t s 表面。利用p e i 的还原特性，原位 还原a un p s ，实现了a un p s 在m w n t s 表面的有效负载，合成了m w n t s a un p s 纳米复合材料。利用a u s 键实现了h s ( c h 2 ) 6 f e 在m w n t s a un p s 纳米复合物 表面的有效组装，构建了m w n t s a u n p s h s ( c h 2 ) 6 f e 复合纳米材料生物传感器。 采用t e m 、u v o v i s 、e d x 、f t i r 和电化学等实验对传感界面的构建过程进行了 表征。结果表明，m w n t s a un p s h s ( c h 2 ) 6 f c 复合纳米材料的合成，不仅有效 防止了h s ( c h 2 ) 6 f c 的泄漏，还大大促进了电极表面电子的传递速率。将制备的 生物传感器应用于对a a 的电化学催化性能研究，结果表明，m w n t s a u n p s h s ( c h 2 ) 6 f c 修饰电极对a a 的氧化具有良好的电催化能力，而且响应快速 ( 小于3s ) ，灵敏度高，稳定性好，抗干扰能力强，在电分析化学和生物传感研 摘要 究领域中具有良好的发展潜力。 2 将合成的m w n t s a un p s 表面氨基化，再与羧基二茂铁( f m c ) 通过酰 胺键生成m w n t s a un p s f m c 复合材料；利用c s 成膜性好的特点，将g o x 和 m w n t s a un p s f m c 复合材料固定于电极表面，构建无试剂葡萄糖生物传感器。 通过循环伏安和计时电流法对传感器的电化学特性进行了研究。结果表明，c s 为保持固定化生物分子的活性提供了生物相容微环境；复合膜中m w n t s 、a u n p s 和f m c 的存在，极大地提高了膜的导电性和传电子能力；该传感器对葡萄糖 检测的线性范围为0 0 1 2 5m m ，检出限为3 6 “m ，米氏常数为1 2 1m m 。 3 采用交联法制备了壳聚糖二茂铁复合材料( c s f c ) ，再将该复合材料 与a un p s 和葡萄糖氧化酶( g o x ) 混合，通过简单、可控的一步电化学沉积法 制备了c s f c a u n p s g o x 复合薄膜生物传感器。考察了a u n p s 、g o x 含量、p h 值以及电沉积时间等因素对沉积的复合膜性能的影响。采用扫描电镜( s e m ) 和电化学阻抗( e i s ) 对传感界面的构建过程进行表征。结果表明，二茂铁与c s 的交联极大地改善二茂铁的溶解性，有效防止了电子介体二茂铁的流失；传感 界面上a un p s 的引入，可作为酶的活性中心与电子介体二茂铁之间电子传递的 “导线 ，加快电子的转移速率；共沉积法得到的三维多孔结构复合薄膜具有 良好的扩散传质性能，促进了传感器与检测底物的接触，提高了生物传感器的 电催化活性和响应灵敏度。 4 结合电沉积技术和自组装技术，先在玻碳电极表面电化学沉积c s f c 复合 膜，利用c s 中带正电荷的氨基( - n h 2 ) 与a u n p s 之间的吸附作用，将a u n p s 固 定到电极表面，再利用a un p s 对乙肝表面抗体( h b s a b ) 的强烈吸附，制备了 c s f c a un p s h b s a b 免疫传感器。采用c v 和e i s 法，对电极逐层修饰过程进行 表征。结果表明，c s f c 复合膜的形成，不仅有效抑制了电子介体的流失，而且， c s f c 电化学沉积到电极表面形成的一层均匀生物相容性多孔结构薄膜，还有效 增大了电极表面进一步负载a un p s 和h b s a b 的比表面积。实验还对缓冲液p h 值、 免疫反应孵育温度、孵育时间等免疫测定参数进行了优化选择。在优化的实验 条件下，采用差示脉冲伏安法( d p v ) 对乙肝表面抗体( h b s a g ) 进行定量测 定，线性检测范围为0 0 5 , - - 3 0 5n g m l ，检出限为0 0 1 6n g m l 。 关键词：多壁碳纳米管：复合纳米材料：金纳米粒子：二茂铁；生物传感器： a b s t r a c t a b s t r a c t b i o s e n s o r s ，w h i c hw e r ean e wf i e l db a s e do nb i o l o g y ，i a t r o l o g y ，p h y s i c s ， c h e m i s t r ya n de l e c t r o n i ct e c h n o l o g y ，h a v eb e c o m et h em a i na n a l y t i c a lm e t h o d si n c l i n i c a la n db i o c h e m i c a la n a l y s e sa n di no t h e ra r e a ss u c h 嬲e n v i r o n m e n t a lc o n t r o l ， f o o dq u a l i t yc o n t r o le t c w i t ht h e i rp o t e n t i a lu t i l i t ya ss p e c i f i c ，s i m p l ea n dd i r e c t d e t e c t i o nt e c h n i q u e sa n dr e d u c t i o n si ns i z e ，c o s ta n dt i m eo fa n a l y s i s ，b i o s e n s o r s c o n t i n u et ob eav e r ya c t i v ea r e ao fr e s e a r c h t h en a m eb i o s e n s o ri sad e v i c e c o m p o s e do fab i o l o g i c a lr e c o g n i t i o ne l e m e n ta n dat r a n s d u c e r i th a sb e e nr e p o r t e d t h a tt h ec r u c i a la s p e c ti nt h ef a b r i c a t i o no fab i o s e n s o ri st h e d e p o s i t i o n o f b i o r e c o g n i t i o nm o l e c u l e ，s u c ha sa ne n z y m e ，a n t i b o d y ( a n t i g e n ) ，s e q u e n c eo fd n a ， e t c ，i nh i g ha m o u n t sw i t hr e t e n t i o no ft h e i rs p e c i f i ca c t i v i t y f o rt h e s er e a s o n sa l l i n c r e a s i n gn u m b e ro fd i f e r e n ti m m o b i l i z a t i o np r o c e d u r e sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d t h e r e f o r et h es e l e c t i o no ft h ee l e c t r o n i cm e d i a t o r ，t h em o d i f i c a t i o no ft h em e d i a t o r o n t ot h ee l e c t r o d e s u r f a c e ，t h em e t h o d so ft h eb i o r e c o g n i t i o nm o l e c u l e i m m o b i l i z a t i o na n dt h ec o n s t r u c t i o no fan o v e lb i o s e n s o rh a db e e nd e v e l o p e di nt h i s t h e s i sa n dd e s c r i b l e da sf o l l o w s ： 1 i n t h i s a r t i c l e ， ad e t a i l e de l e c t r o c h e m i c a l s t u d y o fan o v e l 6 - f e r r o c e n y l h e x a n e t h i o l ( h s ( c h 2 ) 6 f c ) s e l f - a s s e m b l e dm u l t i w a l l e dc a r b o n n a n o t u b e s - a un a n o p a r t i c l e s ( m w n t s a un p s ) c o m p o s i t ef i l mw a sd e m o n s t r a t e d m w n t s a un p sw e r e p r e p a r e db yo n e s t e pi n s i t u s y n t h e s i su s i n g l i n e a r p o l y e t h y l e n e i m i n e ( p e l ) a sb i f u n c t i o n a l i z i n ga g e n t h s ( c h 2 ) 6 f c ，w h i c ha c t e da st h e r e d o xm e d i a t o r ，w a ss e l f - a s s e m b l e dt o m w n t s a un p sv i aa u - sb o n d t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) ，e n e r g y d i s p e r s i v ex r a ya n a l y s i s ( e d x ) ， f o u r i e rt r a n s f o r m e di n f r a r e da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ( f t i r ) ，u v - v i s i b l ea b s o r p t i o n s p e c t r o s c o p y ，a n dc y c l i cv o l t a m m e t r yw e r eu s e dt oc h a r a c t e r i z et h ep r o p e r t i e so ft h e m w n t s ，a un p s h s ( c h 2 ) 6 f cn a n o c o m p o s i t e t h ep r e p a r a t i o no ft h en a n o c o m p o s i t e w a sv e r ys i m p l ea n de f f e c t i v e l yp r e v e n t e dt h el e a k a g eo ft h eh s ( c h 2 ) 6 f cm e d i a t o r d u r i n gm e a s u r e m e n t s t h ee l e c t r o o x i d a t i o no fa ac o u l db ec a t a l y z e db yf e f c t c o u p l ea sam e d i a t o ra n dh a dah i g h e re l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s ed u et ot h eu n i q u e i a b s t r a c t p e r f o r m a n c eo fm w n t s 儿n p s t h en a n o c o m p o s i t em o d i f i e de l e c t r o d ee x h i b i t e d e x c e l l e n tc a t a l y t i ce f f i c i e n c y ，h i g hs e n s i t i v i t y ，g o o ds t a b i l i t y ，f a s tr e s p o n s e ( w i t h i n3s ) a n dl o wd e t e c t i o nl i m i tt o w a r dt h eo x i d a t i o no fa aa tal o w e rp o t e n t i a l 2 an o v e la m p e r o m e t r i cb i o s e n s o rf o rg l u c o s ew a sd e v e l o p e db ye n t r a p p i n g g l u c o s eo x i d a s e ( g o x ) i nac h i t o s a nc o m p o s i t ed o p e d w i t hf e r r o c e n em o n o c a r b o x y l i c a c i d a m i n a t e d g o l dn a n o p a r t i c l e s m u l t i w a l l c a r b o nn a n o t u b e sn a n o c o m p o s i t e ( m w n t s a un p s f m c g o x c s ) 1 1 1 ee n t r a p p e df e r r o c e n e m e d i a t o rp e r f o r m e d e x c e l l e n tr e d o xe l e c t r o c h e m i s t r ya n dt h ep r e s e n c eo fm n t s a un p si m p r o v e dt h e c o n d u c t i v i t y o ft h e c o m p o s i t e f i l m t h i sm a t r i xs h o w e dab i o c o m p a t i b l e m i c r o e n v i r o n m e n tf o rr e t a i n i n gt h en a t i v ea c t i v i t yo ft h ee n t r a p p e dg o xa n dw a si n f a v o ro ft h ea c c e s s i b i l i t yo fs u b s t r a t et ot h ea c t i v es i t eo fg o x ，t h u st h ea f f i n i t yt o s u b s t r a t e sw a si m p r o v e dg r e a t l y t h er e s u l t i n gg l u c o s eb i o s e n s o rs h o w e dh i g h s e n s i t i v i t y , l o n g t e r mo p e r a t i o n a ls t a b i l i t y , f a s tr e s p o n s et i m e t h el i n er a n g eo ft h e b i o s e n s o rw a sf r o m0 0 1t o2 5m mw 汕ad e t e c t i o nl i m i to f3 6p , m ( s n = 3 ) t 1 1 e a p p a r e n tm i c h a e l i s m e n t e nc o n s t a n t ( ) f o rt h eb i o s e n s o rw a s1 21 m m 3 as i m p l ea n dc o n t r o l l a b l ee l e c t r o d e p o s i t i o nm e t h o di sd e s c r i b e dt of a b r i c a t ea h o m o g e n e o u s c h i t o s a n - f e = o c e n e a u n a n o p a r t i c l e s g l u c o s eo x i d a s e ( c s f c a u n p s g o x ) n a n o c o m p o s i t ef i l m w i t hp o r o u ss t r u c t u r e t h em o r p h o l o g i e sa n d e l e c t r o c h e m i s t r yo ft h en a n o c o m p o s i t ef i l m w e r ei n v e s t i g a t e db yu s i n gs c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y( s e m ) a n de l e c t r o c h e m i c a l t e c h n i q u e si n c l u d i n g e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) a n dc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) ， r e s p e c t i v e l y t h ef e r r o c e n eg r o u p ( f c ) e o v a l e n t l yb o u n d e d c h i t o s a nh y b r i d ( c s f c ) c a ne f f e c t i v e l ya v o i dt h el e a k a g eo f f ea n dr e t a i ni t se l e c t r o c h e m i c a la c t i v i t y f u r t h e r i m m o b i l i z a t i o no fa un p si n t ot h ep o r o u ss t r u c t u r eo ft h ec sm a t r i xe n h a n c e sb o t h t h ec h a r g e t r a n s p o r tp r o p e r t i e so ft h ec o m p o s i t ea n db i o a f f i n i t yt oe n z y m e b i o s e n s o r b a s e do nt h i sc s f c a un p s g o xf i l mh a sa d v a n t a g e so ff a s tr e s p o n s e ，e x c e l l e n t r e p r o d u c i b i l i t ya n dh i g hs t a b i l i t y t 1 1 i ss e n s o rs h o w sal i n e a rr e s p o n s et og l u c o s ei n t h ec o n c e n t r a t i o nr a n g ef r o m0 0 2m mt o8 6 6m mw i t had e t e c t i o nl i m i to f5 6l a ma t as i g n a l t o n o i s er a t i oo f3 t h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yi sa sh i g ha s1 4 3 心m m 1 c m 嘭 t h ep r e s e n tm e t h o do f f e r saf a c i l ew a yt of a b r i c a t eb i o s e n s o r sa n db i o e l e c t r o n i c d e v i c e s i v a b s t r a c t 4 an o v e la m p e r o m e t r i ci m m u n o s e n s o rf o rt h ed e t e c t i o no fh e p a t i t i sbs u r f a c e a n t i g e n ( h b s a g ) h a sb e e nd e v e l o p e db y m e a n so f e l e c t r o d e p o s i t i o n a n d s e l f - a s s e m b l i n gt e c h n i q u e s f i r s t l y ，ap o r o u sn a n o s 眦t u r ec s - f ef i l mw a sf o r m e d b ye l e c t r o d e p o s i t i o n ，t h e na un p sw e r ee h e m i s o r b e do n t ot h ea m i n o - g r o u p so ft h e p o r o u sc s f cc o m p o s i t e s ，a n df i n a l l yh b s a bw a sa d s o r b e do n t ot h es u r f a c eo ft h e b i l a y e ra un p st oc o n s t r u c ta l lh b s a b a un p s c s f ci m m u n o s e n s o r t h e c h a r a c t e r i s t i c so ft h em o d i f i e de l e c t r o d ea td i f f e r e n ts t a g e so fm o d i f i c a t i o nw e r e s t u d i e db yc y c l i cv o l t a m m e t r y ( c v ) a n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y ( e i s ) i na d d i t i o n ，t h ep e r f o r m a n c e so ft h er e s u l t i n gi m m u n o s e n s o rw e r es t u d i e di n d e t a i l t h ep r e s e n ti m m u n o s e n s o re x h i b i t saw i d el i n e a rr a n g ef r o mo 0 5 - 3 0 5 0 5 n g m l “、j ，i t hal o wd e t e c t i o nl i m i to f0 016n g m l a ts i g n a l t o n o i s er a t i oo f3 m o r e o v e r , t h es t u d i e db i o s e n s o re x h i b i t e dh i g hs e n s i t i v i t y , g o o dr e p r o d u c i b i l i t ya n d l o n g - t e r ms t a b i l i t y k e yw o r d s ：m u l t i w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ；n a n o c o m p o s i t e ；g o l dn a n o p a r t i c l e ； f e r r o c e n e ；b i o s e n s o r v 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ：勿磁移签字日期：加驴年19 , - 月确 l 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直昌太堂有关保留、使用学位论文 的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁 盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全 部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究 所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名( 手写) ：2 砒b导师签名( 手写) ：步移 7 签字日期：砌彩年f 月钌珀签字日期：嘟f 月析 第l 章绪论 1 1 生物传感器概述 第1 章绪论 生物的基本特征之一，是能够对外界的各种刺激做出反应，所以生物能感 受外界的各类刺激信号，并将这些信号转换成体内信息处理系统能接收并处理 的信号。在信息社会中，信息处理系统要对自然和社会的各种变化做出反应， 需要通过传感器将外界的各种信息接收下来并转换成信息处理单元( 即计算机) 能够接收和处理的信号。生物传感器是传感器的一种，它是一门由生物、化学、 物理、医学、电子技术等多学科相互渗透而成长起来的高新技术，在生物、医 学、环境监测、食品检测及军事等领域有着重要的应用价值【l 卅。 生物传感器是将生物技术、材料技术、纳米技术、微电子技术等结合起来 形成的新兴高科技产品，它是在化学传感器基础上发展起来的一类特殊的化学 传感器，广泛应用于医学、工农业及其他领域的检测分析【5 。7 】。国际纯粹与应用 化学联合会( 砌p a c ) 对化学传感器的定义为：一种小型化的、能专一和可逆 地对某种化合物或某种离子具有应答反应，并能产生一个与此化合物或离子浓 度成比例的分析信号的传感器。 1 1 1 基本原理 生物传感器是一类特殊的化学传感器，以生物活性单元( 如酶、抗体、核 酸、细胞等) 为生物敏感基元，对目标被测物具有高度选择性的检测器。 1 9 6 7 年，u p d i k e 和h i c k s t l 8 】将葡萄糖氧化酶固定在氧电极表面，研制出世界 上第一支葡萄糖传感器，开创了生物传感器的历史。此后，随着生物、化学、 物理学、医学、电子技术等相关学科的迅速发展，各种类型的生物传感器相继 出现；特别是2 0 世纪8 0 年代以来，生物技术与传感技术的提高与应用，带动了 生物传感器的快速发展。己成为分析化学最为活跃的研究领域之一，也是世界 各国十分重视的一项高新技术。生物传感器一般由生物敏感膜、换能器和信号 处理器三部分组成1 9 1 ( 图1 1 ) 。 第l 章绪论 图1 1 生物传感器的分析过程示意图 生物敏感膜内含有能与目标物进行选择性作用的生物活性组分；换能器则 能敏感捕捉生物活性组分与目标物之间的作用过程，并将其表达为可检测的物 理信号。当待测物与具有分子识别作用的通过特殊技术固定在换能器内( 或表 面) 的生物活性因子作用时，产生电化学、光学、热学、压电学等响应信号， 其大小与分析物含量或浓度存在定量关系，从而实现对待测物质的定量检测。 生物敏感膜是生物传感器的关键部件，由膜基质和敏感材料组成。可做敏感材 料的生物材料有：酶、抗原( 抗体) 、微生物、生物组织、细胞和d n a 。由于 待测物与生物组分之间产生可逆识别，因此，传感器在保持生物敏感组分有效 活性情况下，可对同一底物反复多次检测。 1 1 2 生物传感器分类 生物传感器一般可从以下三个角度进行分类：根据信号转换器不同分为： 电化学生物传感器、光学生物传感器、压电生物传感器、半导体生物传感器、 热敏生物传感器、场效应晶体管生物传感器、声波生物传感器等| l o , n 】。根据生物 敏感物质相互作用的类型分为：生物亲和型生物传感器、代谢型生物传感器和 催化型生物传感器。根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质分为： 酶传感器【1 2 】、免疫传感器、微生物传感器、组织传感器【1 3 , 1 4 】、基因传感器等。 1 1 3 生物传感器的特点 生物传感器具有如下优点：( 1 ) 生物传感器是由选择性好的生物材料构成 的分子识别元件，具有良好的敏感性和选择性；( 2 ) 体积小，可实现连续在线 监测；( 3 ) 响应快，样品用量少，可反复多次使用；( 4 ) 传感器连同测定仪 的成本远低于大型的分析仪器，便于推广普及。作为一种新的检测手段，生物 2 第1 章绪论 传感器正迅猛发展，在生物工程、医学与临床、环境检测等领域展现出十分广 阔的前景【15 1 。 1 2 酶传感器 酶是生物体内产生的、具有催化活性的一类蛋白质，对相应底物具有催化 转化能力。酶不仅具有一般催化加快反应速度的作用，而且具有高度的专一性， 即一种酶只能作用于一种或一类物质，产生一定的产物。根据酶的这些特性， 可以将酶固定到电极表面构建电化学生物催化传感器，即酶传感器。酶传感器 的研究经历了三个发展阶段： 第一代酶生物传感器：由固定了酶的非活性基质膜与电化学电极组成。它是 以氧为中继体的电催化，以葡萄糖氧化酶( g o x ) 催化葡萄糖为例： 酶层g o x ( o x ) + 葡萄糖一葡萄糖酸+ g o x ( r e d ) g o x ( r e d ) + 0 2 g o x ( o x ) + h 2 0 2 电极h 2 0 2 _ 0 2 + 2 w + 2 e 以溶解氧为电子介体【1 6 1 7 1 ，可通过氧电极( c l a r k 电极) 测量氧的消耗或过 氧化氢的产生来测定底物的传感器。这种传感器的优点是制作简单，无人工介 体；缺点是：( 1 ) 受溶解氧波动的影响比较大；( 2 ) 测量过氧化氢的电位较高 ( + o 6 0v ，v ss c e ) ，试样中共存的还原性电活性物质给测定带来干扰。该传感 器的灵敏度和选择性相对较差。 第二代生物传感器：利用人为加入电子媒介体来解决传递电子的问题。这 种电子媒介体是具有电催化作用的氧化还原体，在酶与电极之间起到传递电子 的作用。其电子转移机理如下： 酶层g o x ( o x ) + 葡萄糖_ 葡萄糖酸+ g o x ( r e d ) 修饰层g o x ( r e d ) + m ( o x ) _ g o x ( o x ) + m ( r e d ) 电极m ( r e d ) 一m ( o x ) + n e ( m 为电子介体) 介体型酶生物传感器是利用人工合成的电子介体代替溶解氧，电子介体在 酶和电极之间传递电子，通过测量电子介体的电催化信号来测定底物的传感器。 电子介体加强了酶与电极间的电子传递，加速了电极反应，降低了天然氧浓度 的影响，提高了测定的灵敏度；采用氧化还原电位较低的电子介体，可降低工 作电位，减少了还原性物质的影响，干扰少，测量浓度线性范围较宽。但该类 第1 章绪论 传感器也存在缺点，比如电子介体容易流失，电子介体对电极的污染，介体在 酶分子上的修饰会使酶的生物活性有所下降等。因此选择一种合适的电子介体 和改进酶活性物质的固定方法显得尤为重要。 目前，用于生物传感器研究的电子介体分为小分子媒介体和高分子媒介体。 小分子媒介体包括：亚铁氰化钾、二茂铁及其衍生物；染料类如亚甲基绿、亚 甲基蓝、麦尔多拉蓝、靛酚类等；醌及其衍生物；四硫富瓦希( t t f ) 及其衍生 物和导电有机盐等。高分子媒介体主要包括变价过渡金属离子型和有机氧化还 原型等氧化还原聚合物1 8 。2 2 1 ，如锇吡啶聚合物等【2 3 1 。 第三代生物传感器：即无介体传感器 以酶在电极上直接电子转移为基础进行电催化的传感器，电极本身就是电 子的受体( 或供体) ，与氧气或其它媒介体无关，酶与电极之间直接进行电子交 换从而完成催化循环 2 4 。3 1 】。其简单、制作方便，是一种极好的传感器模式。 1 3 免疫传感器 免疫分析是最为重要的生物化学分析方法之一，可用于测定各种抗体、抗 原、半抗原以及能进行免疫反应的多种生物活性物质( 例如激素、蛋白质、药 物、毒物等) 。1 9 9 0 年h e n r y 等将免疫分析应用在传感器上，提出了免疫传感器 的概念【3 2 1 。免疫传感技术是生物传感器的一种，具有分析灵敏度高、特异性好、 使用简便以及成本低等优点。 1 3 1 免疫传感器的定义 将高灵敏度的传感技术与特异性免疫反应结合起来，用以检测抗原抗体反 应的生物传感器称为免疫传感器【3 3 1 。可用于痕量免疫原性物质的分析研究。免 疫传感器能识别较大分子之间的微小差异，具有很强的专一性。免疫传感器的 工作原理和传统的免疫测试法相似，都属于固相免疫测试法，即把抗原或抗体 固定在固相支持物表面，检测样品中的抗原或抗体，不同的是，传统免疫测试 法的输出结果只能定性或半定量地判断，一般不能对整个免疫反应过程的动态 变化进行实时监测。而免疫传感器将抗原( 或抗体) 固定在传感器基体上，通 过传感技术使吸附发生时产生物理、化学、电学或光学上的变化，转变成可检 4 第1 章绪论 测的信号来测定待测分子的浓度。它具有能将输出结果数字化的精密换能器， 不但能达到定量检测的效果，而且由于传感与换能同步进行，能实时监测到传 感器表面的抗原抗体反应。 1 3 2 免疫传感器的工作原理 免疫传感器的的优劣取决于抗体( 或者抗原) 与待测物结合的选择性和亲 和力。抗原( a n t i g e n ，a g ) 是能刺激机体免疫系统产生抗体或致敏淋巴细胞， 又能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的物质。抗体( a n t i b o d y ，a b ) 是机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白，具有高度的特异性， 只能与相应的抗原发生专一反应，其最基本的生物功能是防御外界物质对机体 的侵袭。抗原和抗体结合即发生免疫反应，特异性很高，具有极高的选择性和 灵敏度。 免疫传感器相对于一般免疫检测方法的主要优势在于：它能弥补目前常规 免疫检测方法不能进行定量测定的缺点，且由于传感与换能同步进行，能实时 监测到传感器表面的抗原抗体反应，有利于对免疫反应进行动力学分析。免疫 传感器相对于其它传感器的优势则是：由于免疫抗原和抗体的结合具有很高的 特异性，从而减少了非特异性干扰，提高检测的准确性，且检测范围宽。 1 3 3 免疫传感器的分类 根据是否使用标记物，可将免疫传感器分为标记免疫传感器和非标记免疫 传感器。标记法是采用酶、荧光物质、电活性化合物等进行标记，抗体与抗原 反应过程通过电化学、光学等手段进行检测，同时对浓度信息加以化学放大( 如 酶标记) ，实现对目标物的高灵敏检测。该类传感器的原理主要有夹心法和竞 争法。非标记法是在抗体与其相应抗原识别结合时直接转变成可测信号。这类 传感器在结构上可进一步分为结合型和分离型两种。前者是将抗体或抗原直接 固定在传感器表面上，传感器与相应的抗体或抗原发生结合的同时产生可测信 号；后者是用抗体或抗原制作抗体膜或抗原膜，当其与配基反应时，膜电位( 或 其他物理参数) 发生变化，测定膜电位的电极与膜是分开的。根据转换信号的 不同，免疫传感器又可以分为光学免疫传感器、电化学免疫传感器、压电免疫 传感器及表面等离子共振型免疫传感器。 第1 章绪论 电化学免疫传感器是将免疫测定法与高灵敏的电化学传感技术相结合而构 建的一类新型生物传感器，应用于痕量免疫原性物质的分析研究。将抗体或抗 原固定在电极表面，通过传感技术使吸附发生时产生电学的变化，转化成可检 测的电学信号来测定环境中待测分子的浓度【3 4 】。电化学免疫传感器具有可实现 在体检测，不受样品颜色、浊度的影响( 即样品不需处理，不需分离) ，且需要 的仪器相对简单等优点，具有良好的发展前景。 根据测量信号的不同，电化学免疫传感器分为电流型【3 5 。7 1 、电位型【3 8 ，3 9 】及电 容型等免疫传感器。 ( 1 ) 电流型免疫传感器 电流型免疫传感器是在在恒定电压下监测由于抗原抗体结合或继后反应中 电流的变化。由于抗原抗体生物分子本身不具备电活性，电流型免疫传感器一 般需要标记，标记物有酶和电活性物质两种。 以a f p 测定为例，利用酶的放大作用，可获得极高的灵敏度。a f p 传感器 在1 0 一1 0 j 2 9 - m l d 范围内有定量关系。方法是将抗原固定在氧电极表面，测定 时在待测的a f p 溶液中加入己知浓度经标记过氧化氢酶的a f p 溶液，一旦遇到 a f p 抗体时，待测的a f p 抗原与标记的抗原就在电极上产生与抗体结合的竞争 反应，最后达到一定的比例，然后将电极取出用水洗干净，再放入含过氧化氢 酶活性物质的溶液中，由于标记的酶能催化过氧化氢分解而产生氧，氧的增加 使传感器电流值增大，从电流的增加速度或最大变化量可求出标记酶的量，即 结合于膜上标记a f p 的量。便可推算出被测非标记a f p 抗原的量1 4 。r u q i ny u 实验小组制作了c 3 电流型免疫传感器，该免疫传感器把c 3 抗体固定在溶胶- 凝 胶修饰电极上，并与待测溶液中的c 3 h r p 和c 3 竞争反应，从而达到检测抗体 c 3 的目的。此外，用酶联免疫吸附试验及多功能电流免疫传感器还先后检测 了茶碱、载脂蛋白e 、促卵泡激素等人体血清中的生物活性物质，为传感器在医 学领域的应用拓宽了道路。 ( 2 ) 电位型免疫传感器 1 9 7 5 年j a n a t a 首次描述了用电位测量来检测免疫化学反应，这种免疫测量 原理是先通过聚氯乙烯膜将抗体固定在金属电极上，然后用相应的抗原与之特 异性结合，抗体膜中的离子迁移率随之发生变化，从而使电极上的膜电位也相 应发生改变。膜电位的变化值与待测物的浓度存在对数关系，因此，根据电位 变化值即可求出待测物浓度。但这种传感器灵敏度较低，故未得到实际应用 4 2 1 。 6 第1 章绪论 2 0 世纪8 0 年代，r e e h n i t z l 4 3 】等将商业上取得成功的离子选择性电极、p h 电极或 气敏电极引入到电位型免疫传感器中，使灵敏度得以改进。如将c 0 2 气敏电极 用于抗生素、人体i g g 和地高辛抗体等。y u a nr u o 小组】报道了纳米金修饰玻 碳电极用于固载抗体的电位型白喉类毒素免疫传感器，该传感器利用纳米材料 大的比表面积及良好的生物兼容性，增大固定在电极上的抗体量，并使抗体保 持良好的生物活性，从而提高了传感器的灵敏度。 ( 3 ) 电容型免疫传感器 电容型免疫传感器是一种高灵敏非标记型免疫传感技术。金属电极与电解 质溶液接触时，在电极溶液的界面上存在双电层。蛋白质分子是一类分子量大 极性小的生物大分子，吸附到电极表面会显著降低电极溶液界面的电容。电容 型免疫传感器是基于将抗体固定在电极表面，当抗原抗体在电极表面复合时， 界面电容相应降低，