（分析化学专业论文）线扫伏安法间接测定三种生物大分子的研究.pdf

青岛科技大学研究生学位论文 线扫伏安法间接测定三种生物大分子的研究 摘要 生物大分子不仅是自然界中生命体的重要组成部分，而且还是重要的信息分 子，在生命科学、化学、医学等学科研究中都具有举足轻重的地位。常见的生物 大分子包括蛋白质、核酸以及生物多糖三种。本论文以生物大分子为主要研究对 象，以滴汞电极为工作电极，采用线扫极谱法建立了三种生物大分子的电化学分 析新方法。在选定的电位范围内，由于生物大分子本身没有电化学信号，故采用 电活性有机染料小分子为电化学探针，在一定条件下，染料分子在滴汞电极上可 以发生还原反应，出现良好的线性扫描极谱波，加入生物大分子后，它们之间发 生相互作用导致电化学信号发生变化，从而可以对生物大分子进行间接研究。本 论文主要包括以下三个方面的内容： 1 有机染料茜素红s 、偶氮胂i 、偶氮胂i n 与蛋白质相互作用的研究。 以茜素红s 、偶氮胂i 和偶氮胂i i i 为电化学探针，利用加入蛋白质前后峰电 流的降低值与蛋白质浓度成正比的原理，建立了测定蛋白质的新方法。优化了结 合反应的条件，在最佳条件下建立了测定蛋白质的工作曲线并成功应用于蛋白质 模拟样品的测定。讨论了染料蛋白质反应体系在滴汞电极上的电化学行为，求解 了反应体系的结合比和结合常数。 2 有机染料吖啶橙、藏红t 、维多利亚蓝b 与核酸相互作用的研究。 研究了吖啶橙、藏红t 和维多利亚蓝b 与核酸的相互作用，优化了结合反应 条件，在最佳条件下测定了核酸工作曲线并将该方法应用于模拟样品的测定，结 果令人满意。对反应体系在滴汞电极上的电化学行为进行了讨论，计算了相关电 化学参数并求解了体系的结合比和结合常数。 3 有机染料吡哆红b 、甲苯胺蓝与生物多糖硫酸软骨素相互作用的研究。 考察了吡哕红b 和甲苯胺蓝与生物多糖硫酸软骨素的相互作用，优化了结合 反应的条件，在最佳条件下，峰电流的降低值与硫酸软骨素的浓度成正比，将该 方法应用于模拟样品的测定，结果令人满意。利用电化学数据求解了体系的结合 比和结合常数。 关键词：蛋白质；核酸；硫酸软骨素；茜素红s ；偶氮胂i ；偶氮胂i i i ；吖啶橙； 藏红t ；维多利亚蓝b ；吡哕红b ；甲苯胺蓝；电分析化学；超分子复合物 线扫伏安法间接测定三种生物大分子的研究 u n e a rs w e e pv o i ，t a mm e t r i c d e t e r m i n a t l 0 no ft h r e e n d s0 f b i o m o l e c u l e s b i o m o l e c u l e sa r ev e r yi m p o r t a n tc o m p o n e n t si na l ll i v e so ft h ew o r l d , w h i c hp l a y s i g n i f i c a n tr o l e sa si n f o r m a t i o nm o l e c u l e si nt h er e s e a r c hf i e l d so fl i f es c i e n c e , c h e m i s t r ya n dm e d i c i n e g e n e r a l l ys p e a k i n g ，b i o m o l e c u l e sa r ed i v i d e da sp r o t e i n ， n u c l e i ca c i d s 触) a n dg l y c o s a m i n o g l y c a n s ( g a g s ) i nt h i sp a p e r , s e v e r a lb i m o l c c u l e sa r es e l e c t e df o rt h ei n v e s t i g a t i o n ，w h i c hh a v en o e l e c t r o c h e m i c a ls i g n a l st h e m s e l v e si nt h es e l e c t e dp o t e n t i a lr a n g e t h ee l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o r so fo r g a n i cm o l e c u l ea n di t si n t e r a c t i o nw i t hb i m o l e c u l ea r ec a r e f u l l ys t u d i e d b yl i n e a rs w e e pv o l t a m m e t r y o r g a n i cd y ec a l lb er e d u c e do nt h em e r c u r ye l e c t r o d e a n dh a saw e l l - d e f i n e ds e c o n do r d e rd e r i v a t i v el i n e a rs w e e pp o l a r o g r a p h i cc u r v e a f t e r t h ea d d i t i o no fb i m o l e c u l e ，t h e yc a ni n t e m c tw i t he a c ho t h e ra n dr e s u ri nt h ec h a n g e s o fe l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s e t h e p a p e r c a nb cs u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 t h es t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no fa l i z a r i nr e ds ，a r s e n a z oia n da r s c n a z o1 1 1w i t h p r o t e i n a l i z a r i nr e ds ，a r s e n a z oia n da r s c n a z oh ia r es e l e c t e da se l e c t r o c h e m i c a lp r o b e s f o rt h ed e t e r m i n a t i o no fp r o t e i n a f t e rt h ea d d i t i o no fp r o t e i ni i l t 0t h es o l u t i o n ，t h ep e a k c u r r e n td e c r e a s e da p p a r e n t l ya n dt h ed i f f e r e n c eo ft h ep e a kc u r r e n tw a s p r o p o r t i o n a lt o t h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i n t h ec o n d i t i o n sf o rt h ei n t e r a c t i o nw e r eo p t i m i z e d u n d e r t h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ew o r k i n gc u r v ef o rp r o t e i nw a sc o n s t r u c t e d s y n t h e t i c s a m p l e sw e r ed e t e r m i n e dw i t hs a t i s f a c t o r yr e s u l t sa n dt h es t o i c h i o m e t r yo fp r o t e i n w i t ho r g a n i cd y e sw a sc a l c u l a t e db yt h ev o l t a m m e t r i cd a t a 2 t h es t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no fa c r i d i n eo r a n g e ，s a f r a n i n eta n dv i c t o r i ab l u e bw i t hn u c l e i ca c i d s t h ei n t e r a c t i o no ft h r e eo r g a n i cd y e ss u c ha sa c r i d i n eo r a n g e ，s a f r a n i n eta n d 玎 青岛科技大学研究生学位论文 v i c t o r i ab l u ebw i t hn u c l e i ca c i d sw e r es t u d i e d t h ec o n d i t i o n sf o r t h ei n t e r a c t i o nw e r e o p t i m i z e d u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ew o r k i n gc u r v ef o r n u c l e i ca c i d sw a s e s t a b l i s h e d s y n t h e t i cs a m p l e sw e r ed e t e r m i n e dw i t hs a t i s f a c t o r y r e s u l t sa n dt h e s t o i c h i o m e t r yo fn u c l e i ca c i d sw i t ho r g a n i cd y e sw a sc a l c u l a t e db yt h ev o l t a m m e t r i c d a t a 3 t h es t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o no fp y r o n i n eba n dt o l u i d i n eb l u ew i t hc h o n d r o i t i n s u l f a t e t h ei n t e r a c t i o no fp y r o n i n eba n dt o l u i d i n eb l u ew i t hc h o n d r o i t i ns u l f a t ew a s s t u d i e d t h ec o n d i t i o n sf o rt h ei n t e r a c t i o nw e r eo p t i m i z e d u n d e rt h eo p t i m a l c o n d i t i o n s ，t h ed e c r e a s e o fr e d u c t i o n p e a k c u r r e n tw a sp r o p o r t i o n a lt ot h e c o n c e n t r a t i o no fc h o n d r o i t i ns u l f a t e ，w h i c hw a sf u r t h e ru s e df o rc h o n d r o i t i ns u l f a t e a n d s y n t h e t i cs a m p l e sd e t e r m i n a t i o n k e yw o r d s ：p r o t e i n ，d n a , r n a , c h o n d r o i t i ns u l f a t e ，a l i z a r i nr e ds ，a r s e n a z oi a r s e n a z oi i i a c r i d i n eo r a n g e ，s a f r a n i n et v i c t o r i ab l u eb ，p y r o n i n eb ，t o l u i d i n eb l u e ， e l e c t r o c h e m i s t r y , s u p r a m o l e c u l e m 线扫伏安法间接测定三种生物人分子的研究 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得其他教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示谢意。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 本人签名： 走妇f ； j 签字日期：加叼年1 2 月劲日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。本人离校后发表或使用使用 学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛科技大 学。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 本学位论文属于： 保密口，在 年解密后适用于本声明。 不保密眵。 本人签名： 导师签字： 起姗 钰吁 签字日期：如叼年f 二月z o 日 签字日期：2 ( 研年j 2 月加日 青岛科技大学研究生学位论文 第一章文献综述 生物大分子的定量分析是临床检测、生化分析、生物体液测定和遗传诊断等 方面的重要内容，因此也是生物、化学等诸多学科中最活跃的领域之一。常见的 生物大分子包括蛋白质、糖类、核酸等物质。 1 1 蛋白质的分析研究 1 1 1 研究意义 蛋白质是生物体内重要的一类生物大分子，它不仅对于维持生命是十分重要 和必不可少的，同时，它与生命遗传密码的翻译、信息的转录、d n a 的复制等都 有密切关系。有关蛋白质分子与小分子相互作用的研究，不仅对改进和发展检测 蛋白质的方法有促进作用，而且对研究蛋白质分子和外源小分子相互结合作用的 配位本质，促进生命科学的发展有着重要的意义。 1 1 2 蛋白质定量分析的研究进展 蛋白质含量的定量分析方法很多，理想的方法应该是灵敏度高、线性范围宽、 干扰物质少、操作简单、快速，适合于常规临床样品中各种蛋白质成分的测定。 现有的方法主要分为浊度法和凯氏定氮法、分子光谱分析法、免疫法和电化学分 析法等。 1 1 2 1 浊度法和凯氏定氮法 浊度法是利用沉淀剂与蛋白质反应所产生的浊度与标准溶液浊度比较而定 量测定蛋白质浓度的分析方法，常用的蛋白质沉淀剂有磺基水杨酸、三氯化铁和 三氯乙酸。该法操作简单、快速、试剂易购，为临床常规检查所用；缺点是受温 度的影响较大，而且所用试剂的浓度、滤光片的波长及反应浓度没有标准化，因 此，准确度及精确性较差。 凯氏定氮法【i 】是利用一般蛋白质含氮量平均在1 6 ，可将测得的含氮量折算 成样品中蛋白质含量的方法。凯氏法的优点是适用范围广，可用于动植物的各种 组织、器官及食品等组成复杂样品的测定，但操作比较复杂，含大量碱性氨基酸 的蛋白质测定结果往往偏高。 线扫伏安法间接测定三种生物人分子的研究 1 1 2 2 分子光谱分析法 ( 1 ) 分光光度法。测定蛋白质含量常用的分光光度法包括经典的双缩脲法、 l o w r y 法、蛋白质与染料结合的光度法。 乱双缩脲法。双缩脲法【2 】是基于蛋白质与双缩脲反应的方法。在碱性溶液中 蛋白质与c u s 0 4 反应生成紫色络合物，最大吸收峰位于5 4 0n m 处，在一定范围内 吸光度值与蛋白质浓度成正比。本法的缺点是灵敏度不高且干扰较大。 b l o w r y 法。l o w r y 法列是l o 、 州等人于1 9 5 1 年建立的，是至今定量测定蛋白 质最常用的方法。它结合了双缩脲法中铜盐反应及f o l i n c i o c a l t e n 试剂( 主要是磷 钼酸和磷钨酸盐) 反应的特点，通过蛋白质中芳香族氨基酸残基一酪氨酸残基和 色氨酸残基的迅速反应及与肽链、极性侧链或者两者的铜配合物较慢的反应，而 把磷钼酸、磷钨酸发色团还原成暗蓝色，反应产物的最大吸收波长在7 5 0n m 处。 在一定条件下，吸光度与蛋白质浓度成正比。该法操作简便，线性范围较宽，但 也存在着灵敏度低等不足。 c 蛋白质与染料结合的光度法。蛋白质与染料结合的光度法是目前研究和应 用最为广泛的方法。它包括染料结合法【】和金属离子一染料结合法 9 - 1 3 1 。其中， 染料结合法应用更为广泛。该法基于某些有机染料在酸性环境中带负电荷，而大 多数蛋白质的肽键亚胺和n 端氨基质子化成阳离子带正电荷，在静电力和非静电 力( 疏水力、范德华力、羟基力等) 的协同作用下可以形成有机染料一蛋白质复 合物，利用形成复合物的吸收光谱或荧光光谱的改变来测定蛋白质含量。染料结 合法具有简捷、经济、准确等特点，不足之处是染料吸附严重，线性范围窄。金 属离子一染料结合法是由于金属离子与含有o h 或c = o 的有机染料相遇时，氧 原子中的孤对电子可进入杂化轨道形成稳定的配合物体系，在酸性条件下该体系 遇到结构不对称的分子时互相极化产生静电作用而结合成新的大分子团，进而改 变了原体系的光谱性能从而能定量测定蛋白质的含量。该法具有灵敏度高、线性 范围广、干扰离子少、操作简单、快速及适用于临床常规应用等特点。 ( 2 ) 荧光光度法。荧光法是另一种常见的测定蛋白质的分析方法。一些与蛋白 质结合的染料，其光谱特性往往允许从蛋白质的芳香氨基酸到配体或配体之间进 行有效的长距离能量转移，即荧光猝灭和敏化荧光现象，其荧光强度的变化在一 定范围内与蛋白质浓度成正比，可用于蛋白质的测定【l 7 1 。通常较紫外可见分光 光度法更灵敏，但仅适用于具有荧光的体系，使该方法的使用范围受到限制。 ( 3 ) 共振光散射法。光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中，光散射是 指当光通过介质时，在入射光以外的各个方向上所观察到光强的现象，它是电磁 辐射与物质之间相互作用的一种表现形式，源于光电磁波的电场振动而导致分子 中电子产生的受迫振动所形成的偶极振子。光散射法是基于蛋白质对染料的光散 青岛科技入学研究生学位论文 射信号的放大效应，光散射信号的增强与蛋白质含量呈线性关系，由此可进行蛋 白质分析 1 8 - 2 3 】。目前，已发现的用作光散射法的染料主要有酸性偶氮类、酸性三 苯甲烷类、卟啉类及其联苯型染料。这些染料都具有大的电子共轭环、强的芳香 性或疏水性并带有负电荷的亲水性基团，如磺酸基、羧基和酚羟基，具有水溶性 或醇溶性好的特点。 0 1 1 2 3 免疫法 利用外来物质( 抗原) 注入动物的血液后所产生的物质( 抗体) ，与抗原的反应 有极高的选择性这一原理，可用抗原作试剂测定抗体，也可用抗体作试剂测定抗 原。抗原与抗体都属于蛋白质，固定一定的抗体，通过免疫反应就可测定蛋白质， 这就是免疫法。文献报道的免疫法主要包括免疫扩散法、琼脂糖免疫电泳法和毛 细管电泳免疫法等。 ( 1 ) 免疫扩散法。免疫扩散法包括环状免疫单扩散法【2 4 】、双向扩散、法【2 5 1 。 ( 2 ) 琼脂糖免疫电泳法。琼脂糖免疫电泳法包括微量免疫电泳法【2 6 1 、对流免疫， 电泳法、火箭电泳法【2 7 】、双向定量免疫电泳法和放射免疫电泳法【2 引。 ( 3 ) 毛细管电泳免疫法( c e ) 。在用琼脂糖免疫法定量分析抗原和抗体蛋白质 时，抗原和抗体的纯化是非常麻烦的。近年来发展较快的是毛细管免疫电泳，它 的分离速度快、分辨率高且不受染色时间、温度、染色剂浓度、显色时间等因素 的影响，这些优点使其广泛应用于包括球蛋白在内的各种临床指标的检测。该方 法的基本原理是进行毛细管电泳分离后将血清与某种蛋白的抗体混合，观察峰高 的降低，以此进行抗体的定性与定量测定。现在多采用计算机图象处理的方法， 从电泳图谱中抽取有用的信息，采用图象分析技术确定电泳图谱中蛋白质的强度 【2 9 3 1 1 。 1 1 2 4 电化学分析法 电化学分析是利用物质的氧化还原性质来测定物质组成的分析方法。从生命 现象的电化学本质来看，许多生命物质是荷电的微粒或分子，生命活动往往伴随 着电荷的运动。电化学分析方法已经成为生命科学研究中最基本的方法之一。蛋 白质与电极之间的电子转移在某种程度上类似于生物体内蛋白质之间的电子转 移过程，但人们发现许多生物体内进行可逆氧化还原反应的氧化还原型蛋白质， 在金属电极上的电化学反应并不是可逆的1 3 引，这是由于蛋白质分子的电活性中心 不容易暴露以及在电极表面强烈吸附会造成电极的钝化，所以蛋白质电化学分析 法的研究不如分子光谱分析法研究的充分，其研究的深度与广度还有待于进一步 探索和完善。但电化学分析法能排除生物样品中常遇到的混浊、黄疸、溶血等干 3 线扫伏安法间接测定二种生物火分子的研究 扰，具有较高的灵敏度，仪器价格便宜且易于自动化。 目前，关于蛋白质的电化学分析研究主要分为蛋白质的极谱分析、蛋白质与 有机小分子相互作用的电化学分析和蛋白质在固体电极上的电化学行为等三个 方面。 ： ( 1 ) 蛋白质的极谱分析。极谱法具有设备简单、操作快速、灵敏度高等特点， 近年来在生化分析、药物分析、临床检测等方面应用较为广泛。凡是使用滴汞电 极或其他表面周期性更新的液体电极的特殊电解分析称为极谱法，极谱法具有设 备简单、操作快速、灵敏度高等特点。蛋白质的极谱研究主要基于以下几个方面： 一类是蛋白质自身的氧化还原波，即在溶液中或吸附在电极表面的蛋白质直接或 间接的与工作电极发生电子交换1 3 3 3 5 】。另一类是蛋白质的催化氢波，即溶液中或 吸附在汞电极表面的蛋白质能够有效降低氢的超电位，催化氢离子提前放电而产 生氢波，这类催化电流在低浓度的蛋白质溶液中也很容易被检测【3 引。此外还有 蛋白质与金属离子配合物产生的极谱还原波。 ( 2 ) 蛋白质与小分子相互作用的电化学研究。蛋白质与有机小分子能够发生相 互结合反应，现在普遍认为在蛋白质的碱性氨基酸的残基中，精氨酸和赖氨酸残 基上的n h 4 + 与染料离子上的s 0 3 靠静电引力相结合；在蛋白质的疏水氨基酸中， 色氨酸残基与疏水阴离子靠疏水作用相结合。在许多情况下，蛋白质与有机小分 子反应不仅是某一种力的单独作用，而是多种力协同作用的结果，这些力包括静 电引力、疏水作用力、范德华力等，其中，静电力起着重要作用。k r a g h h a n s e n 通过实验详细地研究了静电力在有机小分子酚红与血清白蛋白间所起的作用【3 9 1 ， 结果表明蛋白质总体上带正电时，二价的酚红( 带两个负电荷) 比一价的酚红( 带 一个负电荷) 更易与血清白蛋白结合；在蛋白质总体上带负电时，一价的酚红比 二价的酚红易于与血清白蛋白结合，这说明利用静电力与蛋白质上的碱性基团相 结合是小分子与蛋白质相互作用的一种方式。m o s h e 和f a z e k a s 提出考马斯亮蓝 r - 2 5 0 与蛋白质的作用首先是依靠静电引力相互吸引，疏水键再起加固作用1 4 0 , 4 1 l 。 有文献指出疏水环境和蛋白质上的正电荷是疏水阴离子与蛋白质作用的必须条 件【4 2 】。 ( 3 ) 蛋白质在固体电极上的直接电化学行为。由于蛋白质分子空间结构庞大， 电活性中心不容易暴露，而且蛋白质易在电极表面强烈吸附造成电极钝化和蛋白 质变性，因此，蛋白质在电极上的电子转移速率慢，通常得不到有效的电流响应， 所以，目前的研究工作多集中在寻找合适的媒介体和促进剂或者使用修饰电极来 活化蛋白质的氧化还原中心，改善蛋白质电极反应的可逆性并加速其在电极上交 换电子的速率方面【4 3 卅。媒介体和促进剂之所以能加速电极上交换电子的速率， 初步认为是因为促进剂和媒介体与蛋白质相互作用形成复合物，使蛋白质的多肽 青岛科技大学研究生学位论文 链作某种空间伸展，疏水结构被打开，使电活性中心暴露而易于发生电极反应【4 7 1 。 1 2 核酸的分析研究 1 2 1 研究意义 核酸是一类重要的生命物质，根据核苷酸单元的糖组分的不同，可以分为脱 氧核糖核酸( d n a ) 和核糖核酸( r n a ) 。其中d n a 是主要的遗传物质，是遗传信息 的载体，在生物的生长发育、物种延续等正常生命活动中有着十分重要的意义。 它不但与生命的正常活动如种族遗传、细胞分化等密切相关，而且与生命的异常 活动如肿瘤、辐射损伤、遗传病和代谢病也息息相关。人类的许多遗传疾病与其 d n a 序列不同程度的变异有关。r n a 具有储存、传递信息和催化的功能，参与 蛋白质的生物合成，在基因调控中起着重要的作用，并与一些疾病如艾滋病的诊 断与治疗相关联，近年来受到化学、生物和医药等诸多学科的极大关注。因此核 酸的研究是生命科学研究的重点和热点。 1 2 2 核酸与小分子的作用模式 小分子与核酸结合的部位是核酸的碱基、磷酸骨架和戊糖环。核酸由平行堆 积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条由核苷酸链形成的大沟、小沟组成了 小分子识别的位点。通过对核酸上大沟、小沟等小分子识别位点的研究，科学家 们发现金属配合物、药物和染料分子等可以作为核酸的靶向分子。小分子与核酸 的相互作用模式主要有非共价结合、共价结合和剪切作用等三种形式【4 8 】。 1 2 2 1 非共价结合 非共价结合包括表面结合( o u t s i d eb i n d i n g ) 、沟槽结合( g r o o v eb i n d i n g ) 和嵌 插结合( i n t e r c a l a t i v eb i n d i n g ) - - 种模式( 图1 1 ) 。 ( 1 ) 表面结合。表面结合即小分子通过非特异性的相互作用结合于带负电的 d n a 双螺旋结构的外壁，因此又叫静电结合( e l e c t r o s t a t i cb i n d i n g ) ，无选择性。通 常认为单纯的静电结合模式在作为药物的应用上价值不大，但是有些分子与d n a 的静电作用对于其与d n a 的嵌插和沟槽作用起重要的稳定作用。 ( 2 ) 沟槽结合。沟槽结合是外源分子与核酸的大沟或小沟的碱基对边缘直接 发生作用，大分子蛋白质结合于d n a 的大沟槽中，而大多数小分子则是在小沟槽 区作用。小沟槽内是a = t 富集区，典型的与d n a d x 沟区结合的小分子含多个简单 线扫伏安法间接测定三种生物大分子的研究 的芳香环，这些环通过可自由扭转的键连接，随键的合适扭曲，取代水分子进入 小沟区，与双螺旋中沟区的碱基边缘通过范德华力形成接触。常见的以这种作用 与d n a 作用的分子有h o e c h s t3 3 2 5 8 、纺锤霉素等。 ( 3 ) 嵌插结合。嵌插结合即小分子以平面或几乎平面的芳环嵌入d n a 双螺旋 结构中，这是芳环离域7 c 体系与碱基对的兀体系间的兀7 c 相互作用及疏水作用的结 果。药物分子多与d n a 发生嵌插作用，常见的抗癌药物如阿霉素、柔红霉素以及 很多中草药的有效成分都可以以嵌插方式与d n a 结合【4 9 1 。因为小分子的结构不 同，嵌插剂又可细分为单嵌插剂和双嵌插剂p o j 。 表面结合 沟槽结合 i n 燃。n ou t s i d eb i n d i n gg r o o v eb i n d i n g 1 “。b i 。n 。k i l 。n g 。1 。“ 图i - i 非共价结合的三种方式 f i g 1 - 1t h r e ew a y so f n o n c o v a l e n tb i n d i n g 1 2 2 2 共价结合 与非共价结合作用相比，小分子与d n a 的共价键结合的序列特异性识别能 力要强的多。共价键结合的小分子多表现为链内交联或链间交联，与特定碱基作 用形成加和物，使核酸双链解旋且产生弯曲。如苯并二吡咯类抗癌药物道诺霉素 ( d u o c a y m y c i n ) 及其衍生物只能在d n a 小沟中对a t 富集区识别，分子中活泼的 环丙烷基与小沟区内特定碱基序列中a 的n 3 共价结合后导致在该位点脱去嘌呤 p l ，5 2 1 。 1 2 2 3 剪切作用 d n a 断裂在d n a 修复、转录及突变中是很重要的一个生物学过程。具 有剪切作用的分子断裂d n a 的位点是由其与d n a 结合的选择性决定的。博莱霉素 ( b l e o m y c i l l ) 是一种天然的d n a 断裂剂【5 3 】，其分子结构的特殊性使其能够识别并结 合在d n a 中57 g c 3 序列的鸟嘌呤上，然后经一系列化学反应最终导致d n a 断 6 青岛科技人学研究生学位论文 链。b a r t o n 掣5 4 j 合成的双核配合物，左边的r h ( i i i ) 的配体插, , n d n a 大沟斟”j ， 右边的锌肽起水解酶的作用【5 6 1 ，使超螺旋的p b r3 2 2d n a 断裂变成切e l 和线状两 种形式；铜( i i ) 的邻菲咯啉类配合物1 5 7 】在巯基化合物和过氧化氢存在下可使d n a 于小沟槽区断裂。这种双功能性对于设计人工核酸酶及发展有效的抗肿瘤药物具 有非常重要的指导意义。根据这一原理现在已有大量的研究把对d n a 具有剪切功 能的分子与能对d n a 序列进行特异性识别的分子连接起来，以合成序列特异性更 高的人工核酸酶或抗肿瘤药物。 1 2 3 核酸定量分析的研究进展 核酸是生命现象中不可缺少的生物大分子，也是生物遗传信息的载体，它控 制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能，其定量测定是诠释核酸结构和功能的基 础。目前，测定核酸的分析方法很多，其中研究最多、操作较为简便的有化学发 光法、分子光谱分析法以及电化学分析法等。 1 2 3 1 化学发光法 该方法具有灵敏度高、仪器简单及线性范围宽的特点，在生物学、医学、环 境检测等领域得到了广泛应用。吖啶酯、鲁米诺和光泽精作为经典化学发光试剂， 为生物大分子和有机化合物的分析测定提供了灵敏的检测方法。目前，化学发光 技术逐渐应用于d n a 的分析测定中，但这些方法存在耗时、背景干扰大的缺点。 如何治柯等【5 8 】基于c e ( ) 和r u ( b i p y ) 3 2 + 在硫酸介质中的氧化还原反应建立了一种 检测d n a 的化学发光法。 一 1 2 3 2 分子光谱分析法 光谱法是研究小分子和d n a 相互作用的重要方法，主要包括紫外可见吸收 光谱法、荧光光谱法、共振光散射法、线二色谱和圆二色谱法、拉曼光谱法、红 外光谱法、核磁共振光谱质谱法、x 射线晶体衍射法等。 ( 1 ) 紫外可见吸收光谱法。这是研究小分子与核酸相互作用的一种最方便、 最常用的技术。小分子与核酸的相互作用会引起吸收带的红移( 蓝移) 现象或增色 ( 减色) 效应。根据l 0 n 一5 9 】的理论，若该体系吸光度减小、吸收带红移以及产生等 吸收点是小分子与d n a 发生嵌插作用的标志，而单纯的减色效应是由于小分子和 d n a 之间产生静电作用的结果。 ( 2 ) 荧光光谱法。具有灵敏度高、选择性好、操作方便等特点，在生物分析 中有非常广泛的应用。由于核酸内源荧光很弱，无法将荧光技术直接应用于核酸 结构和性质的研究中，因此必须引入荧光探针。通常探针自身的荧光性质在加入 7 线扫伏安法间接测定二种生物人分子的研究 d n a 后发生猝灭或者增强效应，说明其与d n a 发生了明显的相互作用，根据其荧 光的变化可以获得反应的热力学和动力学的数据。常用的荧光探针有染料探针、 稀土配体探针、金属配合物和抗生素探针。溴化乙锭( e b ) 是应用最早，也是应用 最广的荧光探针唧6 1 j ，由于它可以插入到双链d n a 的碱基对之间，因此当加入一 定量的d n a 时，e b d n a 复合物的荧光强度比游离e b 的荧光强度强得多。然而当 有其它也能与d n a 发生插入作用的配合物存在时，会与e b 竞争与d n a 作用的位 点，e b d n a 的荧光强度将显著降低，因而e b 可作为配合物与d n a 作用的荧光探 针。用e b 作荧光探针，还可研究b e n d r i m e r s 的特异性结合位点【删，另外根据 s c a t c h a r d 方程可判定小分子与d n a 结合方式【6 2 1 。但由于e b 的强致癌性，使其应 用受到很大限制。 ( 3 ) 共振光散射法。共振光散射法是一种在普通荧光分光光度计上进行测量 的光散射分析技术，光散射现象广泛存在于光与粒子的作用过程中。它的原理是 基于7 c 堆积功能染料在d n a 表面组装产生强烈的共振光增强效应并以此建立的 d n a 分析方法。黄承志等人曾经以金属配合物c o ( i i i ) 5 p a d a b 6 3 】和有机染料分 子如酚藏花纠删、天青a 【6 5 】、天青b 【6 6 】等作为共振光散射探针测定d n a 。 ( 4 ) 线二色光谱( l d ) 法和圆二色光谱( c d ) 。线二色光谱( l d ) 采用与固定光轴 方向平行或垂直的平面偏振光，可以快速区分经典的嵌入结合、沟槽结合和表面 结合等模式，并能获得小分子结合在d n a 上的准确方向信息及动力学数据【6 7 】。圆 二色光谱( c d ) 以高频变换的左旋或右旋偏振光作为入射光，为有机化合物的绝对 构型、构象和反应机理的研究提供了很多信息，是研究有机化合物和生物大分子 的构型、构象和三维空间结构强有力的工具。一方面可以根据d n a 在2 6 0n l t l 处的 吸收提供有关结构信息，另一方面对一些本身没有c d 信号，但与d n a 结合后能 产生诱导c d 信号的分子，可获得一定的有关其结构的间接信息。f i e l 等【6 8 】研究了 卟啉配体与d n a 之间的相互作用，c d 技术为二者之间的嵌插和非嵌插作用提供 了有力的证据。彭小彬掣6 9 】通过c d 等手段研究了手性苏氨酸卟啉锌配合物的超 分子聚集体与小牛胸腺d n a 构建的新型生物超分子，依据卟啉与d n a 作用时c d 光谱的外型来判断卟啉与d n a 的结合模式，提出了具有不同构型的手性苏氨酸卟 啉锌配合物聚集体与d n a 构建新的超分子时不同的构建方式。z i n c h e n k o 等【7 0 】报 t r ( c h 3 ) 2 n + ( c h e ) n + ( c h 3 h r 类化合物与d n a 之间的作用机理，基于c d 光谱的 研究发现，二价阳离子诱导d n a f l 3 b 型转变成a 型的驱动力大小取决于两电荷间 的距离，而与取代烷基的长度无关。 ( 5 ) 拉曼光谱。拉曼光谱是一种富含信息的分析技术，这种特定技术与共振 和表面增强现象相结合使其逐渐成为一种极具诱惑力的生物医学分析技术。i s o l a 等【7 1 1 对h 1 vd n a 进行标记，并与表面增强拉曼技术相结合，使拉曼信号显著增强： 青岛科技大学研究生学位论文 其灵敏度与荧光标记法相当，却比后者能提供更多的结构信息。 ( 6 ) 红外光谱法。红外光谱法在药物小分子与d n a 相互作用的研究中得到了 广泛应用，为从分子水平上了解药物d n a 复合物的结构信息提供了有利工具。 小分子与d n a 的共价结合比较容易从振动光谱加以区别，不同的d n a 组分在不同 的波数范围内有不同的红外吸收峰，因此通过d n a 指纹区的红外光谱可以判断 d n a 的构象，确定d n a 与小分子作用而引起的构象的变化。 ( 7 ) 核磁共振( n m r ) 和质谱法( m s ) 。核磁共振( n m r ) 分析法可以定量确定结 合位点的化学变化，并且对长距离驰豫效应更为准确。通过n m r 谱研究结构一活 性关系( n m r - s a r ) 是最早报道的用n m r 方法筛选靶向r n a 小分子的方法，并且 可以通过靶向蛋白质的二维1 h 1 5 n 光谱筛选附近亚结合位点的小分子物质。z h o u 等r 7 2 】以光度法和崃研究结果证明抗癌药物放射菌素d 以嵌插方式与寡聚核苷 酸【d ( a t c g a t ) 2 作用。由于d n a 分子的n m r 光谱十分复杂，所以目前一般仅限 于小片段d n a 与药物相互作用的n m r 研究，此方法的最大问题是谱图解析困难， 因此受到一定限制。 随着软电离技术的发展，质谱法以及液质联用技术在小分子与d n a 复合物 的结构分析中发挥着独特的作用，该方法能灵敏快速地获得小分子与d n a 作用 的结合区域、结合位点数、亲和力以及非共价键结合方式等信息。 ( 8 ) x 射线晶体衍射法。x 射线晶体衍射法结合分子动力学模拟计算可获得非 常详细的小分子与d n a 结合位点及结构变化的信息，以及相关的动力学数据， 因此它也是研究小分子与d n a 相互作用的有利工具。在测定小分子与d n a 相互 作用的光谱法中，x r a y 晶体衍射晶体数据最为准确可靠，但由于存在培养药物 - d n a 复合物晶体的巨大困难而受到限制。 1 2 3 3 电化学法 由于生物体系是一个充满电解质溶液的体系，绝大多数反应都发生在膜系统 的界面上，因而尽管存在许多物理和化学上的差异，电化学体系仍然是一个非常 好的生物体系模拟，在d n a 和r n a 的分析中起着重要作用。对d n a 的电化学行为 的研究是实现d n a 电化学检测、d n a 传感器设计及研究d n a 与靶向分子作用的 基础。常用的电化学技术包括：循环伏安法和线性扫描伏安法【7 3 】；方波伏安 法【7 4 】；微分脉冲伏安法【7 5 】；溶出伏安法t 7 6 1 ；电致发光法【7 7 】等。 p a l e c e k 等【7 8 】基于核苷酸在汞电极上的反应建立了测定d n a 和r n a 的吸附 伏安法。p a n g 等【7 9 】建立了一种制备d n a 修饰电极的简便方法，修饰电极表面固 定的d n a 与电活性分子因相互作用而产生表面放大效应，可方便地研究d n a 与 9 线扫伏安法间接测定二种生物人分子的研究 小分子的相互作用，且灵敏度高。李启隆等1 8 0 l 用离子注入技术研制了一种新的修 饰电极，并用于研究博莱霉素与d n a 相互作用的电化学行为及其应用，这种电 极的稳定性和重现性优于一般的化学修饰电极。c h e n 等峭l j 将b 环糊精( 1 3 c d ) 的 包络作用引入到小分子与d n a 的作用体系研究中，利用光谱电化学方法研究了 染料分子被b c d 包络前后与d n a 作用性质的变化，阐述了染料与d n a 的作用 机制。b a r d 等人【8 2 埘】系统研究了o s ( b p y ) 3 2 + 、c o ( b p y ) 3 3 + 、f e ( b p y ) 3 3 + 、c o ( p h e n ) 3 、 f e ( p h e n ) 3 s + 等金属配合物和d n a 的相互作用后发现，若e o 向负方向移动，则小 分子与d n a 发生静电作用；若e o 向正方向移动，则小分子与d n a 发生嵌插作 用，这也成为电化学法研究小分子和d n a 相互作用的重要依据。 1 3 生物多糖的分析研究 1 3 1 研究意义 糖类物质是继蛋白质和核酸后新发现的又一类信息载体，它具有相对稳定 性、生物安全性、生物相容性、生物降解性、粘度可调节性、金属离子络合性、 吸湿保湿性、成膜性、絮凝性、凝胶性、生物再生性和多种生物活性( 免疫、抗 感染、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射、抗变性反应等) 。因此，生物多糖在医药、食 品、化学、日用品、生物技术、农业及环境工程等领域均有重要应用。目前，对 糖类物质的合成方法、结构测定、结构与功能关系以及糖类药物开发等方面进行 深入的研究已成为分子生物学发展过程中的又一次高峰。常见的生物多糖包括壳 聚糖、硫酸软骨素、肝素、透明质酸、芦荟多糖和茯苓多糖等。 1 3 2 生物多糖定量分析的研究进展 对多糖的研究，最早是在2 0 世纪4 0 年代，但自5 0 年代末人们发现真菌多 糖具有抗肿瘤活性后，尤其是近二十年来，由于分子生物学免疫物质的化学研究 与发展以及新药物资源的寻找与开发，多糖的研究才受到越来越广泛地重视，但 与蛋白质和核酸研究的飞跃式发展相比仍显得远远落后。之所以如此，主要有两 个原因：一是糖类的结构比核酸和蛋白质复杂的多，难以研究；二是以前发现糖 类的功能比较单调，人们对于糖类的早期研究只注意到它作为能源物质的重要性 和细胞的组成成分，制约了对多糖的深入研究。目前，多糖的研究以日本、美国、 德国、俄罗斯等国处于领先地位，我国的科研工作者也做了大量研究工作，取得 了一定成绩，有预言说2 1 世纪将是糖的世纪。 1 0 青岛科技火学研究生学位论文 糖类的研究方法主要有：分子光谱法、电泳法、质谱法、高效液相色谱法、 生物传感器法、电化学分析法等。 1 3 2 1 分子光谱法 分子光谱法由于其仪器简便、易操作、能够对分子结构进行表征而成为研究 小分子与大分子结合反应及对生物大分子进行定量分析的重要手段。常用的分子 光谱法包括分光光度法、荧光分析法和光散射分析法。 ( 1 ) 分光光度法。分光光度法是基于长链多糖带有多个大阴离子，在水溶液 中离解后可与染料阳离子相互结合发生反应，从而引起染料吸收光谱的变化来进 行测定的。孙伟掣8 5 】研究了在p h4 0 的b r 缓冲溶液中吖啶橙与硫酸软骨素的 相互作用；蒋志良等【8 6 】对维多利亚蓝b 与硫酸软骨素反应生成的有色产物进行了 分光光度分析。分光光度法具有仪器简单、结果直观等特点，但其灵敏度不够高， 因此一般用于常量糖的测定，而且在在线、在位、适时、微型化、自动化及多组 分