（分析化学专业论文）金属元素与生物体系键合特性的研究.pdf

中国科学技术大学硕士学位论文 致谢 本文是在黄碧霞教授的精心指导下完成的。 黄教授忘我的工作热情、严谨的治学态度、不断创新的学术思 想、和认真求实的工作作风己深深地铭记在我心，必将激励我更好 地投入到今后的学习与工作中去。在整个论文的进展过程中，我不 仅得到了黄教授多方面呕心沥血的指导和生活上无微不至的关怀， 同时也得到了一个科学工作者和教育工作者良好素质的榜样。 在论文即将完成之际我要向我的导师表示衷心的感谢和深深的 敬意。 感谢十二系的岳军教授在百忙之中为我的实验工作所作的精心 指导，他渊博的知识、踏实的工作作风和谦和的为人给学生留下了 深刻的印象。 实验过程中，得到了李碧琳副教授、陈树榆教授、何友昭副教 授、淦五二老师、芮蕾老师、李前荣老师、安徽地质实验研究所的 徐洛高工和科大经济技术学院的时亮老师等诸位老师的热情帮助， 在此一并表示我最诚挚的谢意。 感谢蔡继宝、谭庶欣、张延华、秦亭等同学给予我的帮助，在 此谨向他们表示我良好的祝愿和诚挚的谢意。 感谢我的安大老师及同学多年来对我的关心与帮助。 最后感谢我的家人对我的支持与鼓励。 中国科学技术大学硕士学位论文 摘要 本论文工作运用采用h p l c 与i c p a e s 联用的方法、h p l c 与 c p m s 联 用的方法、红外光谱( i r ) 、凝胶层析( g p c ) 、火焰原子吸收光谱( f a a s ) 、紫外光 谱( u v ) 等多种手段对金属离子与生物体系的结合形态进行了系统而深入的研究， 分别对以下两种体系进行了研究即银一明胶体系和稀土元素一细胞质膜体系。 f 真体作了以下几方面的工作： l l以鱼明胶体系为对象、借助于红外光谱研究了银离子、卤化银与明胶的键 合特性。结果表明a g + 主要与明胶中蛋氨酸残基的硫醚键配位；明胶中的蛋氨 酸在物理成熟的过程中不稳定，易被氧化为蛋氨酸亚砜。通过凝胶层析、紫外、 及火焰原子吸收光谱，我们得到了明胶中蛋白及a g + 的分子量分布曲线。结果 表明明胶中的a g + 不与明胶大分子蛋白y 组分结合t 而主要与小分子蛋白或肽 结合。 2以天然生长的植物为对象，研究了稀土元素与细胞质膜的键合作用。采用 离心分离的方法获得细胞质膜后，再用去污剂s d s ( 十二烷基磺酸钠) 溶解质 膜成分。将所得到的富质膜组分样品进行排阻高效液相色谱分离。用i c p m s 和i c p a e s 分别检测级分溶液中的稀土元素含量和钙含量。研究结果表明在 根细胞质膜上存在有l a 、c e 、p r 和n d 等元素并且这些元素集中分布在与蛋白 无关的磷脂组分中；质膜上的c a 一部分是与与蛋白无关的磷脂结合。另一部分 与与蛋白有关的磷脂结合。这个实验结果说明与蛋白无关的磷脂是质膜上l a 3 + 等稀土离子与c a 2 + 共同的结合配体。此外，我们还研究了土壤施加混合稀土对 生物膜上c a 分布的影响研究结果表明稀土元素与c a 竞争膜磷脂上的结合位 、 点从而影响了膜上的c a 2 + 转运机制导致了c a 在细胞中分布的改变。卜。 关键词：明胶，银，细胞质膜，磷脂，稀土元素，钙 4 中国科学技术大学硕士学位论文 a b s t r a c t m a n yc o u p l e d m e t h o d so fh p l c 一1 c p a e s 、h p l c - 1 c p m s 、i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y 、u vs p e c t r o s c o p ya n dg e lf i l t r a t i o n - - f l a m e a t o m i ca b s o r p t i o nw e r e u s e df o rs t u d y i n gc h e m i c a lm o r p h o l o g yo fa gi ng e l a t i no rr e e sa n dc ai np l a s m a m e m b r a n e 1 p h o t o g r a p h i cg e l a t i n i so n eo ft h em o s t i m p o r t a n t m a t e r i a l sf o rs i l v e rh a l i d e e m u l s i o ng e l a t i ni san a t u r a lb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l a rm a t e f a lw i t hap o l y p e p t i d e l i n ks t r u c t u r e ，w h i c hc a nc o m b i n em e t a le l e m e n t sw i t hv a r i o u sg r o u pw h i c hm a y r e s u l ti nd i f f e r e n tp h y s i o l o g i c a la c t i v i t yi ti sb e c o m i n gm o r ei m p o r t a n tt os t u d yt h e c h e m i c a lc o m b i n a t i o nf o r m si np h o t o g r a p h i cg e l a t i ni nt h ep r e s e n tw o r k ，a gb i n d i n g f o r m si n p h o t o g r a p h i cg e l a t i nw e r es t u d i e d f r o mi rs p e c t r o s c o p y ，w ek n o wa g b i n d e d s c h 3 o fm e t h i o n i n ea n dt h em o l e c u l a rd i s t r i b u t i o no f a g w e r ee x p l o r e db y g p c s p e c t r o p h o t o m e t r y t h er e s u l t ss h o wt h a ta g + c o o r d i n a t e sw i t hg e l a t i np r o t e i n a n de x s i t si ns m a l lm o l e c u l a rp r o t e i no rp e p t i d em a i n l y , 2p l a s m am e m b r a n e so fc e l l so fs o y b e a nr o o t sw e r ep r e p a r a t e db yc e n t r i f u g a t i o n m e t h o da n ds o l u b i l i z a t e db ys d sp l a s m am e m b r a n ec o m p o n e n t s - e n r i c h e ds a m p l e w a sc h r o m a t o g r a p h e do ns i z ee x c l u s i o nc o l u m nr a r ee a r t he l e m e n tc o n t e n t so r c a l c i u mc o n t e n t so ff r a c t i o ns o l u t i o n sw e r ed e t e r m i n e db yi c p m so rb yi c p a e s e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sl a n t h a n u mi np l a s m am e m b r a n e so fc e l l s o f s o y b e a nr o o t sa n di t c o m b i n e dt h ep a r to f p h o s p h o l i p i d sw h i c hi s n tr e l a t e dw i t h p r o t e i n s a n dc ac a nc o m b i n e dt h ep a r to f p h o s p h o i i p i d st o o i na d d i t i o n ，t h ee f f e c t s o f a d d e dr e e sm i x t u r e si ns o i lo nd i s t r i b u t i o no fc ai nb i o l o g i c a lm e m b r a n ew a sa l s o r e s e a r c h e dt h er e s u l t si n d i c a t et h a tr e e sc o m p e t ew i t hc a ：+ a ts o m ec a - + b i n d i n g s i t e sl o c a t e di nm e m b r a n ep h o s p h o l i p i d s ，w h i c hm a yh a v ee f f e c to n a c t i v i t y o f m e m b r a n e c a 2 t r a n s p o r tm e c h a n i s m s a n di n d u c et h ec h a n g e so fd i s t r i b u t i o no fc a 2 i n e e l i k e yw o r d s ：g e l a t i n ，s i l v e r , c e l lp l a s m am e m b r a n e , p h o s p h o l i d s ，r a r ee a r t h e l e m e n t s ，c a l c i n m 中国科学技术大学硕士学位论文 明胶概述 第一部分综述 第一章明胶 明胶是胶原蛋白经不完全降解转化而得到的、由十八种氨基酸组成的多肽 链的天然生物大分子物质。1 8 7 1 年m a d d o x r i 】首次将明胶引入a g x 感光乳剂体 系制出明胶a g b r 干板以来，明胶在感光材料生产中取得了难以取代的特殊地 位。 明胶作为感光材料，特别是a g x 感光材料的重要基质原料，具有其他天 然或人工合成的高聚物所不可替代的独特性质和作用。从乳剂制备、化学成熟、 涂布、曝光直至显影加工的各道工序，明胶都起着十分重要的作用陆”1 。 二鱼明胶i ”i 鱼明胶是明胶的一种，具有明胶的通性。但由于它来源于深水鱼类( 硬骨 鱼) 的皮所以与一般的动物皮胶和骨胶又有差别。鱼明胶在其蛋白组分上、 氨基酸成份上与普通的牛明胶的不同分别见表1 1 和表1 2 所示。 表1 - 1 明胶蛋白组分的相对含量 相对含量( ) 样品 【 o r - 2l + 。l o r 2鼠1p 1 2p i l + p 12 y 鱼明胶 1 3 35 4 36 7 6l ：4 02 388 ，63 24， 牛骨胶 4 0 41 7 95 831 ：04 41 5 81 5l3 091 06 从表卜l 可知在鱼明胶中主要蛋白是分子量小的n 组份，b 组份较少，几 乎不含分子量最大的y 组份；而在骨明胶中n 组份占优势，y 组份较少，还有 部分b 组份。因此鱼明胶分子量小于骨胶且其分布明显窄于骨胶。 6 中国科学技术大学颈士学位论文 表l - 2 明胶氪基酸残基的相对含量( ) 氨基酸鱼明胶牛骨胶 丙氨酸 1 2 41 1 4 精氨酸 5 55 l 天冬氨酸 3 74 5 半胱氨酸 谷氡酸 7 77 l 甘氨酸 3 3 43 2 5 组氨酸 95 羟脯氨酸 5 48 6 异亮氪酸 1 0 l l 亮氨酸 2 02 5 赖氨酸 3 53 4 蛋氨酸 1 36 苯丙氨酸 l l1 3 脯氮酸 1 0 61 3 5 丝氨酸 6 53 7 苏氨酸 2 61 8 色氨酸 酪氨酸 23 缬氨酸 2 22 2 从表1 2 可清楚地看出鱼明胶中羟脯氨酸残基的含量大约只有牛骨胶的 2 3 ，而鱼明胶中的蛋氨酸残基含量较高，是牛骨明胶中蛋氨酸残基含量的2 倍。 正是鱼明胶在组成上的特点决定了它具有不同于一般骨明胶的特性。据报道以 鱼明胶制备乳剂可得到粒径 4 为了防止光作用产生的光电子再与光解产生的卤素x 复合导致光敏度降 低就需要有卤素受体，而明胶具有很强的吸卤能力。 四对潜影的稳定作用一阻止潜影衰退 没有明胶的卤化银乳剂中的潜影寿命只有几秒钟，有明胶时却长得多。 五影响乳剂的显影作用 阻碍照相乳剂显影，影响影像银的结构。其作用机制尚未完全达成共识， 但人们发现，明胶的存在方面减小了卤化银表面上吸附的显影液的浓度，这 可能是明胶阻碍显影的重要原因。另一方面由于它可以键合银离子而减少了 颗粒表面游离的银离子的浓度。还发现显影时明胶的存在与否影响显影的部位： 无明胶时显影迅速遍及整个颗粒：有明胶时显影从颗粒表面确定部位( 潜 影核) 开始，最终形成可见影像。对生成的a g 的结构有明显影响：有明胶时， 生成的a g 更多的是丝状的、自然色调、高覆盖率；无明胶时，生成的a g 呈密 集形、棕色、低覆盖率。王越的工作进一步表明：即使有明胶存在，明胶的存 在状态也影响显影银的形貌i 。 中国科学技术大学硕士学位论文 2 2 明胶对卤化银纳米粒子的保护作用 目前对卤化银纳米粒子的研究对明胶提出了新的研究课题。纳米尺度的卤 化银体系由于具有超高的信息记录和储存容量、高反差、高分辨率、高解像力 等许多传统乳剂所不具有的优良特征而逐渐受到人们的重视，并且己在航空摄 影mj 、全息照相【“】、微缩胶卷”】、光刻技术【”1 等众多领域得到越来越广泛的应 用。其中，超细粒子卤化银乳剂的制备一直是感光科学研究中引起人们广泛关 注的课题之一。 一对于一般的动物骨明胶，必须是在相当高的胶银比( 1 0 ：1 ) ，即相当低的银 含量时才能制备出较稳定的纳米卤化银乳剂 】”。银的相对含量一旦增加，骨胶 对颗粒长大的抑制作用减弱。 二在骨明胶一高聚物( 如p v a ) 体系的共同保护作用下，当胶银比较低( 如7 6 ：1 ) 时，也可获得稳定的、平均粒径约为2 0 n m 的卤化银颗粒t ”】。 三以鱼明胶作为保护性介质利用直接反应法可以在一个比较宽的胶银比值范围 内获得稳定的、粒度较均匀的、平均粒度小于2 0 n m 的卤化银颗粒口。而且胶 银比值低达4 ：l 时仍能获得粒度良好的卤化银乳剂。 以上研究结果表明照相明胶对于卤化银纳米粒子的制备起着十分重要的保 护作用。不同种类的明胶在保护能力上的差异可能是因为其组成和结构上的不 同所致，因而需进一步深入研究明胶中不同组分与卤化银之间的作用机制。这 将有助于我们理解和拓展纳米卤化银粒子的性质与应用，从而在根本上解释卤 化银成像过程中的复杂机理问题。 1 0 中国科学技术大学硕士学位论文 2 3 明胶对卤化银颗粒的保护作用与卤化银对明胶的吸附有关 有关吸附层的认识 1 卤化银微晶大约00 1 1u 直径范围，即1 0 0 1 0 0 0 0 a 。原纤维朊直径约2 0 a ， 前者大约是后者的5 5 0 0 倍以上，卤化银颗粒被明胶大分子维系。 2 h b o r g i n o n 2 1 1 认为被卤化银颗粒吸附的明胶层是明胶的分子以些基团附着 在卤化银表面上，明胶蛋白链的其余部分伸向四周环境。因此所吸附的明胶 层的厚度随链的长度而增加。在明胶中有非极性区和极性区，非极性区主要 包括甘氨酸，脯氨酸和羟脯氨酸。极性区由极性更大的一些氨基酸构成，极 性区与吸附有关不是不可能的。虽然有人发现在明胶水解后，大部分天门冬 氨酸还处于被吸附状态。 3 p o u r a d i e r l 2 2 l 等研究表明明胶分子量自3 0 ，0 0 0 增至1 9 0 ，0 0 0 时，被吸附的明胶 量从o 9 5g g a g b r 增至l9 m g 。在等电点所吸附的明胶量最多，盐的进入 减少了静电作用，明胶分子变得更小，因而吸附的更多。 4b e r e n d s o n t 2 3 1 认为吸附量与明胶浓度和胶银比有关。 5明胶的吸附在很大程度上是不可逆的，这意味着用水洗不下来。 二明胶的保护作用与明胶组分 明胶被卤化银颗粒吸附可能有以下三种途径：主要是明胶与卤化银颗粒间 的化学键，另外还有静电吸附以及疏水部分的吸附。 l 认为吸附力的本质是明胶与a g + 的键合口“。与卤化银中a g + 键合有关的明胶 基团是：在低p h ( 略酸性) 下。只有蛋氮酸的硫醚基对a g + 有足够的亲和 力：p h 高一些时羧基也可以：在更高p h 时，终端氨基、组氨酸的咪唑基 团也可以与a g + 键合。在整个p h 范围内，蛋氨酸均能与a g + 键台。不同的 明胶与a g + 的键合能力不同，这种差别与明胶的氧化程度有关，这是由于氧 化程度不同，其中未受损的蛋氨酸残基含量不同所致。hb o r g i n o n t 2 5 他们还 中国科学技术大学硕士学位论文 测出了蛋氨酸被卤化银吸附的吸附热。z i m k i n 1 发现将被吸附的明胶水解 后，留在卤化银上的明胶中天门冬氨酸很丰富，因而他们认为是形成了这样 的环状化合物：羧基( 天门冬氨酸) 一银离子一亚氨基( 肽键) 。也就是说 通过这些残基明胶被吸附在a g b r 上，但这并未获得其他太多的支持，因为 天门冬氨酸与a g x 的吸附热检测不出这意味着它们之间的吸附作用不明 显。至于为什么在z i m k i n 的实验中未发现硫醚基团和谷氨酸我们认为这 与其采用的具体实验方案有关。z i m k i n 用羧肽酶、氨肽酶于室温下水解非 键合的氨基酸后，用5 0 c 水反复冲洗微晶：卤化银吸附的氮基酸是将卤化 银晶体置于6 nh c i 中在1 0 0 。c 恒温3 0 h 得到后再进行测定的。我们知道蛋 氮酸性质较不稳定，在高温或氧化剂存在条件下，蛋氨酸极易被氧化为蛋氨 酸亚砜( m e t s o x ) 和蛋氨酸砜( m e t s o n ) 。在上述实验操作步骤中蛋氨酸极 有可能因高温而被全部或部分氧化掉，这就是为什么z i m k i n 在实验中未发 现硫醚基团的可能原因。至于谷氨酸，可能是其残基与a g * 生成的七环化合 物是不稳定的缘故。其中相应的氨基酸结构式为： n h ， i h c c h 2 - - c h 2 一s c h 3 l c o o h 蛋氮酸 n h ， l h c c h ，一c 0 0 h | c o o h 天门冬氨酸 n h ， i h c 一( c h 2 ) 2 - - c o o h i c o o h 谷氨酸 n h ， i h c 一( c h 2 ) 3 一n h i c o o h 精氨酸 n h ， i h c c h ，一c = c h ll i c o o hn h n i 石。 c h 组氨酸 n hn h ，o | | i c - n h ：h c c h ：- - c h 2 一s c h j l c o o h 蛋氨酸亚砜 2 带正电的明胶基团可吸附在卤素位点，这种作用是静电的，很弱，未得到足 够的重视。 3 在明胶大分子中还有些疏水侧链可吸附到卤化银表面的疏水部分如丙氨 酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸等。 中国科学挂术大学硕士学位论文 第三章实验方案的设计 关于银离子或卤化银与明胶的键合作用已有不少报道。h b o r g i n o n t 2 5 】通过 测定蛋氨酸被卤化银吸附的吸附热，从而得出了在p h 为3 时，a g + 主要与明胶 中的蛋氨酸残基键合的结论。m d ec l e r c q 通过计算a g + 与相关配体的稳定常数 2 7 2 s 1 而提出a g 与明胶之间的反应应主要归结于a g + 与明胶中蛋氨酸残基的作 用。上述关于a g 一与明胶作用的研究均未能给出关于结构方面的直接信息。红 外光谱( i r ) 是鉴定化合物和测定分子结构最有效的方法之一特别在研究氨 基酸或其它相似配体与金属离子的键合方面能提供十分有用的信息( 2 9 - 3 1 i 。本文 选择用红外光谱( i r ) 这一手段研究明胶组分与银离子或卤化银的键合特性，m 分析特征性强，能很灵敏地反映出结构上发生的变化，并具有样品的用量少、 不破坏样品、分析速度快的特点。为了比较全面地研究乳剂中卤化银与明胶的 结合特点，本文同时进行了红外光谱分析和化学形态的研究。具体实验方案如 下： 一氨基酸与银离子的键合特眭研究 首先了解氨基酸简单体系与银离子的键合情况目的是为理解明胶体系的 红外谱特征提供必要的背景知识。明胶是由十八种氨基酸所组成的复杂体系， 我们选择其中的蛋氨酸、组氨酸、精氨酸作为研究对象，不仅是因为它们在明 胶中的含量较高，且重要的是它们所具有的含硫基团、咪唑基等最有可能与银 离子有较强的结合力。再考虑到蛋氨酸极易被氧化为蛋氨酸亚砜，我们又研究 了亚砜与a g 的光谱特征，以此来测定在乳剂制备过程中引起的明胶中蛋氨酸 形态的变化。 二明胶与银离子的键合特性研究 银离子与明胶基团的配位情况及其与不同种类的明胶( 骨明胶与鱼明胶) 中国科学技术大学硕士学位论文 键合特性的比较。 三明胶体系与卤化银的键合特性研究 研究卤化银一鱼明胶乳剂中卤化银与明胶键合的特性及其在乳剂制备过程 中随着物理成熟时间的改变明胶红外光谱的变化隋况。 四银离子在明胶中结合形态的研究 用凝胶层析法对明胶中银离子的分子量分布进行测定，并结合红外结果对 银在明胶中的存在形态进行深入探讨。 1 4 中国科学技术大学硕士学位论文 第二部分银与明胶的键合特性及结合形态研究 第一章银与明胶的键合特性的红外光谱研究 试剂与仪器 1 实验试剂 a g n 0 3照相级北京化工厂 k b ra r 上海化学试剂公司 k ia r 上海化学试剂公司 d l 一蛋氨酸、d l - 蛋氨酸亚砜、l - 组氨酸、l 一精氨酸均为生化试剂 骨明胶法国惰胶 鱼明胶美国n o d a n d p r o d u c t si n c 2 实验设备 f r i r 红外光谱仪p e r k i n e 1 m e r2 0 0 0 蠕动泵r d b - 7 型江苏沙洲仪表仪器总厂 电动搅拌机江苏东台县安丰电器厂 稳压器c z 一6 3 型上海金山五金厂 调压器上海电压调整器厂 二实验步骤 1 样品的制备 ( 1 ) 键合银的氨基酸及蛋氨酸亚砜样品的制备 分别准确称取氨基酸及蛋氨酸亚砜0 2 0 0 0 9 ，加入2 t r d3 m o l 的a g n 0 3 溶 液，混合均匀后于3 5 c 水浴中恒温l h ，取出置于4 c 的干燥器中脱水、干燥。 ( 2 ) 骨明胶膜样品的制各 中国科学技术大学硕士学位论文 准确称取8 9 骨明胶，加入3 2 m l 去离子水溶涨0 5 h ，置于3 t c 水浴中恒温 溶解l h 后取出，冷却至室温后制成膜样品。 ( 3 ) 鱼明胶膜样品的制备 准确称取5 9 鱼明胶，加入1 5 m l 去离子水溶涨0 5 h ，置于3 0 。c 水浴中恒温溶 解1 h 后取出，冷却至室温后制成膜样品。 ( 4 ) 外加银的骨明胶膜样品的制备 按下述方法制备胶银比( 质量比) 为7 6 ：1 的膜样品：准确称取8 9 骨明 胶，加入2 0 m l 去离子水溶涨0 5 h ，置于3 7 c 水浴中噎温溶解l h ，将1 2 m lo8 m o l i a g n 0 3 溶液在1 m i n 内等速加入到胶液中，同时不断搅拌- 上述溶液再保温9 m i n 后取出，冷却至室温后制成膜样品。 ( 5 ) 外加银的鱼明胶膜样品的制备 按下述方法制备胶银比( 质量比) 为7 6 ：l 的膜样品：准确称取5 9 骨明 胶，加入1 0 m l 去离子水溶涨o 5 h ，置于3 0 c 水浴中恒温溶解1 h ，将5 m l12 m o l i a g n o ，溶液在1 m i n 内等速加入到胶液中，同时不断搅拌，上述溶液再保温9 m i n 后取出，冷却至室温后制成膜样品。 改变a g n o ，溶液的浓度制备胶银比为2 ：l 的膜样品。 ( 6 ) 乳剂的膜样品制备 a 溶液的配制 底液的配制：称取25 9 鱼明胶，加入3 25 m l 去离子水，在室温下充分溶胀后 置于3 0 。c 恒温水浴中。 补加液的g d n 称取l g 鱼明胶，) j n a 1 0 m l 去离于水，在室温下充分溶胀， 备用。 a g n 0 3 溶液( 0 8 m o l l ) 的配制：准确称取6 7 9 4 9 9a g n 0 3t - , j , 烧杯中，加入 适量去离子水溶解后，转移至5 0 m l 容量瓶中，加去离子水定容。 k b r k i 混合液( r , b r n o8 m o l l ，其中k b r 0 7 6 m o l l ，k 100 4 m o l l ) 的配制：称 取4 5 2 2 1 9 k b r 和0 3 3 2 9k i 于小烧杯中，加入适量去离子水溶解后，转移至5 0 m l 容量瓶中，加去离子水定容。 b 乳化过程 在中速搅拌下将1 2 m la g n 0 3 溶液和1 2 m lk b r + k i 溶液以1 5 m l m i n 的流 中国科学技术太学顿士学位论文 速等速地加入到底液中，反应液温度为室温，底液温度为3 0 c 。乳化时间为 l o m i n 。乳化结束后，加入补加液，搅拌均匀，冷冻静置，加入2 0 克1 0 f 一 1 l 沉降剂、l7 5 m l1 0 醋酸，搅拌，4 5 下静置3 0 分钟使其沉降完全。倾 去上层清液用4 5 去离子水洗三次，每次2 0 分钟。然后加入2 2 7 5 m l1 n a ，c o ，溶液，于3 0 下复溶，加水至5 0 m l 。 cf成熟过程取样( 暗室操作) 成熟时间为9 0 m i n ，成熟温度为5 5 ( 2 ，每隔1 5 m i n 取一次样制成膜样 品。上述样品均在保干器中保存至干透。 2 红外光谱的测定 用f t m 光谱仪在室温下测定上述样品的红外谱图。该仪器的分辨率为 2 c m - t 测量范围为4 0 0 c m “至4 0 0 0c m 一。 三结果 1 蛋氨酸、组氨酸、精氨酸及蛋氨酸亚砜的红外谱图分别示于图1 1 至图1 - 4 中。 0 6 0 5 04 0 3 o2 0 1 4 0 0 03 5 0 03 0 0 02 5 0 02 0 0 0 1 5 0 01 0 0 05 0 0 w a v e n u m b e r ( c m ) 图1 - 1 蛋氨酸的红外光谱 一s百#1lc薯j上 中国科学技术太学硕士学位论文 05 5 05 0 04 5 霎o 4 0 0 3 5 量0 3 0 篮 皇o 2 5 02 0 0 15 o 0 o6 o5 0 4 03 o2 0 1 o0 3 5 0 03 0 c 02 5 0 02 0 0 0 w a v e n u m b e r ( c m 1 ) 图1 - 2 组氨酸的红外光谱 3 5 0 03 0 0 0 2 5 0 02 0 0 0 w a v e n u m b e r ( c r n 1 ) 图l _ 3 精氨酸的红外光谱 1 8 一摹一8昌#乍工isu岳卜 中国辩学技术大学硕士学位论文 3 0 0 02 5 0 02 0 0 01 5 0 0，0 0 05 0 0 w a v e n u m b e r ( c m 。) 图1 4 蛋氨酸亚砜的红外光谱 2 银离子一氨基酸的红外光谱特征 蛋氨酸、组氨酸、精氨酸与a g + 的红外光谱结果如表l 一3 至表1 - 5 所示。 表1 3 a g 对蛋氮酸i r 光谱的影响 样品f r e q u e n c e ( c m 4 ) i n t e r p r e t a t i o n 【j “ 9 ( c m 。) 不含a g含a g 蛋氪酸 3 4 3 8 73 4 4 1 9n hs i r + 32 2 9 1 8l2 9 1 75c hs y ms i r - 06 1 6 5 081 6 5 44n h ，d e f y n h ，+ 36 】6 2 33】6 2 3 0n hd e f- 03 1 5 8 0 91 5 8 09 c 0 0 。a s y ms t r 0 1 5 1 49i5 1 46n hd c f- 03 1 4 1 421 4 1 44 c o o 。s y ms 虮 + 02 1 3 4 0 51 3 3 9 9c hs y i t tb e n d- 06 1 2 2 l01 2 2 26n hd e f+ 1 6 l j 6 1 41 1 6 1 6 n h ；r o c k i n g + o2 1 0 8 0 01 0 7 8 1 c h 、r e e k i n g - l9 9 2 8 、8 9 2 5 5 c h ，r e e k i n g 33 8 7 7 ，58 7 5lc h lr o c k i n g - 12 6 8 496 8 l9c ss y ms t r- 30 1 9 嘴 咖 ：曼 嗡 恼 一紫一8岳#薯l卜 中国科学技术大学硕士学位论文 表1 - 4 a g 对组氨酸i r 光谱的影响 不含a g含a g 组氨酸 3 4 4 103 4 4 42n - hs i r+ 3 2 1 6 3 451 6 3 53 n h ：d e f t n h + o 8 1 5 9 091 5 9 09c o o 。a s ns t t 0 1 5 6 821 5 6 78 c o o a s y ms t r - l6 1 4 6 481 4 6 26c ha s y mb e n d - 22 1 4 1 5 41 4 1 5 5 c 0 0 s y m s t r + o1 1 3 1 47i 3 1 5 2c hb e n d + r i n g + 05 s t r 1 2 5 111 2 5 1 5 r i n gs l r + 04 1 1 7 131 1 7 16 r i n gs l r + 03 j i 4 681 1 4 7 4 r i n gs t r + 06 表l _ s a g 对精氨酸m 光谱的影响 样品f h q u e n c e ( c m + 1 )i n t e r p r e t a t i o n 【”j9 ( c m 1 ) 不含a g含a g 精氮酸 3 2 9 873 3 7 62n - hs t r+ 7 75 2 9 4 482 9 2 39c hs y ms i r- 2 0 9 1 6 7 791 6 7 30 c = nd e f- 49 1 6 2 7 81 6 3 5 3 n h ：d e f t h h “ + 7 5 】5 5 8 71 5 5 6 】 c 0 0 。a s y ms 仃 26 1 4 7 3 91 4 6 9 5c h ，d e f 4 4 1 4 2 l21 3 8 27 c 0 0 。s y ms t r 3 85 1 3 3 261 3 6 59 c h ，w a g + 3 3 3 l j 8 52】1 8 05 n h w a g 4 7 1 1 3 781 1 0 68n h ，m g 3 l0 蛋氨酸的一s c h ，基与a g + 可能有较强的配位能力，若二者发生键合，生成的 s a 鼻键不仅在3 8 0 r i m 附近1 有吸收峰的出现，而且还会引起c s 键伸缩振动 及c h ；变形振动频率的变化。本文利用c s 键伸缩振动及一c 心变形振动频 率是否发生了较明显的变化来判断a g + 与s 原子的配位。表l - 3 显示银的加入 使蛋氨酸的c s 伸缩振动及c h ，变形振动频率分别减少了3 0 和33 c m 一，大 于红外仪的分辨率2 c m 一，说明a g + 与蛋氨酸的硫醚基上的s 原子发生了键台。 组氨酸的咪唑基在p h 较高时可与a g + 键合，眯唑基的红外吸收峰位于表1 4 中 1 3 1 5c m - 1 、1 2 5 0c m 、1 1 7 0c m 1 和1 1 4 6c m 。附近，加入a g + 后，咪唑基振动频 率的变化均小于2 c m 一可以认为组氨酸的眯唑基与a g + 没有发生明显的键合作 用。图1 4 中在1 6 7 5c m 1 附近有一很强的吸收峰，这是精氯酸胍基上c = n 的 变形振动频率m 】。在加入a g + 后该振动频率减少了5 c m 。( 如表1 5 所示) ，说明 2 0 中国科学技术大学硕士学位论文 了a g 与精氨酸的胍基有较强的键合能力。 除了上述特殊基团不同的氨基酸共同具有的基团是n h ，和c o o h ， 这两种基团也可能与a g + 有配位能力。与这两种基团相关联的红外谱带在 3 4 0 0 c m 、1 6 2 0c m 一、1 5 8 0c m 和1 4 1 0c m 1 附近m 。3 4 0 0 c m 、1 6 2 0c m 。分别 是氨基的伸缩振动和一n h ：变形振动1 5 8 0 c m 。1 和1 4 1 0c m 。1 分别对应于羧基的 不对称伸缩振动和对称伸缩振动。当加入a g + 时，如表l 一3 所示蛋氨酸位于 3 4 4 0 c m 。的谱带增加了32c m 一，而位于1 5 8 0c m l 和1 4 1 0c n f 附近的谱带几乎 没有变化，这说明a g + 与蛋氨酸的n h ：发生了键合，而与一c o o h 没有配位。 组氨酸的情况与蛋氮酸类似，a g + 与其氨基键合而不与羧基键合。表1 5 是精 氨酸a g + 的红外光谱结果，当加入a g + 时，精氨酸的n h 伸缩振动频率从 3 3 0 0 c m 。增加到3 3 7 6c m 一，变化了7 6 c m 。；位于1 5 6 0 c m 。和1 4 1 0 c m 1 的羧基 的不对称伸缩振动和对称伸缩振动频率也分别变化了26 c m 。和3 8 c m 一，说明a g + 与其氨基和羧基均有强烈的键合作用。精氨酸与银的键合特征与蛋氨酸和组氮 酸相比有很大的差异，显然这是因为其胍基结构的存在引起的。 3 银离子一明胶的红外光谱特征 银离子一骨明胶及银离子鱼明胶的红外光谱结果分别示于表1 - 6 至表1 7 。 表1 - 6a g 对骨明胶i r 光谱的影晌 样品 f r e q u e n c e ( c m 1 ) i n t e r p r e t a t i o n 骨明胶不含a g胶银比( 76 ：1 ) 3 3 2 433 3 2 3 2n hs t r1i 中国科学技术大学硕士学位论文 鱼明胶 3 2 9 0 03 3 0 9 4 n hs f f + 1 94 2 9 4 0 9 2 9 4 0 2 ( 2 - h s y m s t r - 0 7 1 6 5 2 71 6 5 27c = o s f f 【a m i d e1 ) o 1 5 4 081 5 4 18 n hd e f + c ns 仃+ l c o o a s v ms t r ! 兰! ! ：! ! ! ! !二丛! ! ) 。婴宝望垂f 曼望3 2：! ：! ! ! 塑三：! 三! 鱼至鱼堕：! ! 墨! 堕：! ：z 1 3 3 841 3 3 51 c hs 、r mb e n d + 33 1 2 4 19 无c ns f f 甘q hb e n d ! ! 竖! 堡 ! ! 墼! ! 盟!曼! ! 丛! 坚：! ：! ! ! ! ! ! ! ! ! ：!旦3 婴丛! 竖望! ! ! ! ：! ! ! ：!= ! ! z 型堕：! ! ! 明胶是由氨基酸残基通过肽链构成的蛋白质大分子，其中也含有部分游离 的氨基酸，因此明胶的红外光谱不仅具有蛋白质肽键的特征谱带，同时还有氨 基酸的相关谱带( 如羧基) 。与肽键有关的谱带有酰胺i 带( 1 6 6 0c m 1 附近) 、 酰胺i i 带( 15 7 0c m 。附近) 和酰胺1 i i 带( 1 3 0 0c m 。1 附近) 3 8 1 。银离子骨明胶 的红外结果如表1 - 6 所示，a g + 的加入使得3 3 2 4 c m 。1 附近的一n h 伸缩振动减少 了i 1 c m ，低于2 c m 。，所以a g + 与骨明胶的n 原子没有发生键合；位于 1 5 6 0 c m 一、1 4 0 3 c m 。1 分别变化了6 2c m 一、4l c m 1 ，1 5 6 0 c m 。是酰胺i i 带和羧基 的不对称伸缩振动的重合谱带因为触+ 与n 原子没有发生键合，酰胺i i 带的 频率不会发生明显的变化，所以上述谱带的变化应归结于羧基的不对称伸缩振 动的变化，是a g + 与骨明胶中带侧链羧基的氨基酸( 如骨明胶中含有的较丰富 的谷氨酸) 的_ c o o h 了发生键合而引起的。a g + 的加入使得6 5 0 c m 附近的c s 伸缩振动减少了8 5 c m - ，变化的幅度很大，所以加入的a g + 主要与骨明胶中的 蛋氨酸残基的硫醚基配位。组氨酸咪唑基的谱带( 1 2 4 0c m 。) 在加入a g + 后，未 发生明显的变化说明在我们的骨明胶溶液( p h 为4 ) 中，其眯唑基没有与a g + 发生键合。虽然a g + 可引起精氨酸光谱明显的改变，但在骨明胶中我们没有 观察到其特征吸收峰，因而无法断定骨明胶中的精氨酸是否与a g + 作用。 银离子一鱼明胶的红外光谱结果如表l 一7 所示，胶银比为76 ：l 的鱼明胶 中国科学技术丈学硕士学位论文 位于1 4 0 3 c m 。变化了77 c m 一，是因为h g + 与鱼明胶中带侧链羧基的氨基酸的一 c o o h 发生键合而引起的。a g + 的加入使得鱼明胶c s 伸缩振动减少了9 9 c m ， 因为鱼明胶中的蛋氨酸含量高，与a g + 的键合能力大。所以鱼明胶c s 伸缩 振动的移动比骨明胶的8 5 c m 。要大。与骨明胶一样的是，加入的a g + 主要与鱼 明胶中的蛋氨酸残基的硫醚基配位。此外，a g + 的加入使胶银比为7 6 ：l 的鱼 明胶位于3 3 0 0 c m 。1 附近的一n h 伸缩振动增加了1 94 c m ，所以a g + 与鱼明胶的 n 原子发生了键合作用，这是令人十分感兴趣的结果。为什么在骨明胶中没有 a g n 键的生成而a 分与鱼明胶中的n 原子却发生了配位，我们认为可能有以 下几种原因：( 1 ) 由于鱼明胶的主要组分是一条单链。其侧链基团( 如蛋氨酸 的甲硫基) 能充分暴露出来a g + 优先与蛋氨酸的硫昧基键合后，可以再与相邻 的n 原子键合，生成了n a g s 稳定的六元环结构：( 2 ) 是精氨酸的存在引 起的，精氨酸的 伸缩振动位于3 2 9 8 c m ，与鱼明胶( 3 2 9 0c m l ) 十分相近， 且精氮酸的n h 对a g + 有较强的亲和力。虽然在两种明胶中，精氨酸的含量十 分接近( 分别为5 5 和5 1 ) ，但也可能是存在空间结构的不同引起的：( 3 ) 在鱼明胶中可能存在含有氨基结构的、可与a g + 键合的特殊物质。其中准确的 机理值得我们进一步的深入探讨。 生物体内的金属离子对配位给体的结合倾向经常受软硬酸碱的制约。在明 胶介质中提供这些配体的有蛋白质、肽及氮基酸，对于软的a 矿，最倾向于与 软的s 原子结合，因而它最容易与蛋白质、肽的蛋氮酸残基的硫醚键部位键合。 4 银离子一蛋氨酸亚砜的红外光谱特征 银离子一蛋氨酸亚砜的红外光谱结果如衷1 8 所示。 图1 - 4 蛋氨亚砜的红外光谱图，在1 0 1 6c m 处有一非常强的红外峰，是c s o c 骨架振动引起的蛋氨酸亚砜的特征峰m 】。a g + 的加入使n h 伸缩振动由3 4 2 4 c m 1 增加到3 4 4 3c m l ，变化了1 9 c m 比蛋氨酸( 32c m 。) 大的多：位于1 6 5 0c m 1 附近的n h 变形振动频率增加了9 87c m 。，说明a g + 与蛋氨酸亚砜氨基的结 合能力更强。位于】5 8 0c m 。和1 4 0c m 。的羧基的不对称伸缩振动和对称伸缩 振动在加入a g * 后，前者减小了4 4c m 一，后者则变得很弱，这说明a g + 与c o o h 之间发生了键合作用。而a g * 与蛋氨酸的- - c o o h 却没有这种作用。蛋氨酸亚 中国科学技术太学硕士学位论文 砜的c s 不对称伸缩振动在加入a g + 后由8 2 1 3 c m 4 增加到8 3 2 8c m ，增加了 1 l5 c m ，说明s a g 键的生成。值得注意的是，位于1 6 5 0c m 。附近的n _ h 变形振动频率的变化幅度晟为明显，因而我们可以借助该谱带判断明胶中蛋氨 酸存在形态的变化与否。 表l - 8 a g 对蛋氨酸亚砜i r 光谱的影响 样品 墅9 1 婴! ! ! ! 堕! ! i n t e r p r e t a t i o n9 ( e r a “) 塑! ! ! ! ! ! ! 堂! 生塑坐! ! ! 鲤垒g 蛋氪酸亚砜 3 4 2 473 4 4 35 n hs i r 1 1 墨 2 9 2 l22 9 2 4 9c hs