（分析化学专业论文）分子印迹技术在偶氮染料和蛋白质分子识别上的应用研究.pdf

攘要 摘要 分子印迹技术是制备对特定分子具有专一识别性能的聚合物的技术，分子印 迹聚合物对模板分子的识别具有预定性、专一性和实用性等优点而在生物模拟、 分离提纯、免疫测定以及痕量分析等领域显示出广阔的应用前景。 本文对分子露迹技术，特别是生物大分子的印迹技术进行了一些研究和探 讨，总共分为四个章节。 第一章，文献综述；对分子印迹技术的基本原理、分子印迹聚合物的制备和 应用进行了总述，对分子印迹技术当前存在的问题和未来的发展趋势进行了分析 和展望。 第二章，以a 。甲基丙烯酸为功能单体，在氯仿溶剂中，利用传统的分子印迹 聚合物制各技术，合成了偶氮类分子1 ( 2 毗啶儡氮) 2 萘酚的窜迹聚合物。通过 红铃和紫外光谱等手段对聚合物进行了表征测定，并利用平鬻实验结果研究了聚 合物的吸附特性。 第三章，以0 4 5 岬聚乙烯滤膜为支载膜，丙稀酰胺为功能单体，n ，n 亚甲基 双丙稀酰胺为交联剂，通过表面印迹法制备得到牛血清白蛋白( b s a ) 分子印迹 渗透膜，并研究了其对b s a 分子和类似物牛血红蛋白( b m ) 的渗透性能。结果 表翡，当模板分子、功能单体和交联剂用量分别为0 0 0 4 、0 0 9 6 、0 0 2 0g m l 时， 印迹膜对冒标分子具有良好的识别透过能力。 第四章，通过表面印迹法直接在碳纳米管表蘑会成了具有窜迹麓力的聚合膜， 构成蛋白质分子印迹纳米管( p r o t e i nm o l e c u l a ri m p r i n t e dn a n o t u b e s ，p m i n ) 。实 验表明，相对于无印迹纳米管，由于纳米管具有高比表面积和蛋白质结合位点位 于其表面上，使得p m i n 的结合容量增大，p m i n 表现出了较好的选择识别性能。 研究通过承和s e m 等方法对p m i n 的成分和表面形貌迸行了分析。 关键词：分子印迹技术；表面印迹法；l 一( 2 一吡啶偶氮) - 2 一萘酚；蛋白质；牛血 清是蛋盎；窜迹纳米管；包覆 a b s t r a c t m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dt e c h n i q u e ( m i t ) i san e wm e t h o dt h a tc o n t a i n st a i l o r - m a d e r e c o g n i t i o ns i d e sf o rc e r t a i nm o l e c u l e s i ti sw i t hm a n yc h a r a c t e r i s t i c ss u c h 觞 p r e d e t e r m i n a t i v e ，s p e c i f i ca n dp r a c t i c a la b i l i t i e so fm o l e c u l er e c o g n i t i o n i th a sb e e n e x t e n s i v e l ya p p l i e di nb i o m i m i e s ，p u r i f i c a t i o n , s e p a r a t i o na n de n r i c h m e n tf i e l d s i nt h i sd i s s e r t a t i o n , m i t ，m a i n l yi n c l u d i n gt h ep r o t e i nt e m p l a t ei m p r i n t e dt e c h n i q u e ， w a ss t u d i e d f o u rc h a p t e r sa r ep r e s e n t e di nt h et h e s i s i nc h a p t e rl ，i nt h i sr e v i e ws e c t i o n , t h ep r i n c i p l e so fm i t ，t h ep r e p a r a t i o nm e t h o d s a n dt h ea p p l i c a t i o no fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p s ) w e r es u m m a r i z e d t h e c u r r e n tp r o b l e m so c c u r r e di nm i ta n di t sd e v e l o p m e n tw e r ea n a l y z e da n dp r o s p e c t e d i nc h a p t e r2 ，am o l e c u l a ri m p r i n t e dp o l y m e r , 1 - ( 2 - p y r i d y l a z o ) 一2 一n a p h t h o l ， w a ss y n t h e s i z e d 、析ma - a c r y l i ca c i d ( m a a ) a saf u n c t i o n a lm o n o m e ri nt h ec h l o r o f o r m s o l v e n tb yc l a s s i c a lm o l e c u l a ri m p r i n t e dt e c h n i q u e t h ep o l y m e rw a sc h a r a c t e r i z e db y i ra n du v s p e c t r aa n dt h ee q u i l i b r i u mb i n d i n ge x p e r i m e n t t h ea d s o r p t i v ec a p a b i l i t yo f t h ep o l y m e rw a si n v e s t i g a t e di nt h es t u d y i nc h a p t e r3 ，m i p sw e r ep r e p a r e dw i t ha l b u m i nb o v i n es e r u m ( b s a ) a st e m p l a t e m o l e c u l e ，a c r y l a m i d e 嬲f u n c t i o n a lm o n o m e ra n dn ，n - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d ea s c r o s s l i n k e rb ys u r f a c em i ti nt h ep r e s e n c eo fo 4 5 岬p o l y e t h y l e n ef i l t e rm e m b r a n e ， a n dt h es e l e c t i v ep e r m e a t i o nw a ss t u d i e df o rt h eb s aa n di t sa n a l o g u e sh e m o g l o b i n b o v i n eb l o o d ( h b b ) ah i g h e rp e r m e a t i o ns e l e c t i v i t yt ob s aw a so b t a i n e dw h e nt h e c o n d i t i o nw a ss e l e c t e da sp o l y m e r i z e dc o n c e n t r a t i o no ft e m p l a t em o l e c u l e ，f u n c t i o n a l m o n o m e ra n dc r o s s - l i n k e rw a s0 0 0 4 、0 0 9 6 、0 0 2 0e g m l ，r e s p e c t i v e l y i nc h a p t e r4 ，an e wb s ap r o t e i nm o l e c u l a ri m p r i n t e dn a n o t u b e s ( p m n 0w a s s y n t h e s i z e db yas u r f a c em i to nt h es u r f a c eo fc a r b o nn a n o t u b e s t h es e l e c t i v e r e c o g n i t i o no fp m i nw a se v a l u a t e db ya d s o r p t i o ne x p e r i m e n t s c o m p a r i n gt h e n o n - i m p r i n t e dn a n o t u b e s ( n f m i n d ，t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ep m i ne x h i b i t e d e x c e l l e n tr e c o g n i t i o na n ds e l e c t i v ea b i l i t yt ob s ad u et o l a r g es u r f a c ea r e ao ft h e n a n o t u b e sa n dt h ep r o t e i ni m p r i n t e ds i t e sb el o e a t e da tt h e s u r f a c er e s u l t si nl a r g e p r o t e i nm o l e c u l eb i n d i n gc a p a c i t yo ft h ep m i n m o r e o v e r , t h ec o m p o n e n t so fp m i n h w e r ea n a l y z e db yi ra n di t sc o n f i g u r a t i o n sw e r eo b s e r v e db ys e m k e y w o r d s ：m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dt e c h n i q u e ；s u r f a c em o l e c u l a ri m p r i n t i n g t e c h n i q u e ；1 - ( 2 - p y d d y l a z o ) - 2 - n a p h t h o l ；p r o t e i n ；a l b u m i nb o v i n es e r u m ；i m p r i n t e d n a n o t u b e s ；e n c a p s u l a t i o n m 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在 文中以明确方式标明口本人依法享有和承握由此论文产生的权利 和责任。 声明人( 签名) ： 2 0 0 7 年月 目 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部门或其指定机构送交论文的纸质版和电 子版，有权将学位论文用于非赢利露的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 l 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( ) ( 请在以上相应括号内打“ ) 作者签名： 导师签名： 墨期： 日期： 年月蠢 年月日 第一露翦寓 第一章前言 1 分子印迹技术( m i t ) 概述 1 1 分子印迹技术( m i t ) 的起源 分子在溶液或者气相中是无规则运动着的，每个分子的运动与相邻物种不相 关，即使两个分子由于偶然相遇丽产生碰撞复合物，这些复合物韵寿命也是极短 的。然两在窦然界中，存在着一类物质分子( 称之接受体，r e c e p t o r ) ，它们能准确 地区分各种分子，并且可以在大量的不同形状分子中找出与自己相匹配的“伴侣 分子”，与之形成共价或非共价的复合物。此复合物具有一定的稳定性，和较大的 平衡常数，而对于体系中的非“伴侣分子”，其相互作用的力可以完全忽略，该过 程称为“分子识别 。人们把生物体内早已熟知的识别过程( 如酶一底物、抗体一 抗原等) 比喻成“钥锁机制，这种说法虽然没有完全表现出分子识别的“智能化 的重要特点，僵也院较形象地说明了分子识别过程中高度专一性。 分子识剐对予生命的存在具有至关重要的意义，没有识别，生物体就无法生 存。例如，处于细胞膜表面的接受体( r e c e p t o r ) 可以通过和不同荷尔蒙( h o r m o n e ) 的结合，来传递细胞之间的信息；抗体( a n t i b o d y ) 对于对应客体的特 疋键合能准 确地俘获外来物种抗原( a n t i g e n ) ，并将其带入溶酶体进行破坏，对身体起到了保 护作用；酶对底物的识别也显示了其重要性。对自然界的分子识别的认识，促使 许多人对它们进行模仿和学习。 分子印遮技术( m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n o l o g y ，m i t ) 是西前所知道的具有 良好发展前景酶分子识别技术之一。在高分子的结构中，将分子按照入们的意图 冻结下来，形成有规则的排列固定在体系中。这一方法构想独特并具有相当的挑 战性，而其低廉的价格和行之有效的功能使其成为该领域最舆潜力的技术，有专 家预测其将为化学、生物和环境等学科带来革命性的变化。 m 1 1 r 的起源应该追溯到上个世纪4 0 年代，p a u l i n g 试图用锁匙理论解释免疫体 系哆虽然他的理论经盾人的实践证明是错误的，但是在他的这种错误的理论中仍 有两点是正确的：( 1 ) 生物体所释放的物质与外来物质有相应的结合位点；( 2 ) 生物 体所释放的物质与外来物质在空闻上相互匹配。正是基于这两点假设，入们发展 了这一项有效的分析技术。1 9 4 9 年，d i c k e y 2 首先提出了“分子印迹 这一概念， 但在很长一段时间内没有引起人们的重视。直至u 1 9 7 3 年由w u l 妒l 研究小组首次报 第一毒蓠赛 道了人工合成的有机分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，m i p s ) 之 震，这项技术才逐渐为入们所认识，特别是1 9 9 3 年m o s b a c h 等在( n a t u r e ) ) 上发表 茶碱印迹聚合物的报道蘑隗，该技术在近十多年内得到了飞速的发震。迄今，在窜 迹机理、制备方法以及在各个领域的应用研究都取得了很大的进展，尤其是在分 析化学方面的应用更是令人瞩目。目前该技术被广泛，应用予色谱【5 1 9 1 、固相萃取 2 0 - 3 3 、仿生传感刚、模拟酶催化 4 2 删等领域中 1 2 分子印迹韵原理 m i t 是指为获褥在空闻和结会位点上与某一分子( 模板分子、印迹分子) 完 全匹配的聚合物的制备技术。其基本思想起源予人们对抗体一抗原、酶一底物的 智能化翔专一性的认识，是模拟自然界所存在的分子识别作用，以目标分子( 以 下称印迹分子) 为模板合成聚合物即m i p s 的方法。在生物体内，分子复合物的形 成通常需要借助非共价键( 氨键、范德华力、离子键等) 相互作用。虽然单个非 共价键比单个共价键键能低，但多重非共价键的耦合和多个作用位点的协同作用 则会形成很强的相互作用，从而使复合物具有很高的稳定性。由p a u l i n g 抗体形成 理论出发，娄模板分子与聚合物单体接魅时会尽可能地同单体形成多重作用点， 如果通过聚合，把这些多重作用点固定或“冻结下来，当模叛分子除去后，聚 合物中就形成了与模板分子在空间和结合位点上相匹配的具有多重作用点的空 穴，这样的空穴对模板分子具有选择性，这样就为目标分子提供了一种可识别接 受体。 _ 一q ，图1 。分子印迹过程示意醒 f i g 1 s c h e m a t i cr e p r e n t a t i o no f t h em o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp r o c e s s 第一襞翦畜 分子窜迹过程通常过以下方法实现( 如图1 ) ； ( 1 ) 首先以具有适当功能基的功能单体与模板分子结合形成单体一模板分子 复合物； ( 2 ) 选择适当的交联荆将功能单体互相交联起来形成共聚合物， 从丽使功 能单体上的功能基在空间排列和空间定向上进行固定； ( 3 ) 通过一定的方法把模板分子脱去。这样就在高分子共聚物中留下个与 模板分子在空闻结构上完全匹配，并含有与模板分子专结合的功能基的三维空 穴。 ( 4 ) 这个三维空穴可以选择性地重新与模板分子结合，帮对模板分子具有 专一性识别作用。 一个理想的m i p s 应具备以下性质：首先，其具有适当的刚性，聚合物在脱去 模板分子艨仍能保持空穴原来的形状期大小。其次具有一定的柔性，使底物与空 穴的结合能快速达到平衡。还有需要具有一定的机械稳定性，这一点对于高效液 相色谱( 肿l c ) 尤为重要。另外，具有热稳定性，使其能在较高温度环境下使 用，戮为对于一般的反应来说，温度较高使动力学上更有利。因此一种有效的 印迹聚合物应该具有高选择性、快速识别的功能。 1 3m i p s 的特点 分子印迹技术之所以吸引了如此众多的研究与开发者的兴趣，主要是因为它 有三大显著特点。其一是构效预定性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) ，其二是特异识别性 ( s p e c i f i cr e c o g n i t i o n ) ，萁三是广泛实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) 。基予m i t 制备的 m i p s 具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好及使用寿命长等特点。 ( 1 ) 构效预定性；入们可以根据自墨的不两想法和嚣的，通过在不同环境中 分子预组织和合成等手段制备高效m i p $ ，从而达到很好的识别效果。这为人们合 成更为完善的印迹聚合物提供了理论上的支持，并为m i t 的发展起到奠基的作用。 ( 2 ) 特异识别性；m i p s 在复杂的基体环境审对磊标分子具有很强的选择性识 别，而对其他分子的影响完全可以忽略，如分子印迹在手性分离上的应用。这一 点是印迹技术的特有功能和存在意义。 ( 3 ) 广泛实用性：m p s 制备的简单和有效为该技术的广泛推广提供了基础， 面生产和生潺中分离技术的普遍存在为这一技术的发展提供了广阔的空阉。经过 第一掌翦寓 几代工作者的努力和凡十年的发展， 传感、模拟酶催化、吸附等领域孛， 将更大的领域内发挥其功能和作用。 这项技术现在广泛于色谱、固相萃取、仿生 可以预想，随着技术的不断完善和拓展，必 1 4m i t 的分类 通过上述可知，m i p s 合成的前提是先让单体和模板分子形成稳定的复合物， 根据单体和模板分子的结合性质不同，可将印迹技术分成三种形式，即共价印迹 法 作为载体，合成的m i p $ 不需碾密、 筛分等工序，颗粒均匀，机械强度高，更主要的是大大减少了功能基团“包埋”的现 象，提高了聚合物的印迹功能。关予表露印迹的报道最早是1 9 4 9 年d i c k e y 用沉淀 法制备了印迹硅胶【1 1 ，他们使用染料甲基橙作为印迹分子，酸化硅酸盐溶液形成染 料霹迹胶体，干燥并洗去印迹分子矗得到了对肇基橙吃乙基橙吸附缝力高2 倍的 吸附材料，而用乙基橙作印迹分子，结果正好相反。m o r i h a r a 小组【7 5 。7 8 】在硅胶表 面剩备催化裁方面徽了大量深入的研究工作；k o d a k a r i 等【7 瞄1 1 利用化学气相沉积 技术( c v d $ ! | 备m i p 也取得了很好的成果：d a i 和他的研究组【观，8 3 】则利用这项技术 在处理含铀酰离子的核废料、废水方谣傲了大量的工作。 2 。4 印迹聚合物的表征 对于m i p s 的结构表征，一般沿用对传统聚合物的表征方法，如通过吸附实验 进行毙表面积的测定、孔容测定、孔径大小及分布测定等；对于m i p s 的化学成分 表征，可用元素分析、重量分析、热分析、核磁共振光谱、红外光谱等等。对于 m i p $ 的性质表征，在实验上可逢过色谱实验和吸附实验来进行测定。通过对印迹 第一寒蓠言 聚合物和非印迹聚合物的比较，可对m i p s 的性能进行科学的评价。 3 分子印迹技术的应用 与传统的分离介质相比，m i p s 的特点是对分柝物具有高度专一的选择性，同 黠，m i p s 具有良好的物理化学稳定性，能够耐离温、高压、酸碱，有机溶荆等等， 容易铡备和保存，易予实现王业化生产。因此，m i t 在色谱分离、固招萃取、仿 生传感、模拟酶催化、临床药物分析、吸附、膜分离等方面得到了日益广泛的应 用，有望在生物工程、晒床医学、天然药物、食品安全、环境监测等领域发挥巨 大的作用。 3 。1 色谱固定相 。 m i t 制备色谱的固定相的传统做法是，在分子印迹条件下制得的聚合物经粉 碎、研磨和过筛后，将宣径适宜豹颗粒放置子不锈钢柱内，用h p l c 泵在高压下 将溶剂通入，在此过程高聚物颗粒将密实的填装予柱内。但是由予这种传统方法 存在处理过程复杂、聚合物利用率低下和印迹效果不理想等缺点，所以，s v e c 和 f r e e h e t 发展了一种在色谱桂内通过溶胶一凝胶法直接捌备印遮固定相的原位聚合 法，大大简化了钊备的过程，实用性强湖。 将m i p s 用作色谱固定相是早期研究的一个重点，也是m i p s 进展最大的领 域，到目前为止已经成功分离了氨基酸衍生物、糖苷衍生物、，苯二氮、普萘洛尔、 萘普生等手性对映体( 5 棚1 。 3 2 固摺萃取 豳相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 是2 e 世纪粥年代由液固萃取与柱液 相色谱技术相结合发展起来的样品分离技术。它将分离与浓缩合为一体，逶过使 用不同的选择性溶剂洗脱出杂质与目标物质，达到分离目的，并可以与h p l c 、 c j c 釉i c 等联用。近年来，随着生命科学、生物工程、合成药物和环境科学等的 迅速发展，对复杂基矮中微量、痰量物质的分离与检测成为了最突啦的阀题，s p e 技术的发展有助于这一闯题的解决，并在上述领域得到了较快的发展。但是，传 统s p e 的目标物与吸附剂之闯的作用力是非特异性的，通常需对萃取和洗脱条件 进行仔细选择，而且对不同基质的分离与分析物需要选择不同的柱填料，从而限 制了s p e 的进一步发展。为了提高柱效与重现性、扩大其应用领域，新型高选择 性识别能力填料基质的开发研制是非常重要的，m i p s 独特的选择性和亲和力适应 1 3 第一章前言 了这一发展要求。由于模板选择的多样性，使得m i p s 能广泛应用于物质的分离与 分析过程，它对于目标物质的高度选择性也是普通s p e 所不能比拟的。 目前，m i p s 用于s p e 的研究已有很多报道，作为s p e 的吸附相，吸附待测物或 于其结构相似的一组化合物，由于待测底物与m i p s 识别位点特异性的结合，对待 测底物保留时间或容量因子的不同，通过洗脱，待测物可被分离。与l c 联用，对 许多化合物具有强的对映体选择性，如药物、氨基酸衍生物、多肤和抗体。 3 3 仿生传感 生物传感器由识别元件和信号转换器组成，识别元件以适当的方式固定在转 换器的表面，当待测分子与识别元件结合时，产生一个物理或化学信号，转换器 将此信号转换成一个可定量的输出信号，通过监测输出信号实现对待测分子的实 时测定。生物传感器由于其高灵敏度和特异性，受到广泛关注。但生物分子固有 的缺陷，即对使用环境要求较高，难以长期保存等，使生物传感器在实际应用中 遇到很多不易克服的障碍。通过对抗原抗体、酶和底物反应原理的研究和理解， 以m i p s 取代生物分子作为识别元件研制分子印迹仿生传感器( m 口s 仿生传感器) 的工作，在2 0 世纪9 0 年代后逐渐成为传感器领域的研究热点。 根据转换器的测量原理不同，传感器可分为：电化学传感器【8 6 8 9 】、质量传感 器凹删、光学传感器瞰搠1 和热学传感器。m i p $ 所具有的优势使其作为识别元件， 特别适合于传感器技术。目前，m i p s 主要应用在前三类传感器中。 3 4 酶催化 催化剂在化工生产中起着重要的作用，化学合成反应的发展很大程度上依赖 于催化剂的品质。自然界的酶是一种高效、专一、反应条件温和的催化剂，但天 然酶提取困难、耐受性差、难以回收等缺点制约了它的生产和运用。分子印迹技 术的出现剂及其模拟抗体方面的研究进展启发人们利用这一技术将识别位点和催 化基团引入聚合物内部，可制备得到模拟酶。目前，研究较多的m p s 模拟酶催化 反应主要有水解反应、合成反应、氧化还原反应、转移反应、脱h f 反应和异构反 应等。 4 分子印迹技术的发展及前景 4 1m i t 的现存问题 m i t 的特点是利用对聚合物进行人为的设计和制备，成为对各种物质进行准 - 1 4 第一章前言 确检测和高效分离的介质。但由于研究历史较短，m 1 t 仍然存在一些有待解决的 问题。 ( 1 ) 机理研究相对肤浅 目前，对于m i t 的机理研究的相关报道不多，而且缺乏系统性。曾经有文献 探讨了空穴的重要性，功能基团位置的影响，也有人借助n m r 和取谱图对识别 过程的微环境进行分析，但大部分的研究仍然停留在m i p s 的制备合成和识别过程 的表观研究，对于结合位点的作用机理、聚合物的形态和传质机理仍然不够明确， 如何从分子水平上理解分子印迹过程和识别过程仍需要深入研究。 ( 2 ) 功能单体、交联剂和聚合方法有待拓展 目前，现有的功能单体、交联剂的种类太少，以至于不能满足某些分子识别 的要求，这就使得m i t 远远不能满足实际应用的需要。功能单体多数是含有能形 成氢键的基团，能不能找到新型的结合位点，能不能开发出全新的功能单体，成 了人们的一个目标。另一方面，人们积极的寻找新的适合的交联剂，既可以自如 的控制其交联性，避免模板分子在聚合物中扩散太慢而导致的传质过程缓慢，又 不易在不同溶剂中发生“溶胀 ，避免导致孔穴变形而丧失印迹能力。 传统的分子印迹聚合物采用本体聚合法制备，虽然装置简单易于控制，但是 聚合物在使用前需经过研磨、过筛等过程来选取大小合适的颗粒，费时费力，收 率较低，而且颗粒的形状很不规则，使得印迹分子难以进入吸附位点，吸附容量 也较低。相比之下，分子印迹微球( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dm i e r o s p h e r e s ，m i m s ) 的制 备和应用方便、色谱效率高且便于功能设计，近年逐渐成为研究的热点。目前制 备m i m s 的方法主要有悬浮聚合、多步溶胀法、沉淀聚合等。采用上述方法虽然 成功制备了m i p s 并将其用于色谱分离，但所得印迹聚合物的识别位点大都在聚 合物微球内部，导致模板分子与识别位点结合困难，分离处理效率不高，仍然无 法得到颗粒形态和吸附特性俱佳的印迹聚合物微球。采用表面印迹方法制备的 m i p s 因其识别位点建立在聚合物表面，模板分子能很快靠近识别位点，具有较高 的结合速率和解离效率，可极大地降低非特异吸附对选择性的影响，并减少包埋 现象。 目前的聚合方法也有待发展，大部分的m i p s 属于颗粒状的，这使得一些结合 位点被埋藏在聚合物的三维结构中而未被利用，导致应用效率大幅度下降。还有， 在m i p s 的制备过程中，聚合物单体、交联剂、溶剂的选择和比例以及操作工艺上 第一鬻前言 的不同都会带来聚合物机构形态方面的差异。但在方面的研究大多处在半经验状 态，有待深化和发展。 ( 3 ) 印迹和识别环境的局限性 网前m i p s 大多只能在有机相中进行制各和应用，而天然的分予识别系统大多 是在水溶液中进行的，如何能够利用特殊的分子闯作用力在水溶液或者极性溶剂 中进行分子印迹和识别仍是一大难题。对于生物分子的印迹和识别，研究水相中 m i t 尤其具有重大意义。 4 2m i t 的发展趋势 展望未来，m 1 t 的发展趋势可能有如下几个方面。 ( 1 ) 制备新方法的开发，提高m i p s 的“印迹容量，大大拓宽了m i t 的应 用范围。通过研究的不断深入，不断有人提出了m i p s 制备的新方法和新技术，得 到了性能更好、应用更广泛的m i p s 。例如纳米印迹( n a n o - - m i t ) ，分子印迹聚合 物对目标分子的印迹和识别是发生在聚合物表面的孔穴中，为了提高聚合物的效 能，就要求颗粒具有大的比表面积。采用以往的制备法得到的m i p s 颗粒较粗，粒 径般在一般粒径在2 0 一5 0t t t n ，导致比表面积较小。纳米技术的发展为解决这一 问题提供了良机，纳米颗粒具有稳定性好、粒径大小均匀、比表面积大等的特点， 由予其纳米级的孔径和几纳米的管壁厚度，因此对目标分子具有嵩选择性、高亲和 性、高容量和快速结合能力，将印迹聚合物直接制备成纳米颗粒有着无法比拟的 优势，这必将成为m i t 的探索和研究方向之一。王小如和他的科研组采用氧化铝 模板法和溶胶凝胶法相结合合成了一系列分子印迹纳米管，对茶碱、孕酮、牛血 清自蛋白旨标分子优异的识别功能1 舡1 嗍；c h a n g 等以二乙烯基苯为单体，合成了 雌激素酮分予印迹纳米胶囊( m o l e c u l 砌yi m p r i n t e dp o l y m e r i cn a n o c a p s u l e ) b 0 5 ；l i 等 透过嵌段共聚物叁组装方法( b l o c ke o p o l y m e rs e l f - a s s e m b l yt e c h n i q u e s ) 毒u 备擞l 一乙 基尿嘧啶、1 一丁基尿嘧啶、1 乙基胸腺嘧啶、l 一丁基胸腺嘧啶分子印迹纳米微粒 【1 0 6 l 。和健酶合作者通过电镀的方法在电极上制得碳纳米管碜饰印迹聚毗咯并应 用与对赫曲霉素a 的萃取上【1 0 7 1 ；c h r o n a k i s 等通过电镀的方法将茶碱和雌二醇分 子瘁迹纳米粒包覆在聚乙烯基对苯二酸酯纳米纤维上，并表现出良好鲍印迹效果 i o s o ( 2 ) m 玎将从氨基酸、药物等小分子过渡到核营酸、多肽、蛋自质、酶等生 第一章髓富 物大分子。西前，对以小分子为磊标物的印逡技术研究爵趋成熟，丽对于生物大 分子的印迹仍存在很大的挑战。原因主要有1 ) 水相中作用力减弱会导致选择性亲 和作用强度降低，氯仿等有机溶剂中生物大分子又容易失去活性。2 ) 三维构象复 杂：生物大分予表面存在的众多类型的结合位点使得一般的聚合物容易产生非特 异性的吸附。3 ) 一些结合位点常被埋藏在聚合物的三维结构中而未被利用，造成 m i p s 的“印迹”容量较低；当溶剂组成改变时，m i p s 容易发生膨胀导致印迹空穴的 不可逆变形，从而丧失选择性；m i p s 的筒效交联性限制了生物大分子在聚合物颗 粒中的扩散，使传质过程非常缓慢。但其在这一领域上潜在的优异性能和应用前 景仍然有着强大的吸寻l 力，因此，分子露迹技术的热点正逐渐由药物、氨基酸等 小分子逐渐转向酶 1 0 9 , i l o l 、蛋白质1 1 3 l 等生物大分子。 第二章1 1 2 毗啶偶氮卜2 萘酚分子印迹聚合物的制各和结龠特性研究 第二章l e - n l 啶偶氮) 吒一萘酚分子 印迹聚合物的制备和结合特性研究 薹引言 偶氮类他合携是品种最多、应篇最广的类合成染料，研究表鹗，许多偶氮 类物质具有致癌作用，如用于人造奶油着色的奶油黄能诱发肝癌，作为指示荆的 挈基红可琴| 起膀觥釉乳腺肿瘤，应焉印迹技术对此类物质的分子识筹| j 研究具有重 要的现实意义和广泛的前景。虽然目前已有多种制备印迹分子聚合物的方法和研 究，但剩焉分子印迹技术进行偶氮类纯合物识别的方法鲜冤有报道。这是由于偶 氮类分子的偶氮键容易断裂，在制备和识别的过程中如何保证胬标分子不被破坏 成为需要解决的问题。在偶氮类化含物中，1 ( 2 毗啶偶氮) 乏萘酚广泛应用于染 料王业和化学分析等领域，是种常见的偶氮类物质；我们研究以1 ( 2 毗啶偶 氮) 爰，蔡酚为西标分子，制备的偶氮类印迹聚合物具有稳定性好，选择性高等特 点，对印迹聚合物的合成条件进行了优化，对聚合物进行了表征。 2 实验部分 2 1 试剂与仪器 d f 一1 0 1 s 集熟式恒温加热磁力搅拌器( 巩义市英峪予华仪器厂) ，h y 一3 a 多用振荡器( 金坛市科析仪器有限公司) ，7 5 6 p c 型紫辨可见分光光度计( 上海 光谱仪器有限公司) ，f t i r 3 6 0 型红外光谱仪( n i c o l e tc o ) 。 丙烯酸( 化学纯，广东汕头疆陇化工厂) ，甲基丙烯酸( m a a ( 化学纯，广 东汕头诬陇化工厂) ，l 。( 2 毗啶偶氮) - 2 萘酚( p a n ) ( 分析纯，上海化学试剂总v ) ， 偶氮二异丁腈( 化学纯，上海试剂四厂) ，二甲基露烯酸乙二醇脂( 嚣g d 氧俄) ( 广 州双键化工有限公司) ，4 乙烯基吡啶( aj o h n s o nm a t t h c yc o 。) 。 2 2 原料预处理 由于市售的聚合原料都含有阻聚剂，不利聚合，所以聚合前必须进行预处理 加以除去。丙烯酸通过蒸馏除去阻聚剂；甲基丙烯酸、苯乙烯、二甲基丙烯酸乙 第二章1 ( 2 毗啶偶氮) 1 2 萘酚分子印迹聚合物的制各和结合特性研究 二酵分别通过减压蒸馏除去阻聚剂；所有试剂在冰箱中保存备用。 2 3 聚合物的制备 称取0 2 4 9 3 9 ( 1r n m 0 1 ) p a n 溶予8m l 氯仿中，加入0 3 4 4 4g ( 4r e t 0 0 1 ) m a a ，超声3 0m i n ，使p a n 与m a a 充分作用，然后加入e g d m a 3 9 6 4 4g ( 2 0 r e t 0 0 1 ) 和1 0n a ga i b n ，充分混合后转入2 5m l 试管串，通n 2 脱氧5r a i n ，密封 后放入恒温水浴中，6 0 下反应2 4h 生成棒状聚合物。然后将聚合物研磨，过 4 0 0 量( 3 7 5 弘趣 筛后用甲酵一乙酸( v 麓9 ：1 ) 溶液洗掉模板分子和未聚合的功能 单体和交联剂，再用乙腈洗去甲醇和乙酸，在干燥箱中8 0 干燥2 4h ，得到以 m a a 为功能单体的1 0 毗啶偶氮) 1 2 萘酚分子印迹聚合物m i p s 。铡各菲翻迹聚 合物n m i p s 除不加模板分子外，其余操作步骤同上。 2 4 吸附实验 准确移取适量一定浓度的p a n 乙臆溶液予1 0 0m l 具塞磨翻锥形瓶中，加入 一定量的m i p s 或n m i p s ，密封，置于振荡器上振摇2 4h 后离心取上层清液，用 丙酮稀释至适当浓度，在紫外可见分光光度计予波长4 6 5n m 处测其吸光发a ， 计算获得吸附后溶液中p a n 的平衡浓度，根据结合前后浓度的变化计算处聚合物 对窜迹分子的吸附量q 。 3 结果与讨论 3 1 单体的选择 印迹聚会物对目标分子的吸附是通过功能单体上的功能基与目标分予之间 发生作用来实现的。这种作用形式有共价键、氢键、静电相互、范德华力等。器 用的种类、物质的构象等对作用力的大小产生直接影响，从而直接影响印迹聚合 物对曩标分予的亲和力和选择性。实验使用紫外可见光度法研究了丙烯酸、学基 丙烯酸、4 - 乙烯基吡啶与p a n 的结合能力大小，实验表明，甲基丙烯酸为功能单 体的效果最佳。紫外可见吸收谱如图l 所示。巍图中可知，曲线2 、3 与麓线l 的最大吸收峰相差很大，说明两者有很强的相互作用。实验考察了不同浓度的 m a a 与p a n 作用时吸光值的变纯，u v - v i s 吸收光谱图如图l 所示，翔入1 0m m o l 第二掌l 移蹴睫偶氮) _ 2 一萘酚分子印迹聚合物麴剩冬秘缝合特性研究 的m a a 后，溶液的吸光度明显下降，从0 8 2 降到0 5 1 ，随着m a a 浓度的增加， 吸光值也随之降低，说明p a n 和m a a 之闻有很强的相互作用。p a n 分子印迹聚 合物的制各过程示意如图2 所示。 o 9 仇8 瓴7 0 6 仇5 0 4 筑3 o 2 0 。l o 3 5 0 4 0 0 4 5 05 0 05 5 0 6 6 5 0 m n m ) 图1 不同浓度m a a 与p a n 作用的u v - v i s 吸收光谱圈 f i g 1 u v - v ma b s o r p t i o ns p e c t r ao fp a n a n dm a ao fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ns y s t e m si nt h e m e t h a n o ls o l u t i o n 1 。p a n 0 0m m o i l ) ；2 。i + m a a ( 1 0m m o l l ) ；3 。i + m a a ( 2 。0m m o l l ) 删q + 妒艮伽p r e a s s e m b l y h 2 c 拳车一c 玛 c o o h 图2 印迹聚合物制备示意图 f i g 2 。s y n t h e s i so fm i p s 3 。2 聚合物红外分析 将印迹分子聚合物与非印迹聚合物进行红外光谱表征，图3 所示，l 、2 分别 - 2 黪- 第二章i “2 吡啶偶氮) - 2 萘酚分子印迹聚合物的制各和结合特性研究 为印迹分子聚合物和非印迹聚合物的红井光谱图。聚合物可与印迹分子产生氢键 的官能团为- - o h ，图中在3 4 4 3c m - 1 有很强o h 的伸缩振动吸收峰，表明其具 有较强的吸附能力；2 9 8 6e m 1 、2 9 5 0e m l 分别为一c 磁和一c h 3 的伸缩振动吸收 峰：1 7 2 6e m 1 为一c 的伸缩振动吸收峰：1 2 6 1c m 1 、11 6 1c ：m 以为酯基c o c 的不对称伸缩振动和对称伸缩振动吸收峰；1 4 5 8c m 。1 为c i - 1 3 的弯曲振动或c 1 - 1 2 的剪式振动吸收峰；另外1 6 3 3c m - 1 附近的吸收峰应为未完全反应的c - c 振动吸 收峰。从图中可看出印迹聚合物与菲印迹聚合物峰形和强度完全一致，说明二者 成分相同，即印迹聚合物中模板分子已洗脱完全。 4 0 0 03 5 0 03 0 0 02 5 0 02 0 0 0 1 5 0 01 0 0 0 w a v e n u m b e r ( e m l ) 图3 印迹聚合物与非印避聚合物的红外谱图 f i g 3 。i rs p e c t r ao fm i p sa n dn m i p s 1 剐【i p s ：2 n 捌囝p s 3 3 聚合物表面分析 力了研究聚合物的表面形态和结构，我们用电镜扫描( s e m ) 对印迹聚合物 进行了表征。通过图4 ( a ) 可以看出，聚合物的粒径大小均在2 0 一4 0 雌之间， 粒度分布较为均匀，形状呈不规则；图4 ( b ) 是聚合物粒子表嚣的照片，阿以看 出其表面均匀分布着纳米级大小的孔径，这大大增大了聚合物的比表面积，为印 迹聚合物对霉标分子的选择性识别提供了良好豹场所。 2 i 第二章1 - ( 2 一吡啶偶氮) - 2 萘酚分子印迹聚合物的制备和结合特性研究 图4 印迹聚合物的表面扫描电镜图 f i g 4 s e mi m a g e so fm i p s 3 4 溶剂的选择 溶剂的选择是聚合物合成中的关键因素，在聚合过程中一方面要求溶剂能够 溶解模板分子和功能单体等物质，另一方面又要求同模板分子之间的相互作用较 小，不至于影响模板分子和之间形成的主客体配合物之间的稳定性。一般选择极 性低，对氢键影响弱的溶剂，因为在非共价键作用中，极性溶剂对离子间作用、 氢键作用的影响较大，但有时候考虑到模板分子的溶解性，也可以选择一些极性 的溶剂【6 】o 由于模板分子1 - ( 2 一毗啶偶氮) 一2 一萘酚易溶于醇和乙腈，微溶于氯仿。而甲醇 是极性溶剂，不但减弱了模板与聚合物的非特异性吸附，同时由于它又是质子传 递溶剂，参与竞争聚合物的活性点位，从而导致特异识别性能也降低。乙腈虽然 极性比氯仿强，但是非质子传递溶剂，模板与聚合物识别点位之间的氢键虽有所 第二鬻1 韶- 虢畹偶氮) 2 - 萘酚分予印迹聚合物的制铸和结合特性研究 削弱，但主要还是以氢键为主，且模板分子的溶解度较大。所以在本实验孝聚合 物的合成是以氯仿为溶剂，吸附性能实验中的溶剂选择乙臆。 3 s 吸附特性聚究 3 。5 1 融溶液标准曲线 准确称取4 0 0m g 的p a n ，加入适量的乙腈溶液溶解，定容至1 0 0m l 。 移取o 1 、9 。3 、o 。5 、0 。8 、1 0 、1 5 、2 。0m l 上述标准溶液，加入乙腈定容至 2m l 。充分振摇后分别移取5 0 此定容至1 0m l ，在4 6 5r i m 波长处