（预防兽医学专业论文）柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊和子孢子差异表达基因的研究.pdf

摘要 鸡球虫病是由艾美耳球虫寄生于肠道所引起的一种危害严重的全球性寄生虫病，给养鸡业造 成巨大的经济损失。目前控制球虫病的主要方法包括化学药物防治和疫苗免疫预防，但由于这些 方法存在安全、价格以及抗药虫株出现等问题，迫切需要寻找新的防治手段来控制球虫病。而研 制高效安全的抗球虫病基因工程疫苗和新药物的关键在于寻找到重要的虫体抗原基因。本论文以 对鸡危害最为严重的柔嫩艾美耳球虫( e i m e r i at e n e l l a ) 为研究对象，开展了et e n e l l a 孢子生殖 发育阶段差异表达基因的分离、鉴定等研究，为探讨鸡球虫的入侵和生长发育机制，研制高效、 安全的抗球虫疫苗和新药物奠定了重要基础。 1 利用抑制性消减杂交技术和e d n a 微阵列技术筛选et e n d l a 孢子化卵囊和子孢子阶段虫体差 异表达基因 为了分离鉴定et e n e l l a 孢子发育阶段虫体的差异表达基因，分别以et e n e l l a 未孢子化卵囊 和孢子化卵囊为驱动组，子孢子为实验组；未孢子化卵囊为驱动组，孢子化卵囊为实验组，利用 抑制性消减杂交( s s h ) 技术，构建了1 个et e n e l l a 子孢子与孢子化卵囊的消减e d n a 文库( z b ) ， 1 个子孢子与未孢子化卵囊的消减e d n a 文库( z w ) 和1 个孢子化卵囊与未孢子化卵囊的消减 e d n a 文库( b w ) 。经p c r 鉴定，2 个子孢子消减e d n a 文库的重组率都为9 6 ，孢子化卵囊消 减e d n a 文库的重组率为9 8 ，大部分插入片段都大于5 0 0b p 。从构建好的3 个消减e d n a 文库 中共挑取3 0 0 4 个克隆制成e d n a 微阵列。芯片杂交分析后获得1 3 7 1 个差异表达基因克隆，其中 从b w 消减e d n a 文库中获得2 4 5 个，从z b 消减e d n a 文库中获得5 8 2 个，从z w 消减e d n a 文库中获得5 4 4 个。对其中7 2 7 个差异表达基因克隆进行测序，结果获得了6 5 7 条有效e s t s 序 列( b w 文库1 9 7 条有效e s t s ，z b 文库2 7 5 条，z w 文库1 8 5 条) ，代表1 1 8 个单一基因，其中 孢子化卵囊3 1 个，子孢子8 7 个。序列同源性搜索结果显示：3 1 个孢子化卵囊单一基因中，蛋白 功能已知的有1 2 个，蛋白功能未知的有1 9 个，在球虫中已报道的有7 个；8 7 个子孢子单一基因 中，蛋白功能已知的有2 3 个，蛋白功能未知的有6 4 个，在球虫中已报道的有6 个。从中选择了 5 个差异表达基因克隆，应用实时定量p c r 进行验证，结果显示与芯片杂交结果一致。b l a s t x 同源性比较分析后发现：孢子化卵囊阶段虫体差异表达基因编码的蛋白与et e n e l l a 微线蛋白、 1 a 4 抗原蛋白、表面抗原蛋白，刚地弓形虫( t o x o p l a s m ag o n d i i ) 的热激蛋白和蛋白质二硫异构 酶，人隐孢子虫( c r y p t o s p o r i d i u m h o m i n i s ) 卵囊壁蛋白等有较高的同源性；子孢子阶段虫体高 表达基因编码的蛋白与恶性疟原虫( p l a s m o d i u m f a l e i p a r u m ) 的丝氨酸，苏氨酸磷酸酶、钙依赖性 蛋白激酶，约氏疟原虫( p l a s m o d i u m y o e l i i ) 神经磷脂酶c ，et e n e l l as e r p i n i 蛋白、微线蛋白、 反转录酶等有较高的同源性。提示这些基因编码的蛋白可能参与了卵囊孢子化的形成、虫体的入 侵、虫体在宿主细胞内的生长发育、虫体与宿主细胞的相互作用、细胞代谢、免疫调节及细胞信 号传导等。本研究为分析鉴定鸡球虫孢子发育阶段虫体差异表达基因，探讨与鸡球虫入侵和生长 发育相关基因的作用机制等奠定了基础。 i i z 晟t e n e a 孢子化卵囊和子孢子差异表达新基因全长e d n a 的克隆与分析 根据差异表达基因的e s t s 序列，利用r a c e 技术扩增获得8 个et e n e l l a 新基因的全长c d n a ， 其中包括5 个孢子化卵囊新基因全长c d n a s ( 编号为：b w i - a 0 5 、b w i e 0 6 、b w 3 f 0 4 、b w 3 - d 1 0 、 b w l l h 0 7 ；g e n b a n k 登录号：e f 5 5 2 2 1 2 、e f 5 5 2 2 1 4 、e f 5 5 2 2 1 3 、e f 5 5 2 2 1 1 、e f 5 5 2 2 1 8 ) ，3 个子 孢子新基因全长c d n a s ( 编号为：z b i - a 0 2 、z b l - a 0 8 、z b ii - a 0 4 ；g e n b a n k 登录号：e f 5 5 2 2 1 6 、 e f 5 5 2 2 1 7 、e f 5 5 2 2 1 5 ) 。利用生物信息学分析软件对新基因编码蛋白的理化性质、跨膜结构、抗 原位点等进行了分析预测，对编码蛋白的保守功能域、结构位点及同源性蛋白进行了搜索，结果 显示4 个基因编码的蛋白与其它顶复器原虫蛋白有较高的同源性，其中孢子化卵囊高表达基因 b w l l - h 0 7 编码的蛋白与zg o n d i i 的假想蛋白有较高的同源性；b w i - e 0 6 基因编码的蛋白与推测的 zg o n d i i 蛋白质二硫键异构酶( p u t a t i v ep d i - l i k ep r o t e i n ) 有较高的同源性；子孢子阶段高表达基 因z b i i - a 0 4 编码的蛋白与z g o n d i i 天冬氨酸蛋白酶3 ( t o x o m e p s i n 3 ) 有较高同源性；z b i - a 0 2 基 因编码的蛋白与婴儿利氏曼原虫( l e i s h m a n i ai n f a n t u m ) 蛋白激酶有较高的同源性；其余基因编 码的蛋白可能是最t e n e l l a 特有的蛋白。本研究为鸡球虫候选基因工程疫苗靶分子和新治疗药物靶 标的筛选提供了重要的参考依据。 3 et e n e l l a 新基因在大肠杆菌中的表达 将获得的et e n e l l c i 差异表达新基因( b w i e 0 6 、b w 3 - f 0 4 、z b i - a 0 2 、z b l - a 0 8 ) 全长c d n a 连接到原核表达载体p g e x - 4 t - 2 中，成功构建了4 个重组表达质粒p g e x - 4 t - e 0 6 ( 4 t - e 0 6 ) 、 p g e x - 4 t - f 0 4 ( 4 t - f 0 4 ) 、p g e x - 4 t - a 0 2 ( 4 t - a 0 2 ) 、p g e x 4 t - a 0 8 ( 4 t - a 0 8 ) ，并在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中成功诱导表达，纯化获得4 个重组融合蛋白( g s t - e 0 6 、g s t - f 0 4 、g s t - a 0 2 、g s t - a 0 8 ) ， 其中4 t - e 0 6 表达的融合蛋白大部分以可溶性蛋白形式出现，其余3 个重组质粒表达的融合蛋白都 以包涵体形式存在，利用g s tr e s i n 成功纯化了4 个重组融合蛋白。w e s t e r n b l o t 分析结果表明4 个重组蛋白都具良好的抗原性。进一步深入研究这些基因以及编码蛋白的功能，对研制鸡球虫候 选疫苗和新治疗药物都具有重要意义。 4 et e n e l l a 重组蛋白免疫保护效果的初步研究 为评价本研究研制的几种基因重组抗原在鸡体中诱导的免疫保护效果，将重组表达抗原 g s t - e 0 6 、g s t - a 0 2 、空载体p g e x - 4 t - 2 表达蛋白g s t 分别设高( 1 0 0 峙) 、中( 5 0l a g ) 、低( 2 5 p g ) 三个免疫剂量加弗氏佐荆肌肉免疫鸡。同时将4 t - e 0 6 、4 t a 0 2 、4 t - a 0 8 、4 t - f 0 4 重组表达 质粒转化的活菌和空载体质粒转化的活菌分两个剂量( 1 5 0t a g 和3 0 0p g ) 1 3 服免疫鸡。分别于7 、 1 7 和2 7 日龄三次免疫鸡，3 1 日龄时经口攻击感染e t e n e l l a 2 1 0 4 个卵囊只。结果显示：1 ) 增 重：所有免疫组鸡增重量均低于不免疫不攻虫组，重组蛋白免疫组增重最多的是4 t - a 0 2 ( 5 0p g ) 免疫组，其相对增重率为8 0 7 ；1 2 1 服活菌免疫组，增重较多是重组表达菌4 t - a 0 8 ( 3 0 0l a g ) 和 4 t - a 0 2 ( 1 5 0 # g ) 剂餐免疫组，相对增重率为8 3 3 和8 1 7 ，与不免疫攻虫组( 7 3 2 ) 相比差 异显著( p 0 0 5 ) 。2 ) 卵囊产晕：重组蛋白免疫组卵囊产量最低的为4 t - e 0 6 ( 5 0 雌) 免疫组， i i i 相对卵囊产量为6 3 6 ；口服活菌免疫组的卵囊产量最低的为4 t a 0 2 ( 3 0 0t t g ) 免疫组，相对卵 囊产量为6 6 6 ；3 ) 肠道病变记分：重组蛋白免疫组病变记分与不免疫攻虫组差异不明显，但 5 0p g 免疫剂量纽的病变记分都低于不免疫攻虫组，其中最低的免疫组为4 t - a 0 2 ( 5 0 肛g ) ；口服 免疫组病变记分都低于不免疫攻虫组的病变记分，其中最低的免疫组为4 t - a 0 2 ( 3 0 0t t g ) 。与不 免疫攻虫组差异显著( p 5 ) ，搅拌均匀后4 c 下作用1 5r a i n 。 ( 6 ) 加l o 倍最的蒸馏水稀释，25 0 0r r a i n 离心1 0r a i n ，沉淀反复用次氯酸钠氧化几次， 2 4 中国农业科学院博卜学竹论文 第二：章柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段抑制帖消碱文库的构建 直至卵囊干净为止，最后再加入蒸馏水洗涤2 3 次，除去次氯酸钠，离心沉淀卵囊，收集未孢 子化卵囊。 ( 7 ) 收集的未孢子化卵囊一部分纯化后液氮保存备用。另一部分放入2 5 的重铬酸钾溶 液中于2 8 3 0 培养箱中进行孢子化培养。 ( 8 ) 待卵囊孢子化后，收集孢子化卵囊，收集的孢子化卵囊一部分液氮保存备用，另一 部分用于收集子孢子。 2 2 5 2 子孢子的收集 参照宋翠萍等( 1 9 9 8 ) 建立的方法进行子孢子的制备，在操作过程中做了相应的修改。将纯 化的孢子化卵囊，用玻璃匀浆器破碎卵囊，p b s 洗涤离心后收集孢子囊，收集的孢子囊用p b s 悬浮后加入5 l o 的鸡胆汁和0 2 5 1 的胰蛋白酶，混匀后4 0 消化直至9 0 的子孢子溢 出，离心收集含子孢子的租提掖，p b s 悬浮后，依次用g 3 砂芯漏斗和( 3 4 砂芯漏斗抽滤，收集 滤液离心洗涤后即获得所需的子孢子，纯化的子孢子收集后液氮保存备用。 2 2 6et e n e a 未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子总r n a 的提取 将提总r n a 所用的玻璃器皿和金属物品，洗净烘烤干燥后以铝箔包好，经1 8 0 烤8h 以上； 塑料制品用终浓度为o 1 的d e p c 水浸泡，室温过夜，高温高压蒸汽灭菌3 0m i n ，以尽量除去 r n a s e 。总r n a 的提取按照t r i z o l 试剂的说明书进行操作。 ( 1 ) 取液氮冻存的e t e n e l l a 未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子，按每5 0 1 0 0 m g 样品 m lt r i z o l 加入t r i z o l 试剂。未孢子化卵囊和孢子化卵囊需用玻璃匀浆器充分匀浆约3 0m i n ，直 至卵囊壁破裂为止；子孢子加入t r i z o l 后充分混匀，不需要用匀浆器匀浆。 ( 2 ) 匀浆液移至离心管中，室温放置5m i n ，使核蛋白复合体充分裂解。按2 0 0 此氯仿l m l t r i z o l 加入氯仿，用手振荡混匀后室温放置1 5m i n 。 ( 3 ) 4 ，1 20 0 0r m i n 离心1 5m i n ，将上层水相转移至一新r n a s e - f f e e 离心管中。 ( 4 ) 5 0 0 虹异丙醇，珈i l t r i z o l 加入异丙醇，混匀，室温放置5 l o m i n 。4 ，1 2 0 0 0r r a i n 离心1 0m i n ，去上清液，r n a 沉于管底。 ( 5 ) 按1m l 7 5 的乙醇( d e p c 水配制) m l t r i z o l 加入7 5 的乙醇，温和振荡离心管， 悬浮沉淀。 ( 6 ) 4 c ，80 0 0r m i n 离心5m i n ，去上清，沉淀室温干燥1 0m i l l ，d e p c 水溶解。取少量 进行甲醛凝胶变性电泳分析t o t a lr n a 的完整性，用紫外分光光度计测定其浓度并分析其纯度。 2 2 7et e n e h a 未孢子化卵囊、孢子化卵囊和子孢子m r n a 的分离 将经电泳和紫外分光光度计测定符合要求的et e n e l l a3 个阶段虫体的t o t a lr n a ，用p r o m e g a 公司的m r n a 的分离试剂盒分离m r n a 。操作步骤按照说明书进行，具体如下： ( 1 ) 取o 1 1n a g t o t a lr n a 至1 5m lr n a s e - f r e e 离心管中，加d e p c 水至终体积为5 0 0 u l 2 5 中国农业科学院博七学位论立第：章柔嫩艾荚耳球虫孢于发育阶段抑制性消减文库的构建 ( 2 ) 6 5 热激1 0 r a i n 。 ( 3 ) 加3h lb i o t i n y l a t e d - o l i g o ( d t ) p r o b e 和1 3p l2 0 x s s c ，混匀，室温放置1 0r a i n 至溶液 冷却。 ( 4 ) 将s a p m p s 轻弹，悬浮，直至颗粒全部分开。 ( 5 ) 将悬浮的s a - p 御s 放在磁柱上，静止3 0s ，小心移去上清，加3 0 0 此0 5 x s s c 洗 s a p m p s , 每次洗完后放在磁柱上，小心吸去上清。重复3 次。 ( 6 ) 用1 0 0 u l 0 5 x s s c 重悬s a p m p s 。 ( 7 ) 将冷却的t o t a l r n a 加入悬浮的s a - p m p s 中，混匀，室温放置1 0 r a i n ，每2 m i n 颠 倒混匀一次。 ( 8 ) 将t o t a lr n a 和s a - p m p s 混合物放在磁柱上，静置3 0s 。小心移去上清。 ( 9 ) 取下离心管，加入3 0 0p l o i x s s c ，轻弹管底悬浮，再置于磁柱上，静置3 0s ，小心 移去上清。重复3 次，最后一次，尽量吸去上清。 ( 10 ) 取下离心管，加入1 0 0 皿d e p c 水重悬s a - p m p s ，再置于磁柱上，静置3 0s ，吸取 上清，即为分离的m r n a 。 ( 11 ) 在1 0 0 止的m r n a 中加入1 0 此的n a o a c 和1 0 0p l 异丙醇，混匀后7 0 过夜。 ( 12 ) 4 c 。1 2 0 0 0r m i n 离心1 0 m i n ，去上清。 ( 13 ) 沉淀加1 m l 7 5 的乙醇，4 c ，1 2 0 0 0r m i n 离心5 m i n 。 ( 14 ) 去上清，室温干燥1 0m i n ，加1 0 乩d e p c 水溶解。取少量进行甲醛凝胶交性电泳 分析m r n a 的完整性，用紫外分光光度计测定浓度。 2 2 8et e n e a 孢子发育阶段虫体o d 州l 消减文库的构建 2 2 8 1 抑制性消减杂交的分组 利用c l o n t e c h 公司的p c r - s e l e c t t mc d n as u b t r a c t i o nk i t 通过抑制性消减杂交的方法构建 e t e n e l l a3 个不同发育阶段的抑制性消减文库。实验分3 组：( 1 ) 以未孢子化卵囊的c d n a 作 为d r i v e r ( 驱动组) ，孢子化卵囊的c d n a 作为t e s t e r ( 实验组) ；( 2 ) 未孢子化卵囊的c d n a 作 为d r i v e r ( 驱动组) ，子孢子的c d n a 作为t e s t e r ( 实验组) ；( 3 ) 孢子化卵囊的c d n a 作为d r i v e r ( 驱动组) ，子孢子的c d n a 作为t e s t e r ( 实验组) 。 2 2 8 2e t e n e a3 个孢子发育阶段虫体以及对照样品( 人骨骼肌m r n a ) e d n a 第链的合 成 按照c l o n t e c h 公司的p c r - s e l e c t l ”c d n as u b f f a c t i o nk i t 使用手册进行操作，具体步骤如下： ( 1 ) 将所获得的3 个阶段虫体的m r n a 以及对照组的m r n a 稀释为0 5 舭，在无菌 的0 5m l 微量离心管中加入4 皿m r n a ，1i i lc d n as y n t h e s i sp r i m e r ( 1 0t t m o l l ) 混匀。 ( 2 ) 热循环仪上7 0 ，2 m i n 。 ( 3 ) 冰上放置2m i n 后，轻微离心，在离心管中加入下列试剂： 5 x f i r s t - - s t r a n db u f f e r 2i | l d n t p m i x ( 1 0 p me a c h )1 皿 2 6 中国农业科学院博卜学位论文 第_ 章柔蝉l 艾荚耳球虫孢于发育阶段抑制件消减文库的构建 灭菌d e p c h 2 0 lu l a i v l v 反转录酶( 2 0u “l )l 止 ( 4 ) 轻微混匀离心，4 2 培养箱中孵育9 0m i l l 。 ( 5 ) 冰上终止第链e d n a 的合成，立即进行c d n a 第二链的合成。 2 2 8 3 e t e n e 胁3 个孢子发育阶段虫体以及对照样品( 人骨骼肌m r n a ) e d n a 第二链的合 成 ( 1 ) 在第一链合成的反应体系中立即加入下列物质： 灭菌d d f l 2 0 4 8 4u l 5 x s e e o n d - - s t r a n db u f f e r 1 6 0u l d n t pm i 1 0 m m o l le a c h ) 1 6j i l 2 0 x s e c o n d - - s t r a n de n z y m ec o d a a i l 4 0t l l ( 2 ) 混匀，轻微离心。 ( 3 ) 1 6 水浴2 h 。 ( 4 ) 加入2 l l l i 4 d n a 聚合酶 ( 5 ) 1 6 c 温浴3 0r a i n ，加入4 皿2 0 x e d t a 耱原终止c d n a 第二链合成反应。 ( 6 ) 在每管中加入1 0 0 止酚一氯仿鼻戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 混匀，1 40 0 0r r a i n 室温离心1 0m i n 。 ( 7 ) 小心取上清置于另一干净离心管中，再加入氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 混匀，1 40 0 0r m i n 离心1 0 m i n 。 ( 8 ) 取出上清加入4 0 皿4 m o l l n h 4 0 a c 和3 0 0 此9 5 z 埔t ，混匀1 4 0 0 0r r a i n 离心2 0 r a i n 。 ( 9 ) 去掉上清，沉淀加入5 0 0 l i l 8 0 乙醇，1 4 0 0 0r r a i n 离心1 0 m i n 。 ( 10 ) 去上清，空气中干燥沉淀1 0 m i n ，加入5 0 皿d d h 2 0 溶解。每管取6 址，于另一新管 中，一2 0 保存，用于r s ai 酶切后电泳分析。 2 , 2 8 4 霹t e m - a3 个孢子发育阶段虫体以及对照样品双链e d n a 的r ni 的酶切 ( 1 ) 在一个无菌的0 5m l 离心管中加入下列试剂： 双链e d n a 4 3 ，5l i l 1 0 x r s air e s t r i e t i o nb u f f e r 5 0 “l r s a i ( 1 0 u l ) i 5u l ( 2 ) 混匀，轻微离心后于3 7 c 孵育9 0r a i n 。 ( 3 ) 加2 5 | i l2 0 x e d t a 糖原终止反应。 ( 4 ) 加5 0 p l 酚氯仿- 异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) 混匀，1 4 0 0 0r r a i n 室温离心1 0 m i l l 。 ( 5 ) 小心取上清置于另一干净0 5m l 离心管中，再加入5 0 此氯仿一异戊醇( 2 4 ：1 ) 混匀， 1 40 0 0r r a i n 离心1 0r a i n 。 ( 6 ) 小心取上清置于另一干净0 5m l 离心管中，加入2 5v - l4m o l ln i 4 0 a c ，1 8 7 5u l9 5 的乙醇。 ( 7 ) 混匀，1 40 0 0r m i n 室温离心1 0m i n ，小心去上清。 2 7 中围农业科学院博 学位论文第二章柔嫩芰芙耳球虫孢子发育阶段抑制件消减文库的构建 ( 8 ) 沉淀加入2 0 0 l 8 0 的乙醇，1 4 0 0 0r m i n 室温离心5 m i n 。 ( 9 ) 小心去上清，室温放置5 1 0 m i n ，使乙醇挥发干净，最后沉淀溶于5 5 止d d h 2 0 中， 一2 0 保存备用( 消化后的c d n a 将直接用作实验的d r i v e rc d n a ，下一步消化的e d n a 连接接 头后用作杂交实验的t e s t e r c d n a ) 。 2 上& 5 作为t e s t e r 的孢子化卵囊、子孢予以及对照人骨骼肌的c d l n a 与接头的连接 ( 1 ) 分别取l 皿，孢子化卵囊和子孢子双链e d n a 的r s a i 酶切产物，加5 皿d d h 妒稀释， 作为实验用的t e s t e r c d n a 稀释液。 ( 2 ) li l l 对照组的骨骼肌t e s t e rc d n a ，加5i i l 稀释的e x l 7 4 h a e h l ( 1 5 0n g m l ) 对照 d n a ，作为对照t e s t e re d n a 的稀释液。 ( 3 ) 将稀释的实验组d s c d n a 分别分成两管，按如下反应分别建立连接接头反应： 管1管2 连接组分t e s t e r | 一l 。t c s t e r l - 2 # 稀释的t e s t e rc d n a 2 i l l2 止 a d a p c o r l ( 1 0 n o f l ) 2u l a d a p t o r2 r ( 1 0 “m o f l ) 一 2u l 无菌水3 皿3 灶 5 l i g a t i o nb u f f e r 2i i l 2 灿 t 4 d n a l i g a s e ( 4 0 0 u “l ) 1i i l1i t l 终体积1 0 皿1 0 江， # 柔嫩芟美耳球虫孢子化卵囊的t e s t e r 编号为t i - i ，t i 一2 依照同样的体系建立子孢子和对照样品的t e s t e r ，子孢子的t e s t e r 编号为r 2 - l ，t 2 - 2 ；对照 样品的t e s t e r 编号为t 4 1 ，1 4 2 。 ( 4 ) 取2 l 子孢子的t i 1 和2 皿的t 1 - 2 于另一新管中混匀，作为未消减的t e s t e r 对照， 编号为t l a 2 。用同样的方法获得t 2 q 2 和t 4 - c ，t 1 - c 、1 r 2 c 、t 4 - c 将用于后续实验中消减效率 的分析。 ( 5 ) 将建立的连接反应体系轻微离心后于1 6 连接过夜( 1 6h ) ( 6 ) 连接结束后，加1 止，e d t a g l y c o g e n 混匀，终止反应。 ( 7 ) 7 2 5m i n 灭活连接酶，轻微离心。 ( 8 ) 分别取ll l l t i - c 、1 2 c 、t 4 稀释至1m l ，用于消减效率分析的模板，其余- 2 0 c 2 保 存备用。 ：z 2 8 6 接头连接效率的分析 为了保证后续实验的顺利进行，至少有2 5 的t e s t e r c d n a 与接头连接，才能保证差异表达 基因的有效富集。以试剂盒中的对照样品为例来评价接头的连接效率： ( 1 ) 别取对照组人骨骼肌连接产物t 3 一l 和1 3 - 21i i l ，加d d h 2 ( ) 稀释至2 0 0 灿。 ( 2 ) 按如下体系建立p c r 反应： 2 8 中同农业科学院博卜学位论文 第一章柔嫩艾美耳球虫孢子发育阶段抑制件消减文库的构建 成分 管l 管2 管3管4 t e s t e r 4 l ( 稀释)1 0 i i l1 0 旺 t e s t e r 4 - 2 ( 稀释) - 1 0 皿1 0 皿 g 3 p d h 3p r i m e i ( 1 0p m o l l ) 1 0i l l 1 0 此 1 oi i l 1 0 此 g 3 p d h 5 p r i m e r 0 0t t m o i l ) 一 1 0i | l 一 1 0l i l p c r p r i m e ri ( i o m o l l ) 1 0 止 1 0 肚 1 0 x p c rr e a c t i o nb u f f e r 2 5 皿2 5 皿 2 5i l l2 5i l l d n t p m 诹1 0 m m o l 几) 0 5i i l 0 5i l l 0 5 旺0 5 止 5 0 x b d a d v a n t a g ee d n ap o l y m e r a s em i x0 5 i l0 5 皿0 5i i l 0 5i i l s t e r i l e h 2 0 1 8 5 i l l1 8 5 皿1 8 5 皿1 8 5 皿 t o t a lv o l u m e 2 5 0 皿 2 5 0i l l 2 5 0 匝 2 5 0i i l ( 3 ) 混匀，轻微离心，加5 0 u l 矿物油覆盖。 ( 4 ) 7 5 5 r a i n ( 5 ) 立即进行循环，循环条件为：9 4 c3 0s ；6 5 3 0s ；6 8 c2 5 m i n 。2 0 个循环。 ( 6 ) 反应结束后，取5i t lp c r 反应产物，2 琼脂糖凝胶电泳分析结果。 2 2 & 7 第一轮消减杂交 ( 1 ) 预先将4 h y b r i d i z a t i o nb u 疵r 室温放置1 5 2 0m i n ，或3 7 放置1 0r a i n 。 ( 2 ) 在0 5 m l 的离心管中加入下列成分： 成分 杂交样品1杂交样品2 r s ai 消化的d r i v e re d n a ( 见步骤2 2 8 4 ) 1 5 江 1 5u l a d a p t o r1 连接的t e s t e d 1 、见步骤2 2 8 5 )1 5 l a d a p t o r2 连接的t e s t e d 2 ( 见步骤2 2 8 5 ) 1 5 l 4 x h y b r i d i z a t i o nb u f f e r 1 0 此1 0 l 终体积40皿40ul # 孢子化卵囊的e d n a 为t e s t e r ，末孢子化卵囊的e d n a 为d r i v e r 记为t i i 和t | - 2 以相同的杂交体系建立其它的三组杂交反应，为便于分清，子孢子e d n a 为t e s t e r ，孢子化 卵囊e d n a 为d r i v e r ，记为t 2 一l 和t 2 - 2 ；子孢子e d n a 为t e s t e r ，未孢子化卵囊e d n a 为d r i v e r ， 记为t 3 1 和t 3 - 2 对照组为佴1 和t 4 - 2 。 ( 3 ) 匀后，加一滴矿物油覆盖，轻微离心。 ( 4 ) 9 8 ( 29 0s & c r 仪) ，然后6 8 c 孵育1 0h 。反应结束后立即进行第二轮杂交。 2 2 8 8 第二轮杂交 第一轮杂交后两个样品混合再加入过量的新鲜变性的d r i v e r 进行第二轮杂交，使差异表达 基因进一步得到富集，这一轮杂交获得的杂交分子带有两种不同的接头。 ( 1 ) 在0 5 m l p c r 管中加入下列物质： d r i v e re d n a ( 见步骤2 2 8 4 )1 n l 2 9 中国农业科学院博l 学位论文第一章柔嫩芟羹耳球虫孢予发育阶段抑制性消减文库的构建 4 x h y b r i d i z a t i o nb u f f e rl 此 s t e r i l e h 2 0 2u l ( 2 ) 将上述物质混匀后取1i i l 至新的0 5 m l p c r 管，加一滴矿物油覆盖。 ( 3 ) 将p c r 管置于p c r 仪上9 8 变性1 5 r a i n 。 ( 4 ) 通过下面操作将变性的d l 曲c re d n a 与第一轮的杂交样品1 和2 同时混合。首先将 微量移液器调至1 5i l l ，处，在含有杂交样品2 的p c r 管中轻轻将移液器吸头触及矿物油群品的 界面，小心将所有的样品吸入吸头，然后移开吸头并吸入少量空气；随即在新鲜变性的d r i v e r 管 中重复同样的步骤；最后将全部液体移入含杂交样品l 的管中，用吸头上下混匀。 ( 5 ) 轻微离心，6 8 c 杂交孵育过夜( 2 0h ) 。 ( 6 ) 加入2 0 0 止稀释液混匀后，于p c r 仪中6 8 孵育7 m i n ，- 2 0 c 保存 4 组杂交样品杂交后，为便于分清，记为z b h ( 子孢子e d n a 为t e s t e r ，孢子化卵囊e d n a 为d r i v o r ) ，z w - h ( 子孢子e d n a 为t e s t e r ，未孢子化卵囊e d n a 为d r i v e r ) ，b w - h ( 孢子化卵 囊e d n a 为t e s t e r ，未孢子化卵囊e d n a 为d r i v e r ) ，试剂盒中提供的人骨骼肌对照组为d - h 。 2 2 8 9i c r 扩增反应 第一次f c r 扩增反应： ( 1 )准备p c r 模板：取二轮杂交后的稀释液( z w - h ，z b h ，b w - h ，d - h ) 各1 儿和 t e s t e r 未消减对照组( t i - c ，t 2 c ，t 4 - c ) 各l 儿为模板。 ( 2 ) 加入下列p c r 反应体系 p c r 反应体系成分体积( 皿) s t e r i l eh 2 01 9 5 1 0 x p c rr e a c t i o nb u f f e r 2 5 d n t pm i x ( 1 0 r e t o o l l ) 0 5 p c r p r i m c r l ( 1 0 “m o l l ) 1 0 5 0 x a d v a n t a g ee d n ap o l y m e r a s em i x 0 5 p c r 模板1 0 t o t a lv o l u m e2 5 0 ( 3 ) 混匀后，轻微离心，加5 0 u l 矿物油覆盖。 ( 4 ) 于p c r 仪上7 5 ，孵育5 m i n 。 ( 5 ) 立即进行p c r 循环，条件为：9 4 3 0s ；6 6 3 0s ；7 2 ( 21 5 m i n 。共2 7 个循环， 反应结束后取8u l p c r 产物进行2 琼脂糖凝胶电泳分析结果。 第二次f c r 扩增反应： ( 1 ) 第一次p c r 产物3 皿加2 7 i i l h 2 0 ，混匀后取l 皿作为第二次p c r 扩增的模板。 a ，2 6 ，0 k d a ，2 0 0 k d a ，1 4 4 k d a ) ：l l 重组质粒4 t - a 0 8 在i p t g 诱导后1 2h 的表达产物；2 ：纯化的4 t - a 0 8 重组蛋白 r q ；5 , - 7 t h ep u r i f i e dp c g x 4 t - a e on m m n b i n n tp r o t e i n m ：p r o t e i nm a r k c f ( f r o mu pt od o w n ：9 4 0k d a ，6 6 2k d a ，4 5 0k d a ，3 5 0k d a ，2 6 0k d a 2 0 0k d a ， 1 4 ak d a ) ：l ；4 t - a 0 8 b l 2 1i n d u c e dw i t i n 删f o r1 2 h ：2 ：p u r i f i e d4 a 0 8r e c o m b i r m a tp r o t e i n 5 3 2 a 重组质粒4 t - f 0 4 在大肠杆菌中的表达及重组蛋白的纯化 b w 3 f 0 4 基因o r f 含1 3 s 6 b p ，编码4 6 2 个氨基酸，理论分子量为5 0 1 4 k d a ，与p g e x - 4 t - 2 连接构建的重组表达质粒4 t - f 0 4 ，经终浓度i m m o l li p t g 诱导后，表达的重组蛋白大约为7 6 k d a , 经s d s - p a g e 电泳后发现重组蛋白的大小与预期的一致。从图中可以看出，加入i p t g 诱 导后8h 时，表达即达高峰，随着诱导时间延长，表达量有所增加，但不明显( 图5 8 ) 。重组表 达菌离心、超声裂解后，上清和沉淀经s d s p a g e 分析后，发现表达的重组蛋白以包涵体存在， 经纯化后获得了融合蛋白g s t - a 0 8 ( 图5 9 ) 。 1 l8 中国农业科学院博卜学位论文第五章柔嫩艾茭耳球虫新基田在大肠杆菌中的表达 圈5 - 8s d s - p a g e 分析4 t - w 0 4 b l 2 1 不同时相的表达蛋白 m ；蛋白质标准分子量( 从上至下：9 4 0k d a ，6 6 2k d a ，4 5 0k d a ，3 5 ，0k d a ，2 6 0k d a ，2 0 0k d a ，1 4 4 k d a ) ；l ，2 ：空载体p g e x - 4 t - 2 在i f f g 诱导后0 h 、1 0 h 的表达产物；3 - 9 ：重组质粒4 t - f 0 4 在1 p t g 诱导 后0 h 、2 h 、4 h 、6 h ，8 h 、1 0 h 、1 2 h 的表达产物 矾g 孓s s d s - p a g ea n a l y s i so f e b ee x p r e m i e lp r o d a c t so f 4 t - 1 m 4i ae e o f f m ；p r o t e i nm a r k e r ( f i o mu pt od o w n ：9 4 0k d a ，6 6 2k d a ，4 5 0k d a ，3 5 0k d a ，2 6 0k d a ，2 0 0k d a ， 1 4 4 k d a ) ；l a n e l - 2 ：p g e x - 4 t - 2 b l 2 1i n d u c e d w i t h i p t g f o r o ha n d1 0 h ：l a n e 3 - 9 ：4 t - f 0 4 b l 2 1i n d u c e d w i t h i p t g f o r o h 、2 h 、4 h 、6 h 、8h ，1 0 h a n d1 2 h 图5 - 9 纯化的4 t - f 0 4 重组蛋白 m ：蛋白质标准分子量( 从上至下：9 4 0k d a ，6 6 2k d a ，4 5 0k d a ，3 5 0k d a ，2 6 0k d a ，2 0 0k d a ，1 4 4 k d a ) ；l - 2 ：纯化的4 t - f 0 4 重组蛋白；3 ：重组质粒4 t - f 0 4 在i p t g 诱导后8 h 的表达产物 f i g ”t h ep a r i f i e d4 t - f 0 4r e e e m b i a a a tp r o t e i n m ：p r o t e i n m a r k e r ( f r o mu p t o d o w n ：9 4 0 k d a ，6 6 2 k d a ，4 5 0 k d a ，3 5 0 k d a ，2 6 0 k d a 2 0 0 k d a ， 1 4 4 k d a ) ；i - 2 ：p u r i f i e d 4 t - f 0 4r e c o m b i n a r l tp r o t e i n ：3 ：4 t - f 0 4 b l 2 1i n d u c e d w i t h i p t g f o r 8h ： 1 1 9 中国农业年= 学院博【+ 学位论文第五章柔搬芟美耳球虫新幕闻存夫肠杆菌中的表达 5 3 3 重组表达蛋白抗原性的鉴定 将纯化的重组蛋白4 t - e 0 6 ，4 t - a 0 2 、4 t - a 0 8 、4 t - f 0 4 进行s d s - p a g e ，再转移至p v d f 膜 上，用最t e n e l l a 卵囊口服免疫鸡( 四次) 的抗血清作为一抗，羊抗鸡i g g 作为二抗进行w e s t e r n b l m 分析。结果4 个重组蛋白都不同程度出现了反应条带，分子量与预期结果大小一致( 图 5 1 0 a 、b 、c 、d ) ，表明4 个表达的重组蛋白都具有一定的抗原性。 1 2 0 中国农业科学院博卜学位论文第五章柔嫩芏荚耳球虫新基因存大肠杆菌中的表达 图s - 1 0 重组蛋白w e s t e m - b i o t 分析 m i ：预染的标准蛋白分子量( 从上至下：1 7 0 k d a 、1 3 0 k d a 、9 5 k d a 、7 2 k d a 、5 5 k d a 、4 3 k d a 、3 4 k d a 、 2 6 k d a 、1 7 k d a ，l ii c d a ) ；m 2 ：标准蛋白分子量( 从上至下：9 4 0 k d a ，6 6 2 k i y a ，4 5 0 k d a ，3 5 0 k d a ，2 6 0k d a ，2 0 0k d a ，1 4 4k d a ) ：九l 纯化的重组蛋白4 t - e 0 6 ； b 1 ：纯化的重组蛋白 4 t - f 0 4 ； c 1 ：纯化的重组蛋白4 t - a 0 2 ；d 1 ：纯化的重组蛋白4 t - a 0 8 ； l r l 9 5 - 1 0w 柚a n - b l o t i n l l i y 出o f p u r i f i e dr e c o m b i m m t p 哪西 m 1 ：p r e s t a i n c d p r o t e i n l a d d e r ( f r o m t o d o w n ：1 7 0 k d a 、1 3 0 k d a ，9 5 k d a 、7 2 k d a 、5 5 k d a 、 4 3k d 凯3 4k d a 、2 6k d a 、1 7k d 8 、l lk d a ) ：m 2 ：p r o t e i ni i 尬r k e r ( f r o mu pt od o w n ：9 4 0k d a 6 6 2 k d a ，4 5 0k d a ，3 5 0k d a ，2 6 0k d a ，2 0 0 k d a ，1 4 4k d a ) ；a 1 ；p “f i c dr c c m n b i n a mp r o t e i n4 t - e 0 6 b hp u r i f i e dr e c o m b i n a mp r o t e i n4 t - f 0 4 ： c 1 ：p u r i f i e dr e c o m b i n a n tp r o t e i n4 1 b a 0 2 ：d 1 ：p u r i f i e d r e c o m b i n a mp r o t e i n4 i 栅 5 4 讨论 应用原核载体表达外源基因是研制基因工程产品的常用手段。但是，外源基因高效表