（微生物学专业论文）兔盲肠宏基因组中β葡萄糖苷酶基因的分离研究.pdf

摘要 从兔盲肠宏基因组中 分离b 一葡萄糖苷酶基因的研究 微生物专业硕士研究生马淑华 指导教师周泽扬教授 摘要 在人口激增的今天，世界范围的粮食危机越来越严重；石油、煤炭等矿物能源日渐枯竭， 因此，寻找可再生的替代能源已成为全人类迫在眉睫的课题。天然纤维素拥有可再生、产量 大、环境友好等特点，被人们认为是解决这些危机的希望。但目前国内外在利用生物降解的 方法来利用纤维素方面均存在酶活性低、酶的种类相对较少等问题。寻找和开发高活力、广 底物、耐高温高碱等极端条件的新型纤维素酶，对r 纤维素酶的开发利用具有重要的l ：业价 值和社会价值。在纤维素酶系水解纤维素的过程中，d 一葡萄糖苷酶可以水解纤维二糖和低分子 量的纤维寡糖为葡萄糖；同时，8 葡萄糖苷酶作为酶制剂生产应用也有非常重要的作用。因 此研究和开发新型高效b 一葡萄糖苷酶具有十分重要的意义。 据分析，由于环境样品的微生物中9 9 以上的类群是未被培养而没有得到人们的认识，开 发这些未能培养的微生物及其基因资源已成了近年来国际上的研究热点。目前已经建立起一 条研究开发这些未能培养微生物的途径，即宏基因组学研究。宏基因组学以环境中所有微生 物基因组为研究目标的微生物研究方法，通过扩增测序、总基因组文库的构建和测序分析， 可以获得人量的关于未知微生物的有用信息。兔盲肠肠道里聚集着大量能分泌纤维素酶的微 生物群体，但由于传统纯培养技术造成对这些环境内微生物研究利用的局限，对其内部的纤 维素降解相关基因的研究就存在极大的空间。 本研究基于d 一葡萄糖苷酶的重要价值和开发兔盲肠新型纤维素酶类基因前景的广阔性，采 用宏基因组学研究手段，构建兔盲肠内微生物宏基因组d n a 文库，从中成功筛选获得一个新 的与纤维素降解相关的基因p 葡萄糖苷酶基因，咖7 ，并且对其相应酶进行了酶学性质分析。 主要结果如下。 一、兔盲肠内微生物宏基因d n a 的提取 为寻找高效提取兔盲肠肠道微生物宏基因组d n a ，本研究从兔盲肠肠道内收集菌体之后， 分别采用三种不同的基因组提取方法。用这三种方法均能提取获得宏基因组d n a 。通过测定 所获得d n a 的o d 2 。眈鲫，以及进行分析限制性酶酶切分析，发现：p v p p 电洗脱方法获得的基 因组d n a 的纯度最高，基冈组d n a 含量较大，同时可以较好的被限制性内切酶酶切消化；基 两南人学坝i 学 节论文 因组提取试剂盒方法虽然操作最为简单且提取到的d n a 纯度较高。但是提取基因组的量很低， 且酶切效率不高；方法酚氯仿方法提取基因组d n a 的量晟大，但是d n a 纯度展差，且用限制 性内切酶无法进行酶切消化。提取结果比较表明，p v p p 电洗脱方法所得到的兔盲肠宏基因组 d n a 含量较高，纯度也高，而且能很好的被限制性内切酶消化，可以满足后续建库的要求。 二、兔盲肠内微生物宏基因组d n a 文库的构建 从采集的兔盲肠内提取微生物宏基因组d n a ，然后利用限制性内切酶妇“3 ai 进行部分酶 切消化，回收大小为2 o _ 4 5k b 左右的d n a 片段。回收的片段d n a 与预先用曰删h i 酶切、并经 去磷酸化处理的质粒p u c l l 8 载体连接，转化到大肠杆菌感受态细胞内，构建宏基因组文库。 本次的研究中，成功构建了一个约含有9 0 0 0 个重组克隆的兔盲肠内容物宏基因组d n a 文库， 其插入片段的大小主要为1 5 _ 4 5k b 。这为后续新型基因的筛选利用提供了材料，同时为探索 兔盲肠微生物多态性研究奠定了基础。 三、厣葡萄糖苷酶基因的分离研究 本研究利用口葡萄糖苷酶活性检测平板，从兔盲肠宏基因组文库中分离得到1 个肛葡萄 糖苷酶基因，编号为，掣z 7 。该基因的开放阅读框( o r f ) 全长为2 8 2 b p ，g c 含量为6 0 3 ， 编码9 3 个氨基酸。该基因编码的蛋白质的预计分子量( m w ) 为1 0 5 4 5 9 0d a ，等电点( p i ) 为5 3 0 ，是一种亲水性蛋白质。推导的蛋白序列中没有信号肽序列存在，但有一个跨膜结构 域，位于7 6 8 1 残基之间。通过n c b i 在线b l 蕊t 比对分析表明：该伊葡萄糖苷酶基因，私脚7 与现有数据库中的伊葡萄糖苗酶基因之间在核苛酸或者氨基酸水平上无同源性，因而被推测 是新型的胁葡萄糖苷酶编码基冈。 四、伊葡萄糖苷酶酶学性质分析 本研究以大肠杆菌为表达宿主菌，以同一批发酵液测定不同条件下酶活力大小，初步研 究该d 一葡萄糖苷酶基因编码产物的酶学性质。测定结果显示：该酶反应最适温度为5 0 左 右，最适p h 为1 0 o 。该酶在中性和碱性环境中具有比较高的酶活力，同时具有比较好的稳 定性；在高温时虽然能具有较高的反应酶活力，但是稳定性却很差，且随着温度的升高稳定 性也越来越差。不同金属离子及表面活性物对该酶酶活力具有不同的影响。m 9 2 + 、2 0 + 、m n 2 + 对该酶有较强的促进作用；c a 2 + 、c u 2 + 对酶活力没有影响；而n a + 、k + 、f e 3 + 、e d l a 、脲对 该酶有较强的抑制作用，甚至使酶完全失去活性。该酶的底物特异性不强，它可以作用于不 同底物的b 葡萄糖苷键，且酶活力大小不同。对于乳糖和麦芽糖表现较高的酶活力，几丁质 次之。对于滤纸、七叶苷及粉末纤维素均表现一定的酶活力。 上述研究结果表明，对于通过宏基因组筛选分离得到的p 一葡萄糖苷酶基因，泓加7 为一 个新的p 一葡萄糖苷酶基因，对于它的研究有利于对d 葡萄糖苷酶及纤维素酶的研究利用。且 通过酶学性质研究发现，该酶可以很好的适应碱性环境，可用于碱性酶制剂的生产利用，对 于它进一步的高效表达生产开发具有十分重要的意义和价值。 p q 雨人掌坝f 学位论文 m e t a g e n o m i cd n a ，劬ma l l 廿l eo 唱a n i s 傩w i l i i lm e 姗p l e t l l eo b t a i n e dm e t a g e n o i i l i cd n ai s 锄b s e q u e n t l yc l o n e di n t 0c e r t a i no fv e c t o r st 0c o n s 仇l c tm e t a g e m m i cl i b 内n e st l l a ta r es r e e df 0 r g e n e so fi n t e r e s tb yd n a d n ah y b d i 盟t i o n ，p o l y m e r a s ec h a i n 陀a c t i o n ( p c r ) 0 ra c t i v i t y s c r e 锄i n g t h ed i g e s t i v e 仃a c t so fs o m ek i n d so fa n i m a l sa 托r 印o r t e d 舔a9 0 0 dr e s o u r c ef o rh i g i le 伍c i 肌t c e l l u l 淞e ，s i n c eal o t0 fi i l i c i i o b e s i n h a b i t t i n gm e r ec a np r o d u c el o 伍0 fc e l l u l 弱et od i g e s tm e c e l l u l o s i cf e e d s u c hd i g e s t i v e 衄c t si n c l u d ct l l em m 肌o fc o wa n ds l l e 印，t l l ec e c 啪o f h o s ta n d m b b i t ，甜l dt h em t e s t i l l a l 仃a c to fl o n 百c o ma n dt e 疵t e b y 锄a c t i v i t y - b 舔e di m t a g e n o r n i ca p p r o a c h ，、 c l o n e dan o v e lc e l l u l 舔eg e 肿丘d mt i l e l i c r o b e s i i lr a b b i tc e c u 耻舶m e d 增饥7 ，锄dt r i e dt 0 锄a 1 ) r z ei t se n z y i l o g ) ，p r o p e r t i e s 1 e x t r a c t i o no fm e t a g e n o m i cd n af r o mr a b b i tc e c u m t of i n dab e t t e ra n dm o 心e 伍c i e n tw a yf 0 r e x 仃a c t i n gi i l i c r o b i a lm e t a g e n 伽血cd n a ，w eu s e d 曲肥ed i 丘e r e n tm e m o d sa 矗e rt l l ec e l l sc o l l e c t e df b mc e c 啪c o n t e n l & t h e n ，w ec i e t e n l l i n e d t h e o d 2 毗8 0 o fm e d n as 姐】p l e s ，a n dd i g e s t e dm 锄w i mv 谢。吣r e s t r i c t i o ne n d o 硼c l 锹s 1 k 坨s u l t sd i s p l a y e dt 1 1 a tt h em e t a g e n o m i cd n a so b t a i n e dw i t hp 叩_ e l e c 慨l u t i w e r eo f h i g h e s t p u r i 吼r e l a t i v e l yh i g h e r 锄o u n t ，姐dab e n e r 豫s t r i c t i e n d o 肌c l e a sd i g e s t i o n ；t l l o o b t a i n e d w i lp h e n o l 柚dc h o l o r o f 0 髓w e 豫o ft i l el o w e s tp 谢q u i t e l yl o wa n l o u n t ，a n dn 彻- 他s _ t r i c t i o n 锄d 0 i n l c l e 弱e sd i g e s 廿o n ；锄d0 b t a i n e d 毗hg e n o r i l i ce ) 【仃孔t i o nl ( i t ，t h e 眦t a g e i i l i cd n a sw e r e o fr e l a t e dl l i g hp u r i 劬m el o w e s tc o n t e i l t ，a n dab a dr e 撕c t i 豇屹”n ed i g e s t i o n t h l _ i s ，w ec o n t i n u e o u r 他a r c hw i t hd n ae x 仃t e db yp v p p - e l e c 仃o e l u t i o n 2 c o n s t r u c t i o no fm e t a g e o i i l i cd n a u b r a l y a r e rb e i n gd i g e s t e d 谢l 3 ai ，t l 把d n a 丘a g m 锄t sf b m2 ot 04 5k b 、e r e 坞c o v e r e d s u b s e q u n yc l o 鹏do m ov e c t o rp u c l l8 ，w l l i c hh a db e e nd i g e s t e dw 汕肋m hia n dh a db e 锄 p i l o s p h o 巧l a t e dp 陀v i o u s l y 1 k c o m b i i l 枷v e c t o 塔w e 佗t 1 1 e n 仃缸l s f o m 脚e di n t 0c o m p e t e n tc e l l so f e ” p 曲缸c o 妇t oc o n s 咖c tam e t a g e n o i n i cl i b m r y i l lo u rs t u d y w e 蛐c c e 鼹如1 1 ) rc o n s m j c t c da c e c 啪m e t a 目m 砌cl i b r a r yc o n t a j n gd b o u t9 ，o o o 咖s 丘d m 柚t sc o n t a i l l i n gi i l s e n e dd n a 的粤球m t s v l 3 g e n ec l o n i n ga dp a n i a yc h a r a c t e r i z a t i o no fa 争g l u c o s i d a s eg e n e 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加 了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同 仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。 学位论文作者：蜀沦午 签字日期： p 矿年口6 月f f 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生部可以将学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存、汇编学位论文。、 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，。本论文：口不保密，口 保密期限至年月止) 。 学位论文作者签名：蜀波噜导师签名： 签字日期： g 年p 占月厢签字日期： 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第一千义献琼述 第一章文献综述 纤维素( c e l l u l o s e ) 是地球上贮量最丰富的天然有机化合物。据估计，每年 由光合作用所生产的各类纤维素大约是1 0 1 2 吨，我国每年仅农作物秸秆的产量就 高达7 亿吨，其主要成分是纤维素。纤维素是由葡萄糖残基以伊1 ，4 一糖苷键 ( 伊l ，4 g l y c o s i d i cb o n d ) 连接形成的直链高分子化合物。纤维素通过纤维素酶降 解成为葡萄糖，葡萄糖不仅是人类医用、食品的重要支撑，也可以通过发酵等途 径为人类提供所需的能源。在人口爆炸的今天，世界范围的粮食危机越来越严重； 石油、煤炭等矿物能源日渐枯竭，因此寻找可再生的替代能源已成为全人类迫在 眉睫的课题。天然纤维素因拥有可再生、产量大、环境友好等特点，被人们认为 是解决这些危机的希望所在。 目前工业方法降解纤维素成本高、耗能大，对环境的污染严重等原因制约了 纤维素的利用。如果在工业生产中适当利用纤维素酶，用生物降解来替代或补充 化学降解，则可以大大缓解上述问题。然而，由于纤维素通常是以不溶性的纤维 成晶状排列形式存在的，再加上纤维素分子与其它多糖如半纤维素、果胶等结合 在一起，其外又包裹上木质素，致使参与消化的纤维素酶分子难以接近等原因造 成了纤维素不容易被降解。目前国内外在生物降解纤维素方面均存在酶活性低、 种类相对较少等问题。因此寻找和开发高活力、广底物、耐高温高碱等极端条件 的新型纤维素酶以满足于工业生产已经成为首要问题。 微生物是一座潜在的探之不尽的基因资源宝库【lj ，这为我们寻找高效新型纤 维素酶产生菌打开了一扇大门。但是，过去利用微生物普遍采用传统纯培养技术， 而9 0 以上的微生物难以在实验室条件下被培养出来的，这就造成了大多数微 生物资源没有被人们认识。开发这些未能培养的微生物及其基因资源已成了近年 来国际上的研究热点，随着分子生物学技术的不断发展和拓展，目前已经建立起 一条研究开发这些未能培养微生物的途径，即宏基因组学研究。 1 1 未培养微生物的研究概况及其发展前景， 1 1 1 未培养微生物的研究概况 微生物学长期以来是依靠纯培养技术研究微生物的，然而纯培养方法也严重 地限制了我们认识微生物的视野，这是因为许多未知微生物缺乏再现环境条件的 方法和培养基质，造成了大多数微生物难以被标准实验室方法复苏和培养，这类 微生物占全部微生物总数的9 0 以上，我们称之为未培养微生物或称为不可培养微 生物【2 1 ( 腑c u l t u i e dm i c r o o 曙删s m ) 。随着社会的发展，人们已经越来越难从已知代 谢产物中分离到新物质来适应社会发展的需要了。由于自然界中大部分的微生物 两南人学硕i 。学位论文 仍未被人们认识和开发，它们产生的代谢产物也未被利用，因此人们将目光转移 到了对这部分未培养微生物的开发利用。为了绕过传统培养方法的障碍，人们开 始不断摸索新方法对未培养微生物的开发利用。1 9 8 6 年o l s n 等在发表应用分子 d n a 技术探索自然环境中微生物多样性的文章后，引起了人们对这领域的广泛重 视。随后，核酸技术在对微生物多样性的研究方面得到了广泛地应用，并显示出 了传统的微生物学研究方法所不具备的巨大优势。1 9 8 7 年已知可培养的微生物有 2 6 个类群，多年后的今天微生物类群己多达5 2 个，其中半数是未被培养、利用核 酸技术获得的。 随着基因组学和现代分子生物学技术的飞速发展，利用1 6 s r r n a 和1 8 s r i 斟a 基因序列分析、d n a 杂交、p c r 技术、电泳分离技术、核酸指纹图谱以及宏基因 组学( m e t a g e n o m i c s ) 等分子技术在环境微生物多样性、种群构成及种群变化研究方 面已得到越来越多的应用，也为寻找新基因及其产物提供了一条新的途径【3 】。 1 1 2 未培养微生物的发展前景 由于未培养微生物在其物种类群、新陈代谢途径、生理生化反应、产物等方 面都存在多样性，因而它比可培养微生物具有更为丰富的、可供人类开发利用的 生物资源，其发展前景主要集中在以下几个方向：筛选编码功能蛋白的基因以及 具有特异生物功能的酶基因，如耐高温、耐强酸强碱高盐的酶；发现新的代谢调 控机理，便于筛选和构建各种蛋白的高产菌株；筛选具有不同生态功能的微生物 活细胞等；寻找具有生物活性的次生代谢产物。 近年来现代分子技术和基因组学逐渐渗透到有关生命科学的整个领域，这为 微生物生态学提供了新的研究方法和机遇，也必将在未培养微生物资源的开发利 用中发挥越来越重要的作用。 1 2 宏基因组学方法在微生物研究上的应用与进展 1 2 1 宏基因组概念的提出 由于微生物形体微小，肉眼不可见1 1 9 】及用传统的培养方法难以获得纯培养【2 0 】 等原因造成环境中绝大多数的微生物还未被研究。1 9 8 5 年，p a c e 等【2 l 】首先提出可 以直接从环境样品中提取微生物群体基因组d n a 从而绕过传统微生物研究方法所 必需的培养阶段对其进行研究，并利用这一方法成功的获得了大量的前所未知的 微生物信息。1 9 9 1 年，s c h m i d t 等【2 2 】进一步利用这一方法构建了来自海水样品d n a 的入噬菌体文库，并进行了1 6 sr r n a 基因的筛选分析。1 9 9 6 年，d e l 0 n g 等i 刀l 开展 了一项在这一领域里具有里程碑意义的工作，他们克隆了一段来自一种未知海洋 古细菌的4 0 k b 的基因组片段并进行了测序分析。1 9 9 8 年，h a n d e l s m 锄等【2 4 】对这一 2 第币义献铄述 新的研究方法进行了定义：一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象， 以功能基因筛选和测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、 功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法， 并第一次使用了m e t a g e n o m i c s 这个名词，中文文献中将其译为“宏基因组学【2 5 2 7 1 。 虽然在有的文献中使用了环境d n a 文库( e n v i r 0 衄e n t a ld n al i b r 撕e s ) 【3 0 】、土壤 d n a 文库( s o i ld n al i b r 撕e s ) 【2 8 】、e d n a 文库( e d n al i b 瑚一e s ) 【2 9 1 、重组环境文 库( r e c o m b i n a n te n v i r o m e n t a ll i b r 撕e s ) 【j 、全基因组文库( w r h o l eg e n o m e 仃e 2 l s u r e s ) 【3 1 】、群体基因组( c o m m u n i t yg e n o m e ) 【3 2 1 、全基因组鸟枪法测序( w h o l eg e n o m e s h o t g u i ls e q u e i l c i n g ) 【3 3 】等，但在大部分的工作中都以“宏基因组学【3 4 4 6 】作为其 正式名称。在随后的几年里，宏基因组学经历了飞跃式的发展。首先是以获得基 因编码产物为目的的研究普遍展开。 1 2 2 宏基因组学研究方法 宏基因组学的基本方法是分析微生物环境中的基因组组合，直接分离未培养 微生物基因组d n a ，基冈组d n a 与载体连接，将连接产物转入宿主细胞，然后从阳 性转化子中筛选目的基因或d n a 片段( 图1 1 ) 。 图1 1 环境微生物宏基因组学研究策略 f i g u 陀1 1r e s e a r c hs t r a t e g yf - 0 re n 讥r o m e n t a l1 1 1 i c r o b i cm e t a g e n 硎c 3 两南人学硕f ：学位论文 1 2 3 目标克隆子的筛选 目标克隆子的筛选很困难，主要的筛选方法有序列筛选( s e q u e n c e b a s e d s c r e e i l i n g ) 和功能筛选( f u n c t i o n a ls c r e e n i n g ) 。序列筛选可以鉴定一些在宿主中不表 达的序列：功能筛选可以检出根据序列不能检出的目的基因。因此把两者结合起 来是非常必要的。 ( 1 ) 序列筛选：该方法是采用引物或探针，根据保守序列鉴定出已知基因的 同源物进而从文库中筛选出目的基因的方法。例如，可以通过系统发育标记如 1 6 s 枞和r e c a 筛选；也可以利用基因的保守序列进行杂交或多重p c r 【6 1 】；另外 还可以对文库随机测序，然后对序列进行分析获得所需信剧2 4 郧加】。 ( 2 ) 功能筛选：该方法能方便地从成千上万的克隆中检测出活性克隆。例如， 可以根据某些特异的表型如酶活、抗生素活性等进行功能基因的筛选【6 8 ，8 4 ，8 9 1 。 这些方法都有各自的优势和缺陷，但这些方法为我们进一步了解那些未知微生 物的生物多样性、遗传多样性、某些特异基因的功能活性、微生物的代谢网络、 微生物之间的协作与拮抗作用、微生物对环境变迁的影响、微生物与环境之间的 相互作用提供了一条可靠有效的途径，也为我们更加充分的利用微生物资源提供 了一个稳定的平台。通过建立的筛选体系筛选宏基因组文库，已经获得了抗菌物 质代谢相关基因、色素合成基因、脂肪酸烯醇酯合成基因、几丁质酶基因、生物 素生物合成相关基因、酯酶基因、乙醇氧化还原酶基因、淀粉酶基因、新生物催 化剂基因、新酶基因等具有功能活性的基因，有些甚至是以前从未研究过的新基 因。这些成功的研究先例表明，通过建立宏基因组文库，从文库中筛选目的基因 是一条利用未被培养微生物资源的有效途径。 1 - 3 纤维素酶的研究进展 1 3 1 纤维素的结构 作物秸秆的干物质一般由灰分和含氮化合物与非含氮化合物组成。含氮化合 物主要是蛋白质和其他含氮物：非含氮化合物主要是纤维素、半纤维素和木质素 等，这一部分占秸秆干重的8 0 左右。水稻、小麦及玉米等主要农作物秸秆的纤维 素含量为3 0 3 5 ，半纤维素含量为2 5 3 0 ，木质素含量为2 0 2 5 【5 1 。它 们是秸秆降解的主要对象。 纤维素分子是由许多吡喃型的d 一葡萄糖残基以b 一1 ，4 糖苷键相连接而成的多 糖。它的聚合范围非常宽，可以从几百直到一万五千左右，是一种高分子化合物。 在纤维素链之间存在着氢键的缔合作用，使纤维素链形成纤维素束【6 】。在纤维素的 连续结构中，分子密度大的地方成平行排列，有较好的定向性，形成纤维素的结 4 算、一 了义献练j 丕 晶性区域【7 1 。在纤维素分子的结晶区内，其直链状聚合物是同向配位的，被称作平 行构造。在纤维素分子中邻近的聚合物，有1 4 个分子离开原来位置在晶格空间无 间隙地配位形成氢键，使其稳定化。随着分子密度的变小，结合程度变弱，分子 间空隙变大，定向性变差，形成了纤维素的无定形区域。在纤维素中，除了纤维 素链之间存在氢键外，在分子内也存在氢键。氢键的存在给纤维素水解带来很大 的困难，而且纤维素被半纤维素及木质素层包围，物理地阻止了纤维素酶对纤维 素的降解，限制了纤维素酶活性的发挥。因而除去木质素，尽量使纤维素结晶度 降低的预处理是非常重要的【8 州。 1 3 2 纤维素降解机理 纤维素酶是一种复合酶，它使纤维素转化为葡萄糖的具体作用细节至今仍不 是很清楚。目前较为流行的理论主要有三种：协同理论( s y n e r 百s m ) 、原初反应 假说( i n i t i a l d e 铲a d i n g ) 和碎片理论( f m g m t a t i o n ) ，但大多数人倾向于协同理 论，即c 1 一c x 学说。 对于纤维素各组分之间的协同降解理论存在两种观点：一种观点认为【1 0 1 ，首 先由c x 酶在纤维素聚合物内部起作用，在纤维素的非结晶部分进行切割产生新的 末端然后再由c 1 酶以纤维二糖为底物由末端进行水解，最后由纤维二糖酶( c b ) 将纤维二糖水解为葡萄糖( 图1 2 ) 。 另一种观点认为【1 1 】，首先由外切型葡聚糖酶( c b hi 和c b hi i ) 水解不溶性纤维 素生成可溶性的纤维糊精和纤维二糖然后由内切型葡聚糖酶( e gi 和e gj 1 ) 作用于 纤维糊精，生成纤维二糖再由纤维二糖酶( c b ) 将纤维二糖分解成二个葡萄糖( 图 1 3 ) 。 纤维素 c b hi 、 纤维糊精 、c b hi i 葡萄糖 图1 2 纤维素酶对纤维素的协同降解模型 两南人学硕l j 学位论文 不溶性纤维素 图1 3 纤维素酶水解纤维素的可能途径 1 3 3 纤维素酶的组成 纤维素结构的复杂性决定了任何一种酶都难以有效的降解它，因此天然纤维 素的降解酶都是复杂的多酶体系纤维素酶。一般按其性质可将纤维素酶分为三类 【1 2 】： ( 1 ) 葡聚糖内切酶( e n d o l ，4 一b d 羽u c a n a s e ，e c ，3 2 1 4 ，简称e g ) ，或称c m c 酶或c x 酶。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解b 1 ，4 糖苷键，将 长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。 ( 2 ) 葡聚糖外切酶( e x o 一1 ，4 b d 一鲥u c 锄a s e ，e c ，3 2 1 9 1 ，简称c b h ) ，或称微 晶纤维素酶、纤维二糖水解酶或c l 酶。这类酶作用于纤维素分子末端，水解8 1 ，4 糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子。 ( 3 ) b 葡萄糖苷酶( b g l u c 锄筋e ，e c ，3 2 1 2 1 简称b g ) ，或称纤维素二糖 酶。这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子。虽然它对纤维素无作用，但它可以消 除上述两种酶催化反应的终产物对反应的抑制作用，从而加快反应速度。 1 3 4 产纤维素酶微生物研究进展 纤维素酶的来源非常广泛。真菌、放线菌及细菌等在一定条件下均可产生纤 维素酶，至今已有很多关于纤维素酶生产菌株的研究报道【1 3 d4 1 。目前研究较多的 是霉菌和热纤梭菌【1 5 - 1 引。 1 3 5 兔盲肠微生物及纤维素分解菌 在一些非反刍动物来说，盲肠微生物是消化纤维素的重要器官，例如马和兔。 1 9 9 0 年m c l a u 曲l i n d e 等发现兔盲肠的许多微生物可以产生纤维素酶破坏植物细胞 壁。虽然对牛瘤胃微生物降解纤维素的研究颇多，但是一直以来对兔盲肠中降解 纤维素的微生物一直进展不大。2 0 0 6 年中国学者y if e n g 等【6 8 】利用宏基因组方法绕 6 第一章文献锚；述 过传统纯培养微生物的方法克隆到了1 1 个纤维素酶基因。因此，兔盲肠也在获得 纤维素酶新基因研究方面有很大潜力。 1 4p 葡萄糖苷酶简介及研究概况 1 4 1b 葡萄糖苷酶简介 在纤维素酶系水解纤维素的过程中，伊葡萄糖苷酶是一种能催化水解芳香基或 烷基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖的酶，该酶的功能是将纤维二糖和纤 维寡糖水解形成葡萄糖。根据氨基酸序列分类，人们将b 一葡萄糖苷酶划分在糖苷 水解酶家族1 和3 中。家族1 中的b 一葡萄糖苷酶来自于细菌、植物和哺乳动物；家族 3 中的酶来自于真菌、细菌和植物。几乎所有的伊葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结 构的专一性较差，能裂解c o 糖苷键、c s 键、c f 键、c n 键等。在所有底物中， b 一葡萄糖苷酶对纤维二糖的活性最强。 1 4 2b 葡萄糖苷酶产生菌 1 8 3 7 年“e b i g 等首次在苦杏仁汁中发现了b 葡萄糖苷酶【4 7 j 。1 9 7 7 年 s t e m b e r g 等将黑曲霉中的p 葡萄糖苷酶加到木霉的纤维素酶制剂中，发现水解活 力显著提高，并提出该协同作用的机制是由于伊葡萄糖苷酶解除了纤维二糖对木 霉中纤维素酶的抑制作用。随后伊葡萄糖苷酶便广受关注【4 8 】。目前己经发现的产 肛葡萄糖苷酶的生物类群包括原核生物、真核生物和古细菌三个界，共几十个属， 几百个种【4 9 1 。虽然伊葡萄糖苷酶广泛存在于植物的种子和微生物中，但植物来源 的伊葡萄糖苷酶活性远比微生物来源要低【矧，所以目前的研究主要集中在微生物 上。 在许多微生物中发现伊葡萄糖苷酶存在，如曲霉属、拟康氏木霉、康氏木霉、 里氏木霉、绿色木霉、枯草杆菌、梭状芽孢杆菌、链霉属、酵母掣5 1 1 。在众多的 产酶菌中，黑曲霉是到迄今发现的最佳的p 葡萄糖苷酶产生菌【5 2 】。在产伊葡萄糖苷 酶的微生物中有很多种都不止编码一种伊葡萄糖苷酶，它们的酶学性质也可能相差 很远。 1 4 3b 葡萄糖苷酶作用机理的研究 ( 1 ) 作用假说 1 9 5 0 年i k e s e 等曾提出c 1 - c x 的假说。b 1 ，4 酶( 内切b 一1 ，4 葡聚糖酶) 能水解 纤维素的衍生物，如梭甲基纤维素( c m c ) ，但不能水解天然纤维素。天然纤维素 经c l 酶( 外切b 1 ，4 葡聚糖酶) 作用后的产物，才能被c x 酶降解为纤维寡糖，然后 再由b 葡萄糖苷酶的作用下生成葡萄糖。众多的文献资料证明，分解纤维素并不 7 两南人学硕i 。学位论文 是单一酶，而是一个多酶体系，因此单独或外加伊葡萄糖苷酶来处理纤维素尚未 见报道，但可以肯定纤维素的降解离不开b 葡萄糖苷酶的作用。 ( 2 ) 活性中心结构 s o n n 0 1 t 等认为在b 葡萄糖苷酶中起催化作用是2 个g l u 残基，靠近n 端的 g l u 起酸碱作用，另一个则是亲核试剂。而g r a b n i t z 等【5 3 j 研究发现来自c ，凼触历 肪溯d 砒“聊的伊葡萄糖苷酶的活性部分是一个包含1 3 0 个氨基酸残基的区域， 它的氨基酸序列中心基团是h i s a s n g l u p r 0 ，而具有催化作用的残基是h i s 和 g l u ，它们之间的距离是3 5 5 5 个氨基酸。而高度保守的c 端附近的残基也许参与 了酶与糖苷底物的键合。 1 4 4b 葡萄糖苷酶酶活力的测定 伊葡萄糖苷酶酶活力的测定方法很多，概括起来主要有荧光法、电化学法、分 光光度法i 矧等。( 1 ) 荧光法：r 0 b i n s o n 使用4 甲基伞形酮的伊d 一葡萄糖苷作为底 物，经伊葡萄糖苷酶作用，专一地分解为具有强烈荧光的禾甲基伞形酮，此法灵敏 度高且快速。( 2 ) 电化学法：由g u i l b a u l t 和k r a m e r 设计，以扁桃苷为底物，根据 所产生的氢化物，用与自发( 内) 电解池相联结的一对银铂电极来测定其葡萄糖苷 酶活性。( 3 ) 分光光度法：由于肛葡萄糖苷酶可以酶解多种底物，如水杨苷、对 硝基苯基一伊d 葡萄糖苷( 讣咿g ) 和纤维二糖等，所以酶活力的测定方法有所不同。 用水杨苷作为底物时，将水杨苷裂解为水杨醇和伊d 葡萄糖，然后对所产生的葡萄 糖用比色法测定；也可将酶解产物用4 氨基胺替比林作显色剂，使释放出来的水杨 醇显色，再用比色法测定。用p n p g 作为底物时，对产生的对硝基苯酚可直接用 比色法测定。用纤维二糖作为底物时，酶解产生的葡萄糖用葡萄糖氧化酶或过氧 化酶试剂氧化后再用比色法测刘5 5 】。( 4 ) 碘量法：用熊果苷( p d 葡萄糖苷一对苯 二酚) 作为底物，对产生的葡萄糖可用碘量法加以测定。 1 4 5b 葡萄糖苷酶的理化性质 b 葡萄糖苷酶有胞内酶和胞外酶之分，有些生物体内只含有胞内b 葡萄糖苷 酶，有些只含胞外b 葡萄糖苷酶，也有少部分微生物体内同时含有胞内和胞外b 葡萄糖苷酶。 ( 1 ) 相对分子量：b 葡萄糖苷酶的相对分子量一般在4 o 2 5 ok d a 之间。 不同来源的b 葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大。宛晓 春等【删从黑曲霉得到的b 一葡萄糖苷酶的分子量为约1 2 0l a ：汪大受【5 6 】从康氏木 霉提取到b 一葡萄糖苷酶的分子量仅为7 7l a ；陈向东等【s 7 】对日本根霉0 5 3 1 8 纤维素酶纯化测得b 葡萄糖苷酶是由四个约为1 0 0i a 的亚基组成，分子量约为 第币义献绿述 3 9 oi a ；王沁等【5 8 j 从黑曲霉发酵液中分离提纯了b 葡萄糖苷酶，得到四种分子 量分别为7 7l 乏d a 、7 3k d a 、6 7k d a 和4 3k d a 的酶组分；d a y 和w i t h e r s 等【5 9 l 从中分离出的野生性b 葡萄糖苷酶是一种二聚体，由两个质量为5 0l a 的b 葡萄糖苷酶的亚基构成。 ( 2 ) 最适p h 值：大部分b 葡萄糖苷酶的最适p h 值都在酸性范围，一般在 3 o 6 o 并且变化不大。王沁【5 8 】研究黑曲霉b 葡萄糖苷酶发现其最p h 值在5 o 5 5 ； 宛晓春【”】研究该酶其最适p h 值在4 o 4 5 。但该酶最适p h 值也可以超过7 o ，而且酸 碱耐受性强【5 7 5 8 】；t u r 锄y 等【删对甲基营养型毕赤酵母胞内b 葡萄糖苷酶表达进行 了研究发现该酶的最适p h 值为7 3 ，稳定p h 值范围为5 5 9 5 ；“y a w 1 【u e i l 和j c l l i l c h 锄s o c 等中国学者【6 1 】从， f 口阳6 口c f 仃f “聊珑e 捍以g 印f 洒行删中分离出的b 一葡萄糖 苷酶其p i 在9 0 ，最适p h 值为5 0 。 ( 3 ) 最适温度和热稳定性：b 一葡萄糖苷酶的最适温度在4 0 1 l o 之间都有分 布，特别是来源于古细菌的b 葡萄糖苷酶最适温度和热稳定性都要高于普通微生 物来源的该酶【6 2 1 。例如李志强等分离纯化了碧桃叶中的伊葡萄糖苷酶，该酶最适 反应温度为6 0 ，温度低于6 0 时该酶较为稳定，温度高于6 5 时酶易失活：张 艳梅等【6 3 】从大豆中提取到的伊葡萄糖苷酶在低于4 0 较稳定，7 0 酶活全部丧 失；宛晓春等【删发现该酶的最适温度为6 5 ，6 0 保温1 0h 残余酶活力为7 0 ， 比其它一些真菌和细菌酶表现出更强的热稳定性；而楚春雪等哗1 分离纯化了一株 嗜热毛壳菌产生的伊葡萄糖苷酶，该酶反应的最适温度和p h 值分别为6 0 和 4 5 5 o ，有较好的酸稳定性和热稳定性。因为酶的热稳定性越高越有利于工业生产， 嗜热细菌产生的耐热的伊葡萄糖苷酶的机制引起了越来越多人们的兴趣， ( 4 ) 影响酶活的作用因子：虽然葡萄糖是伊葡萄糖苷酶的典型抑制剂，但也 发现许多微生物酶对该抑制并不敏感，表现出较高的米氏常数( k m ) 。例如a 矿、 c u 2 + 、h 孑+ 对酶有较强的抑制作用，l i + 、s n 2 + 、f e ”、e d t a 、s d s 和脲对该酶也 有一定的抑制作用，a l ”、b a 2 + 、p b 2 + 、z n 2 + 等则对酶活无明显影响【弘5 7 巧& 6 5 1 ，m 孑+ 、 k + 则是对某些伊葡萄糖苷酶是激活剂，对另一些又是抑制剂。 ( 5 ) 动力学研究：米氏常数k m 值是酶的特征常数之一。通常采用 l i n e w e a v c r - b u c k 作图法( 双倒数作图法) 求得k m 值。不同来源的伊葡萄糖苷酶的 k m 值并不同。如果酶有几种底物，则对每一底物各有一个特定的k m 值，k m 值越 小表示其酶活力越高。 1 4 6b 葡萄糖苷酶基因的克隆筛选 人们对b 葡萄糖苷酶基因方面的研究己有较长历史，到目前己有上百个微生 物b 葡萄糖苷酶基因己得到克隆。现已从燕麦、蜀黍、早金莲、长春花、黑檀等 9 两南人学硕f j 学位论文 植物中进行了克隆和表达。随着基因组学的发展，越来越多的微生物基因组全序 列被测定，通过序列筛查定位分析出可能的6 一葡萄糖苷酶基因，是获得b 一葡萄 糖苷酶新基因的有效手段脚j 。 目前利用b 葡萄糖苷酶可与许多底物作用并显色，在平板上筛选重组转化子 大致有三种方法：( 1 ) 用m u g ( 4 - m e t h y l 啪b e l l i 蠡奠y l b d g l u c o p y r 锄o s i d e ) 筛选， 酶液可水解m u g 释放出的产物可在紫外灯下显荧光进行筛选；( 2 ) 在x 西u ( 5 b r o m o 年c h l o r 0 3 一i n d og l u c o p 脚l o s i d e ) 平板上筛选，当b 葡萄糖苷酶与x g l u 作用时，释放出的产物在平板上面显现蓝斑，即为阳性菌落；( 3 ) 用p n p g q - n i 仃o p h e n y - b - d - 9 1 u c o p y r a n o s i d e ) 筛选，当酶与底物作用时释放出来的产物显 现黄色【硎。 1 4 7b 葡萄糖苷酶的应用 伊葡萄糖苷酶主要应用有：降解纤维素、作为风味酶、生产低聚龙胆糖、水解 大豆异黄酮等方面。 ( 1 ) 在工业生产中适当利用纤维素酶，用生物降解来替代或补充化学降解， 则可以大大缓解高温高压和化学降解的方法成本高、耗能大，对环境的污染严重 等问题。b 葡萄糖苷酶是纤维素酶系中关键的一个组分，它可以将纤维二糖水解 为葡萄糖。目前对于纤维素酶菌的研究以木霉为主，但在木霉的纤维素酶系中b 葡萄糖苷酶的酶活力最小，这就影响了纤维素的降解效率。因而获得纯b 葡萄糖 苷酶用于提高纤维素降解效率的研究是有意义且需要的。 ( 2 ) 目前，肛葡萄糖苷酶主要应用在食品工业中。t r e s s l 等经研究发现，几乎 所有水果中的天然糖苷是伊糖苷，因此可以利用伊葡萄糖苷酶水解前体物伊糖苷， 释放出挥发性糖苷配基对葡萄酒等果酒、果汁起至| j 增香的作用【6 7 1 。d a v i dt a t e 通过 在酿酒过程中添加商品化的伊葡萄糖苷酶时提高了葡萄酒的风味。另外，还可以利 用伊葡萄糖苷酶将苦杏仁苷分解，使得苦味大大减少。 ( 3 ) 在工业上，伊葡萄糖苷酶的应用主要是生产低聚龙胆糖。低聚龙胆糖由 于比麦芽糖具有更高的吸水性和较低的粘度，可以防止食品中的淀粉老化和水分 流失。另外，通过伊葡萄糖苷酶水解大豆异黄酮制备的高活性的大豆异黄酮苷元产 品，是工业上制备富含大豆异黄酮苷元产品十分有效的途径之一。 ( 4 ) 在其他方面：伊葡萄糖苷酶在医学上可用于肿瘤疾病的诊断和治疗。当 人体缺乏p 葡萄糖苷酶会导致葡萄糖奋n 脂酞鞘氨醇的积累会引起戈谢病；在乳 品工业上用于分解乳糖；另外，肛葡萄糖苷酶可以作用于茜草科植物栀子原料，产 生天然栀子蓝色素等。 l o 第一：幸绪论 第二章绪论 昴一早殖v 匕 2 1 研究目的与意义 新世纪我们面临巨大的能源危机，国际普遍认为2 l 世纪能源危机的解决方法 之一就是生产生物乙醇。纤维素是地球上含量最丰富的可再生的天然资源和生物 量，更是生产生物乙醇的最有效物质，因此有效利用纤维素生产多糖获得生物乙 醇已经是目前国际研究的热点。目前工业方法降解纤维素成本高、耗能大，对环 境的污染严重等原因制约了纤维素的利用，人们寄希望于工业生产中适当利用纤 维素酶，用生物降解来替代或补充化学降解以缓解上述问题，而获得高活性高纯 度纤维素酶对于提高纤维素降解是有意义且需要的。在纤维素酶系水解纤维素的 复杂的过程中，伊葡萄糖苷酶催化水解纤维二糖和纤维寡糖生成葡萄糖，是纤维素 降解的限速酶，这就意味着获得高活性的新型b 一葡萄糖苷酶对于开发利用高效纤 维素酶和生产应用中都具有重大意义。 据报道，在兔盲肠中存在着大量纤维素酶产生菌，但是由于培养方法限制了 对它们的研究，因此为了获得更为新颖的纤维素酶基因，我们必须绕过传统培养 方法的障碍，聚焦于兔盲肠未培养微生物上。 随着分子生物