（病原生物学专业论文）粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在巴斯德毕赤酵母中的表达研究.pdf

粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在巴斯德毕赤酵母中的表达研究摘要目的：通过具有创新性的基因工程手段获得粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( g m c s f ) 基因，并将其按照酵母偏爱密码子优化，消除自然序列中存在的发夹结构，然后导入巴斯德毕赤酵母表达系统，使其诱导表达，获得具有生物活性且具有一定经济价值的g m c s f 。方法：首先从人体基因组克隆得到h g m c s f 全基因，然后通过采用引物5 端加长法克隆了含1 2 7 个编码氨基酸的h g m c s f ，在引物克隆过程中对该基因做了局部的密码子优化。最后通过高保真t a q 酶扩增和e c o r i 单酶切的方法将该基因整合进毕赤酵母分泌型表达载体p p i c 9 k ，通过电击转化和甲醇诱导筛选，最终获得一株摇瓶水平粗蛋白表达量达3 8 9g 1 的转化子。结果：p c r 、s d s p a g e 与w e s t e r a nb l o t t i n g 免疫杂交证实h g m - c s f 活性正常。s d s p a g e 电泳发现所表达的h g m c s f 均发生了糖基化，通过n 糖苷酶f 去糖基化也证实了这点。结论：本研究成功构建了可高效表达、有效分泌h g m c s f 的重组毕赤酵母工程菌，提供了条产量高、分离纯化简便，可低成本大规模生产h g m c s f 的新途径。为实现h g m c s f 生产的产业化奠定了基础。硕士研究生张玉军( 病原生物学)指导教师王斌教授关键词：人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子；引物5 端加长法；人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子基因；毕赤酵母；分泌表达e x p r e s s i o no fh g m c s fi nt h ep i c h i ap a s t o r i sa b s t r a e to b j e c t i v e ：t og e tp i c h i ap a s t o r i sw h i c he x p r e s st h ea c t i v i t yh g m c s e h g m c s fg e n ew a si n t e g r a t e di n t oy e a s ta c c o r d i n gt ob i a sc o d o no p t i m i z a t i o n m e t h o d s ：h g m c s fg e n ew a so b t a i n e db yb e i n gc l o n e df r o mh u m a mg e n e ，c o d eg e n eb e i n gc l o n e df r o mt h eh u m a ng e n o m eb yt h ep r i m e r - 5 e x t e n s i o n ，a st h es a m et i m et h a tc o d eh a db e e no p t u m i z e dp a r t l yt og e n ei nt h ec l o n e dp r o c e s s i o n i tw a si n t e g r a t e di n t ot h eg e n es e c r e t e dp i c h i ap a s t o r i se x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 ka n dt h em c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 k c s fw a so b t a i n e d p i c h i ap a s t o r i ss t a i ng s115 p p i c 9 k c s fw a sc o n s t r u c t e db yt r a n s f e r i n gt h ee x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 k - c s fi n t op i c h i ap a s t o r i sg s115c o m p e t e n tc e l l sv i ae l e c t r o p o r a t i o nm e t h o d u n d e rt h ei n d u c t i o nb ym e t h a n o l ，t h ee x p r e s s e dm o n e l l i nw a ss e c r e t e di n t om e d i u ma tt h el e v e lo f3 8 9 9 l r e s u l t ：p c r , s d s p a g ea n dw e s t e r nb l o t t i n gc o n f i r m e dh g m c s fg e n ew a si n t e g r a t e di n t ot h ey e a s tg e n o m ea n de x p r e s s i o nw a ss u c c e s s f u l e x p e r i m e n t si nv i v os h o w e dt h a tm i c ee x p r e s s i o no fh g m c s fi nm i c ew a sa c t i v i t yn o r m a l s d s - p a g ee l e c t r o p h o r e s i sr e v e a l e dt h a tt h eh g m - c s fe x p r e s s i o nh a do c c u r r e di ng l y c o s y l a t i o n ，n g l y c o s i d a s eft og l y c o s y l a t i o na l s oc o n f i r m e dt h i sp o i n t c o n c l u s i o n ：t h es t u d ys h o wt h a tp i c h i ap a s t o r 括o fh g r n c s fi nh i g he x p r e s s i o nh a db e e ns t u c t u r e d ，p r o v i d i n gt h en e ww a yt op r o d u c e ，t od i s t i l la n dt ol o w e rt h ec o s t i tm a k e st h ef o u n d a t i o nf o rt h ei n d u s t r i a l jz a t i o n g r a d u a t es t u d e n t ：y u j u n z h a n g ( p a t h o g e nb i o l o g y )d i r e c t e db yp r o f w a n gb i nk e yw o r d s ：h u m a ng r a n u l o c y t e - m a c r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r lp r i m e r - 5一e x t e n s i o n th u m a ng r a n u l o c y t e - m a e r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o rg e n e sp i c h i ap a s t o r i s ；s e c r e t i o ne x p r e s s i o n学位论文独创性声明学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究戏果。文中依法引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的切责任和后果。论文作者签名：矛乙& 罕日期：州年斗月日学位论文知识产权权属声明本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛大学。本学位论文属于：保密口，在年解密后适用于本声明。，不保密囱。( 请在以上方框内打“4 )用)论文作者签名：岛强罕日期：朋年牛月日导师签名：壶浓l日期：2 d 。7 年4 月f 7e t( 本声明的版权归青岛大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使4 7引言引言人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子( h u m a ng r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o r , h g m c s f ) 属于造血生长因子，主要由t 细胞和巨噬细胞产生，能诱导粒细胞前体和巨噬细胞前体细胞呈集落性生长( 即形成集落) 。该因子是从人白血病细胞系m o 或人t 淋巴细胞系t 7 中克隆得到的，是第一个被克隆和利用重组d n a 技术生产的造血刺激因子，在造血调控和免疫调节中发挥重要作用【l l 。h g m c s f 能诱导早期红细胞、巨核细胞、嗜酸性粒细胞前体细胞的增殖，增强中性粒细胞的细胞毒作用，主要用于治疗骨髓发育不全综合症、再生障碍性贫血、艾滋病、肿瘤放疗和化疗引起的粒细胞减少、辅助骨髓及外周血液细胞移植等，在促进粒细胞恢复方面疗效显著，具有一重要的临床应用价值f 2 j 。巴斯德毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) 表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一p j 。它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包含体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷；弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂，表达水平低，产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处【4 】。因此，本研究利用毕赤酵母表达某些药用蛋白的研究是近几年研究的热点，我们利用世界上最优秀的表达菌株巴斯德毕赤酵母来完成对肿瘤治疗和化疗后白细胞增生具有重要作用的g m c s f 合成是有重要意义的。：本研究打破传统的r n a 逆转录获得c d n a 或通过人工合成的方法，采用加长引物57 端的方法剔除基因内含子，将各外显子连接成完整的基因。此方法将为我国基因工程中获得完整高等真核基因提出一条可供参考的新途径。青岛大学硕士学位论文1 1 材料1 1 1 菌种和质粒第一章材料与方法( 1 ) 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) d h 5 a 为本校生化实验室保存：( 2 ) 毕赤酵母( p i c h i ap a s t o r i s ) g s l l 5 ( h i s m u t + ) 由山东大学微生物国家重点实验室庄国强教授惠赠；( 3 ) p u c l 9 为本校生化实验室保存；( 4 ) p p i c 9 k 由山东大学微生物国家重点实验室庄国强教授惠赠。1 1 2 实验动物及新鲜血液( 1 ) 普通级小白鼠4 0 只，体重1 8 2 2g ，3 4 周龄，购自山东新华制药厂动物房；( 2 ) 新鲜血液取自山东万杰医学院生物化学教研室王红艳老师。1 1 3 培养基( 1 ) l b 培养基：5 酵母提取物，1 0 胰蛋白胨，1 0 n a c l ，p h 7 0 ；( 2 ) y p d 培养基：1 酵母提取物，2 胰蛋白胨，2 葡萄糖；( 3 ) r d b 固体培养基：1m o l 1 山梨醇，1 葡萄糖，1 3 4 y e a s tn i t r o g e nb a s ew i t ha m m o n i u ms u l f a t ew i t ha m i n oa c i d s ( y n b ) ，0 0 0 0 0 4 b i o t i n ，0 0 0 5 谷氨酸，o 0 0 5 甲硫氨酸，0 0 0 5 赖氨酸，o 0 0 5 亮氨酸，0 0 0 5 异亮氨酸，1 5琼脂；( 4 ) m m 固体培养基：1 3 4 y n b ，0 0 0 0 0 4 b i o t i n ，o 5 甲醇，1 5 琼脂；( 5 ) m d 固体培养基：1 3 4 y n b ，0 0 0 0 0 4 b i o t i n ，2 葡萄糖，1 5 琼脂：( 6 ) b m g y 培养基：1 酵母提取物，2 蛋白胨，1 0 0m m o l l 磷酸缓冲液( p h6 0 ) ，1 3 4 、b ，0 0 0 0 0 4 b i o t i n ，1 甘油( v ，) ；( 7 ) b m m y 培养基：除以o 5 甲醇代替甘油，其余成份相与b m g y 相同。1 1 4 试剂及仪器( 1 ) 限制性内切酶、碱性磷酸酶、连接酶等购自b i o l a b s 公司( 2 ) t a qp l u sd n a 聚合酶购自上海生物工程公司：( 3 ) 山羊抗兔i g g a p 、n b t b c i p 染色试剂盒购自华美生物工程公司：+2第一章材料与方法( 4 ) t e m e d 购自b i o r a d 公司；( 5 ) 其他化学试剂均为国产分析纯：( 6 ) 蛋白电泳仪为北京六一厂产品，蛋白电转膜仪为美国b i o r a d 公司产品。( 7 ) 紫外分光光度仪l a m b d ab i o4 0 ，为p e 公司产品。1 1 5 引物本实验中克隆及所用到的引物如表1 1 。表1 - 1 克隆所用到的引物引物名称序列外显子1 上外显子l 下外显子2 上外显子2 下外显子3 上外显子3 下外显子4 上外显子4 下引物5引物65 g a ct a ag c t t g cg c cg g g c c gg 3757 c t g t t t c a t t c a t c t c a g c c l g c c l g t g t c 3 57 g c g g c t g a g a t g a a t g a a a c a g t a g a a g 3757 g g t c g g c t c c t g g a g g t c a a a c a t t t c 37：57 g 1 1 t g a c c t c c a g g a g c c g a c g t g c c 3 57 c a g g a c l g t t t c c g g g g 畅g g c g g g c a g 3 57 c c 7 a c c c c g g a a a c 6 t c c t g t g cg _ a c t c 3 5 乇t c a g a a t t c t c a c t c c t g g 3757 g c g c c g g g c c g g t c g c c 3 使用前将57 磷酸化同外显子4 下，1 2 方法1 2 1 人基因组d n a 的获得利用葡聚糖悬浮法分离新鲜抗凝全血中的白细胞1 5 j 。然后用p h8 0 的t e s 溶液( 1 5r e t o o l 1t r i s h c i + 1 5r e t o o l 1e d t a + 1 5m m o l ln a c i ) 5m l 悬浮白细胞，加蛋白酶k 2 5 0 3 5 0l a g ，1 0 s d s2 6 0g l ，充分混匀，置3 7o c 过夜。冷却至4o c ，加等体积碱s 饱和酚，充分混匀，4o c3 0 0 0r p m 离心3 0m i n ，吸取上层溶液移至另一离心管，加等体积t r i s 饱和酚，重复上一步。加等体积氯仿异戊醇充分混匀，4o c3 0 0 0r p m 离心5m i n ，多重复几次直至组蛋白清除干净。吸取上层溶液至2 5 倍体积冷纯乙醇中，轻摇至d n a 析出，4o c1 2 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，去除上清液，沉淀用7 0 乙醇冲洗2 次，冷干，用无菌超纯水溶解。3青岛大学硕士学位论文1 2 2 质粒d n a 的小量提取1 2 2 1 所涉及溶液的配制( 1 ) s o l u t i o n( 2 ) s o l u t i o ni ：5 0m m o l2 5m m o l1 0m m 0 1i i ：o 2m 0 11 葡萄糖碱s c le d t an a o hs d s使用前现配现用( 3 ) s o l u t i o ni h ：每1 0 0m l 含5m o l 1k a c冰乙酸蒸馏水( p h8 0 )( p h8 0 )6 0 0m l1 1 5m2 8 5m l( 4 ) 无d n a 酶的r n a 酶：将1 0 0m gr n a 酶粉剂溶于1 0m m o l t r i s c i ( p h7 5 ) 、1 5m m o ln a c l 中，定容至1 0m l ，配成1 0m g m l 的浓度，于1 0 0o c 加热1 5 分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于2 0o c 。( 5 ) t eb u f f e r ：10m m o lt r i s c i( p h8 0 )1 m m o le d t a( p h8 0 )1 2 2 2 提取操作步骤( 1 ) 挑取单菌落于5m l 带有相应抗生素的液体l b 培养基中，于3 7o c 、2 5 0 r p m振荡培养过夜；( 2 ) 将1 5m l 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 。c 、1 2 0 0 0r p m 离心1 分钟，吸弃上清( 可重复一次) ；( 3 ) 向离心管中加入1 0 0l a l 用冰预冷的s o l u t i o ni ，用旋涡振荡器重悬沉淀；( 4 ) 加入2 0 0g l 新配制的s o l u t i o ni i ，盖紧管口，快速颠倒离心管5 次，冰上放置5 分钟；( 5 ) 加入1 5 0 t l 用冰预冷的s o l u t i o ni l l ，轻轻混匀，冰上放置3 5 分钟；( 6 ) 用微量离心机于4o c 、1 2 0 0 0r p m 离心5 分钟，将上清转移到另一离心管中；( 7 ) 加等体积酚、酚：氯仿( 1 ：1 ) 、氯仿抽提，振荡混匀，用微量离心机于4o c 、4第一章材料与方法1 2 0 0 0r p m 离心2 分钟，将上清转移到另一离心管中；( 8 ) 向上清中加入2 倍体积的无水乙醇，混匀后，于室温放置2 分钟；( 9 ) 用微量离心机于4 。c 、1 2 0 0 0r p m 离心5 分钟，弃上清，用7 0 乙醇洗涤1 2 次，沉淀于空气中干燥1 0 分钟；用适量t eb u f f e r 溶解质粒d n a ，加入1p l1 0m m lr n a 酶，3 7o c 处理1 小时后使用或于2 0o c 贮存。1 2 3 质粒d n a 的大量制备：( 1 ) 挑取单菌落接种于2m 1 加有相应抗生素的液体l b 培养基，3 7o c ，2 5 0r p m振荡培养过夜。( 2 ) 1 接种量转接到1 0 0m l 加有相应抗生素的液体l b 培养基，3 7o c ，2 5 0r p m振荡培养1 2 1 6 小时。( 3 ) 于4o c 以5 0 0 0r p m 离心5 分钟，收集菌体。( 4 ) 用5 0m l 冰预冷的s t e 溶液洗菌体。s t e 溶液：0 1m m o u ln a c l1 0m m o u lt f i s - c i ( p h8 0 )1m m o l 1e d t a ( p h8 0 )( 5 ) 用5r n l 冰预冷的s o l u t i o ni 悬浮菌体，旋涡振荡使菌体分散。( 6 ) 加入1 0m l 新配制的s o l u t i o n i i ，轻轻混匀，室温放置1 0 分钟。( 7 ) 再加入7 5m l 冰预冷的s o l u t i o n l i i ，温和混匀后冰浴15 分钟。( 8 ) 于4o c 以1 2 0 0 0r p m 离心1 0 分钟，将上清液转移至新管，加0 6 倍体积的异丙醇，室温沉淀1 0 分钟。( 9 ) 于4o c 以1 2 0 0 0 r p m 离心l o 分钟收集沉淀，用7 0 的乙醇洗涤沉淀，冷冻抽干后溶于2m lt e 缓冲液，加入1 0 “lr n a a s e ( 1 0m g m 1 ) ，3 7o c 消化1 小时。( 1 0 )分装至1 5m l 微量离心管，每管5 0 0 山。然后分别用酚、酚：氯仿( 1 ：1 ) 、氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 各抽提一次，4o c 以1 2 0 0 0r p m 离心5 分钟，将上清液转移至新管。( 11 )加入1 1 0 体积的3m o l 1n a a c ( p h5 2 ) 、2 倍体积的无水乙醇，- 7 0o c 沉淀d n a 半小时。( 1 2 )于4o c 以1 2 0 0 0r p m 离心1 0 分钟，收集沉淀，7 0 乙醇洗一次沉淀，冷冻抽干后溶于1 0 0 “lt e 溶液，紫外扫描定量。1 2 4d n a 的限制性酶切反应( 1 ) 在一灭菌的微量离心管中，加入以下成分：5青岛大学硕士学位论文q ao 2 1 0u g1 0 x 限制酶缓冲液2u l限制性内切酶1 2u超纯水xr t l总体积2 0l 1( 2 ) 轻弹管外壁以混匀反应物，置于酶反应适当温度并按所需时间进行温育。反应完成后，可直接进行凝胶电泳分析或进行其它操作。1 2 5 目的d n a 片段的电泳回收1 , 2 5 1 冻融法( 用于大量回收)( 1 ) 用刀切下含有目的片段的胶块，置于一个1 5m l 微量离心管中；( 2 ) 加入2 0 0g l i r i s 饱和酚( 胶块如很小可加1 0 10 0g lt eb u f f e r ) ；( 3 ) 用液氮反复冻融3 5 次，每次3 分钟，然后于12 0 0 0r p m 离心1 0 分钟，取上层水相继续用氯仿抽提后，乙醇沉淀备用。1 2 5 2 d n a 回收k i t 法( 博大公司生产，用于小量回收)( 1 ) 用刀切下胶块，置于一个1 5m l 微量离心管中；( 2 ) 加入3 0 0p , l 溶胶b u f f e r ( 约是胶块体积的3 倍) ，室温或5 0o c 溶解胶块；( 3 ) 加1 0 山玻璃奶混匀后置于冰上，每2 3 分钟混匀一次，1 0 分钟后1 2 0 0 0r p m离心3 0 秒，弃上清；( 4 ) 用2 5 0l a lw a s h i n gb u f f e r 重悬沉淀( 用加样器轻柔地冲散混匀) ，12 0 0 0r p m离心3 0 秒，吸弃上清；重复洗涤2 次；( 5 ) 置于3 7o c 温箱干燥1 5 2 0 分钟；( 6 ) 加1 0 3 0 l 无菌超纯水或t eb u f f e r ，混匀后，6 0o c 水浴5 分钟：( 7 ) 7 ) 1 2 0 0 0r p m 离心1 分钟，回收上清备用。1 2 6 外源d n a 连接( 1 ) 在一灭菌的微量离心管中，加入0 1p g 载体d n a 及等摩尔量的外源d n a ；( 2 ) 加适量超纯水，再加入1p 11 0 t 4d n al i g a s eb u f f e r 和1w e i s s 单位的t 4d n al i g a s e ( m b i 公司产品) ，使总体积为1 0 山；混匀后，于1 6o c 连接过夜。6第一章材料与方法1 2 7 大肠杆菌感受态细胞的制备( 1 ) 取大肠杆菌d h 5 0 【_ 单菌落接种于5m ll b 液体培养基( 不含抗生素) ，于3 7o c 、2 5 0r p m 振荡培养过夜；( 2 ) 取l m l 过夜培养物按1 ：1 0 0 的稀释比例倒入1 0 0 m ll b 液体培养基中，3 7o c振荡培养2 4 小时，待细菌达到对数生长期( o d 6 0 0 为o 5 0 6 ) ：( 3 ) 将培养液转移到两只预冷的5 0m l 无菌离心管中，置冰上1 0 分钟，使菌液冷却到0o c 。于4o c 、5 0 0 0r p m 离心5 分钟，弃上清；( 4 ) 每只离心管加入1 0m l 冰冷的o 1m o l 无菌c a c l 2 将茵体重悬，冰浴放置3 0分钟，于4o c 、5 0 0 0r p m 离心5 分钟，去上清；( 5 ) 每只离心管各加入1 7m l 冰冷的o 1t o o lc a c l 2 重悬沉淀，再加入3 0 0 “l 无菌甘油混匀后，按每管2 0 0p 1 分装于无菌1 5m l 微量离心管中，置7 0o c 保存备用。1 2 8 质粒d n a 转化大肠杆菌( 1 ) 用无菌吸头取1 0 0g l 感受态细胞到预冷的1 5m l 微量离心管中，加入待转化的d n a1 0 1 0 0n g ，轻轻混匀，冰上放置3 0 分钟；( 2 ) 将离心管放到4 2o c 循环水浴中热激9 0 秒；( 3 ) 快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却；( 4 ) 每管加8 0 0 ll b 液体培养基，3 7o c 预表达培养4 5 分钟；( 5 ) 取5 0 、1 0 0 、2 0 0l a l 上述培养物分别转移到含相应抗生素的l b 固体培养基上( 如要检测u 互补，可在菌液中加入适量的x g a l 和i p t g ) ，用一无菌的涂布器将菌液均匀涂满整个平板表面；( 6 ) 将平板置于3 7o c ，约2 小时后液体被吸收，倒置平板，于3 7o c 培养1 2 1 6小时后可出现菌落。1 2 9 转化子的快速筛选( c r a c k i n gs c r e e n )2 c r a c k i n gb u f f e r ：1 0i t i o ln a o h l0 5m o le d t a 1 ( p h8 o )s d s溴甲酚绿甘油75 0m l1 om l0 5gx 山5 0 m l青岛大学硕士学位论文定容5 0m l( 1 ) 挑单菌落划线，3 7o c 培养过夜；( 2 ) 用无菌牙签挑取少许菌落抹于1 5m l 微量离心管底部，加1 0p l 超纯水，振荡悬浮，加入1 0p l2 c r a c k i n gb u f f e r ，室温下反应5 分钟；( 3 ) 经琼脂糖凝胶电泳分离，找出比载体对照大的克隆。( 由于反应物粘稠，不好上样，可以采用干点样的方法) 。1 2 1 0 毕赤酵母感受态细胞的制备( 1 ) 挑取毕赤酵母受体菌g s l1 5 ( h i s ，m u t + ) 的单菌落接种于1 0m ly p d 液体培养基中，3 0o c 摇床培养过夜，( 2 ) 再以1 的接种量转接于1 0 0m ly p d 培养基中，3 0o c 培养至o d 6 0 0 = 1 3 1 5 。( 3 ) 4o c5 0 0 0r p m 离心5m i n ，弃去上清，( 4 ) 用1 0 0m l 冰预冷的无菌水将菌体重悬，4o c5 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，弃去上清，( 5 ) 用5 0m l 冰预冷的无菌水将菌体重悬，4o c5 0 0 0r p m 离心1 0m i n ，( 6 ) 再用2 0m 1lm o l l 山梨醇洗涤1 次，溶于2 0 0g l1m o l d 冰预冷的山梨醇中，以备转化。1 2 1 1 酵母的电击转化及重组子的初筛因毕赤酵母表达载体为整合型载体，电击转化之前载体需作线性化处理。用不同的酶切p p i c 9 k c s f ，转化宿主g s l l 5 ( h i s m u t + ) 会引发不同位点和方式的整合，产生不同表型的转化子，如下表1 2 所示。表1 - 2 酵母的转化插入位点( 1 ) 用b g l l i 酶切重组表达质粒p p i c 9 c s f ，使质粒线性化，( 2 ) 取8 0p l 感受态细胞与线性化质粒( 1 5p g ) 混合后转移到冰预冷的0 2c m 电击杯中，电击转化酵母感受态细胞( 2 5k v ，5m s ) ，8第一章材料与方法( 3 ) 立即向电击杯中加入1m l 冰冷的1m o l 1 山梨醇，混匀后，以每板2 0 0u l菌液涂布到r d b 平板上，( 4 ) 3 0 。c 培养至长出转化子。1 2 1 2 酵母重组子甲醇利用型的确定( 1 ) 用无菌牙签挑取上面筛选到的重组子分别点种m m 平板和m d 平板，同时点种对照菌株g sll5a l b u m i n ( h i s 4 十m u t s l 和g sll51 3 g a l ( h i s 4 + m u t + ) 。( 2 ) 在m m 和m d 上生长一致的，其表型为m u t 十。( 3 ) 在m d 上生长正常，在m m 上生长缓慢或不长的，其表型为m u t 5 。1 2 1 3 酵母重组子的直接p c r 检测( 1 ) 挑取新鲜培养的重组子菌落悬浮于1 0 山无菌水，( 2 ) 加5 山5u i t l 酵母裂解酶，3 0o c 温育1 0m i n ，( 3 ) 然后液氮冷冻lm i n ，作为模板，( 4 ) 5 0p lp c r 反应体系：l o x 扩增缓冲液( 内含1 5m mm 9 2 + )5 山d n t p ( 4 种d n t p 混合物1 0m me a c h )1 山引物5 ( 1 0p m o l 1 d )3p l引物6 ( 1 0p m o l 山)3 山模板d n a3p l无菌水3 4 5 山总体积4 9 5 山( 5 ) 反应混合液9 4o c 变性5m i n ，加入3 ut a qd n a 聚合酶，( 6 ) 扩增条件：1 、9 5 0 c l m i n ，5 5 0 c 退火l m i n ，7 2 0 c 延伸l m i n ，重复3 0 个循环；2 、7 2o c 延伸7m i n( 7 ) 1 的琼脂糖凝胶电泳检测p c r 结果。1 2 1 4 酵母总d n a 的提取( 1 ) 分别用1 0m lm d ，m d h ，3 0 。c 培养重组菌和受体菌( g s l1 5 ) 到o d 6 0 0 = 5 1 0( 约1 2 小时) ，5 0 0 0r p m 室温1 0 m i n 离心收集细胞，用1 0m l 无菌水洗涤菌体一次。( 2 ) 将细胞沉淀重悬于新配制的2m ls c e dp h7 5 缓冲液 s c e d ：1m l o l 山梨醇，1 0m m l o l 柠檬酸钠( p i a7 5 ) ，1 0m m l o 1e d t a ，1 0m m l o 1d t t ，加9青岛大学硕士学位论文o 3m g 消解酶混匀3 7o c 温育5 0 m i n 。( 3 ) 加2m l1 s d s 将管倒置数次混匀内容物，在冰上放置5m i n ，操作应尽可能温和小心，加入1 5m l5m l o 1 乙酸钾( p h8 9 ) ，轻柔混匀。1 2 0 0 0r p m4o c1 0m i n 离心。弃沉淀取上清。( 4 ) 上清中加2 倍体积无水乙醇，室温静置1 5m i n ，1 2 0 0 0r p m4o c2 0m i n 离心取沉淀。( 5 ) 沉淀重悬于0 7 m lt e ( p h7 4 ) ，轻柔溶解后转至1 5 m l 离心管中。( 6 ) 酚：氯仿( 1 ：1 ) ，氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 各抽提次离心取水相。( 7 ) 将水相等份转移到两个1 5m l 离心管中。加1 2 体积7 5m l o 1 乙酸铵( p h7 5 ) 和2 倍体积的无水乙醇，混匀2 0o c6 0m i n 沉淀。( 8 ) 1 2 0 0 0r p m4o c2 0m i n 离心回收核酸，弃上清用7 0 乙醇洗涤沉淀物，离心弃上清，晾干残留乙醇，每管沉淀重悬于5 0 山t e ( p h7 5 ) 中，2 0o c 保存待用。1 2 1 5 初筛表达h g m c s f 的转化子( 1 ) 挑取在m m 平板上生长缓慢而在m d 平板上生长良好的转化子接种于装有5m lb m g y 培养基的1 5m l 试管，8 层纱布封口。j( 2 ) 于3 0o c 摇床培养4 8h ，5 0 0 0r p m 离心，弃去上清，( 3 ) 用1m lb m m y 培养基重新悬浮菌体，在3 0o c 诱导培养4 8h ，( 4 ) 离心取5 0 山上清，加等体积2 s d s p a g e 加样缓冲液，( 5 ) 沸水煮3 5m i n ，( 6 ) 1 2 0 0 0r p m ，离心1 0m i n ，：( 7 ) 取1 0 山，用1 5 的s d s p a g e 检测上清中g m c s f 的表达，筛选出表达量高的转化子。1 2 1 6 摇瓶水平各转化子的表达( 1 ) 选取初筛g m c s f 表达水平较高的转化子，观察其在摇瓶水平g m c s f 的表达。( 2 ) 将上述转化子单菌落接种于含1 0m lb m g y 培养基的1 0 0m l 三角瓶中，3 0o c2 5 0r p m 培养4 8h 后，离心弃去b m g y 培养基，( 3 ) 加入1 0m lb m m y 甲醇诱导培养基，3 0o c2 5 0r p m 诱导培养4 8h 。( 4 ) 每隔2 4h 取一次样，同时补加甲醇使其终浓度维持在0 5 ( v v ) 。1 0第一章材料与方法1 2 1 7h g m c s f 的初步纯化( 1 ) 离心收集发酵上清液，( 2 ) 加硫酸铵至7 0 饱和度，边搅拌边加，至硫酸铵完全溶解，4o q 沉淀过夜，( 3 ) 4 。c1 0 0 0 0r p m 离心收集沉淀，用0 0 1m o l 1 的磷酸钠缓冲液h = 7 2 ) + 2m m o l le d t a 溶解，装于截留分子量为8 0 0 0 的透析袋，用0 0 1m o l 1 的磷酸钠缓冲液4o c 透析约1 2 小时，其间换3 次透析缓冲液。1 2 1 8 考马斯亮蓝法测定蛋白含量标准曲线绘制表1 - 3 蛋白含量标准曲线的绘制、b 0o咖缸皿醐o 20 30 40 50 d5 9 5图1 - 1 考马斯亮蓝法测蛋白含量标准曲线的绘制加如如加如。青岛大学硕士学位论文( 1 ) 取5 0m g 牛血清白蛋白( b s a ) ，溶于5 0m 1 0 1 5m o l 1 氯化钠中，制成1m e d m l标准蛋白溶液。( 2 ) 按表1 3 分别加入不同量的b s a 标准蛋白溶液和0 1 5m o l 1 氯化钠，再加入5 皿考马斯亮蓝g 一2 5 0 溶液，测定o d 5 9 5 的光吸收值，绘制标准曲线。( 3 ) 根据标准曲线绘制结果得出的蛋白含量公式为：蛋白浓度( m g m 1 ) = ( o d 5 9 5 x 1 3 3 4 7 0 5 8 3 6 ) n 1 0o d 5 9 5 ：5 9 5n n l 处光吸收值；n ：稀释倍数；1 0 ：将o 1m l 蛋白稀释中的蛋白含量折算为1m l 中的蛋白含量。1 2 1 9 蛋白质的s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e )1 2 1 9 1 溶液的配制( 1 ) 3 0 丙烯酰胺凝胶母液( 2 9 ：1 )丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺h 2 0 定容( 2 ) 4 分离胶缓冲液t r i s c ls d sp h( 3 ) 4 浓缩胶缓冲液t r i s c ls d sp h( 4 ) 2 样品缓冲液t r i ss d s蔗糖巯基乙醇溴酚蓝h c i 调p h6 8( 5 ) t r i s 甘氨酸电泳缓冲液t r i s1 22 9g1g1 0 0m l1 5m o l 1o 4 8 81 5m o v l0 4 6 80 3 5g1g4 5g0 5g0 0 2 5gh 2 0 定容至2 5m 12 5m m o l l第一章材料与方法( 6 ) 脱色液( 7 ) 染色液1 2 1 9 2 灌胶s d s甘氨酸甲醇冰乙酸h 2 0甲醇冰乙酸h 2 0考马斯亮蓝r 2 5 00 1 2 5 0 m m o l l ( p h 8 3 )4 5 ( v v )1 0 ( v )4 5 ( v v )4 5 ( v )1 0 ( v )4 5 ( v )o 2 5 ( w )( 1 ) 配制1 2 的分离胶溶液h 2 01 6m l3 0 丙烯酰胺母液2 0m l1 5m o l 1t r i s - c 1 ( p h8 8 )1 3m l1 0 s d s0 0 5 m l1 0 过硫酸铵o 0 5m lt e m e d0 0 0 2m l总体积5m l迅速灌胶，留出灌注浓缩胶所需空间，小心用注射器在分离胶上覆盖l 厘米高的水，室温聚合3 0 分钟。( 2 ) 配制2m l 浓缩胶溶液h 2 01 4m l3 0 丙烯酰胺母液0 3 3m l1 5m o l 1 ir i s c i ( p h8 8 10 2 5m ll o s d so 0 2m l1 0 过硫酸铵0 0 2m lt e m e d0 0 0 2m l总体积2m 1在分离胶上灌注浓缩胶，插入梳子，室温聚合4 5 分钟。1 3青岛大学硕士学位论文1 2 1 9 3 样品的处理取1m l 培养液于1 5m l 微量离心管离心收集菌体，5 0 0 x lt e ( p h8 0 ) 洗一次菌体，加入2 0 山h 2 0 和2 0g l2 样品缓冲液悬浮菌体，1 0 0 。c 煮沸3 分钟：于4 。c以1 2 0 0 0r p m 离心1 0 分钟去除细胞碎片，取2i l l 上清上样电泳。1 2 1 9 4 电泳8v c m 电泳至染料前沿进入分离胶，将电压提高至1 5v c m ，继续电泳至染料到达分离胶底部，下胶。1 2 1 9 5 染色、脱色( 1 ) 加至少5 倍体积的染色液浸泡凝胶，放在平缓摇动的摇床上室温染色4 小时以上。( 2 ) 换脱色液，平缓摇动4 8 小时，其间换3 4 次脱色液，脱色后的凝胶可保存于2 0 的甘油溶液中。1 2 2 0w e s t e r nb o l t 鉴定1 2 2 0 1 所需溶液及其配制( 1 ) t r i s 甘氨酸电泳缓冲液2 5m m o l 1t r i s2 5 0m m o l 1 甘氨酸o 1 s d sp h8 3( 2 ) 转膜缓冲液：每1 0 0 0m l 含t r i s甘氨酸甲醇( 3 ) 丽春红s 染色液o 5g1m l加水至1 0 0m l( 4 ) t b s 溶液3 0 3g1 4 4g15ph8 3 8 4丽春红s冰乙酸使用前现配1 0 0 m m o l lt r i s h c l ( p h 7 5 )1 4第一章材料与方法0 9 n a c l( 5 ) t t b s 溶液：含0 1 t w e e n2 0 的t b s 溶液( 6 ) 碱性磷酸酶底物缓冲液1 0 0m m o l 1t r i s h c i ( p h9 5 )1 0 0m m o l 1n a c l5m m o l lm g c l 2( 7 ) b c i p n b t 显迹液6 6l a ln b t 贮存液( 1 4m ld m f ，1 0 0m g n b t ，6 0 0i - t l h 2 0 )1 0m l碱性磷酸酶底物缓冲液3 4 “lb c i p 贮存液( 2m ld m f ，1 0 0m g b c i p )使用前现配，室温1 小时内稳定1 2 2 0 2 操作过程( 1 ) 采用b i o r a d 公司的m i n i b l o t 电转仪进行蛋白质转移。( 2 ) 以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶3 0 分钟：( 3 ) 将转移盒放入一个较大的托盘中，加入足量的能浸没整个转移盒的转移缓冲液；( 4 ) 在塑料转移盒的底边，依次将下面物品组装转印夹层：i s c o t c h b r i t e 垫或海绵：i i 一张如凝胶大小并预先以转移缓冲液湿润的滤纸；i i i 凝胶；i v 用一试管或玻璃棒在凝胶表面缓慢滚动，以排去凝胶和滤纸间的气泡。凝胶朝向滤纸的一面绝对应是凝胶的阴极面( 也就是当放进转移槽时，最终是朝向负极) 。( 5 ) 准备转印膜( p v d f 膜) ，按凝胶大小但各边都比凝胶大约1m l t l 剪膜，成4 5o 地慢慢将凝胶放入蒸馏水中，水将会渗进膜中并湿润整个表面。然后在转移缓冲液中平衡1 0 1 5 分钟后，短暂地在1 0 0 甲醇中放一下，然后再于转移缓冲液中平衡1 0 1 5 分钟；( 6 ) 用转移缓冲液湿润凝胶表面，直接将已湿润的膜放在凝胶顶部( 即阳极面) ，排去气泡；( 7 ) 湿润另一张滤纸，并置于膜的阳极面，排去所有气泡，在滤纸的顶部放另一块s c o t c h b r i t e 垫或海绵；( 8 ) 将转移盒顶部的半面放置适当，扣紧，完成组装；( 9 ) 往转移槽中加入转移缓冲液，按正确的极性方向将转移盒放迸电转仪中：1 5青岛大学硕士学位论文( 1 0 )在冷却条件下1 0 0v 电转膜3 0 , - - 6 0m i n ，或在冷室中1 4v 电转膜过夜；( 1 1 )关闭电源，拆卸转印装置，取出转印膜，并在膜上剪- d , 角或软性铅笔作上标记定位；( 1 2 )膜可待干后用于下一步操作，或放在可密封的塑料袋中保存一年以上( 在进一步操作前，干的p v d f 膜须在小量1 0 0 甲醇中湿润，然后用蒸馏水洗去甲醇) ；( 1 3 )转印膜的可逆染色：室温中将转印膜放入丽春红s 燃料溶液中染色5 分钟，在水中脱色2 分钟，用铅笔标记蛋白质分子量标准的位置所在，然后在水中再浸泡1 0 分钟，使完全脱色；( 1 4 )将膜放入可热密封的塑料袋中，加1 0 0m l 含5 脱脂奶粉的t t b s 溶液( 封闭液) ，密封塑料袋，在旋转摇床上摇动3 0 6 0 分钟；( 1 5 )用t t b s 溶液稀释第一抗体( g n a 晶体蛋白抗体以1 ：1 0 0 0 稀释) ；( 1 6 )打开袋子，倾去封闭液，以稀释的第一抗体工作液代替之，在室温下摇动3 0 6 0 分钟：( 1 7 )带着手套