（有机化学专业论文）彩绒革盖菌草酸脱羧酶的诱导制备.pdf

0 彩绒苹盖菌早酸脱羧酶的诱导制备 彩绒革盖茵草酸脱羧酶的诱导制备 摘要 草酸脱羧酶是一种含锰的酶，在木腐菌中广泛存在，少数低等真 菌和细菌中也能产生。该酶的应用主要集中在以下几方面：造纸废水 中的草酸盐降解；食品中的草酸降解；草酸的生物法检测( 如l 临床诊 断、食品中草酸检测) 等。由于草酸脱羧酶产量较低和提取较困难， 使得草酸脱羧酶的生产成本大大提高，从而限制了该酶的应用。一些 特殊氨基酸序列的存在决定了该酶的表达形式为诱导型，菌株的基因 调控序列中含有一段受草酸化合物作用的序列，并有一段可以被低p h 诱导的序列，具体的诱导调控机制不详。为了进一步了解该酶的详细 诱导机制，进而提高其产量，本研究利用各种酸诱导彩绒革盖菌制备 草酸脱羧酶，并初步推测了各种酸诱导产酶的机制( 底物诱导和低p h 值诱导) ，并尝试优化了该酶的提取条件。 本课题首先研究彩绒革盖菌的诱导产酶。主要研究该酶的各项诱 导因素，包括诱导剂的种类、诱导p h 值等影响因素。所用的诱导剂为 无机酸、有机酸及有机酸根离子( 例如盐酸、硫酸、磷酸、草酸、醋 酸、柠檬酸、草酸根离子、醋酸根离子、柠檬酸根离子等) ，控制其 离子强度和培养液p h 值来观察诱导产酶情况。 通过测定菌体生长过程中的不同参数( 例如酶活、蛋白含量、生 物量等) 来比较不同诱导条件下的产酶优劣，发现无机酸可以显著诱 导彩绒革盖菌合成草酸脱羧酶，其中硫酸的诱导效果最好，比酶活i i 孽季乏学 瞄队疆：船丌 彩绒革盖菌学酸脱羧酶的诱导制备 最高为1 0 ou g 菌体干重；比酶活i i 最高为3 2u ，m g 蛋白质。本实验 还研究了p h 值对菌体产酶的影响，发现p h2 5 较利于诱导草酸脱羧 酶。有机酸中草酸的诱导效果最好，添加草酸后第二天获得最大酶活， 比酶活i 最高为6 7u g 菌体干重，比酶活i i 最高为1 ou m g 蛋白质， 其后酶活逐渐消失。柠檬酸的酶活在培养后期逐渐升高。有机酸根离 子中醋酸钠的诱导效果最好，比酶活i 最高达1 8u 儋菌体干重，比酶 活i i 最高达o 2u m g 蛋白质。 对各种诱导剂的诱导产酶结果进行综合比较，发现无机酸的诱导 效果最好，体积酶活较高，都大于2 0 ou l ，酶产率都大于2 。5u ( l d ) ， 最大比酶活i i 都大于9 5u 儋菌体干重。根据各种诱导剂在发酵液中存 在的形式进行对比分析，推测无机酸与柠檬酸诱导产酶的机制是低p h 环境诱导，草酸的诱导产酶机制是底物诱导，醋酸的是底物结构类似 物诱导。 本实验还对彩绒革盖菌草酸脱羧酶的提取条件进行了优化。在提 取缓冲液中添加吐温8 0 ，较利于酶的提取；当提取缓冲液p h 为3 o 时，酶的提取率最高。 关键词：草酸脱羧酶，彩绒革盖菌，草酸，诱导因素，提取 i i 孽季天学 彩绒革盖菌警：酸脱羧酶的诱导制备 i n d u c t i o no fo x a l a t ed e c a r bo x y l a s ef r o m a b s t r a c t o x a l a t ed e c a r b o x y l a s e ( o ) 【i ) c ) i sak i n do fm n - c o n t a i n i n ge n 纠m e ，w h i c hi sw i d e l yd j s t r i b u t e d i nw o o dr o tf u n 舀af e wo t h e rf u n g ia n db a c t e r aa l s oc 绷p m d u c et h ee n z y m e c u r r e n t l y m o r et h 锄 t e no x a l a t ed e c a r b o x y i a s e sf o md i 毹r e n ts o u r c e sh a v ea l r e a d yb e e ni s o l a t e d 锄dp u r i e e d o x a l a t e d e c a r b o x y l 笛e sw e r es u c c e s s 如l l ya p p i i e di ns e v e r a la r e a s ，s u c h 笛e n 巧m a t i cd e g r a d a t i o no fo x a l i c i di nt h ep u l p 卸dp a p e ri n d u s t r y 矾df o o dj n d u s t 私w e l la sb i o l o g i c a la n a l y s i so fo x a l i ca c i d ， e t c b e c a u s e0 ft h el o wp r o d u c t i o na n dl o w e re x t m c t i o ne 用c i e n c yo ft h i se n z y m e ，t h ep r o d u c t i o n c o s to fo x d ci sm u c hh i g h e r t h 吣l i m i t i n gt h ee n 2 y m ea p p l i c a t i o n s i n d u c b i ee x p r e s s i o no fo x a l a t e d e c a r b o x y l a s ei sd e t e 珊i n e db ys o m es p e c ia la i n i n oa c i ds e q u e n c e s ，b u tt h es p e c i f i cr e g u j a t o r y m e c h a n i s mi ss t i l lu n k n o w n i no r d e rt os t u d yt h ei n d u c t i o no fo x d ci nd e t a j l ，t oi m p r o v ey i e l d s 锄d t or e d u c et h ec o s to fo x d c ，i ti sf i r s tt i m et os t u d yt h ep r o d u c t i o no fo x d cb ya c i di n d u c t i o n ，t o d i s c u s st h em e c h a n i s mo fo x d ci n d u c t i o na n dt oo p t i m i z et h ee x t r a c t i n gc o n d i t i o n so fo x d ci nt h i s p a p e r f i r s t l y ；t h ep r o d u c t i o no fo x d cf b mzv p 坶缸d ，c 胪w a ss t u d i e d t h ea s p e c to fr e s e 2 l r c hi s m a i n l yf o c u s e do ni n d u c i n gf a c t o r si n c i u d i n gi n o r g a n i ca c i d s ( h y d r o c h l o r i ca c i d ，s u l f u r i ca c i da n d p h o s p h o r i ca c i d ) ，o r g 卸i ca c i d s ( o x a l i ca c i d ，a c e t i ca c i d 卸dc i t r i ca c i d ) a n do 唱a n i cs a l t s ( o x a l a t e ， a c e t a t ea n dc i t r a t e ) t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l l i n o 唱a n i ca c i d sc o u l di n d u c eo x d ce x p r e s s i o n o b v i o u s l y - t h eh i 曲e s ts p e c i f i ca c t i v 时a g a i n s td r ym y c e l i aw e i 曲tw 弱l0 。o ou 绝a n dt h eh i g h e s t s p e c i f i ca c t i v 时a g a i n s tp r o t e i nw 鹊3 2 0u m gw h e ns u l f u r i ca c i dw 雒u s e d t h et o t a lo x d c a c t i v i t yi n d u c e d b yo x a i i ca c i dr e a c h e dh i 曲e s ta tt h ef i r s tt 、v od a y sa n dt h e nd e c r e a s e dq u i c k l ya tt h e f o l l o w i n gd a y s ，t h eh i g h e s ts p e c i f i ca c t i v i t ya g a i n s td 口m y c e l i aw e i g h tw 鼬6 7 0u 倌a n dt h eh i g h e s t s p e c i f i ca c t i v i t ya g a i n s tp r o t e i nw 雒1 0 0u i n g t h eo x d ca c t i v 时i n d u c e db yc i t r i ca c i dr o s e c o n t i n u o u s l yi nla _ c c r 伊o w i n gs t a g e o x 【) ca c t i v 时舔e ra d d j t i o no fa c e t i ca c i dw 硒n o td e t e c t e d o x d ca c t i v 时w 勰a l s oi n d u c e db ya c e 协t eo b v i o u s l y t h eh i 曲e s ts p e c i f i c a c t i v i t ya g a i n s td 叫 m y c e l i aw e i g h tw 船1 7 7u 绝a n dt h eh i 曲e s ts p e c i f i ca c t i v i t ya g a i n s tp r o t e i nw a so 2 3u m g 。 i a r e rc o m p r e h e n s i v ec o m p a r i s o no f t h ey i e l d so fo x ) co b t a i n e db yu s i n gd i 仃e r e n ti n d u c i n g f k t o r s ，t h er e s u l t ss h o w e dt h ey i e l d so fo x ) ci n d u c e db yi n o 唱卸i ca c i d sw e r em o r eh i g h e r t h 锄b y o t h e ri n d u c e r s ，t h eh i g h e s tv o l u m ea c t i v i t i e so fo x d cw e r ea l l h i g h e rt h a n2 0 0u l ，t h e p r o d u c t i v i t i e so fo x d cw e r ea l lm o r et h 锄2 5u ( l d ) ，跏dt h eh i g h e s ts p e c i f i c t i v 时a g a i n s td d r m y c e l i aw e i g h tw e r ea l lh i g h e rt h a n9 5u 绝。t h ep o s s i b l ei n d u c l i o nm e c h a n i s mb e h i n di n o 唱a n i c a c i d s 卸dc i t r i ca c i di s i o w - p hi n d u c t i o n ，w h i i et h ep o s s i b l em e c h 锄j s mb e h i n do x a l i ca c i di s s u b s t r a t e i n d u c e da n dt h ei n d u c t i o nm e c h a n i s m0 fa c e t i ca c i di ss u b s t r a t e 锄a l o g u e - i n d u c e d e x t r a c t i n gc o n d i t i o n so fo x d cw e r eo p t i m i z e d m o r eo x d ca c t i v 时w o b t a j n e db y 峪i n g m e t w e e n 8 0 a u d d e de x t r a c t i n gs o l u t i o n s w h e np hv a l u eo f t h ee x t r a c t i o nb u f f e rw 弱3 o ，t h eh i 曲e s t e x t r a c t i o np e r c e n tw a sg a i n e d c u i x i az h u ( o 唱a n i cc h e m i s 仃y ) s u p e l v i s e db y f e n gh o n g k e yw o r d s ：o x a l a t ed e c a r b o x y l 雒e ，7 ，口历p f 甜w 坶f c d 肠，i n d u c i n gf i a c t o r s ，e x t r a c t i o n i v 聋季乏学 影耻口：咖 f 彩绒革盖菌学：酸脱羧酶的诱导制餐 附件一： 东华大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师 的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已明确注明和引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲白撰 写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 牺谈 日期加肝1 月1 日 0 撼臻 彩绒革盖菌草酸脱羧酶的诱导制备 附件二： 东华大学学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解学校有关保留、使刖学位论文的规定，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印什和电子版，允许论文被夯阅或借阅。本人授权东华人学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。可以采川影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密a 。 学位论文作者签名： 蒙事次 日期：础年j 月1 ：日 指删币签名：了兹末氓 日期：) 一8 年1 月7 日 0 彩绒革盖菌学酸脱羧酶的诱导制各 第一章前言 草酸是自然界中常见的一种有机酸，多是以草酸盐的形式存在，是生物体生 长过程中的一种代谢产物，生物体中重要的代谢途径三羧酸循环与乙醛酸循 环中都有草酸生成【i 】。草酸盐能够与体内的一些金属离子络合形成化合物。在生 物体内，草酸水平过高形成草酸盐积累会对生物体产生一定的毒性。例如：在一 些植物( 豆类、番茄、向日葵等) 中，草酸盐的积累会导致植物营养缺失、生长 停滞等相关症状。在人类和其它脊椎动物中，由于草酸盐的积累易产生尿结石、 肾结石、高草酸尿、低血钙症、维生素b 6 缺乏等症状圆。不同的生物体内，草 酸代谢产生以及草酸盐积累的量有一定的差异，这主要与生物体本身的草酸降解 能力有关。另外，在一些工业生产中，由于草酸络合金属离子产生沉积，造成堵 塞管道、筛孔等现象。如：制浆造纸以及啤酒工业中，经常会遇到这些问题。因 此降解草酸，减轻其对人及工业造成的危害非常重要。 草酸可以通过生物酶降解的方法除去。酶降解草酸的途径主要有以下三种： ( a ) 草酸氧化酶的降解【引、( b ) 草酸脱羧酶的降解【4 1 、( c ) 草酰辅酶a 脱羧 酶的降解纠。 o o o o o o a i a l eo x j d a s e 0 22 h + 2 c 0 2 + h 2 0 2 o h 型兰竺掣坐l c 0 2 + ”c a t o ，”。h + o h s c o a o x a i y | - c o ad e c a r b o ) c y l a s e h h + 一 c 0 2 + 图1 1 草酸的不同降解途径 o o s c o a 0 彩绒革盖菌革酸脱羧酶的诱导制冬 草酸氧化酶主要由大麦芽中提取p j ，植物的生长周期及生长条件极大地限制 了产量，售价高昂；草酰辅酶a 脱羧酶【5 j 主要存在于原核生物中，因为有辅酶a ， 对酶的稳定和提取都需要很高的要求；草酸脱羧酶有广泛的微生物来源【4 】，反应 条件要求简单，因此利用草酸脱羧酶降解草酸更可行。然而，草酸脱羧酶的低产 量极大地限制了其广泛应用，因此本论文以期通过用各种诱导剂诱导产酶来提高 酶产量并分析讨论诱导机制。为进一步提高该酶的产量提供理论基础。 草酸脱羧酶的研究虽然有较长的历史，但在很长时期里，主要集中在体内功 能的研究，如它在真菌自身发育分化中的定位、分布、专一性、可能的生理功能 等。随着生物技术，特别是分子生物学的发展，草酸脱羧酶的研究也掀开了新的 一页，从体内功能研究发展到体外分子性质和功能研究，取得了巨大的进步，主 要表现在以下几个方面：分离纯化了很多来源的草酸脱羧酶，进行了理化性质和 生化性质的研究；克隆和表达了部分基因；拓展了酶的用途。 1 1 草酸脱羧酶的来源 表1 1 能产草酸脱羧酶的菌种 属名 菌种名 a g n r t c u s a s p e r g m u s a s p e r 蛋n s b a c i l l t l s 只口，咒，行“，f ，7 口 d i c h o m i i h s h e t e r o b 8 s i d i o n m y r o t h e c i t l m p h a n e r o c h a e t e p h 8 n e r o c h a e f e p 0 s n n s d e r o t i n i 口 t r a m e t e s t r a ，n e t e s a g q r i c u sb i s p o r m q a s p e r g i l l m sn l g e l 4 印p 曙f z j 淞p 厅d p f c d l 3 l b 口c t i u ss h b m i u 砌m 所“，切口v p ，甜，场p 【4 ，1 5 】 d 记厅d _ ，2 f ，淞s 口枷把埘【1 6 】 h e e e r o b 口s i d i o nq n n o s u 矗、钧 西，| d 腑2 c f “， ，馏，甜c 口，f 口【l 7 】 p h 口n e r o c h c i e t ec h r y s o s p o r t u 豫p 圈 p 向口玎p r o c 口p ，pj 口憎加p 口f 1 6 】 p d s ，f 口p 肠c p 门f 口1 1 2 1 9 j s c z e r o t i n i ns c l e r o t i o r t l 付 i 、q z t ，口m p ，p sv p ，s f c d 肠，1 2 0 】 7 砌， f ，e sd c 办，口c p 口【l 6 】 0 彩绒革盖菌草酸脱羧酶的诱导制备 草酸脱羧酶( o x a l a t ed e c a r b o x y l a s e ，o x d c ，e c4 1 1 2 ) 是一种含锰酶，与植 物体系中的草酸氧化酶【6 i 、刀豆球蛋白i7 1 、菜豆球蛋白i g 】同属于c u p i n 蛋白家族， 在结构和功能上存在着许多相似性。该酶最早由s h i m a z o n o 在白腐菌中被发现【4 1 ， 后来也发现褐腐菌尸o s 砌p 勉c e 抑科汜j 和软腐菌彳印p 堰f 池s 捍劫r 和彳芦矽馏f 淞 肋d p 门f c 对b l 能产该酶，但在木材腐朽真菌，尤其是白腐菌中分布更广。在其它真 菌中报道相对较少。后来又在豚鼠( 天竺鼠) 的肝脏中发现该酶，其它动物的肝 脏中则未见报道【9 1 。1 9 8 7 年m a g r o 等【1 0 l 在植物致病真菌昆，d ，f 疗衙s c 彪加，f d ，“m 中 分离得到一种草酸脱羧酶，其具体性质尚未可知。最近，有研究发现枯草芽孢杆 菌b 叩f 盯姗s 幻f f 胁在低p h 值环境下也可诱导合成草酸脱羧酶【l l 】。表1 1 给出了已报 道的能产草酸脱羧酶的主要菌种。 1 2 草酸脱羧酶的性质 近些年来，提纯了约十多种不同来源的草酸脱羧酶，并对其性质作了进一步 的研究。这些酶蛋白的表观分子量有很大的差异( 5 5k d a 2 6 4k d a ) ；通过免 疫金细胞化学标记技术，显示该酶存在于包囊内靠近细胞质膜【2 0 j ：皆为单体酶， 酶分子中一般都含有两个锰原子；适宜的反应温度较低，一般在室温左右；在低 酸度下有较好的活性；对底物具有很好的专一性，底物主要为草酸。金针菇产的 草酸脱羧酶的生化性质已经被详细研刭2 5 】：该酶的分子量为6 4k d a ，去糖基化后 酶的分子量为5 5k d a ；以草酸钾为底物，k m 值约为4 5m m ，最大酶反应速度v m 戡 为1 6 6p m o l m i n 1 m 分1 ，该酶可被磷酸根离子竞争性抑制，抑制常数k i 为9m m ： 对草酸具有高度的底物专一性，酸度活性范围较宽；热稳定性较好：酶活性不受 巯基等还原剂的影响：对s d s 等蛋白变性剂亦具有良好的抵抗性。 不同来源的酶在反应最适p h 值与辅助因子有一定差异。来源于白腐菌的酶， 最适p h 值在2 5 3 o 范围内【2 0 】：来源于褐腐菌的酶，最适p h 值在2 o 2 2 之削1 2 】； 来源于软腐菌的酶，最适p h 值在1 1 左右；来源于细菌的酶，最适p h 值在6 9 左右，催化反应需要a t p 、c o a 、m 矿+ 、硫胺焦磷酸( t h p p ) 、醋酸作为辅助条 件【2 2 j 。但它们有很多相似的性质【2 1 l ：( 1 ) 催化底物的反应都不需要其它辅助因 素，仅需要催化量的氧，( 2 ) 在低酸度下活性都较好，( 3 ) 对草酸有高度底物 专一性，( 4 ) 都含有两个键合锰原子。但天然草酸脱羧酶一些性质的局限性妨 碍了其有效作用，因而有必要对酶空间结构进行适当的改造。t 锄e r 等【i i ，2 4 】利用 枯草芽孢杆菌肋c 甜，淞s 幻f f 凰的y ”，肺妒神瑾因的表达来研究该酶的基因编码序 列：i n c h i 等【2 2 】利用重组酶的晶体结构研究其催化机理，并对该酶作了深入研究。 0 彩绒革盖菌学酸脱羧酶的浃导制备 1 3 草酸脱羧酶的结构及活性中心 对草酸脱羧酶进行n m r 、e p r 光谱分析，并与与刀豆球蛋白、菜豆球蛋白、 大豆球蛋白等同源种子贮藏蛋白比较分析，对草酸脱羧酶的生物化学及结构特性 有了较为深入的了解。该酶单体结构含有两个结构相似的c u p i n 结构域，在每个 域的中心部位含有一个金属结合位点，与周围的氨基酸残基结合成为双核中心， n 一末端还含有短螺旋突出肽链i 翻。 晶体衍射与蛋白序列测定研究更详细描述了草酸脱羧酶的空间结构。r u c h i 掣博j 通过测定来源于丑口c f ，掰ss “搬凤的草酸脱羧酶的氨基酸序列，分析比较得出 该酶蛋白约含有3 7 9 氨基酸残基多肽序列。该酶单体结构含有两个c u p i n 结构域， 结构域i 包含一段5 6 2 3 3 氨基酸残基序列，结构域i i 包含一段2 3 4 3 7 9 氨基酸 残基序列和n 端一段8 5 5 氨基酸残基序列，对比后发现两个域的序列有2 7 同 源性。域结构与序列的高同源性表明草酸脱羧酶在进化中是编码c u p i n 结构域基 因复制的产物，同时对比b i c u p i n 种子贮藏蛋白的结果也证明了这一点i 确。通过得 到枯草芽孢杆菌肋c 以淞j 肋r 玎括草酸脱羧酶的结晶，分析了同一晶体在1 7 5 a 分辨 率条件下的x r a y 图谱。表明单个酶分子由两个c u p i n 结构域组成，每个域都具有 一个五链的反平行p 一折叠和一个七链的反平行p 一折叠，这两个p 一折叠形成了 一个果冻卷饼型的拓扑结构【2 引。金属锰离子周围分别连有三个组氨酸和一个谷氨 酸保守性氨基酸残基，形成一个八面体几何构型。晶体结构分析发现，在结构域 i i 的金属中心，谷氨酸3 3 3 在催化脱羧反应中起着重要作用，它是作为甲酸形成 的一个质子供体，通过把谷氨酸3 3 3 突变成丙氨酸，发现酶催化活性有很大降低 【2 l j 。当时推断，该酶的催化活性中心可能主要是在结构域i i 的结合位点上。后来 发现结构域i 的金属中心，谷氨酸1 6 2 也能起到质子供体的作用并参与反应，结 构域i 也有催化活性1 2 2 。并发现结构域i i 有一个可允许底物进入与产物释放的通 道，验证了仅仅是锰结合位点调控催化的假说。进一步实验验证两个锰离子协同 作用催化反应，然而机理未明田j 。 1 4 草酸脱羧酶的催化机理 草酸脱羧酶催化底物反应属于一个非氧化脱羧反应，关于它的机理存在着一 个新的机理解释问题。在对该酶光谱学、同位素效应以及晶体衍射研究的基础上， r u c h i 掣2 5 1 提出了其催化机理( 见图1 2 ) 。 4 0 彩绒革盖菌荦酸脱羧酶的诱导制螽 ， 这个机理假设建立在以下四个方面的论述上：( 1 ) 草酸脱羧酶的催化活性 与分子氧的浓度有关【2 7 ，3 0 】；( 2 ) 由于酶的活性中心锰离子的存在，能够从结合 的底物上获得电子【1 0 ，2 7 】：( 3 ) 该酶催化底物反应不需要其它辅助因烈2 2 】：( 4 ) 从底物和产物来看，该催化反应不是 纯粹的氧化还原反应。在这个机理中，基于单电子转移的基础上，二氧化碳的形 成是底物羧酸盐脱质子形成羧酸盐阴离子的结果：m n ( i i ) 和m n ( i i i ) 是通过氧化 还原的形式参加反应的；g l u - 3 3 3 在反应中起碱的作用；从反应的过程看，脱羧 反应是c c 键的异裂【3 0 】。 ( h ) o o h s 竺 n - i p h i ，i 飞 h i s o 。从g 岫。 o h ”h ”a b s t r a c t i o n h 、n + h h 、叩火警八a r 9 2 7 。 ii hh o ( h ) 0 、0 h s 2 n - i p h i s ，i 飞 鞫n “勺? 二孰k i u 3 ：孙焉弋飘迂弋 h 、l ；l 火i ：i ：为h 、甲儿l ：i ：为 1 5 草酸脱羧酶的酶活测定方法 酶活性大小是研究酶特性、进行酶制剂生产及应用的一项必不可少的参数。 测定草酸脱羧酶活性的方法有h p l c 法【1 2 】、分光光度法【3 1 1 、测压法【3 2 1 等。 目前测定草酸脱羧酶的活性通常以草酸作为底物，测定酶对其催化脱羧的速 度。酶的活性可以通过测定分解产生的甲酸的量或草酸分解减少的量得到。甲酸 的测定可以用h p l c 法【引，草酸的测定可以通过h p l c 【3 3 】或酶法测定【3 4 l 。1 9 8 0 年 b e u t l e r 等p l j 人以草酸为底物，加入辅酶n a d + 以及甲酸脱氢酶，用分光光度法在 3 4 0m 处测定其吸光值从而得到甲酸的量。一个酶活力单位定义为在一定条件下 h n h + 、w = 盐酸 1 9 “n”n“让 h d 餐髓越 0 彩绒革盖菌学酸脱羧酶的诱导制备 磷酸 硫酸。 3 、无机酸对菌体利用碳源的影响 一对照一盐酸一硫酸十磷酸 图2 4 加入无机酸后发酵液残糖含量的变化趋势 对照样的发酵液残糖含量在培养阶段一直在下降，由1 4 2 0g l ( 第1 天) 降 至1 2 2g l ( 第9 天) ，葡萄糖浓度平均变化幅度为1 4 4g l 1 d - l 。添加无机酸后， 发酵液的残糖含量变化趋势与对照样的变化类似，葡萄糖含量都是逐渐降低，下 降幅度略低。残糖含量下降的幅度由小到大依次为硫酸 盐酸 盐酸 磷酸，表明无机酸对菌体的生长也有一定的抑制作用。 单季天学 啦；e 址啊i 舢丌 彩绒革盖菌草酸脱羧酶的诱导制备 + 对照+ 盐酸一硫酸十磷酸 图2 5 菌丝体干重的变化趋势 5 、无机酸对酶液蛋白含量的影响 对照样的蛋白含量在4 到9 天内，都在4 0 0p g 左右，基本无变化。三种无 机酸诱导的菌体的蛋白含量与对照样相比，蛋白含量下降明显，三种无机酸诱导 的菌体蛋白含量都在2 0 0 腭以下( 图2 6 ) ，尤其是加硫酸的样品第五天后，蛋 白含量均在1 0 0 肛g 以下。 说明无机酸对菌体蛋白的合成具有明显的抑制作用，三种无机酸的蛋白含量 与对照组样比几乎低了一半；加硫酸的发酵液p h 较低( 图2 3 ) ，提取蛋白的量 也最低，低p h 环境可部分抑制菌体蛋白的合成。 一对照+ 盐酸+ 硫酸十磷酸 图2 6 提取酶液中蛋白含量的变化趋势 2 t 彩绒苹盖菌单酸脱羧酶的诱导制餐 6 、三种无机酸对菌体生长影响的比较分析 三种无机酸的加入对菌体生长的影响作用类似，均可抑制菌体生长( 见表 2 7 ) 。添加三种无机酸后发酵液p h 值都在2 5 左右，因此可推测主要是p h 值即 氢离子浓度对菌体生长造成的影响。从菌体形态、残糖含量、菌体干重和蛋白产 量的变化幅度都可以看出对菌体生长的影响由大到小依次为硫酸 盐酸 磷 酸 对照，而硫酸的p h 值最低，这表明在p h2 5 3 0 范围内，p h 越低，对菌 体的生长抑制也就越明显，同时也与阴离子的种类有关，磷酸根离子可以为菌体 提供磷酸，可以促进菌体的生长，在p h 值相对高的情况下，氯离子抑制菌体的 生长较严重主要因为是生物体中含有许多氯离子通道，因而氯离子对菌体有一定 的毒性。 表2 7 三种无机酸对菌体生长影响的比较 盐酸、硫酸、磷酸三种无机酸对彩绒革盖菌的生长有抑制作用，主要因为其 造成的低p h 环境，而p h 环境是菌体生长外环境的重要因素之一【5 ，它可以影 响细胞膜的电荷，从而影响微生物对营养物质的吸收：它也影响代谢过程中酶的 活性，从而影响微生物的生命活动。 彩绒革盖菌生长过程中会分泌草酸和其它有机酸【l6 】( 有机酸对其影响见本论 文第三章) ，使胞外p h 环境降低，根据对照样发酵液p h 值变化也可看出p h3 0 以上的环境不会影响彩绒革盖菌的生长；但p h 值降到2 5 左右时，菌体生长会 受到轻微抑制，为了适应胞外低酸度的环境，菌体的蛋白产量也明显降低：在 p h 值为2 0 和1 5 时菌体停止生长。 白腐菌在生长过程中会分泌草酸使生长环境的p h 值下降，而为了改善这种 环境，它本身有缓冲调控体系对培养基进行调控1 5 2 1 ，从而使环境p h 稳定在一定 0 爰擞 彩绒革盖菌草酸脱羧酶的诱导制备 范围内。而添加无机酸后，p h 值一直较稳定并维持在较低水平，这表明菌体的 这种缓冲调控体系可能只能作用于菌体代谢产生的有机酸和草酸，而不能对无机 酸产生任何作用，因此发酵液p h 一直较稳定。 7 、p h 对菌体生长的影响 由于磷酸一方面对菌体生长的影响最小，另一方面也能为菌体的生长提供磷 源，因此为了更进一步考察无机酸对菌体生长的影响，在菌体对数生长期间向发 酵液中添加磷酸，并分组调节1 5 、2 0 、2 5 三个p h 值，在加磷酸的第三天开始， 每2 4 小时取样，通过测定发酵液p h 和菌丝体干重来考察p h 对菌体生长的影响， 实验结果见图2 7 。 “ ” z u u z az z 土 l j l - l 2 + 对照+ p 卜- p 扣t p h i 5+ 对f p h 2 _ 一p h 2 o 十p h i 5 图2 7 发酵液p h 对菌体生长的影响 磷酸组和对照的p h 值都比较稳定，基本无变化。菌丝体干重由大到小依次 为对照组( p h3 1 ) p h2 5 组 p h 2 o 组 p h1 5 组。图2 7 表明发酵液p h 值在3 o 以下时，p h 环境会影响到菌体的生长，p h 在1 5 和2 0 时，菌体的生 长受到很强的抑制。 2 2 2 无机酸对产酶的影响 添加无机酸后每天取样提取草酸脱羧酶、测定酶活力、提取液蛋白含量、发 酵液残糖含量、菌丝体干重等数据，通过计算总酶活、比酶活i 和比酶活i i 等( 以 单位摇瓶发酵液为标准) 来考察无机酸对产酶的影响( 各种酸三个平行对照，取 平均值作图) ，实验结果见图2 8 2 1 0 。 1 、无机酸对总酶活的影响 研究表明，对照样酶活基本无变化，三种无机酸样的总酶活在培养阶段都是 彩绒革盖菌草睃脱羧酶的诱导制备 逐渐升高，且酶活值都接近，说明三类无机酸诱导产酶效果明显，平均每天升高 约o 2u 。在第九天测到的盐酸、硫酸和磷酸的总酶活分别为1 2 8u 、1 3 0u 和 1 1 6u ，而对照样的酶活几乎为0 。 培养时间( d a y ) 图2 8 添加无机酸后总酶活的变化趋势 2 、无机酸对比酶活i 的影响 三组无机酸比酶活i 和总酶活的变化规律相似( 图2 8 和图2 9 ) ，干重比酶 活逐渐升高，平均每天升高1 2u 儋。在培养的第9 天测得的盐酸、硫酸和磷酸 比酶活i ( u 儋菌体干重) 分别为1 0 6 0 、9 9 8 和9 6 2 。 1 2 1 0 1 噩l * 3 攀 3 。6 烬 遴4 u u 2 0 5673 培养时间( d a y ) 图2 9 添加无机酸后比酶活i 的变化趋势 2 4 6 4 2 0 8 4 2 o l l l l n o n e n 拿蜒苗蹈 0 孽霉天学 碗m - 啊n l 眦f 彩绒革盖菌草酸脱羧酶的诱导制备 3 、无机酸对比酶活i i 的影响 图2 1 0 显示盐酸样和磷酸样的比酶活i i 值增加趋势和大小都接近，每天平 均升幅约为1 3 3u 肺g 蛋白，并且随时间增幅减缓，培养最后一天均为1 1 5u m g ； 硫酸样的升幅最大，每天平均升幅约为1 6 8u m g ，比酶活i i 最后可以达到3 1 6 u m g 蛋白。 这和硫酸诱导的蛋白产量最低有关( 图2 6 ) ，形成对应关系，说明硫酸对杂 蛋白质的合成具有明显抑制作用，通过降低杂蛋白，从而提高草酸脱羧酶的比酶 活。 4 o 3 5 4 5 67 89 培养时间( d a y ) 图2 1 0 添加无机酸后比酶活i i 的变化趋势 4 、三种无机酸对产酶影响的比较分析 表2 8 三种无机酸对产酶影响的比较 如 坫 加 ：2 m 帖 仰 一皿嘲mn)n蜒髓丑 0 彩绒革盖菌譬：酸脱羧酶的诱导制餐 由表2 8 可见，三种无机酸诱导产草酸脱羧酶的效果都比较明显，其中硫酸 组的诱导效果最好，对产酶的影响作用由大到小为硫酸 盐酸 磷酸 对 照。与三种无机酸对干重的影响作用大小的顺序一致( 见表2 ，7 ) ，硫酸的p h 值 最低，表明p h 越低，对菌体的生长和产酶的影响越大。 a z a m 等1 4 3 】发现低p h 环境诱导f ，e ，“f 妒e s 产草酸脱羧酶，因为脱羧化对质 子的大量消耗可以引起胞外p h 升高【5 0 1 ，并推测fw ，“f 勿p s 是为了抵抗胞外p h 环境的降低而大量表达草酸脱羧酶的基因。本实验中低p h 环境可以显著地诱导 彩绒革盖菌产草酸脱羧酶，是彩绒革盖菌为了抵抗胞外较低p h 环境，持续增强 草酸脱羧酶的表达。即添加无机酸后，发酵液p h 值降低，酶活增高。 为了更好的研究无机酸的诱导调控机制，排除菌体分泌草酸对本研究的影 响，利用高效液相色谱技术对后期发酵液的草酸含量进行了检测( 谱图未附) 。 研究发现，发酵液中草酸的浓度低于0 1m m ( 甚至更低) ，与无机酸的浓度相 差数十倍以上，且草酸是有机酸，供质子的能力远小于无机强酸，这就排除了培 养后期因草酸积聚，诱导产生草酸脱羧酶的可能性，也进一步表明无机酸诱导产 草酸脱羧酶是低p h 环境诱导，与底物草酸诱导产草酸脱羧酶是不同的调控机制。 5 、p h 对产酶的影响 为了更进一步了解p h 值对产酶的影响，在菌体对数生长期时，向发酵液中 添加磷酸调至1 5 、2 o 和2 5 三个p h 值，并在加酸两天后开始取样，通过测定 酶活力并计算总酶活和蛋白比酶活来考察p h 对产酶的影响( 各组样品三个平行 对照，取平均值作图) ，结果见图2 1 l 。 皿 嘲 3 = 一 蜒 避 丑 对熙p h 2 ，- - p i l 2 ，扣p p h l 5一- 一对e 一p h 2 卜一p i l 2 扣，- p h l 5 图2 1 l 发酵液p h 对产酶的影响 o 彩绒革盖菌草酸脱羧酶的诱导制备 由图2 1 1 可看出，p h2 5 的诱导效果最好，p h2 0 和p h1 5 由于严重抑制 了菌体的生长( 图2 7 ) ，酶活极低。p h2 5 诱导的总酶活在第7 、8 、9 天都较高， 为0 5 3u 、0 5 4u 和o 5 6u 。蛋白比酶活在第1 1 天和第1 2 天较高，约为2 3u m g 蛋白质( 以单位摇瓶发酵液为标准，每瓶均含5 0m l 发酵液) 。 2 3 小结 无机酸都明显抑制菌体的生长，比较分析盐酸、硫酸和磷酸等三种无机酸 对菌体生长作用，发现由大到小都为硫酸 盐酸 磷酸 对照，添加硫酸 的p h 值最低，表明无机酸对菌体生长的影响直接与其调节的发酵液p h 值相 关。在发酵液的p h 值为2 5 左右时，菌体生长受到轻微抑制，蛋白产量受到 较大影响，几乎降低一半；在发酵液p h 值为2 0 和1 5 时，菌体生长受到严 重抑制。 三种无机酸都可以明显诱导彩绒革盖菌产草酸脱羧酶，且三种酸的诱导效 果相似，都比较好，且在添加无机酸后几天内草酸脱羧酶的活力持续上升，比 较其产酶结果，发现由高到低为硫酸 盐酸 磷酸 对照，而添加硫酸的 p h 值最低，表明无机酸对菌体产酶的作用与发酵液p h 值负相关，p h 值越低， 酶活越高，这也表明低p h 环境可以诱导彩绒革盖菌产草酸脱羧酶。在研究p h 值对菌体产酶的影响时发现p h2 5 诱导的酶活最高。 0 彩绒革盖苗筚酸脱羧酶的诱导制各 第三章有机酸诱导制备草酸脱羧酶 引言 很多来源的草酸脱羧酶可以被草酸明显诱导【1 0 ，1 9 ，2 0 ，2 5 1 ，为了研究草酸及有机 酸的诱导效果进而提高酶产量，本论文考察了草酸及其结构类似物醋酸和柠檬酸 对彩绒革盖菌生长和产酶的影响，发现草酸的诱导效果最好，为了提高草酸脱羧 酶的产量，又考察了分批补料草酸对产酶的影响。 随着对草酸脱羧酶研究的深入展开，发现该酶亦可以被低p h 环境诱导【l l ，4 4 1 ， 因为草酸可以使发酵液p h 降低，草酸与其它有机酸诱导产酶是作为底物诱导还 是降低了环境p h 从而诱导产酶一直存在着争议。研究草酸脱羧酶的诱导调控机 制对提高草酸脱羧酶的产量具有理论指导意义。为了进一步研究其诱导机制，本 论文又考察了草酸根、醋酸根、柠檬酸根离子对彩绒革盖菌生长和产酶的影响， 同时结合第二章无机酸诱导产酶的结果，综合比较各种酸诱导产酶效果的优劣及 对其诱导机制进行初步探讨。 3 1 实验材料、仪器与方法 3 1 1 实验材料 1 、试剂 表3 1 试剂 名称分子式分子量试剂规格生产厂家 葡萄糖 蛋白胨 硫酸镁 硫酸弧铁 硫酸锰 c 6 h 1 2 0 6 h 2 0 1 9 8 1 7 m g s 0 4 7 h 2 0 f e s q 4 7 h 2 0 m n s 0 4 h 2 0 2 4 6 4 7 2 7 8 。0 l 1 6 9 0 1 2 8 分析纯 生化试剂 分析纯 分析纯 分析纯 上海化学试剂公司 国药集团化学试剂公司 上海美兴化工有限公司 上海化学试剂公司 上海化学试剂公司 0 彩绒革盖菌譬：睃脱羧酶的诱导制备 硫酸锌 z n s 0 4 7 h 2 0 2 8 7 5 6 分析纯国约集团化学试剂公司 硫酸铜c u s 0 4 5 h 2 0 2 4 9 6 0 分析纯 国药集团化学试剂公司 氯化钙c a c l 2 l l o 9 9 分析纯上海化学试剂公司 柠檬酸c 6 h 8 0 7 h 2 0 2 1 0 1 4 分析纯上海化学试剂公司 草酸c 2 h 2 0 4 9 0 0 9分析纯 上海化学试剂公司 辅酶i生化试剂源聚生物试剂公司 磷酸二氢钾 k h 2 p 0 4 l3 6 0 9 分析纯上海化学试剂公司 磷酸氢二钠n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 3 5 8 1 4 分析纯平湖化工试剂厂 甲酸脱氢酶 5 2 7 u m l 生化试剂f l u k a 生物公司 醋酸c h 3 c