（海洋生物学专业论文）罗氏沼虾四种神经多肽的体外表达和纯化研究.pdf

中文摘要 卵黄蛋白原，是一种特异性存在于无脊椎及低等脊椎卵生动物雌性个体中的蛋 白质，是卵黄蛋白的前体。卵黄蛋白是无脊椎及低等脊椎卵生动物成熟的卵母细胞 的主要成分，也是其胚胎发育过程中的重要营养来源。基于本研究小组之前获得的 三疣梭子蟹卵黄蛋白原c d n a 序列，通过n o r t h e r nb l o t t i n g 对三疣梭子蟹中卵黄蛋白 原的表达特征进行了分析。研究表明卵黄蛋白原基因主要在三疣梭子蟹的肝胰腺中 表达，而且随着它的不同发育时期，肝胰腺内的表达特征有显著的变化。另外通过 r t p c r 检测，发现在卵巢中也有卵黄蛋白原的表达。 在甲壳动物中，卵黄蛋白原形成的调控机制一直是研究的热点之一。甲壳动物 高血糖激素( c h h ) 家族神经激素是甲壳动物特有的多肽类激素。它们主要在眼柄x 器官一窦腺复合体合成，包括：甲壳动物高血糖激素( c h i i ) 、蜕皮抑制激素( m i h ) 和性腺抑制激素( g i l l ) 等。研究表明，这些激素直接或间接地影响着甲壳动物的性 腺成熟，综合调控着甲壳动物的成熟、生殖过程。本研究中，根据本实验室获得的 c h h 家族c d n a 序列( c i 叭c h i il 属于高血糖激素c h h 亚类，m a r s g p a 、m a rs g pb 属于m i h v i h 亚类) ，我们构建p e t 一3 2 a ( 十) 一c h h 、p e t 一3 2 a ( + ) 一c h h l 、 p e t 一3 2 a ( + ) 州a r s g p a 、p e t 一2 8 a ( + ) 一m a r s g p b 原核表达质粒，转入c 0 7 i b l 2 1 ( d e 3 ) ，进而完成了罗氏沼虾四个神经多肽c h h 、c h h l 、m a r s g p a 、m a r s g p b 的诱导表达，并且利用n i n t a a g a r o s e 完成了四个目的蛋白的分离纯化。尽管如此， 三疣梭子蟹中卵黄形成的激素调控机制，尚有待于进一步地体外培养体系的建立和 研究。 关键词：甲壳动物；卵黄蛋白原；肝胰脏；神经多肽家族；原核表达 a b s t r a c t v t e l l o g e n i ni st h ep r e c u r s o ro fv i t e l l i nw h i c hs p e c i a l l ye x i s t s i nf e m a l e si n i n v e r t e b r a t ea n dl o w e rv e r t e b r a t e v t e l l i n n ) i st h em a j o ry o l kp r o t e i ns t o r e di n c r u s t a c e a no o c y t e s ，w h e r ei t p r o v i d e sf r e ea m i n oa c i d s ，l i p i d s ，c a r b o h y d r a t e s ， c a r o t e n o i d s ，a n dm i n e r a l st ot h eg r o w i n ga n dd e v e l o p m e n to fe m b r y oa n dl a r v a b a s e do nt h ef u l l - l e n i g t hc d n ao fp o r t u n ust r i t u b e r c u l a t u sv i t e l l o g e n i no b t a i n e d ， t h ee x p r e s s i o np a t t e r no fv i t e l l o g e n i ni nt h ec r a bw a sc h a r a c t e r i z e db yn o r t h e r n b l o t t i n ga n a l y s i s i tw a ss u g g e s t e dt h a tv i t e l l o g e n i nw a sm a i n l ye x p r e s s e di nt h e h e p a t o p a n c r e a sa n de x h i b i t e das t a g e r e l a t e de x p r e s s i o nm a n n e r m e a n w h i l e ，t h e v i t e l l o g e n i nt r a n s c r i p t w a sa l s oi d e n t i f i e di nt h e o v a r y o ft h ep o r t u n u s t r i t u b e r c u l a t u sb yr e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na n a l y s i s t h e r ea r ea l w a y sg r e a tc o n c e r n so ht h er e g u l a t i o nm e c h a n i s m so fv i t e l l o g e n i n p r o d u c t i o ni nc r u s t a c e a n s c r u s t a c e a nh y p e r g l y c e m i ch o r m o n e s ( c h h ) i saf a m i l y o fh o r m o n e sw h i c hw a ss p e c i f i c a l l ys y n t h e s i z e di ns i n u sc o m p l e xo fx o r g a ni n c r u s t a c e a n s t h ec h h f a m i l yi n c l u d e sc r u s t a c e a nh y p e r g l y c e m i ch o r m o n e s ( c h i d ， m o l t i n g - i n h i b i t i n gh o r m o n e s ( m i h ) a n dg o n a d i n h i b i t i n gh o r m o n e s ( g i i d ，a n ds o o n i tw a ss u g g e s t e dt h a tc h hh o r m o n e sh a v ed i r e c t i n d i r e c te f f e c t so nt h eg o n a d m a t u r a t i o na n dt h e ya l s o r e g u l a t et h em a t u r ea n dr e p r o d u c t i v ep r o c e s s e si n c r u s t a c e a n s i nt h e p r e s e n tr e s e a r c h ，b a s e d o nt h ec h hf a m i l yc d n a s e q u e n c e ( c h h ，c h h - lb e l o n g st oc h hs u b t y p e ；m a r - s g p - a , m a r - s g p - bb e l o n g s t om i h v i hs u b t y p e ) o b t a i n e d ，f o u re x p r e s s i o np l a s m i d s ，a sp e t - 3 2 a ( + ) - c h h ， p e t - 3 2 a ( + ) 一c h h l ，p e t - 3 2 a ( + ) m a r - s g p - aa n dp e t - 2 8 a ( + ) - m a r - s g p b ，w e r e c o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t oe c o i lb l 2 1 ( d e 3 ) a f t e ri n d u c e db yi ”gf o u r p e p r i d e sw e r ee x p r e s s e d t h e n ，i s o l a t e da n dp u r i f i e db yu s i n gn i - n t aa g a r o s e k e yw o r d s ：c r u s t a c e a n ，v i t e l l o g e n i n ，h e p a t o p a n c r e a ，n e u r o p o l y p e p t i d ef a m i l y p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n 2 刖舌 在大多数卵生动物中，雌性个体进入成熟期后，卵母细胞中卵黄大量积累，卵 巢占整个个体的比重迅速增长。一般把这个生理过程称为卵黄发生。卵黄蛋白作为 卵母细胞中卵黄的主要成分，为胚胎和幼体的发育提供游离的氨基酸、脂、糖、类 胡萝h 素以及金属离予等，是胚胎和幼体发育过程中重要的营养来源。卵黄蛋白原 是卵黄蛋白的前体，它可以在卵巢内或卵巢外合成。在卵巢外合成的卵黄蛋白原通 过血液的输送，到达卵巢组织，再通过受体介导的胞饮方式进入到卵母细胞中。卵 黄蛋白原的合成和积累对于卵母细胞的发育以及雌性个体产卵的数量和质量都有着 重要的意义。 在过去的几十年中，卵黄蛋白原已经在许多物种中得到了研究。在低等脊椎动 物中，卵黄蛋白原在肝脏中合成后被释放入血液中。通过血液输送到卵巢组织，通 过受体介导的胞饮方式进入卵母细胞后，卵黄蛋白原被蛋白酶切割为几个小的蛋白 亚基贮存在卵母细胞中，作为胚胎和幼体发育的营养源。在昆虫中，卵黄蛋白原一 般是在脂肪体中首先合成，然后在脂肪体中经过磷酸化、糖基化等修饰过程，最后 被脂肪体内的蛋白酶切割为几个蛋白亚基后，再释放入血液中。在甲壳动物中，和 其他物种相似，卵黄蛋白原也是一种雌性特异性的只在生殖期产生的复杂的藉脂蛋 白。迄今为止，人们已获得了9 o p 甲壳动物卵黄蛋白原的c d n a 序列，其中七种为虾 类，两种为蟹类。现有的研究成果勾勒出了部分甲壳动物卵黄形成的机制和途径： 即在肝胰腺中表达合成卵黄蛋白原( 卵黄蛋白的前体) 并进行初步的分子剪切和修 饰，然后释放到血液中进行进一步的分子剪切和修饰，最终进入卵巢，形成卵巢的 主要物质一卵黄蛋白，为胚胎发育和早期的幼体生长提供营养物质。通过分子特征 的研究，人们认为甲壳动物卵黄蛋白原构成了一个独特的有别于昆虫或低等脊椎动 物的卵黄蛋白原家族。然而，甲壳动物中卵黄形成的调控机制却一直没有得到清晰 地解析。过去人们一直认为参与雌性甲壳动物卵黄生成、卵巢发育调控的只有两个 相互结抗的神经激素：性腺抑制激素( g i h ) 和性腺促进激素( g s t t ) 。随着研究的深入， 现在普遍认为甲壳动物的生殖调控是在多激素综合调控的基础上进行的，多种激素 直接或间接地影响性腺发育、性别分化、卵黄生成。甲壳动物高血糖激素( c h h ) 家 族神经激素是甲壳动物特有的多肽类激素。研究表明，c h h 家族神经激素在甲壳动物 的性腺成熟及生殖过程中起主导调控作用。 甲壳动物是水产养殖中的一个大家族，具有着重要经济价值，特别是虾、蟹都 属于我国重要的出1 3 水产品。对它们卵黄蛋白原合成及调控的研究将对养殖中人工 调控甲壳动物的成熟、提高甲壳动物产卵数量、质量进而促进水产养殖业有着重要 的指导意义。本研究通过n o r t h e r nb l o t l i n g , ( 4 1 r t - p c r 检测，发现三疣梭子蟹卵黄蛋白 原基因在卵巢和肝胰腺中均有表达，卵黄发生后期在肝胰腺中表达为主。在确定合 成部位的基础上，我们构建了四种c h h 家族神经多肽激素的原核表达质粒，体外表达、 分离纯化得到了四种神经多肽，为解析甲壳动物q 6 c h h 家族神经激素对卵黄形成的调 控机制奠定了基础。 4 第一章甲壳动物卵黄蛋白原基因表达及调控的研究进展 一、 卵黄蛋白原的研究及其进展 卵黄蛋白原( v i t e l l o g e n i n ，v g ) 是特异地存在于非哺乳类性成熟的卵牛雌性动 物血液中的一种蛋白，是所有卵生动物卵黄蛋白的前体。v g 最初是p a n 等人【1 1 9 6 9 年对雌性昆虫血液淋巴蛋白的特称，后来这一名称被广泛用于特指雌性动物血浆中 卵黄蛋白原。v g 为正在发育的胚胎提供氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素、磷和 硫等营养和功能性物质。随着研究的深入，人们发现，卵黄蛋白原不仅为胚胎发生 时提供营养物质，它在生物体内还具有其他的生物学功能。 1 卵黄蛋白原的合成方式 卵子发生过程中卵黄的形成对于胚胎发育过程中所需营养物质的提供具有至关 重要的作用。卵黄，主要成分是卵黄蛋白，形成的原料有两种来源：一是可以由卵 母细胞本身合成，称为内源性卵黄合成或自动合成，二是自卵母细胞以外的地方合 成，然后进入卵母细胞，称为外源性卵黄合成。从目前掌握的资料来看，不同门类 的动物或同一门类不同种的动物中卵黄蛋白原的合成方式各不相同，既有内源性合 成的也有外源性合成的，还有同一种在不同发育时期采取不同合成方式的。 内源性卵黄蛋白原合成的证据主要来自于对正在发育的卵母细胞内细胞器的观 察。可以从形态上观察到卵黄蛋白原的合成，与卵黄形成有关的细胞器主要有内质 网、高尔基体和线粒体等，但实际上是在哪一种细胞器中形成的，证据也不一致， 在不同动物中，形成方法也有差异。多毛纲的巢沙蚕( d j o p a t r a c u p r e a ) ，卵黄体是 由卵母细胞内高尔基体合成的，在其它不同种类的沙蚕中( n e r e i sd i b e r s i c o l o r , p e r i n e r e i sc u l t r i f e r r a , n e r i sv y r e n s ) ，卵黄蛋白原也是内源性合成的。腔肠动 物没有血液循环系统，在水母体时期，可在其高尔基体液泡中找到卵黄颗粒，很可 能卵黄颗粒是由粗面内质网上的核糖体和高尔基体联合合成的。腹足类软体动物， 在线粒体里面或线粒体群之问也发现结晶状的蛋白质卵黄小板，腹足纲蜗牛 ( p a n o b a r i u sc o i - i ? e z i s ) 的卵黄蛋白原、贻贝的卵黄蛋白原、太平洋牡蛎 ( c r a s s o s t r e ag i g a s ) 的卵黄蛋白原都是由卵母细胞产生的。甲壳类中河虾的卵黄蛋 白原是由卵母细胞内的粗面内质网合成的，在河虾的卵母细胞内质网的潴泡里可观 察到卵黄的存在，凡纳对虾( p e r n a e u s ，7 月e 力的卵黄蛋白原也是内源性合成的。 外源性卵黄合成，存在于鱼类、两栖类、爬行类及鸟类等脊椎动物以及线虫、 海胆、某些沙蚕、部分软体动物、大多数昆虫、甲壳类等无脊椎动物中。不同门类 动物中，v g 的产生、分泌及其裂解成卵黄蛋白的途径是不同的。在脊椎动物中，如 鱼类、两栖类和鸟类中，v g 由肝脏合成。外源性合成的卵黄蛋白原分泌到血液中， 经血液运送到卵巢后，被卵母细胞通过受体介导的内吞作用吸收到细胞内。在节肢 动物中，大多数昆虫的v g 是在脂肪体内形成，有一些甲壳类动物的卵黄蛋白原也是 由脂肪体合成，大多数甲壳类的卵黄蛋白原是由肝胰脏或滤泡细胞合成，到目前为 止，甲壳类中有关卵母细胞本身合成的卵黄蛋白原的报道不多 2 1 。 对于甲壳动物动物而言，卵黄发生过程对其生殖周期是决定性的。在卵黄发生 期，动物体内血淋巴中卵黄蛋白原物质浓度大量增加，卵母细胞发育快速。根据卵 母细胞发育的不同形态，卵黄发生期又可分为卵黄发生初期和卵黄发生后期。 在卵黄发育的初期阶段，一些物种中存在内源性卵黄合成，卵黄形成的原料主 要来源于卵母细胞自身，在此时期，可观察到正在发育的卵母细胞中的卵黄蛋白原 的合成。与卵黄形成相关的细胞器主要有内质网、高尔基伴和线粒体等，但实际上 是由哪一种细胞器形成的，还没有定论。在不同的动物中，形成方法也各异。成永 旭p j 等观察到，在锯缘青蟹的卵黄发生初期，卵巢内可见大量活跃增值的卵原细胞 形成的多核共质体，卵质很少。在卵质中由少量粗面内质网组成的囊泡中，可见卵 黄体物质已经生成。b e a m s 幂1 3 k e s s e l 4 】在小龙虾中也观察到内质网的潴泡里卵黄的存 在。在小龙虾的卵母细胞中，大量的粗面内质网与光滑型内质网相连通。致密的卵 黄前体颗粒先在粗面内质网中形成，然后运送到光滑型内质网中装配为最后的卵黄 颗粒，在这里光滑型内质网似乎替代了高尔基体的菜些功能。 在卵黄发生后期，外源性的卵黄蛋白通过血淋巴运送到卵巢组织中，通过受体 介导的胞饮方式进入卵母细胞，在卵母细胞中形成大量的卵黄颗粒，使得卵母细胞 体积迅速增大，卵黄物质的积累也大大增加。虽然甲壳类动物和其他无脊椎、脊椎 6 动物卵黄蛋白原产生的部位不同，但它们都是利用相似的机制将卵黄蛋白原输送到 卵巢，然后通过胞饮的方式浸入到卵母细胞中，在卵黄发生的后期，在甲壳动物的 血淋巴中可以检测到高浓度的卵黄蛋白原( 表1 一1 ) 。 一。：。孟：。：；：。；。；：。，= 女船9 豫话毒0 4 酶群捌p 瓣 偿o w 船d 姆# m 枷 榔 袭批# 划蚺l i 衄h i 曲目p 帆 表1 1 不同时期的甲壳类动物血淋巴中卵黄蛋白原的浓度( t s u k i n a r ab r i a n 2 0 0 1 ) 2 、卯黄蛋白原及卵黄蛋白的主要特性 卵黄蛋白原是一种高分子量的含糖、含磷、含脂的蛋白。目前，在不同门类动 物中如昆虫【引、甲壳类嘲、棘皮动物、脊索动物、鱼类【、两栖类 8 1 9 1 、爬行类 1 0 1 和 鸟类等中，卵黄蛋白原都已得到了纯化，并进行了特性研究。在脊椎动物中鱼类、 两栖类和鸟类中对卵黄蛋白原的研究比较广泛；无脊椎动物中，线虫和节肢动物的 卵黄蛋白原的研究比较广泛。不同的动物之间，卵黄蛋白原的分子量存在较大的差 异。脊椎动物特别是鱼类的卵黄蛋白原通常是以两个1 5 02 2 0 k d a 的同源二聚体组成， 而无脊椎动物的卵黄蛋白原多是由分子量不同的多个亚基组成。在己研究的十足类 甲壳动物中，卵黄蛋白原的分子量从2 8 3 k d 到6 0 0 k d 不等( 表卜2 ) ，显示了巨大的差异。 表卜2 已知的各类甲壳动物卵黄蛋白原的分子量( t s u k i n a r ab r i a n 2 0 0 1 ) 卵黄蛋白原，尤其是来源于卵巢外组织的卵黄蛋白原，在合成后往往立即被剪 切为几个蛋白亚基( 表卜3 ) ，通过血液输送达到卵巢组织，被卵母细胞摄取，即成 为卵黄蛋白。卵黄蛋白，又称卵黄磷蛋白，主要存在于卵巢和胚胎中，做为营养源的 最直接形式。 ，t ：= i ：二黑3 ，、t 枷o k d i ：黧麓慧 ：i = 嚣僦： ：竺= ：篇篡 u i “，、- 、，h g i b * t 麓= 忠i 霖： i 1 o d p w 目 = 表卜3 一些甲壳类动物卵黄蛋白亚基的数日( t s u k i n a r ab r i a n 2 0 0 1 ) 在甲壳类动物中，卵黄蛋白的生化特性已经得到了广泛的研究。在斑节对虾 8 ，m：；，、。：。，：； 蠹 一 ( p e n a e u sm o n o d o n ) ，罗氏沼虾( m a c r o b r a c h i u mr o s e n b o r g i ) ，中国对虾( p e n a e u s c h i n e n s i s ) 中，对于纯化的卵黄蛋白的研究表明，卵黄蛋白是一种雌性特异的高密 度脂蛋白( h d l ) ，含有糖和类胡萝卜素成分。随后的研究表明，类胡萝卜素的存在 可以影响卵黄蛋白的颜色。o b e r d o r s t e r 等的实验验证了卵黄蛋白是一种脂蛋白。他 们将短刀小长臂虾( p a l a e m o n e t e sp 昭j d ) 的雌性个体置于含有一种亲脂性的有机 物一多环芳烃芘的环境中培养，发现这些雌性个体所产下的胚胎的死亡率有所上升， 说明卵黄蛋白能结合亲脂性的污染物，并将它们传递给胚胎，这也从另一个侧面证 实了卵黄蛋白的营养源作用。 卵黄蛋白所携带的脂类主要是磷脂。成永旭等指出在卵黄发生的初期，这些磷 脂可能主要源于自身肝胰腺吸收的外源脂肪物质，而在卵黄发生的后期，这些磷脂 成分则主要由外源性磷脂而来。在对另外一种甲壳类动物卤虫的研究中，c h a f f o y “1 等发现卤虫中卵黄蛋白的脂类物质主要是卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸等磷脂和 甘油三酯、胆固醇等中性脂。卵黄蛋白携带的糖类物质主要是中性粘多糖。有研究 表明在甲壳动物的卵母细胞中存在糖原及其他多糖类物质 1 引。王兰 ”i “1 等观察到在 长江华溪蟹中，卵母细胞中糖类的出现是在滤泡细胞形成以后，糖类在细胞内由细 胞的边缘向细胞质中央推进，直至充满整个细胞质，这些现象说明滤泡细胞具有向 卵母细胞提供糖或糖类合成物质的功能。在卤虫中，c h a f f o y 等观察到其卵黄蛋白的 结合糖主要是甘露糖，其余还包括半乳糖、葡萄糖胺等。在小龙虾( 劬咖z q u a d r i c a r i n a t u s ) 中，k h a l a i l a ”1 等确定了在小龙虾卵黄蛋白原分子中的糖基化 位点，同时发现在小龙虾卵黄蛋白原分子所结合的糖类物质丰要是含有大量甘露糖 的多聚糖类。 3 、卵黄蛋白原的生物学功能 虽然不同门类、不同种属的卵黄蛋白原产生的方式不同，同源性较差，但总的 来说，即从无脊椎动物到脊椎动物，包括蠕虫、海胆、鱼类、蛙类和鸟类等所有的 非哺乳类卵生动物，卵黄蛋白原在结构和功能上仍是非常相似的【1 “，他们在不同的 生物体内行使相似的生物学功能，即其营养功能。随着研究的深入，人们发现它在 生物体内还具有其他的生物学功能。1 9 9 6 年k o m a t s u ”蝽人报道螯虾( s a n d c r a y f i s h ) 的v g 具有潜在的钙离子依赖性的蛋白酶活性，且这一蛋白酶活性只有在v g 被卵内具 有蛋白酶活性的低密度脂蛋白降解后才显现出来。v g 不仅能结合并转运金属离子， 它还作为甲状腺素、维生素a 醛、类胡萝h 素以及核黄素等结合蛋白将其运送至卵母 细胞，细胞以这种方式摄入的维生素或胆固醇是信息物质，而载体蛋白没有信息作 用，仅仅是运载工具，但与一般载体蛋白明显不同的是，他们对所载物质具有严格 的选择性，同时又被细胞膜上受体特异性的识别摄入，因此v g 不仅是胚胎发育的能 源物质并且还具有作为非极性分子或酶的载体功能。 二、甲壳类c h h 家族多肽激素研究及其进展 甲壳动物的神经激素可以分为两大类 1 8 ：促色素细胞激素和c h h 家族激素，前 者主要包括红色素聚集激素( r p c h ) 和色素分散激素( p d h ) ；c h h 家族激素主要包括血 糖升高激素( c h h ) 、蜕皮抑制激素( m i h ) 、卵黄生成抑制激素( v i h g i h ) 。根据一级结 构的特征又可分为c h h 亚类和m t h v i h g i h 驻类。c h h 家族的激素对甲壳动物的很多 生理生化过程都起重要调控作用。早期的研究中人们从一些传统的生理学实验中认 识了神经激素的生理功能，这些实验方法包括切除或移植神经内分泌组织提取物或 异源生物活性物质。近年来随着高效的化学分析方法包括反相高效液相色谱、质谱 分析、气相微量担保测序等，以及分子生物学方法的普遍采用，对它们的研究也随 之更加深入。 1 、c h h 家族激素分子特征 高血糖激素( c h h ) ，主要参与甲壳动物血糖水平的调控。目前已对普通滨蟹 1 9 ( c a r c u n u sm a s n a s ) 、美洲龙虾 删、寻常平甲虫【“ ( a r m a d i l l i d i u ms u l g a r e ) 、泥 污鲸鳌虾 鸵 ( o r e o n e c t e sl i m o s u s ) 、原鳌虾 ( p r o c a m b a r u sb o u v i e r i ) 、克氏原鳌 虾 驯( p r o c a m b a r u sc l a r k i i ) 等甲壳动物的c h h 进行了氨基酸序列测定，来自虾、蟹 的四十种c h h 基因被克隆报道。在这些c h h 的一级结构中三对半胱氨酸，两个精氨酸， 1 0 一个天冬氨酸，一个苯丙氨酸具有极高的保守性。三对半胱氨酸形成的二硫键形成 了多肽的基本骨架。在十足目的小龙虾、龙虾、蟹中这类多肽通常由7 2 或7 3 个氨基 酸组成，碳端酰胺化，氮端调节区的谷氨酸脱水焦化，分子量为8 4 k d ，相互问拥有 6 1 一8 1 的相似性瞄j 。c h h 的主要特征有：( 1 ) 氨基酸残基数目相同( 7 2 或7 3 ) ；( 2 ) 肽 链上c y s 残基位置的保守性；( 3 ) 肽链核心部位存在保守氨基酸序列。此外，在多数 种类中都存在c h h 多型性现象，比如在美洲龙虾的窦腺中的c h h 有两种形式：c h h a 和c t t t t b ，他们的序列中有6 个残基氨基酸存在差异，每种形式的c h i t 具有两种异构体， 1 9 9 4 年s o y e z f 2 6 1 等报道这些异构体仅仅是由于一个氨基酸构象的不同而引起的：它 们的第三个氨基酸是l p h e 或d p h e ，因此它的c h h 有4 种。 蜕皮抑制激素( m t h ) 主要参与蜕皮调控，卵黄生成抑制激素( v i h g t h ) 主要参与 生殖调控，它们与高血糖激素( c h h ) 结构相似，所以同属于一个大家族。进一步研究 阐明了他们前体的特征。都含有信号肽序列，但只有c h h 含有前体相关肽，位于成熟 信号肽和荷尔蒙之问，而m i h v i h g i h 没有，m m v i h g i h 通常由7 7 或7 8 个氨基酸 组成。所以人们把它们分为两个亚类c i i h 亚类和m i h v i h g i i i 亚类。2 1 个种的c h h 家族 多肽比较都支持这个结果和分类，近来的研究表明，所有的m t h 在第1 2 位上都有一个 非常保守的甘氨酸，但是在c h h 中是没有的，k a t a y a m a 2 7 等通过基因突变的方法在 c h h 的1 2 位上引入甘氨酸，结果调节血糖作用于对照相比弱很多，说明这一个氨基酸 在结构和功能上都起着重要的作 j 。 另外，值得一提的是，c h h m i h g i h 在都可能存在可变剪切、翻译后调控等转 录水平和翻译水平的调控。对这方面进行研究能使我们更好的了解阐明c h h 家族的基 因特征、进化关系。 2 、c h h 家族激素表达特征 为了研究c h h 家族激素不同阶段的表达，研究者应用免疫细胞化学、原位杂交 n o r t h e r n 印迹分析的方法结合显微观察在细胞水平研究c h i t 家族神经多肽。在八十年 代对蟹、鳌虾、龙虾、对虾等进行免疫化学研究表明，c h h 、m i l l 和g i l t 等都在x 一器官 窦腺复合体的同一区域合成，用同样的方法研究龙虾的幼体和胚胎表明在无节由提 l l 后期就已出现c h i 和g i h 2 8 1 2 ”，i f f j m i h 从蟹的第一期蚤状幼体开始出王见 3 。应用非放 射性c d n a 探针技术已经对有些种类的神经肽的表达进行了研究，他们包括泥污鲸鳌 虾的c h h ，美洲龙虾的g i h 和c h h 及普通滨蟹的m i h 。这些研究结果与免疫细胞化学定 位的结果是一致的。另外，原位杂交的方法与免疫细胞化学染色的方法结合能够同 时在m r n a 水平和蛋白质水平检测x 一器官窦腺复合体的分泌活动。例如，有人对成体 美洲龙虾的雌雄个体及其幼体的合成c h h 和g i h 的神经内分泌细胞作了这样的研究， 其结果表明从幼体发育到成体台成c h h 的细胞数目加倍，而合成g i h 的细胞数目保持 稳定，这说明c h h 家族的神经肽在雌雄甲壳动物的整个生活史中对生殖和蜕皮的调控 起重要作用。 在组织分布上的研究表明，甲壳动物神经分泌腺分布于眼柄、皮下组织、胸腹 神经节。x 一器官窦腺复合体、后部连接的、围心的器官由脑和胸部神经节支配，其 它一些调节器官：大颚腺( m 0 ) ，y - 器官和雄性荷尔蒙腺体都属于典型的上皮激素调 节器官。不同的分泌腺是由不同的分泌细胞构成的。如窦腺，是甲壳动物神经内分 泌的主要调控中心。在大多数有眼柄的种类中，该器官位于眼柄，而在无眼柄的等 足类中，窦腺位于头部近脑侧。h a n s t r o m 在1 9 3 3 首先发现并描述了甲壳动物眼柄的 两种内分泌组织，将其中种命名为x 器官，另一种因其位于血窦旁，命名为窦腺。 因为这两种结构间有纤维束相连，又同位于眼柄，所以通称为x 一器官窦腺复合体。 窦腺还通过纤维束与脑相连。在十足目中，x 一器官一般有1 5 0 2 0 0 个细胞组成，他们 当中的9 0 都是异源的分泌细胞，也就是说分泌不同的神经肽。另外，还有些属于此 类的，少数的分泌细胞位于眼柄、脑、胸部神经节，他们之间通过窦腺神经相联接。 之前对大多数c h h 家族多肽研究表明，它们只在眼柄的端髓表达，沿着轴突传送，然 后被存贮在窦腺内，之后再被释放。但是随着研究的深入，在其他的位置也神经多 肽的分泌被发现。通过r i a ，在k e ll e t d l 垮发现滨蟹( c a r c i n u sm p 曲的围心器官 分泌c h t t 。d ek l e i j n 3 2 垮在美洲龙虾( t t o m a r u sa m e r i c a n u s ) 的窦腺和中枢神经中发 现同一种前激素原，说明两个地方表达同一种c h h 的m r n a 。近来，c h u n 一3 1 等通过免 疫细胞化学发现c h h 也在美洲龙虾( t t o m a r u sa m e r i c a n u s ) 的从根部数第二节胸部神 经节和中枢神经中表达。此外，学者们发现在一些种类中，这些神经多肽也在肠【蚓、 腹部神经元 3 5 和围心器官 3 6 】( p o ) 中表达。这些眼柄外的c h h 被认为与眼柄c h h 具有不 1 2 同的功能结构，行使不同的功能。这一点在对青蟹( c a r c i n u s l l l a e n s s ) 围心器官的研 究中，通过多肽化学、免疫细胞化学、克隆和序列分析被证实。作者发现一种新的 c h h 相似多肽和两种c h i t 前体类似物。在体外培养研究生理功能的实验中，这些p o - c h h 并没有表现出血糖升高促进作用，表明它们与眼柄分泌的c h h 不同，具有其他的生理 功能，眼柄夕f c h h 是否参与血糖调节被怀疑。c h u n g 等在最近的研究中发现肠中的c h t f 表达并不像眼柄中的c h h 一样，在蜕皮前期有个大量的释放过程，在肠中它将保持大 致不变。但一部分学者认为眼柄# f c h h 对其周围细胞的血糖代谢具有调节作用。 3 7 i 蚓 3 、c h h 家族激素生物的生理生化 甲壳类动物中，许多生理过程之间相互重叠相互影响，从而形成复杂的生理过 程。这些过程在成熟前和成熟之后都会发生。比如蜕皮，由蜕皮激素控制，而蜕皮 激素的分泌又受到蜕皮抑制激素的调节。也就是，x 器官分泌m i h 能够抑制y 器官分泌 蜕皮激素。在蜕皮前期，y 器官变大，分泌蜕皮激素。d e l l 【3 9 j 等在0 1 i m o s u s 中的研 究，表明蜕皮激素存在反馈调控，同时也有大鄂腺调控，分泌的m f 负向调控蜕皮激 素。蜕皮和繁殖是相对的生理过程，繁殖通常发生在蜕皮间期，现已知与甲壳动物 生殖有关的两种肽类激素，一种是由甲壳动物眼柄中的x 器官一窦腺复合体合成分泌 的性腺抑制激素( g i h ) ，一种是脑和胸神经节分泌的性腺刺激激素( g s h ) 。g t h 和g s h 共同作用于卵巢，调节其发育。再比如血糖升高激素( c h h ) ，它对发育和各个生活周 期都是重要的调节激素，像上述提到的这些c i i h 异构体不仅对糖的代谢起重要作用， 对其他的生理过程，如蜕皮、繁殖、渗透压调解等也起着重要作用。 关于对糖代谢的调节，c h h 在血淋巴中引起血糖升高，例如在小龙虾中，c h h 在 各个器官和组织中的糖脂能量平衡中起关键作用。在整个生命周期中，c h h 通过一些 反馈调节机制参与适应胁迫环境的应激调节 帅】。无论在体外还是在体内实验都表 明，c h h 的合成和分泌都是正反平衡控制的【4 1 i “。产生c h h 的神经元细胞受血淋巴中 血糖浓度调节，作为对d 型葡萄糖的响应，神经元对发生超极化，从而抑n c h h 的释 放，超极化是由于糖酵解的产物如d 型葡萄糖打开了钾离子通道，使得葡萄糖直接调 节c h h 进入血淋巴。当血糖过低时，c h h 分泌细胞去极化引导c h h 分泌，继而刺激了糖 原质分解成可利用的葡萄糖。在体内实验中表明，还存在另一个正向反馈环，即糖 被大量分解会促进c h h 分泌，进而刺激肝糖原分解。在具有生理活性的c h h 从神经分 泌细胞到目的器官的途中，它们与血蓝质亚基相结合，到达目的组织后，它们启动 糖酵解，分解储存的糖原物质，特别是在中肠、脂肪体中，它们会促进脂肪酸和磷 脂酸的水解 4 3 j ，在蟹( 船印a 葫和小龙虾( 口1 y m o s u s ) 中，c h h 与中肠细胞表面的离 子膜受体结合，膜上蛋白通过环化酶激活g m p 合成。在组织水平，c t l h 在肌肉和中肠 腺体中刺激肝糖原分解，抑制合成酶，激活磷酸化酶。 虽然，c h h 的主要作用在较早前就已经被分析清楚，但是近来的研究表明，c h h 在甲壳动物中是多功能的。比如在小龙虾、蟹分离的鳃中实验证明，c h h 调节离子和 水的平衡。m o r r i s “1 等这些作者报道了c h h 异构体的作用，特别是在三号位上是d 型 苯丙氨酸的c h h ，对渗透压起到调节作用，有趣的是，渗透压调节非常有可能与蜕皮 相关。在m a n e n a s 撇a m e f l c a n u s 中，在蜕皮前，都有c h h 大量积累的过程，c h u n g 4 s 等认为是通过水调节了蜕皮的完成。而且，d ek l e i j n 4 6 】等认为c h h 对小龙虾和龙 虾的卵巢发育有刺激作用，从而影响卵黄发生和成熟。最近的研究又表明上述提到的 m f 也是受到c 洲的调节，m f 类似于昆虫里的保幼激素【4 7 】。 甲壳动物c h h 家族对卵黄发生的多因子调控 如第二部分所述，甲壳动物高血糖激素( c h h ) 家族神经激素是甲壳动物特有的 多肽类激素。它们主要在眼柄x 器官一窦腺复合体合成，包括：甲壳动物高血糖激素 ( c t t t l ) 、蜕皮抑制激素( m i l l ) 和性腺抑制激素( g i h ) 等。研究表明，这些激素直 接或问接地影响着甲壳动物的性腺成熟，综合调控着甲壳动物的成熟、生殖过程。 长期以来，由于实验手段的局限性，内分泌的调控功能被理解得过于简单化，例如： 过去人们一直认为参与雌性甲壳动物卵黄生成、卵巢发育调控的只有两个相互结抗 的神经激素：性腺抑制激素( g i h ) 和性腺促进激素( g s h ) 。但是现在人们普遍认为甲 壳动物的生殖调控是在多激素的基础上进行的，它们直接或间接地影响性腺发育、 性别分化、卵黄生成。 由于美洲龙虾的c h h 家族神经多肤研究较多，在此以它为例说明c h h 家族神经肽 1 4 对卵黄生成以及蜕皮的调控。根据a i k e n ：和w a d d y 删的描述，美洲龙虾的生殖周期被 划分为以下四个时期：为成熟期、卵黄发生前期、卵黄发生期和成熟期。目前在美 洲龙虾已经确定结构和功能的c h h 家族多肽有三种：它们分别是c h h a 、c h h b 和g i h 。 为了更正确全面地认识每周龙虾生殖周期中c h h a 、c h h b 和g i h 的合成、储存、释放 及其潜在的生理功能。d ek l e i j n 4 9 】等测量了雌性个体生殖周期中不同阶段的各种 神经激素的m r n a 水平及窦腺内和血淋巴内神经激素水平( 图1 1 ) 。通过测定发现在 卵黄发生前期c h h a 的m r n a 水平较高，而c h h b 的m r n a 水平较高的时期是卵黄发生前 期和成熟期，在卵黄发生前期两种c h h 都以较高水平储存在窦腺内，在血淋巴中只有 在成熟期较高。而g i h 在x 一器官内的m r n a 水平一直较低，只有到未成熟期窦腺中才出 现少量g i h 异构体，在未成熟期和卵黄发生前期血淋巴中的g i h 水平较高。 t p 4 m 图卜1 雌性美国龙女t h o m a r u s a m e r i c a n u s 体内血液中各种激素在不同生长时期的变化【5 0 】 雌性美洲龙虾在两年的生殖周期中血淋巴内c 1 1 i a 、c h h - 8 和g i h 浓度水平变化显 著。到卵黄发生期时，c h h a 、c h h b 的血淋巴水平显著升高，而g i h 的血淋巴水平到 卵黄发生期后却显著下降，因此c h ha 、c h h 一1 3 能够诱发卵黄发生而g i f l 则起相反作用。 c h a n g 等发现在美洲龙虾存在一种既有蜕皮抑制活性又有高血糖活性的m i h ，最近已 经证明这种m i h 在生理功能上与c h h 很相近。众所周知，眼柄的切除即能出去g i h 又能 出去m i h ，但奇怪的是切除眼柄后的美洲龙虾只是卵黄发生加快而没有蜕皮现象，这 表明抑制蜕皮的因素不仅仅只有眼柄中的m i h ，在其他的神经系统中可能存在其他的 抑制因子，c h h 能够在胸神经节表达意味着它可能具有抑制蜕皮的功能。另外美洲龙 虾成体的g i h 和蟹的b l l h 的氨基酸序列具有较高的相似性，它们的前激素原具有相同 的结构组织形式，这意味着g i h 可能具有抑制蜕皮的功能，当雌性美洲龙虾的幼体孵 化后，它才开始蜕皮，这是c h h 和g i h 的血淋巴水平都较低，在未成熟期具有蜕皮抑 制功能的是g i h ，而在性腺成熟期完成这种功能的是c h h a 和c h h b ，因此在美洲龙虾 两年的生殖周期中。血淋巴内c h h 和g i h 的协调平衡才能够使生殖活动和蜕皮现象有 规律地交替进行。 以美洲龙虾的c t t t l 家族神经肽对生殖和蜕皮的作用模式为基础，结合其他甲壳动 物的研究结果，可以总结出此行甲壳动物的c h h 家族神经肽调控生殖和蜕皮功能模 式。 澍霞光照营荐 图卜2 雌性甲壳动物c l 玳家族神经激素调控生殖和蜕皮的功能模式图【5 1 1 如图卜2 所示，m t h 、g i h 、c h h - a 、c h hb 都能通过阻止y 一器官蜕皮酮的合成和释 放而抑制蜕皮。参与卵巢调控的神经肽包括g i h 、c h h a 、c h h b 。g i h 在未成熟期的 卵黄发生前期对卵巢发育具有直接抑制作用，而c h h a 和c h h b 则在卵黄发生期和成 熟期对卵巢有促进作用。m o i h 能够直接作用于大颚器官( m o ) 抑制其甲基法尼脂( m f ) 的合成，另# f c h h 也有类似m o i h 的功能。m f 是一种类萜化合物，属于类萜激素。m f 在一定浓度时引发卵巢发育和卵黄发生，而且切除眼柄还可以提高其在血淋巴中的 浓度，同时也证实了x 器官一窦腺复合体能合成分泌大颚器抑制激素( m o i h ) 。 参考文献： 【1 】1 p a nm l ，b e l lw j e ta 1 ，v i t e l l o g e n i cb l o o dp r o t e i ns y n t h e s i sb yi n s e c tf a tb o d b s c i e n c en y ，1 9 9 6 ，1 6 5 ：3 9 3 3 9 4 【2 】p a t e r a k ils t r a t a k i se s y n t h e s i sa n do r g a n i z a t i o no fv i t e l l o g e n i na n dv i t e l l i n m o l e c u l e sf r o mt h el a n d c r a bp o t a m o np o t a m i o s , c o m p b i o c h p s i 0 1 p a r tb ， 2 0 0 0 1 2 5 ：5 3 6 1 【3 】成永旭等，锯缘青蟹卵黄发生期卵巢和胰腺脂类的变化，海洋学报，2 0 0 1 ，2 3 ( 3 ) ：6 6 7 7 【4 】4 h wb e a m s ，r gk e s s e l ，e l e c t r o nm i c r o s c o p es t u d i e so nd e v e l o p i n gc r a y f i s h o o c y t e sw