（植物学专业论文）五种木本植物的组织培养及其生理生化研究.pdf

五种木本植物的组织培养茂其生理生化研究 五种木本植物的组织培养及其生理生化研究 研究生：陈陆琴 指导教师：王关林 学科：植物学 专业：植物基因工程 摘要：该论文以五种木本植物合欢、金链花、欧溯花楸、彩萼石楠、欧李的茎尖为材料， 研究了不同处理条件下的植株再生。并对合欢、金链花茎尖分化不定芽过程中的主要生理 指标变化与形态发生的相关隆进行了探讨，为有效地调控植物离体器官形态发生奠定基础。 实验结果表明：五种植物在m s + 6 一b a0 5 1 0m g l + n a a0 1m g l 的培养基中可 以分化出不定芽，且分化率较高。同时，研究了生长素、培养基、糖浓度等因素对生根的 影响，得出最佳生根培养基：1 4 惦+ i b a0 5m g l + 糖1 5 9 l 。从而建立了高效的离体 再生体系。 通过对合欢、金链花茎尖分化不定芽过程中的主要生理指标含量变化的研究，发现在 不定芽形成前期，过氧化物酶、可溶性糖、可溶性蛋白的含量处于上升趋势；在不定芽形 成的后期，以上各物质呈下降趋势。这些结果表明：木本植物不定芽的形态发生与p o d 、 可溶性糖、可溶性蛋白的含量有一定的相关陛。 关键词：木本植物离体再生过氧化物酶可溶性糖可溶性蛋白 4 五种未本植物的组织培养及其生理生化研究 第一部分综述 植物组织培养是2 0 世纪之初，以植物生理学为基础发展起来的一门新兴技术，这项技 术已在科研和生产上得到广泛应用成为举世瞩目的生物技术之一。该技术具有加速育种、 缩短繁殖过程，改良品质，节省空间，减少劳动、周年试验生产，不受自然条件限制等特 点，且组培苗的体积小，便于携带和资源交流。在推动农业现代化方面已有了巨大的经济 效益，社会效益和生态效益，被i x n 是- - n # r 有潜力的高新技术u l 。 早在1 9 0 2 年，德国著名的植物学家t l a n b e f l a n d t 根据细胞理论预言细胞的全能性，认 为每个细胞象胚胎细胞那样，可经过体细胞发育成一棵完整的植株，但限于当时的技术条 件，培养没有获得成功。然而他所提出的具有开创性的科学推断吸引了许多科学家去探索。 1 9 0 4 年，e h a n n l n g 培养了萝b n 辣根属的一种植物的近成熟胚，发现可使其发育成熟， 这是胚培养的第篇论文；1 9 0 8 年s s i m o n 研究白杨嫩茎在培养中的发育过程，观察到愈 伤组织的发生和根、芽的形成；1 9 2 2 年w k o t t 用稀释的k n o p 溶液并加入相当复杂盼有机 物质，培养豌豆和玉米的根尖，但是失败多于成功，在当时并没有发现细胞有形态发生的 能力；到3 0 年代，生长素的发现及应用，b 族维生素对植物细胞生眭的重要畦被认识t 并被普遍采用：g a u t h e r e t 和w h i t e 所发展的基本方法，奠定了植物组织培养的技术基础； 四十年代发现激动素和生长素的比例关系是控制根和芽形成的主要条件之一。随着植物组 培技术的提高，终于在1 9 5 8 年，英国人s t e w a r d 和法国人r e i n e r t ，从胡萝h 愈伤组织和细 胞培养中产生了完整的植株，对植物细胞的全能性给予了科学的证实。 进入6 0 年代，植物组织培养除了在理论研究上获得重大突破外，在实际应用中也显 示了它的巨大潜能。在世界上的不少国家和地区，它已从实验室的研究手段一跃而成为大 规模成批量的种工厂化生产7 3 - ，“无性繁殖系的快速繁殖的生产，试管品种的商品化， 是目前植物组绷细胞培养技术在应用上的主流之一。”因此，该技术在国内外蓬勃发展起 来。6 0 、7 0 年代以来，国外组培发展很快，欧洲许多国家纷纷建立植物微繁殖公司，据欧 洲及地中海植物保护( e p p 0 ) 1 9 9 1 年公报，西欧国家共有2 4 8 个植物微繁公司，重点是 繁殖月5 些经济价值较高的观赏植物，如香石竹、月季、百合、大花萱草等3 0 余种。7 0 年 代以后，植物组织培养研究对象和内容发生了根本的变化，研究对象由经典的实验植物转 向有重要经济价值的农作物，研究内容也由探索和完善农作物技术逐步转向把这些技术应 用于生产实践的研究。 目前，利用组织培养再生植株的植物种娄已有1 3 0 科、近1 5 0 0 种，其中木本植物达 2 0 0 多种，并且在不断增加b u l 。 5 五种木本植物的纽织培养及其生理生化研究 我国白2 0 世纪7 0 年代以来，中国科学院、中国林科院林业研究所、南京林业大学、 北京林业大学、东北林业大学和许多地方林业科研机构和学校都开展了这方面的研究。先 后分别有杨树、泡桐、桉树、马褂木、柚木、竹子、桑树、落叶松、杉木、马尾松、火炬 松、湿地松、云南松等树种从器官、茎尖、成熟胚、花药和愈伤组织诱导成苗。自1 9 8 3 年国家实施“六五”林业科技攻关以来，我国的林木组培育苗研究已从实验室走向工厂化 生产，分别在华南和华北地区建立了具有国际先进水平的年产桉树组培苗2 5 0 万株，杨树 组培苗1 5 0 万株的全自动控制育苗工厂，林木组织培养不仅直接服务于林业的两大体系建 设，而且还为林木遗传育种、植物资源的开发利用提供了系列新技术，如优良品种的大 量繁殖、单倍体育种技术、原生质体培养和体细胞杂交、体细胞变异及突变体的筛选和利 用、林木细胞大量培养等。在木本植物组织培养的基础e ，发展出的一系列基因转移、d n a 直接导入技术己成为基因工程的核心技术组织培养也成为生物技术的重要组成部分 嗡7 矗9 1 。 2 1 世纪是生物技术迅速发展的世纪，而植物组织培养技术是生物技术中的重要内容， 已被越来越广泛的用于扦插难生根植物、引种材料少的植物、脱除病毒的材料、特种转基 因植物、珍稀植物、草本花卉以及商业特需苗木的无性繁殖。如美国布里格斯苗圃每年可 生产1 0 0 万株组培苗；法国对林木组织培养也非常重视，已小批量的繁殖花旗松和桉树苗 木；澳大利亚和新西兰在木本植物组织培养应用方面发展很快，现在澳；k - 和j 亚植物组培已 涉及1 3 个科9 7 个种，新西兰1 9 8 7 年在生产辐射松优贾茸2 0 0 万株；西德已用组织培养方 法大规模繁殖的欧洲山杨优良无性系苗木用于造林；荷兰也能大量生产栎树和其他硬阔叶 树组培苗( 。组织培- g r - e * b f ：遗传育种中也得到了广泛的应用。组培快繁以其繁殖系数大， 成苗速度快和不易受外界环境影响而广泛用于植物的良种繁育。而且，据有关专家预测， 未来1 0 年，市场对组培苗的需求量将以7 8 吲 嫩递增，这为植物组织培养快繁技术 提供了广阔的前蔡1 1 1 1 ；“，“。 1 木本植物组织培养的研究进展 11 木本植物再生途径 g a m b o r g 曾根据所培养的植物材料的不同把组织培养分为5 种类型“，即愈伤组织培 养、细胞培养、器官培养、胚胎培养和原生质体培养。组织培养的理论基础是细胞的全能 性，即任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成完整植株所必须的全部遗传信息，即 具备遗传信息传递、转录和翻译能力。当然，全能性只是一种可能性，要把这种可能性变 6 五种木拳植物的组织培养及其生理生化研究 为现实性必须满足两个条件：一是将这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来， 而使这些细胞处于离体条件下；二是要给予它们适当的刺激及一定的营养物质，并使他们 受到一定的激素作用。一个已经分化的细胞要表现它的全能性首先要经历脱分化过程，然 后在经历再分化过程，在脱分化和再分化的过程中，细胞的全能性才能得蛆表达。 木本植物组织培养再生途径有三种m 川：1 ) 无菌短枝扦插( s t e r i ks h o o tc u t 血n g ) ，这是 用组织培养法进行无性繁殖方面应用最广泛的方法，采用一个有活力的潜伏芽在无菌条件 下扦插，使其长出芽或产生丛生芽并进一步诱导生根形成完整植株。2 ) 器官发生 ( o r g a n o g e n s i s ) ，包括直接器官发生和问接器官发生。直接器官发生是指不经过愈伤组织 阶段，直接从原始外植体上诱导产生不定芽或不定根的过程。这是木本植物器官发生的主 要途径。宜接器官发生再生的培养程序包括：芽分生区诱导；芽的发育和伸长；根 分生区的诱导；再生植株的发育和移栽等。间接器官发生是指先从外植体e 诱导出愈伤 组织，再从愈伤组织上诱导出不定芽或不定根原基的过程。从愈伤组织表面或内部形成芽 和根，其分化取决于细胞分裂素和生长素的比例，高浓度的细胞分裂素有利于芽的形成， 而高水平的生长素有利于根的形成，但是，在愈伤组织培养过程中，普遍存在高频率的多 倍性或非整倍性现象，这是值得注意的问题。影响一种材料能否培养成功的因素主要有物 种遗传特性、外植体类型、培养条件等。在培养过程中般往往先诱导芽分化，然后将无 根苗转入含有低浓度生长素培养基上诱导生根，形成完整植株后移入土壤。3 ) 胚状体发生 ( e m b r y o g e n e s i s ) ，当条件适当时体细胞经过多次分裂先形成原胚，继而再经过球形胚、心 形胚、鱼雷形腔等不同发育阶段，最后发育成具有明显胚轴和子叶的成熟体细胞胚。目前 胚状体既可以在愈伤组织阶段形成也可以直接在外植体上形成，原生质体培养在形成愈伤 组织后也能形成胚状体。通过胚状体再生植株的优点是：在一个培养物e 所能分生的胚状 体数往往比不定芽数多，胚状体形成速度快，胚状体结构完整。一旦形成，般都可直接 萌发形成小植株，因此成苗率较高。 1 _ 2 影响木本植物组培养研究的有关因子及进展 1 2 1 培养基成分 ( 1 ) 基本培养基。在木本植物组织培养中，常使用m s 、1 3 5 和w p m 培养基根据不 同的材料选用合适的培养基。一般来说m s 培养基含的营养元素均衡适合大部分的植物生 长。而培养基中的盐浓度对外植体褐变和试管苗玻璃化均有一定的影响。对某些植物来说， 初代培养时培养基中无机盐浓度过高可引起酚类外溢物质的大量产生，导致外植体褐变， 降低盐浓度则可以减少酚类外溢，从而减轻褐变【1 8 1 。此外，培养基申的某些离子会增加酚 类合成与氧化酶的潘陛，降 氐盐浓度则可起到一定的抑制作用【l 。对于玻靴的试管苗来 7 五种木本植物的组织培养及其生理生化研究 说，提高培养基中c a 的浓度，增加培养基中m g 、m n 、k 、p 、f e 、c u 元素含量，刚氐n 和a 元素比例，特别是刚氐铵态氮浓度，可降低玻璃化“1 。 ( 2 ) 生长调节物质。在组织培养过程中，激素的种类及浓度对培养结果有着重要的影响。 特别是细胞分裂素和生长素浓度配比，一般情况下当二者浓度比例高时有利于分化芽，浓 度比例适中有利于芽的生长，浓度比例低时有利于生根。在以杨树为材料的实验中发现， 愈伤组织在芽分化阶段如果不降低生长素浓度，则很容易永远失去分化能力。而植物的生 根多数都是用生长素单独实现的，i b a 有较好促进生根的作用阎。用幼年状态的材料在低 浓度生长素的培养基中可步生根，生根效果明显优于含有高浓度生长素的培养基：当他 尝试用不含生长素的培养基一步生根时，仍观察到幼年状态的材料有一定生根效果。这说 明生长素完成诱导作用后，他们在培养基中存在对新根发生有抑制作用。因此，对木本植 物的生根培养可采用两步法：即先在富含生长素的培养基上进行根的诱导，而后转接到无 任何生长调节物质的培养基上进行根的伸长生长。这样不仅可提高生根率和有效根的数目， 而且可限制芽苗基部愈伤组织的生成。 ( 3 ) 碳源。糖的使用浓度多在2 q ，但不同植物材料对糖的反应不完全相同。杨 树培养基中糖的使用浓度若超过3 ，则易使愈伤组织变黑老化；另一方面，糖浓度太低 也不易于愈伤组织的诱导和分化瞄】。对于己发生玻璃化的试管苗来说，适当提高培养基中 蔗糖含量。刚氐培养基中的渗透势，可以降低玻璃化口驯。对于木本植物生根，可采用低 浓度的糖因为糖浓度降低会减少生根过程中愈伤组织的产生，这样出来的根质量较好， 否则产生的愈伤组织太多移栽时不易成活， ( 4 ) 琼脂。在固体培养时，琼腊的使用浓度常为0 6 一0 8 。邓成木认为应尽可能地 降低琼脂的浓度，因为较软的培养基能诱导组织较好地发育，而太硬的培养基往往会使培 养物不能与培养基紧密接触，不错b 好地吸收养分而变黄，但孔祥生等瞄】在柿树组织试验 中发现，琼脂含量低啦式管苗水势高，玻璃化现象严重。把琼脂含量从0 6 提高到1 0 后，不仅自 肓教防止玻璃化现象的发生，而且提高了外植体的增殖倍数。 ( 5 ) 培养基的p h 值。培养基中的p h 值因培养材料不同而异，大多数木本植物要求p h 值在5 晰0 。适当刚滞基口h 值可以俐氐多酚氧化酶的活性和底物利用率，从而抑制 褐变。培养基的n h 值还可以通过影响培养物的营养元素的吸收过程来影响呼吸代谢、多 胺代谢与脱氧核糖核酸合成、植物激素进出细胞等作用，进而直接或间接地影响愈伤组织 形成及形态建成蚓。 1 2 2 外植体的选择 外植体的选择和处理对褐变有较大影响。c h e v e r r 2 8 分析欧洲栗的酚类含量的变化结果 r 五种木本植物的组织培养厦其生理生化研究 表明，幼龄材料酚类化合物含量少，而成龄材料比较多。王续甜2 9 时2 4 个苹果品种进行 茎尖培养时发现，以冬春季取材褐变死亡率最低，其他季节取材则都不同程度加重。此外， 外植体组织受伤害程度真接影响褐变，在切取外植体时，伤口面积越少，表面消毒剂对外 植体伤害越少，褐变越轻。 1 2 3 培养条件 ( 1 ) 光照。光照对木本植物的外植体褐变和试管苗玻璃化有一定影响。光照过强，可 使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养组织的褐变1 1 9 】。但增加光照，可促进试管苗成 熟，加快幼茎木质化，从而降低玻璃t 匕【驯。光照还影响一些木本擅物的生根。研究发现， 对c a l i t a 李的生根培养，两周的黑暗处理对获= f 导最大生根率是不可缺的，光照则抑制根的 形成卅。 ( 2 ) 温度。低温可以抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶的活陛，从而减轻褐变， w h 0 1 等在苹果和桃的茎尖培养中发现，5 g 的低温对控制褐变效果十分显著，而且在低 温下培养时间越长，褊变越少，但存活率也随之下降，最佳时间为7 天左右。温度对试管 苗玻璃化有一定影响。文南俨1 1 认为：在1 0 c 一2 6 c 范围内培养的牡丹植株无玻璃苗出现， 在2 6 。c - 3 0 。c 范丽内培养，有6 3 的试管苗发生玻璃化现象，而在3 0 6 c 以上培养的牡丹植 株竟有8 4 发生玻璃化现象。 温度对生根也有一定影响。苹果无根苗在2 8 生根最佳，而在2 l 和2 3 c 生根率下 降，在2 2 c 、2 5 c 或2 9 0 c 对生根无反应。木瓜无根苗，在日温和夜温相对保持在2 7 c 1 和2 5 1 c 时，生根最佳，若日温刚氐，根发生速率也降低。日温从2 2 1 c 增 到2 9 c l 时，根随之增加，在2 9 c 日温下，根变细，侧根增多”“。 ( 3 ) 继代培养次数。组培苗的继代次数对生根有一定影响。处于成年期的组培苗生根 困难，而处于幼年期状态的和经过多代培养h 成年期回转到童年期状态的组培苗，生根要 容易的多。在苹果富士品种的组培苗生根试验吲中发现，_ 般要经过继代培养7 代以上， 生根率才得以改进。继代培养次数对外植体褐变和试管苗玻璃化也有一定影响。刳币翁等 圈在沙棘嫩茎的愈伤组织培养中，及时转移培养材料，继代周期不超过4 周，可有效降低 愈伤组织的褐变。但继代次数也不可过多，继代4 次或5 次，玻璃化频率提高，一般以 2 3 次最佳。 1 3 愈伤组织及胚状体的培养 愈伤组织的培养细胞处于不断分生状态，容易受培养条件和外界压力( 如射线、化学 物质等) 的影响而产生诱导，从中可以筛选出对人们有用的突变体，从而育成新品种。大 量实验表明，从细胞和组织培养获得的遗传变异已成为选择有用变异的一种新重要来源 9 五种未拉植物的组织培养及其生理生化研究 p ”。在木本植物中，具有再生能力的愈伤组织主要由胚外植体得到，而其它部位获得的愈 伤组织再生能力极低，这一直是木本植物利用组织培养技术进行植物改良和植物繁殖的一 大障碍。 李浚明等p 2 1 认为，愈伤组织起初都具有胚胎( 或器官) 发生潜力，但经过反复继代和 保存之后，这种形态发生能力常常下降，有时甚至完全丧失。黄学林等】根据愈伤组织的 形态将它们大致分为两类：一类是质地较松软、湿润的浅绿色愈伤组织，增殖速度快；另 一类质地较致密，表面较干燥，颜色呈黄白色，增殖速度慢。若于植株再生的研究中得出 的结论：前种是茎芽型愈伤组织即非胚性愈伤组织，可以通过器官发生途径产生再生植 株；后一种是体细胞胚愈伤组织即胫陛愈伤组织，可以通过胚状体途径再生植株。当然在 这两种类型之间还存在着许多过渡类型。由于胚性愈伤组织具有胚的特征，遗传陛状和植 株再生能力都优于非胫| 生愈伤组织，因此，最大限度地获得胚性愈伤组织能快速生产出大 量的遗传性状一致的优良株系吲。许多实验表明p i ，将已获得的愈伤组织进行巧妙的继 代培养是获得胚性愈伤组织的必需步骤之一，有时可通过控制培养条件( 特别是生长调节 物质) 和继代的次数将无形态建成能力的愈伤组织变为有形态建成能力的愈伤组织。能够 促成这种转变的控制因子有几种，其中最主要的是植物激素和氮源形刹”矧。一般来说， 生长素是促使细胞进入持续分裂增殖状态的因子，细胞分裂素是促使细胞进入分化状态的 因子，而g a 3 拇哺4 胚状体的发生。氮源除了供给培养物氮素营养外，还原态氢还具有促进 细胞分裂的作用，硝态氮具有抑制细胞分裂的作用。曹孜义等芦l 认为：_ 般在含有丰富还 原氮的培养基上加生长素，尤其是2 , 4 - d 来诱导胚状体的发生，然后转移到喇氐浓度或没 有生长素的培养基上使其成熟、葫发和生长。但在木本植物组织培养中，胚状体发生还不 普遍或产生的胚状体难以成株，限制了这一工作开展。 2 五种木本植物的组织培养研究现状 合欢臼西妇面m 轴穑拥) 又名夜台树、马缨花、绒花树，是一种优良的观赏和药用树种， 非常适宜作公园、机关、庭园行道树及草坪，绿地风景树，5 年即可形成绿色走廊。合欢 花是常用中药，具有解郁安神之功效，常用于治疗心神不安，忧郁失眠。 合欢系含羞草科合欢属落叶乔木，为温带、亚热带、热带树种，喜阳光，不耐荫，能 适应多种气候条件，对土壤要求不严，耐干旱，瘠薄。根具有根瘤菌，有改良土壤之效， 萌芽力不强，花期长。合欢多采用播种法培育实生苗，由于合欢种子种皮坚硬，发芽率不 是很好。因此用组织培养方法来解决这个问题，以最短的时间达到快繁的目的。1 9 8 6 年国 外有 对柯阿金合欢( a c a c i a k o a ) 进行组培研究，但是仅在组培幼苗茎尖取得成功川。1 9 9 4 】0 五种未皋植物的组织培养及其生理生化研究 年王卉f 明等人利用合欢胚的胚芽进行了愈伤组织的诱导，得出在6 - b a3m g & + n a ao 5 珥儿时分芽。1 9 9 6 年，s a k h l a 州曾利用合欢的根作为外植体诱导芽的再生，使用o 0 5 m u m t d z 大约9 5 的外植体能产生芽。2 0 0 1 年，翟建中例等人利用澳大利亚金合欢的大 树顶芽幼苗茎尖，种子小苗上胚轴，幼叶为外植体进行研究。同时周音【帅】等人研究了恶毒 灵在合欢离体快繁中的应用，利用台欢的子叶、下胚轴、根为外檀体进行诱导。2 j 3 0 2 年， h o s s e h l 】利用台欢的根为外植体，使用t d z 诱导芽的形成。而利用合欢实生苗茎尖 n 幼 叶为外植体研究的较少，本实验利用实生苗茎失和叶片进行芽的诱导、增殖及生根的研究， 以达到成苗速度快，成本1 氐，适用于工厂化育苗，快速繁殖的目的。 欧洲花楸( s 砷wd m 4 m 砌) ，蔷薇科花楸属落叶乔木，树高6 - - 1 2 米，树干端直， 冠幅4 5 0 5 米，呈卵圆形，成熟时树冠呈球形，成熟后，逐渐开展，密度适中。春天花 朵为白色，叶片互生，奇数羽状复叶，叶长不足5 厘米。耐寒f 生强、抗凤陛强、适应多种 土壤类型，喜湿润的酸性或微酸胜土壤。春夏季叶片为深绿色，秋季变为鲜艳的紫红色， 有光泽。八月下旬到九月结橘红色浆果，果实可挂到冬季。该种种子和果实富含营养物质： 租蛋白、脂肪、钙、粗纤维、维生索c 等等。木质中含有抗真菌的苯酚类化合物，对某些 特定的病原体有专门的抵御作用。木质硬纹理密，可用于制作工具的把手，叶子具有通便 祛痰功效，果实具有收敛、利尿和抗坏血症的药用功效。欧洲花楸树型魁梧，枝条伸展陛 好，花朵优雅夺目，是优良的园林树种，也是很好的遮荫树种，可作庭院、公园、广场、 小区绿化。该树种是世界著名树种之一，是名贵的园林观赏树种。 欧洲花楸属高位芽植物，完全靠种子繁殖，由于该种种子呈深度和绝对休眠状态，所 以需一定低温层积催芽处理，以克服来自种皮和胚的休眠。试验结果表明：种子经2 下的 冷砂藏是打破休眠唯一途径，6 个月的冷砂藏可以获得较高的发芽率。但对欧洲花楸的组 织培养研究的不多，有人曾报道欧洲花楸在含有适当浓度的6 - b a 、k t 、n a a 的培养基上 可以分化出芽【4 2 】。国内有人阳瑚1 对花楸和黑果肋花楸进行了研究，利用幼胚、成熟胚、茎 段、嫩叶为外植体进行了芽的诱导与增殖。但国内对欧洲花橄的组织培养报道很少。 欧李( c e r a s u sh u m 妇) ，蔷薇科樱桃属落叶小灌木，高0 3 1 5m ，是世界上最小的木 本植物。欧李一般在栽后第2 年便可开花结果，适应性及抗旱性极强，多成片生长栽河流 两岸，干旱的山坡及荒丘地等处，可用其防风、固沙，改造风沙盐碱地。此外，欧李花淡 雅，叶片浓绿果实色彩鲜艳是理想的观赏绿化树种。 欧李一般采用播种育苗及分株、扦插等，但采集欧李种子和移植工作都有一定的难度， 因此不自g 进行大面积的繁育工作，因此利用组织培养的方法对欧李进行大面积繁育。1 9 9 7 年，赵玉军m 蜷人对欧李不同外植体的芽分化和生根进行了研究。2 0 0 4 年，陶秀冬m 】在对 五种木本植物的组织培养及其生理生化研究 钙果的组织培养中采用了欧李为材料进行组培研究。本试验采用欧李的茎段为外植体进行 了研究。 金链花u a b u r n w n a t t a g y r o i d e s ) ，豆科毒豆属落叶小乔木，1 0 年树高可达6 - 1 0 m 。小 枝绿色，被平伏柔毛。三出复叶互生，花金黄色，蝶形，长2 , 5 ，成顶生细长下垂总状 花序，形似金项链。在欧洲有妖精之称，宜于景观长廊旅游景点公园绿化装饰效果极强， 也可以点缀在草坪或石荆战单独观赏之用。金链花一般分布于平均最低温为零下3 0 至零 下1 0 ，喜全光或半荫条件。不择土壤，但以排水良好，肥沃的壤土生长好，土壤p h 值 宜中性偏碱，也耐瘠薄，抗污染性强。根具有根瘤菌，具有固氮作用。一般靠播种繁殖为 主。国内外对其组织培养研究尚未见报道，因此本实验对金链花的离体再生进行了研究。 彩萼石楠( c a u n aw 如恼) ，杜鹃花科石楠属常绿地被植物，原产欧洲地区。株高 3 0 7 0 锄，分枝多而密，花色艳丽有玫红粉紫白等多种颜色，其特点是冬季开花，花期长 从1 1 月到翌年5 月。可在露天零下1 0 2 0 的温度下生长开花，对土壤无特殊要求，以 酸性至徽碱f 生为好，不失为我国北部寒冷地区冬季大地e 的一株春色。彩萼石楠的常规繁 殖多采用扦插或压条，繁殖速度较慢。用组织培养的方法繁殖在国内外还没有报道。 这五种植物都是木本植物，其组培程序一般比草本植物难 4 7 l 。因此本实验在组织培养 方面进行深入研究，重点探讨其陕速繁殖的规律，使其经济价值、生态效益、社会效益得 到充分发挥，为当前改善生态环境、退耕还林提供一定的技术参考。 3 木本植物离体培养过程中的生理生化研究进展 植物体内的各种组织或细胞之间是相互作用、相互影响、相互制约的。因此用整体植 株来探讨细胞分化等一系列重大问题的机制和生理生化过程比较困难，成为一个极其复杂 的问题。植物组织和细胞离体培养不仅减少了相互制约的影响，而且还可在人工控制的条 件下，按预期的目标设置些处理，研究细胞分化和发育的规律，如器官分化和形态建成 在植物体中是如何控制的，内外条件的影响和发育过程中的分子基础是什么等等。 高等植物细胞分化是一个极其复杂的过程，有很多因素在起作用，其中包含着许多生 化物质的变化【船】。关于植物体细胞形态发生中生理生化变化的许多研究发现：蛋白质和糖 类含量在细胞脱分化与再分化时将发生明显的规律性变化，奠定形态发生与建成的物质基 础【4 9 】。糖的转化可能影响形态建成。在四倍体龙牙百合形态发生的蛋白质与淀粉含量研 究中，发现这些物质含量变化的消长曲线与形态发生的进程协调一致酬。蛋白质的新合成 可能是形态发生历程的“信号”。而糖类物质则是通过及时提供能量与碳源影响形态发生。 植物的细胞和愈伤分化生长过程糖类和蛋白质的研究，是发育生物学研究的一个极其重要 】2 五种木本植物的组织培养及真生理生化研充 的领h 剩“。 过氧化物酶是植物体内重要的代谢酶，参与体内生理活动，如抗机械损伤、抗病原物 侵入、细胞分裂分化、组织器官分化及生长发育口j 。过氧化物酶的活性及同工酶的变化被 看成是生物量增长及胚状体发生的参考指标。同工酶几乎存在于所有生物中，它作为类 蛋白质广泛存在于生物的同一种属，同一个体的不同组织，同一组织或同细胞中剐。随 着现代生物技术和分子生物学的发展，对同工酶的研究也日益成为细胞分化和形态遗传学 的分子学基础中的重要内容口堋。 由于同工酶参与植物的大多数生理生态活动和代谢途径，因而同工酶分析技术在植物 生理学的研究中应用相当广泛阳。在植物的不同发育阶段和不同器官组织中同工酶都具有 特异性表现，其合成受一系列基因的调控，常作为遗传信息的指标来研究植物的生长发育 和器官分化【琊9 l 。从植物种子生活力、组织与器官分化、生长与胚胎发育以及环境因素和 植物激素都会影响到同工酶的变化，植物不同发育时期其同工酶酶谱也有差异删。在植物 的生长发育过程中，由于同工酶普遍存在于植物中，而且分离简便易行，相应地研究得较 深入。但在木本植物组织培养过程中的研究较少。同工酶在植物体内的普遍存在以及与生 长发育的关系提供了基因表达的灵敏指标，若能在同工酶的出现与变异方面找出其与生长 发育的关系，就能更好的调控生长发育的过程。 4 本论文的目的与意义 自植物组织培养开展以来，主要围绕陕速繁殖、培育新品种、消除植物病毒和长期保 存种质和远距离运输这几个目的而进行的。木本植物组织培养的目的也不外乎这几个方面。 但是，木本植物组织培养中芽的分化、生根比较困难，通过对木本植物不定芽发生过程中 的生理生化变化研究，深入了解组培中不定芽分化机制，进而探索木本植物器官发育和调 控等基础理论问题，为以后采用生物技术、基因工程等手段对植物进行遗传改良，建立良 好的受体系统奠定坚实的理论基础。 本实验就对五种术本植物的组织培养进行了研究，这对加快木本植物的扩大繁殖将有 实际意义。而有关木本植物组培苗芽分化过程中的生理生化研究报道甚少，但这一思路在 植物发育生物学的研究领域内曾广为应用，本实验研究了合欢、金链花离体再生过程中芽 的分化与同工酶变化、可洛f 生糖的变化及特异蛋白表达之间的关系，为进一步从分子水平 上研究不定芽的发生机制奠定坚实的实验基础。 1 3 五种未本植物的组织培养压其生理生化研究 一、鉴于木j c - 4 直物组织培养较为困难及当今社会对木本植物的需求，本论文以五种木 本植物为试材，研究影响离体再生的主要冈素，建立再生体系，达至啦酲过组织培养繁育苗 木的目的。对现代生物技术的应用及发展具有重要意义。 二、进行五种木本植物离体再生条件的比较研究。探索木本植物形态建成条件的基本 特点及规律对有效调控离体器官形态发生具有实际意义。 三、研究离体培养过程中主要生化物质及重要代谢酶的含量变化，寻找器官发生的 生化特征，对研究植物离体材料器官发生的分子机制具有理论意义。 1 4 五种未苯植物的组织培养及其生理生化研究 第二部分五种木本植物再生体系的建立 1 材料与方法 1 1 材料 合欢。西垃缸血船以幽) 、金链花( l a b u r n u m a n a g y r o i d e s ) 、欧洲；芘楸( s o r b u s a u c u p a r i a ) 的种子( 由大连汉枫种子公司提供) ，彩萼石楠( c 耐l u n a v u l g a r i s ) 、欧李( c e r a s t h u m i l i s ) 的植株( 栽培于辽宁师范大学植物生物工程研究昕温室) 。 1 2 方法 1 2 1 无菌外植体的获得 1 , 2 1 1 茎尖外植体 合欢、金链花、欧洲花楸的种子先用8 0 的热水浸泡2 4h 自然降温后在超净工作台 上用7 5 的酒精洗2r a i n ，然后用0 1 的氯化汞漫泡1 0r a i n ，用无菌水冲洗5 、6 次，每 次冲洗5 m i n 。用无菌滤纸吸千后接种到m s 培养基上，置于温度2 4 2 6 c 和光照为 20 0 0i x 条件下培养。以萌发的幼苗茎尖为外植体。 1 2 1 2 茎段外植体 取盆栽植株茎段，平均分为4 组先用自来水冲洗1h ，然后转移到超净工作台上，用 7 5 酒精消毒3 0s ，然后分别用0 1 的氯化汞浸泡4 、8 、1 0 、1 2r a i n ，用无菌水冲洗5 6 次。用无菌滤纸吸干后接种到m s + 6 - b a1 5m g m + n a a 0 2m g l 腋芽生长培养基上，以 生长出的芽为外植体。统计不同消毒时间的芽的得率。 1 2 2 培养基和培养爷件 基本培养基：m s 培养基 培养条件：在所有的离体培养试验中，温度为2 4 2 6 ，光照时间1 2h d ，光照强 度为20 0 0 i x 。 1 2 3 茎尖培养 1 2 3 1 茎尖培养基的设计 采用正交实验的方法找出对五种植物茎尖培养影响最大的两种激素6 - b a 和n a a ，根 据其设计了不同浓度配比的培养基( 如表1 ) ，将5 种植物的茎尖分别接入表中1 6 种诱导 茎尖分化的培养基中，3 5 加左右进行观察和统计。 五种木本植物的组织培养及其生理生化研究 表l 不同激素组台配比 m k l mc o w b h - 咀f i o n d k f f e r e m h a n e 6 - b an m ( 喇 ( 删 00 0 50 10 5 01 234 0 55678 1 091 01 11 2 1 31 31 41 51 6 1 2 3 2 茎尖培养的环境条件 设蜀三个温度( 2 0 。c 、2 “2 6 c 、3 0 ) 、黑晤和光照条件、培养瓶不同封口方式对茎 尖进行离体培养，3 0 天后调查记录分芽率和生长状态。 1 2 4 叶片愈伤组织的诱导和分q 匕培养 将合欢无菌种子幼苗的叶片剪下，垂直叶脉横切1 2 刀，置于愈伤组织诱导培养基中。 3 0 天后将愈伤组织转入分化培养基中，进行分化培养。观察记录叶片出愈率、愈伤组织不 定芽分化率及幼苗株高。 1 2 5 生根培养 以高度约为2c i t i 的试管苗为试验材料，所有接种材料在培养2 5 天后统计生根率。 1 2 5 1 试管苗生根基本培养基 以m s ，1 2 m s ，1 4 m s 作为基本培养基，分别附加i b a 0 s m g l 、糖3 0 目l ，研究基本 培养基中无机盐浓度对试管苗生根的影响。 1 1 5 2 生根培养基的激素成分 基本培养基为1 4m s ，附加不同激素和浓度，研究激素种类及浓度对试管苗生根的影 响。培养基编号及激素组成如表2 。 1 2 5 3 糖浓度 表2 生长素组台对试管苗生根的作用 t a b l e 2 e f f e c t o f m b i n 血o n o f a u x n s o n p l a n t l e 船r o o f i n g 1 6 五种木拳植物的组织培养覆其生理生化研究 以1 4 m s + i b a 0 5 m g l 为基本培养基，分别添加1 5 9 l 、3 0 9 l 、5 0 9 i 的自砂糖，观 察记录生根情况。 1 , 2 5 4 外植体苗龄 分别取培养不同天数( 1 5d 2 0d ，3 0d ，4 5 d ) 的欧洲花楸和金链花的试管苗转入1 4 m s + i b a 0 5m 肌+ 糖1 5g l 的培养基e 培养，2 5 天后观察生根隋况。 1 2 6 试管苗移栽 试管苗在生根培养基上生长2 5 - 3 0d 左右，苗高达3 - - 5 c m ，有3 条以上的正常根即可 进行移栽。具g t i 螺：先将生根试管苗移入炼苗室不揭瓶盖在自然光下炼苗一周，之后，用 镊子从三角瓶中选取健壮的苗，将其基部的培养基洗干净，移栽到不同基质的营养钵中。 移栽后一次浇足水分，用塑料薄膜封盖成拱棚，控制好温度湿度。一般温度控制在2 2 - 2 7 ，湿度保证在8 5 左右，在晴朗的夏季中午应该加盖遮荫网。3 0d 左右，小苗有新叶长出， 即可逐渐揭开小拱棚通风降温，增加光照，同时应注意早晚喷施水分一次。当移栽的苗长 出3 0 对新叶时，可将小苗移入大田里定植，定植后应立即浇水一次。 1 2 7 比率的定义 本实验所用的各种率均指产生此现象的材料数占总共供试材料的百分数。 2 结果与分析 2 1 消毒时间对无菌外植体或得的影响 由于彩萼石楠茎段上带有许多小毛消毒比较难，经过不同时间的处理找出最佳适宜的 消毒时间。不同消毒时间对彩萼石楠试管苗培养的影响结果见表3 。随着氯化汞消毒时间 的增长，外植体的污染率降低，但是芽的得率和污染率的刚氐并没有成正相关。这是因为 随着消毒时间的增长，消毒剂对外植体的损伤愈严重，在培养过程中出现褐化等现象，培 养物的死亡率增加，导致芽的得率降低。综合表3 的结果，当用0 1 的氯化汞消毒加m i n 可以获得6 0 的芽的得率。欧李的茎段比较光滑因此消毒相对来说比较容易，它的最佳消 毒时间：酒精3 0s 0 l 的氯化汞6 m i l l ，此时获得7 0 的芽的得率。 表3 不同消毒时间对彩萼石楠芽的得率和污染率的影响 t a b l e 3e f f e c t o f v m i o u s 妇f o r s t c r j 1 l z a l l o n o r s u r v i v a lr a t e a n d p o l l u t k m r a t e o f c a l l u n av u l g a r & 1 7 五种木拳植物的组织培养及其生理生化研究 2 2 不同理化因子对茎尖培养的影响 2 2 1 激素对茎尖培养的影响 五种植物茎尖在添加生长素的供试培养基( 表1 ) 中，一周后茎尖基部膨大，两周左 右形成愈伤，不同材料愈伤组织多少不同。三周左右分化不定芽。五种植物茎尖的不定芽 分化率列于表4 。表4 表明在6 - b a 浓度为0 0 5 1 5 m g l 的范围内，五种植物茎尖可分化 不定芽，且随着b a 浓度的增加，不定芽分化率明显提高，但在不同浓度的b a 作用下， 芽的生长状况差异很大。在只添加n a a 的培养基中，没有不定芽的出现。使用生长素时 会在茎尖基部产生愈伤组织，随着n a a 浓度的增加，愈伤组织也越来越大随着培养时间的 延陡，愈伤组织上会分化出大量根。 接入附加不同浓度6 - b a 和n a a 配比的培养基中的茎尖，不定芽分化率明显不同。 实验结果表明：在不附加任何激素的m s 培养基中，茎尖没有分化出芽。当n a a 浓度为 0 0 5i 窖皿时，6 - b a 的浓度由0 5m 班增加到1 5m 叽五种材料的不定芽分化率都明显增 加。例如欧洲花楸不定芽分化率由5 1 3 增加到7 4 5 。当6 - b a 浓度为1 0m g l 时，随 着n a a 浓度的增加，不定芽分化率下降。但从二者的配比情况看随着配比的增大不定芽 分化率增高。如金链花在二者配比为1 0 时不定芽分化率为8 5 ，配比为5 时不定芽分化 率为7 7 7 ，配比为1 时分化率为3 3 3 。其它植物不定芽分化率也是随着二者的比例增 大而增大。在实验中合欢、金链花、彩萼石楠在培养基m s + b a l 0m g l + n a a 0 1 m g l 中 不定芽分化率较高并且幼苗可以长高到2 c m ( 见附图1 、4 、5 ) ：欧洲花楸和欧李在m s + b a 0 5m g l + n a a 0 1n 1 扎培养基不定芽分化率较高，幼苗可以长高( 见附图2 、3 ) 。 表4 不同培养基对五种植物茎尖不定芽分化率的影响 t a b l e 4 t h e 渤o f d i f f e r e n t m e d i a o n d i f f e r e n 枷o n o f s h o o t 却s 五种木本植物的组织培养及其生理生4 e o , 研究 注：字母表差异达p 0 0 1 水平 n o t e ：t h e l e t t e r m e a n sc o m p a r i s o n ss i g n i f i c a n t a t t h e 0 0 1 l e v d 2 _ 2 2 王r , 境n 3 - n - 茎尖培养的影响 2 2 2 1 温度时茎尖培养的影响 温度对芽的分化起着很重要的作片j ，选用m s + b a l 0 m g l + n a a 0 1 m g l 的培养基， 接种合欢、金链花、彩萼石楠的茎尖在不同温度c 2 0 、2 4 - 2 6 6 c 、3 0 4 c ) 下培养。实验结 果表明：培养温度在2 4 - , , 2 6 c 时这三种植物不定芽分化率分别是1 0 0 、9 5 、1 1 3 ) 0 ， 并且不定芽分化速度快，生长健壮，苗展，叶大。在2 0 c 及3 0 。c 培养对不定芽分化率降 低，分化速度熳，芽质也较差，生长细弱。从而得出：适宜培养温度为2 4 - 2 6 c 。 2 2 2 2 光照对茎尖分化芽的影响 实验中发现暗培养明显推迟不定芽出现时间，并且刚氐分化率，再生出的不定芽浅 黄色比较纤细。当给适当的光照( 2 0 0 0 1 x ) ，可明显提高不定芽分化率，改变芽的生长状态。 2 2 2 3 培养瓶不同封口方式对茎尖芽分化的影响 使用不透气膜封口培养的茎尖分化率比透气膜的略高一些，但是使用不透气膜分化出 的不定芽状态不好，出现了玻璃化现象，影响继代培养。而使用透气膜的茎尖分化出的芽 不定芽健壮，绿色，没有玻璃化现象。因而为了更有效的大量扩繁，使用透气膜较好。 2 3 合欢叶片愈伤组织的诱导与分芽 实验中发现合欢叶片在培养1 0 天时切口处膨大，2 0 天左右可见切口处有愈伤组够i 产 生3 0 天左右愈伤组织达到最大，同时愈伤组织上出现许多小芽( 见附图1 2 ) 。通过方差 分析结果( 见表5 ) 表明：不同激素水平对愈伤组织的诱导率和分化率存在极显著差异。 从表5 可以看出合欢叶片在这三种培养基上都可以产生愈伤组织同时分化出芽( 见附图 1 1 ) ，不定芽分化率随着6 - b a 浓度的增加而增多，但是幼苗株高下降了。 继代培养过程中，常常可见位于愈伤组缈 层的部分成白色疏松状；位于愈伤组织内 层的部分呈淡绿色，结构致密。将外层自色愈伤组织( 称为1 号) 年内层绿色愈伤组织( 称为 2 号) 置于不同激素水平的培养基中，结果如表6 所示。外层愈伤组织诱导不定芽分化率很 低，不可作为继代繁殖的材料。内层愈伤组织，随着池的浓度升高不定芽分化率增高， 但幼苗株高下降，以m s + 6 - b a1 0 m g i + n a a o a m g l 的出芽数最多，并且幼苗比较高( 见 1 9 墨茎查查坚竺生望堡兰查墨苎圭墨圭! ! 竺塞 附图1 3 ) 。 表5 不同激素水平对叶片愈伤组织的诱导与分化 1 1 曲j c 5e f f e c t o f d i f f e r e n t h o r m o n eo n 拄k i n d u c t i o n a n d d i f f e r e n t i a t o n o f l e a f 6 - b an a a出愈率分化率 幼苗株高 ( r a g l ) ( i t i c r i u 8 i n d u c t i o nb u d d i f f e r e n t i a t i o n h e i g h t o f m b ( )蹦) p h a t i e t ( a n ) o j0 1 1 0 08 7 5 b2 5 a 1 0 0 11 6 09 5 a 1 7 a b ：! ! ：!竺! ! 坠 ! 兰呈 注：字母表示差异达咖m 水平 n o t e ：t h e l e t t e r m e a n sc o m p a r i s o n s 唧c 蹰t a t t h e 0 0 1 l e v e l 表6 激素对愈伤组织的诱导与分化 i 曲l a6 e 盘d o f h o r m o n e a m c e n n a t i o n o a b u d s a n d s h o o t s 丘0 m c a l h 注：字母表示差异达p 0 0 1 水平 n o t e ：t o e l e t t e r n x a l uc o m p a r i s o n s s i g n i f i c a n ta t t h e 0 0 1l e v e l 注：外层愈伤组织和内层愈伤组织分别接种3 0 块 n o t e ：3 0 c a n la r i n o c u l a t e d t o o u t e r l a y e r o f c s i l u s a n d i n n e r l a y e r o f c a l l u s 1 ：p a r e n c