（有机化学专业论文）色谱方法对几种药物的杂质及含量测定的应用研究.pdf

摘要 摘要 建立一种测定左乙拉西坦原料药含量的色谱方法。采用氰基键合 硅胶色谱柱( 2 5 0m m x 4 6m mi d 5l a m ) ，流动相为甲醇5 0m m 0 1 l j 磷酸盐缓冲液( p h5 6 ，5 0m m 0 1 l 。1 磷酸二氢钾溶液，用5 0m m 0 1 l 1 的磷酸氢二钾调节p h5 6 ) 一三乙胺( 5 0 ：9 5 0 ：2 ) ，检测波长为2 2 0 n m ，流速为1 0m l m i n ，进样量为2 0p l ，柱温为2 5 。在此色谱 条件下，左乙拉西坦的出峰时间为7 5 6 8m i n ，最小检出量可达 1 5 6 7 1 0 一n g ，定量限为5 2 2 4 1 0 n g ，线性范围为0 1 6 2 1g l 1 0 2 4 5 4g l ，相关系数为0 9 9 9 1 。此方法可对左乙拉西坦原料药进 行定量分析。 采用高效液相色谱法手性拆分左乙拉西坦原料药中的右旋异构 体。优化后的色谱条件为：c h i r a l p a ka d h 色谱柱( 2 5 0m m x 4 6 m m i d 1 0 l a m ) ，以正己烷异丙醇( 8 0 ：2 0 ) 为流动相，检测波长为2 2 0 n m ，进样量为2 0 l ，流速为1 0m l m i n 。在此色谱条件下，消 旋体的分离可在1 0m i n 内完成，分离度为5 9 0 ，右旋异构体的检测 限可达4 112 10 l a g l 。此方法可对左乙拉西坦原料药中的右旋异 构体进行定量分析。 建立了左乙拉西坦中残留有机溶剂的气相色谱分析方法。采用 d b w a x 毛细管色谱柱和f i d 检测器，用外标法进行定量计算，并 对优化后的色谱方法进行了验证。丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷的回收 率分别为9 7 4 5 、9 7 1 7 和9 4 4 7 ，线性范围分别为0 0 5 0 1 3g l 1 1 0 0 3g l - i ( f o 9 9 9 7 ) ，0 0 5 0 11g l - 11 0 0 2g l 1 ( r = o 9 9 9 7 ) 禾1 0 0 0 7 0 0 0g l 一o 1 4 0 0g l 。f r = o 9 8 8 8 ) 。此方法稳定、谱图简单、干 扰峰少、快速简便，可对左乙拉中的残留溶媒进行定量分析。 对头孢尼西钠中聚合物的含量测定方法进行了改进研究。采用高 效液相色谱仪和s e p h a d e x g 1 0 ( 1 0 0 3 0 0m m ) 色谱柱，以p h 7 0 的 0 0 2 5 0m 0 1 l o 的磷酸盐缓冲液为流动相a ，以超纯水为流动相b ， 检测波长为2 5 4a m ，进样量为2 0u l ，流速为o 7m l m i n ，应用 自身对照外标法进行计算。此方法缩短了分析时间，提高了工作效率， 具有实用价值。 关键词：左乙拉西坦，高效液相色谱法，顶空气相色谱法，定量分析， 聚合物 中南人学硕十学位论文 a b s t r a c t a bs t r a c t ah p l cm e t h o df o rq u a n t i t a t i v e a n a l y s i so fl e v e t i r a c e t a mw a s e s t a b l i s h e d t h ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n sf o rt h i sm e t h o dw e r et h e f o l l o w i n g s ：c y a n ob o n d e ds i l i c ac o l u m n ( 2 5 0m m x 4 6m mi d 5 肛m ) ， m e t h a n o l 一5 0m m o l lp h o s p h a t eb u f f e rf l u i d t r i e t h y l a m i n e ( 5 0 ：9 5 0 ：2 ) a s m o b il ep h a s e ，u vd e t e c t o rf i x e da t2 2 0n mw a v e l e n g t h ，t h ef l o wr a t ew a s 1 0m l m i n t h ei n j e c t i o nv o l u m ew a s2 0l a l ，t h ec o l u m nt e m p e r a t u r ew a s 2 5 u n d e rt h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sa d o p t e d ，t h ea p p e a r a n c e t i m eo fl e v e t i r a c e t a mw a s7 5 6 8m i n t h ed e t e c t i o nl i m i to f l e v e t i r a c e t a mw a s1 5 6 7 xl0 。n gw i t ht h el i m i t o fq u a n t i t a t i o no f 5 2 2 4 x1o 。n g t h ec a l i b r a t i o nc u r v e sw a s1 i n e a rb e t w e e n0 16 21g l - 1 a n d0 2 4 5 4 g l ( r - - - o 9 9 91 ) t h em e t h o d i ss u i t a b l ef o rt h e d e t e r m i n a t i o no fl e v e t i r a c e t a m ap r a c t i c a b l em e t h o df o rs e p a r a t i o na n dq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so f d e x t r oi s o m e ri nl e v e t i r a c e t a mw a sa l s oe s t a b l i s h e db yh p l c m e t h o d s ： c h i r a l p a ka d hc o l u m n ( 2 5 0m m x 4 6m mi d 10 “m ) a n dt h e m o b i l ep h a s eo fh e x a n e i s o p r o p y la l c o h o l ( 8 0 ：2 0 ) w e r eu s e d ，w a v e l e n g t h o fd e t e c t i o nw a s2 2 0n m ，i n j e c t i o nv o l u m ew a s2 0u la n dt h ef l o wr a t e w a s1 0m l m i n b yt h ec h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n s ，t h es e p a r a t i o no f r a c e m a t ec o u l db ef i n i s h e dw i t h i n10m i n s ，t h er e s o l u t i o nw a s5 9 ，a n d t h ed e t e c t i o nl i m i to f d e x t r oi s o m e rw a s4 1 1 2 1 0 巾“g l at e s tm e t h o df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ft h r e ek i n do fr e s i d u a lo r g a n i c s o l v e n t si nl e v e t i r a c e t a m b yh e a d s p a c eg a sc h r o m a t o g r a p h y w a s e s t a b l i s h e d d b a xc a p i l l a r yc o l u m na n df i d d e t e c t o rw e r ea d o p t e d ， e x t e m a ls t a n d a r dm e t h o dw a su s e df o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s t h ep r o v e n r e s u l t so fo p t i m i z e dm e t h o dw e r ea sf o l l o w s ：t h ea v e r a g er e c o v e r i e sf o r a c e t o n e e t h y la c e t a t ea n dd i c h l o r o m e t h a n ew e r e9 7 4 5 ，9 7 17 a n d 9 4 4 7 t h es t a n d a r dc u r v e sf o rt h et h r e er e s i d u a lo r g a n i cs o l v e n t sw e r e l i n e a ri nt h er a n g eo fo 0 5 0 1 3g l - ! 1 0 0 3g l - l ( r = o 9 9 9 7 ) ，o 0 5 0 11g l 1 0 0 2g l - 1 ( r = o 9 9 9 7 ) a n do 0 0 7 0 0 0 g l 叫 o 1 4 0 0g l 叫( f o 9 8 8 8 ) t h em e t h o di sr a p i d ，s e n s i t i v ea n ds i m p l e a p r a c t i c a b l em e t h o df o rs e p a r a t i o na n dd e t e r m i n a t i o no fh i g h m o l e c u l a rp o l y m e r si nc e f o n i c i ds o d i u m w a sf o u n db vh p l cw i t h l l 中南大学硕士学位论文 a b s t r a c t s e p h a d e xg 1 0c o l u m nf 1 0 o x 3 0 0m m ) m o b i l ep h a s e aw a sp h o s p h a t e b u f f e rf l u i d ( o 0 2 5m 0 1 l - 1 ，p h ：7 o ) ，bw a su l t r a p u r ew a t e r t h el i q u i d c h r o m a t o g r a p hw a se q u i p p e dw i t ha2 5 4n l nd e t e c t o r t h ef l o wr a t ew a s 0 7m l m i n w i t hi n je c t i o nv o l u m eb e i n g2 0l a l t h ee x t e m a ls t a n d a r d m e t h o dw a su s e df o rq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s t h ea n a l y s i sm e t h o dc a n i m p r o v et h ea n a l y s i se f f i c i e n c ys i g n i f i c a n t l y k e yw o r d s ：l e v e t i r a c e t a m ，h p l c ，h e a d s p a c eg a sc h r o m a t o g r a p h y , q u a n t i t a t i v ea n a l y s i s ，h i g hm o l e c u l a rp o l y m e r s 1 1 1 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不 包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我 共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名： 壅阖：日期：迎望年互月丛日 学位论文版权使用授权书 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校 有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文， 允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内 容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科 学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 储戤：址刷磁嘲醐：一l 月- 日 中南人学硕十学位论文第一章综述 1 1 抗癫痫药左乙拉西坦 第一章综述 癫痫( e p i l e p s y ) 是一组由神经元突然异常放电所引起的短暂性大脑功能失常 的慢性综合征，为常见疾病( 发病率为3 0 5 0 1 0 万，患病率为5 8 l0 0 0 ，累计 发病率为3 ) 【1 ，2 1 。据估计世界范围内约有50 0 0 力人受到癫痫的困扰【3 , 4 】，除一 部分患者能针对病因进行治疗外，大多数均需要长期使用抗癫痫药物( a n t i e p i l e p t i c d r u g s ，a e d s ) 治疗，目的是尽可能控制发作，降低药物的不良反应提高患者的生 活质型5 6 】。抗癫痫药物经历了1 0 0 余年的发展，癫痫的治疗取得了较大的发展， 但传统抗癫痫药物合理的单药或者联合治疗后，仍有2 0 3 0 的患者呈现药物 抵抗，即难治性癫痫【7 ，8 】。2 0 世纪9 0 年代后，主要针对难治性癫痫，先后研发上 市了新一代的抗癫痫药物，这些药物具有更好的抗癫痫疗效并且不良反应的发生 率较低、耐受性好、药物相互作用少、药物代谢动力学特性较好的优剧引。 左乙拉西坦( 1 e v e t i r a c e t a m ，l e v ， 商品名k e p p r a ) 是新一代抗癫痫药物，属 吡咯烷酮衍生物。吡咯烷酮类促智药属于五元杂环内酰胺类促智药，可视为y 氨 基丁酸( g a b a ) 的衍生物，对参与神经保护和记忆过程的受体具有特殊作用，是 目前最引人注目的一类促智药，具有广谱、起效迅速的抗癫痫活性，药物代谢动 力学特性较理想、耐受性和安全性好【9 】，是目前报道的唯一具有预防癫痫发生的 抗癫痫药物【1 0 1 ，特别适用于成人和儿童的难治性部分性发作的辅助治疗【l l 12 1 ，文 献【l 弘1 7 】对左乙拉西坦的药代动力学、药效学、治疗效果和耐受性做了详细具体的 报道。左乙拉西坦的结构与作用机制均与其他抗癫痫药物不同f l8 1 ，它的药代动力 学与给药剂量呈线性关系，生物利用度能达到1 0 0 ，不具备肝药酶诱导效应， 大约9 1 的剂量能通过肾脏排泄【l9 】；而且可以通过监控血浆中l e v 的浓度来优化 治疗效果，特别对于有肾损伤的病人或者小孩具有良好的效果，且不良反应小 2 0 - 2 2 】。l e v 于2 0 0 0 年经f d a 获准在美国上市2 3 1 ，2 0 0 7 年3 月1 0r l 在中国上市( 商品 名开浦兰) 。 1 2 异构体控制 手性是物质的本质属性之一，构成自然界物质的一些手性分子虽然从原子组 成来看是一模一样，但其空间结构完全不同，他们构成了实物和镜像的关系，也 中南人学硕十学位论文第一章综述 可比喻成左右手的关系。所以叫做手性分子【2 4 1 。 手性药物的药理作用是通过与体内大分子之间的严格手性匹配与分子识别 而实现的( 2 5 , 2 6 】，也就是在人体内药物通过与具有特定物理形态的受体反应起作 用。药物的两种立体异构体中，只有一种更适合与受体或活性部位结合。如果两 种立体异构体都能适合受体，结合将是不太紧密的，因而药物将会不太活泼。通 常，一种同分异构体有选择地结合。而另一种具有较小的或无活性。不同的对映 体在人体内的药理、代谢过程、毒性和疗效存在着显著差异1 2 7 】，因而其分离问题 日益受到重视1 2 引。 目前，临床上使用的手性药物大都以消旋体给药，而由于体内蛋白质、酶和 受体对两个对映体分子处理的差异，结果会导致对映体疗效和毒性不同，单一对 映体给药己成为一种趋势。单一对映体药物可以通过从天然产物提取、半合成、 不对称合成和外消旋体拆分而获得，而拆分外消旋体是获取单一对映体药物行之 有效的方法，因为通过拆分外消旋体可以同时获得两个单一对映体，这对于单一 对映体药物活性的比较研究具有十分重要的现实意义【2 9 j 。研究建立快速、准确、 灵敏、简便的药物对映体分离分析方法对组合化学以及手性药物先导化合物的发 现、立体选择性代谢研究、手性药物质量控制等诸多方面具有十分重要的意义【3 0 】。 对映体分离的常用方法有气相色谱、液相色谱和毛细管电泳等。而用液相色 谱法解决立体化学问题、分离光学异构体，由于具有快速方便、成本不高等优点 而受到重视【3 ，是目前在药物对映体分离分析中使用最多、最广泛的方法。此法 不需高温，因此可减少药物对映体在分析过程中的分解和柱上异构化，而且被拆 分的对映异构体易回收，并可进行制备和半制备。尤其在不对称合成、不对称催 化及外消旋药物的研究中起着非常重要的作用。 纤维素是自然界中大量存在的具有光学活性的天然生物聚合物，它是p d 一葡 萄糖以糖苷键在1 ，4 位相连形成的线性聚合物，由于葡萄糖单元具有手性，聚合物 又具有高级有序的螺旋结构，对映体进入沟槽中，可以通过吸引和包合作用实现 对映体异构体的拆分【3 2 1 。极性的氨基甲酸酯基团和苯基基团在主链的螺旋槽或沟 上，被分离的溶质分子与极性的氨基甲酸酯基团、c = o 、n - h 形成氢键。c = o 与溶质之间还有可能存在偶极偶极作用，而溶质分子与苯基基团则通过兀一_ 兀作 用形成包合配合物。苯环上的取代基对纤维素衍生物( c s p s ) 的手性识别能力 也有很大的影响，氢键作用在手性识别中也起到很重要的作用【3 3 】。 除了纤维素衍生物本身的手性识别性能之外，色谱填料的制备过程、流动相 的组成以及温度等因素对纤维素衍生物手性固定相的手性选择性也有很大的影 响。纤维素衍生物既可直接以纯的聚合物形态作为填料，也可固定到某种载体上 之后作为填料【3 4 1 。但由于纤维素直接作为手性固定相时手性识别能力很低，而且 2 中南大学硕士学位论文第一章综述 还存在机械性能差的缺点，为此，人们便将纤维素上的羟基进行衍生化之后再用作 为手性固定相。研究得最多的有纤维素三醋酸酯( c t a ) 、纤维素三苯甲酸酯及 其衍生物、纤维素三苯基氨基甲酸酯及其衍生物。自h e s s e 等【3 5 】第一次用微晶形 态的纤维素三醋酸酯( c t a ) 作为液相色谱纤维素衍生物( c s p s ) 到现在，多糖类 ( 纤维素，淀粉) 衍生物固定相是目前广泛应用的手性拆分固定相之一，其分离能 力强，稳定性好，应用范围较广【3 6 】，手性空腔适用于许多光学异构体。o k m o t o 3 7 】 小组继c t a - - c s p s 以后，成功地开发了一系列用作c s p s 的纤维素和直链淀粉衍 生物，并由日本d i a c e l 公司商品化。c h i r a l c e lo 嗍和c h i r a l e e lo d r h 就是d a i c e l 公司推出的两种大孔硅基涂敷纤维素一三( 3 ，5 一二甲基苯基氨基甲酸酯) 手性固 定相商品柱，前者用于正相色谱拆分，后者用于反相色谱拆分。它们具有良好的 手性拆分性能，应用广泛。目i j ，有8 0 的手性化合物可以在这类c s p s 上得到 拆分【3 8 1 。 流动相是h p l c 系统中的动态部分，不但可与被分离溶质作用，还可与手性固 定相作用，可以想象溶质与流动相对手性固定相上吸附点的竞争对手性识别应该 会有所影响。除了微品纤维素三醋酸酯( c t a i ) 一般总用在反相模式外( 一般用甲 醇水或乙醇水) ，其它纤维素衍生物手性固定相既可用于正相，也可用于反相。对 于正相系统，一般使用加有一定量醇( 尤其是异丙醇) 的正己烷作为流动相，分离 羧酸类外消旋体时往往需要在流动相中加入少许酸，如三氟乙酸、乙酸、甲酸等 【3 9 】。而分离碱性物质时，则可加入少许二乙胺以减轻拖尾。k i r k l a n d t 4 0 】认为有时在 流动相中可使用非给质子添加剂( 如甲基叔丁基醚或乙酸乙酯等) 代替醇类添加 剂。若样品只溶解于水，则不能用正相。另外，反相色谱特别适用于生物分析和临 床研究，并且有机溶剂用量少因而成本低以及有机废物排放少对环境有利。反相 系统经常使用甲醇水、乙腈水或甲醇一乙腈水。l s h i k a w a 4 l 】指出，对于反相 c h i r a l c e lo d r 柱，对碱性外消旋体，加入一种离液序列高的阴离子( 女h c l 0 - 4 或p f 。6 ) 是达到良好分离的关键。对酸性外消旋体，需要加入少量强酸( 女 i h c l 0 4 ，p h 3 ) ， 而对电中性外消旋体则不需加入电解质添加剂。t a c h i b a n a 【4 2 】对多糖类手性固定 相的反相色谱体系进行了评述，并指出大约有7 0 的手性样品既可在正相也可在 反相获得分离，其中不到l o 在正反相时沈脱顺序会发生反转。由此可见，尽管在 反相下溶质与固定相之间的氢键作用大大减弱，但j 下反相下的手性识别的机理是 非常相似的。 在手性分离中，一般低温有利于手性分离【4 3 1 ，其原因是温度升高使得溶质与手 性固定相之问的结合物不稳定，而低温让固定相与溶质有充分的时间形成非对映 异构结合物，但有时却是高温有利【删。o b 打翎【4 5 】利用c t m b ( c h i r a l c e lo j ) j 下相柱 分离1 种二醇时得出，高温时( 18 5 0 0 c ) 对映体选择性由焓变所控制，低温时( o 中南大学硕士学位论文第一章综述 1 8 ) 则由熵变所控制。不过，t a c h i b a n a 4 2 1 认为对于反相体系，o 4 0 范罔手性 选择性一般均由焓变所控制。 1 3 残留溶剂检查 药物中的残留溶剂系指在原料药或辅料的生产中、以及在制剂制备过程中使 用或产生而又未能完全去除的有机溶剂。根据国际化学品安全性纲要，以及美国 环境保护机构、世界卫生组织等公布的研究结果，很多有机溶剂对环境、人体都 有一定的危害，因此，为保障药物的质量和用药安全，以及保护环境，需要对残 留溶剂进行研究和控制【4 6 4 1 7 1 。 从理论上讲，药物制备过程中所使用的有机溶剂均有残留的可能，均应进 行残留量的研究。但是，药物研发者可以通过对有机溶剂的性质、药物制备工艺 等进行分析，提出科学合理的依据，有选择性的对某些溶剂进行残留量研究，这 样，既可以合理有效的控制产品质量，又有利于降低药物研究的成本，避免不必 要的浪费。因此，药物研发者在进行残留溶剂研究之前，需要首先对药物中可能 存在的残留溶剂进行分析，以确定何种溶剂需要进行残留量的检测和控制。 在确定了需要进行残留量研究的溶剂后，需要通过方法学研究建立合理可行 的检测方法。目前，常用的检测方法为气相色谱法( g a sc h r o m a t o g r a p h y ，g c ) ， 也有其他一些检测方法。 g c 法具有检测灵敏度较高，选择性较好的特点，采用此法所需的样品用量 较少，基本可以满足所有残留溶剂测定的要求。采用g c 法时，需要结合药物和 所要检测的溶剂的性质，通过方法学研究确定合适的检测条件。由于通常要同时 检测多种溶剂，为操作的可行性和对于固体原料药，如采用溶液直接进样法，需 先用水或合适的溶剂使原料药溶解，以使其中的有机溶剂释放于溶液中，才能被 准确测定。如采用顶空进样法，通常以水作溶剂；当药物不溶予水，但可溶于一 定浓度的酸或碱液中时，可采用不挥发的酸或碱液为溶剂，但不能使用盐酸溶液 或氨水；对于非水溶性药物，可采用合适的溶剂，如n ，n 一二甲基甲酰胺、二甲 基亚砜等为溶剂。不管采用何种进样法，所选择的溶剂应能够尽量同时溶解样品 和待检残留溶剂，所选择的溶剂自身及其杂质不干扰待检残留溶剂的测定，所选 择的溶剂应能使样品和待检残留溶剂保持相对稳定。对照品溶液的配制需要采用 与供试品溶液相同的方法和溶剂【4 8 】。 在某些情况下，可以采用g c 法以外的方法进行残留溶剂的检查，如高效液 相色谱法、毛细管电泳法、离子色谱法、气质联用、液质联用、干燥失重法等。 残留溶剂检查属于样品纯度检查的范围，无论采用何种检测方法，均需要通 4 中南人学硕士学位论文第一章综述 过方法学研究验证方法的合理可行。利用项空气相色谱法测定药品中残留溶剂在 国内外都已经有很多成功应用的例子【4 9 捌】。u s p2 9 版【5 2 1 、b p2 0 0 7 版f 5 3 1 、e p2 0 0 1 版【5 4 1 、j p1 5 版【5 5 】及中国药典2 0 0 5 版【4 6 】都收载了顶空气相色谱法测定药品中的有 机溶剂残留量。但仍然存在一些影响因素可能导致错误的结果，必须排除或减少 这些干扰才能保证测定结果的真实准确。我们通过对大量测定药品中残留溶剂的 经验积累，总结出顶空气相色谱法测定药品中残留溶剂的主要影响因素：即药品 中的未知物质与需检测的残留溶剂在相同时间出峰引起的共出峰干扰；药品在项 空条件下发生热降解，其降解产物是某种需测定的残留溶剂所致的热降解干扰。 考察药品中是否存在干扰残留溶剂测定的共出峰物质，需要分别配制供试品 溶液和对照品溶液，用2 支不同极性的色谱柱分别测定有机溶剂的残留量。比较 测定结果，如果2 个柱系统的测定结果一致则表明药品中没有共出峰干扰；如果2 个柱系统的测定结果不一致，则需要对检出量较低的柱系统进行准确性考察，即 用内加法考察是否有基质效应的干扰。当确定检出量较低的柱系统中没有明显的 基质效应后，可以认为其测定结果是可信的，同时说明检出量较高的柱系统中存 在共出峰干扰【5 引。 药品在项空加热条件下如果对热不稳定，则会发生热降解反应。在一定温度 范围内，药品的热降解程度随顶空温度增高而增大，其挥发性热降解产物的含量 也随之增加。因此在不同顶空温度下分别测定药品中残留溶剂，可以考察药品的 热稳定性。使用较低的顶空温度可以排除热降解的干扰【s 6 1 。 测定药品中残留溶剂时，通常对药品的背景如：药品的热稳定性、药品中含 有何种挥发性杂质均不十分清楚。因此即使残留溶剂的对照品溶液在所用色谱系 统中有良好的系统适用性，也不能排除由药品引入的干扰因素对测定准确性的影 响。由于药品中残留溶剂测定属于限度检查，所以当检出的残留量在规定限度内 时可以不考虑是否有共出峰干扰。而当检出残留量超出规定限度时，为了保证测 定结果的真实可信，必须用不同极性的色谱柱考察药品中是否有共出峰干扰。并 使用不同的顶空温度考察药品在顶空条件下的稳定性。当排除了药品中的共 出峰和热降解干扰后，残留溶剂的测定结果才是可信的【5 6 】。 分子结构中含有甲氧基的药品在1 0 0o c 以上的项空温度下，均容易热降解产 生甲醇。甲醇是i c h 规定的第2 类溶剂，其残留量必须加以控制。因此用顶空气 相色谱法测定含甲氧基的药品中残留溶剂时，不能使用1 0 0o c 以上的顶空温度。 甲醇的沸点为6 4 7 0 c ，顶空温度为7 0 。c 时已足以使药品中残留的甲醇挥发，因此 使用7 0 。c 的项空温度比较合适【5 6 】。 5 中南人学硕士学位论文第一章综述 1 4 杂质和含量分析方法验证内容 任何影响药品纯度的物质均称为杂质。药品质量标准中的杂质系指在按照经 国家有关药品监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定原辅料生产的药品 中，由其生产工艺或原辅料带入的杂质，或经稳定性试验确证的在贮存过程中产 生的降解产物【5 7 】。 按化学类别和特征，杂质可分为：有机杂质、无机杂质、有机挥发性杂质。 按其来源，杂质可分为：有关物质( 包括化学反应的前体、中间体、副产物和降 解产物等) 、其他杂质和外来物质等。按结构关系，杂质又可分为：其他甾体、 其他生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物等。按其毒性，杂质又可分为： 毒性杂质和普通杂质等。普通杂质即为在存在量下无显著不良作用的杂质，而毒 性杂质为具强烈不良生物作用的杂质【5 。 药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应的检测要 求。在建立药品质量标准时，分析方法需经验证。验证的内容有：准确度、精密 度( 包括重复性、中间精密度和重现性) 、专属性、检测限、定量限、线性、范 围和耐用性。视具体方法拟定验证的内容【5 7 5 8 1 。 1 4 1 准确度 准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般用回收 率( ) 表示，应在规定的范围内测试。 1 4 1 1 含量测定方法的准确度 原料药可用已知纯度的对照品或供试品进行测定，或用本法所得结果与己知 准确度的另一个方法测定的结果进行比较。 制剂可用含有已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全 部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或用本法所得结果与已知准 确度的另一个方法测定结果进行比较。 如该分析方法已经测试并求出了精密度、线性和专属性，在准确度也可推算 出来的情况下，这一项可不必再做。 1 4 1 2 杂质定量测定的准确度 可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。如不能得到杂质或降解产 物，可用本法测定结果与另乙成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证 6 中南人学硕： = 学位论文第一章综述 的方法。在不能测得杂质或降解产物的响应因子或不能测得对原料药的相对响应 因子的情况下，可用原料药的响应因子。应明确表明单个杂质和杂质总量相当于 主成分的重量比( ) 或面积比( ) 。 1 4 1 3 数据要求 在规定范围内，至少用9 个测定结果进行评价。例如，设计3 个不用浓度，每 个浓度各分别制备3 份供试品溶液，进行测定。应报告已知加入量的回收率( ) ， 或测定结果平均值与真实值之差及其相对标准偏差或可信限。 1 4 2 精密度 精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得 结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。 在相同条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性；在同 一个实验室，不同时问由不同分析人员用不同设备测定结果之间的精密度，称为 中间精密度；在不同实验室由不同分析人员测定结果之间的精密度，称为重现性。 1 4 3 专属性 专属性系指在其他成分( 如杂质、降解产物、辅料等) 可能存在下，采用的 方法能正确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查和含量测定方法均应考察 其专属性。 在杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考察 测定结果是否受干扰，并可与未加杂质或辅料的试样比较测定结果。对于杂质测 定，也可向试样中加入一定鼍的杂质，考察杂质之间能否得到分离。 在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含有杂质或降解产物的试样进 行测定，与另一个经验证了的方法或药典方法比较结果。用强光照射、高温、高 湿、酸( 碱) 水解或氧化的方法进行加速破坏，以研究可能的降解产物和降解途 径。 7 中南人学硕士学位论文 第一章综述 1 4 4 检测限 检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。常用方法有：非仪器分析目 视法和信噪比法。信噪比法一般用于能显示基线噪声的分析方法，即把已知低浓 度试样测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，算出能被可靠的检测出的最 低浓度或量。一般以信噪比3 ：1 或2 ：1 时的相应浓度或注入仪器的量确定检测限。 1 4 5 定量限 定量限系指试样能被定量测定的最低量。常用信噪比法确定定量限。一般以 信噪比1 0 ：1 相应浓度或注入仪器的量确定定量限。 1 4 6 线性 线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的 程度。 1 4 7 耐用性 耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为使 方法可用于提供常规检验依据，应考虑耐用性。典型的变动因素有：被测溶液的 稳定性、样品的提取次数、时间等。液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的 组成和p h 值、不同厂牌或不同批号的同类型色潜柱、柱温、流速等。气相色谱 法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相、不同类型的担体、柱温、进 样口和检测器温度等。 1 5 抗菌药物头孢尼西钠中的聚合物分析 头孢尼西钠属于p 内酰胺类抗菌药物，是临床上最常用的基本药物之一，同 时也是较易发生不良反应的药物之一，临床中抗菌药物较常见的一类不良反应是 药物所致的过敏反应【5 9 1 ，p 内酰胺类、氨基糖苷类类抗生素及喹诺酮类抗菌药物 均可引发不同类型的过敏反应，尤其以p 内酰胺类抗生素最为严重，不仅对患者 中南人学硕士学位论文第一章综述 的危害极大，对医护人员的心理压力也很大。多年来的研究证明，抗生素所致的 速发型过敏反应并非由药物本身所致，而和药物中存在的高分子杂质有关 5 9 , 6 0 1 。 抗菌药物中的高分子杂质系指药品中分子量大于药物本身的杂质总称，其 分子量一般在1 0 0 0 - - 5 0 0 0 ，个别可至1 0 0 0 0 道尔顿左右。 在六、七十年代就报道b 一内酰胺类抗生素溶液在室温下放置几天产生聚合 物，其具有强的抗原性质，在临床过敏反应中起重要作用【6 。经近几十年的研究 也证明抗生素所致的过敏反应抗生素是由其中存在的高分子聚合物产生的【6 2 】。高 分子杂质是对药品中分子量大于药物本身的杂质总称。抗生素药物中的高分子杂 质按其来源通常分为外源性杂质和内源性杂质：外源性杂质包括蛋白、多肽、多 糖等类杂质，或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物，外源性杂质一般来源于 发酵工艺；内源性杂质系指抗生素药物自身聚合产物，聚合物可来自生产过程， 又可在储存中形成，甚至在用药时也可由使用不当产生。抗生素聚合物的免疫原 性通常较弱，但作为多价半抗原，可引发速发型过敏反应【6 3 1 。 p 一内酰胺类抗生素主要包括青霉素和头孢菌素二大类。除青霉素g # b ，临 床中常用的b 一内酰胺类抗生素均为半合成抗生素，故除青霉g 中还含有少量的 青霉噻哗多肽外，其他, n n 中的高分子杂质主要是聚合物。 近几十年来国内外对8 内酰胺抗生素中高分子聚合物的分离分析研究报道 有许多，概括起来其分离的方法主要是色谱法，分离模式主要有三类：凝胶 过滤色谱法；离子交换色谱法；反相色谱法。 1 5 1 凝胶过滤色谱法 高分子聚合物是分子量大于药物本身杂质的总和，它可能是聚合度不同的多 组分混合体。凝胶过滤色谱法主要是利用分子排阻的原理，即分子量差异进行分 离的色谱模式。这对于分离药物中的高分子聚合物是一种简便易行的分离模式。 近期的报道中主要采用葡聚糖凝胶s e p h a d e x g 1 0 填料，其分子排阻量为7 0 0 道尔 顿( 葡聚糖) 。胡昌勤等运用葡聚糖凝胶s e p h a d e xg 1 0 分离分析d 内酰胺抗生素中 的高聚物并进行了一系列的报道m 抑j ，阐述了各种色谱条件对p 一内酰胺抗生素在 s e p h a d e x g 1 0 凝胶色谱系统中色谱行为的影响，指出：当流动相中离子种类 不变，离子强度越大，p 内酰胺抗生素的k a v 值越大；缓冲液中的阴离子种类， 阴离子所带的负电荷越多，溶质的k a v 值相对越大，色谱峰越易拖尾；当流 动相中有多元酸盐存在时，p h 通过影响多元酸的解离，改变缓冲液中阴离子 类型束改变溶质的保留行为；流动相的p h 也可通过影响溶质的解离状态来影 响溶质的保留行为。对侧链中含有氨基的溶质，流动相的p hn - i 直接影响氨基的 9 中南人学硕士学位论文第一章综述 质子化状念。在酸性条件下氨基主要以n h 3 + 的形式存在，在碱性条件下氨基主 要以n h 2 的形式存在，由于s e p h a d e xg 1 0 对氨基两种状态吸附作用不同，不同质 子化的溶质的保留行为则不同。报道中还指出了6 内酰胺抗生素s e p h a d e xg 一1 0 凝胶色谱系统中色谱行为的定量关系；有目的地利用了溶质与s e p h a d e xg 一1 0 凝 胶介质问的相互作用在凝胶颗粒内、外有较大差异这一现象，通过选择适当的流 动相使d 内酰胺抗生素和其高聚物达到分离。还首次利用在特定情况( 水、o 5 葡萄糖或0 0 1 m o l l 甘氨酸为流动相) p 内酰胺抗生素可以缔合形成表观分子量 较大的缔合物，缔合物在s e p h a d e xg 1 0 凝胶色谱系统中色谱行为和高分子杂质 一样，k a v = o 处表现为单一色谱峰这一特点，采用了自身对照外标法对高分子杂 质进行精确定量，解决了无高分子杂质对照品和溶质主峰十分宽大，致使一般积 分仪难于准确积分的问题。中国药典从2 0 0 0 年版起收载头孢哌酮钠、头孢曲松钠、 头孢他定、头孢噻肟钠四个品种高分子聚合物的测定，方法均采用s e p h a d e xg 1 0 自身对照外标法。 在凝胶色谱模式分离分析高聚物中流动相体系一般为含有哉的水溶液，检测 方法一般使用紫外检测。 在上述的凝胶过滤色谱法中，除t s k 凝胶柱为商品柱外，其余的均为自装柱， 柱的性能常因人而异，柱子的理论塔板数一般较低，峰形宽，分离时间长( 常超 过6 0m i n ) 。而t s k 凝胶柱( 美国药典中要求的凝胶) 的柱床体积随洗脱盐浓度的改 变发生较大的改变【6 3 1 。 1 5 2 离子交换色谱法 采用离子交换色谱法测定b 一内酰胺抗生素中的高聚物的报道不多，主要是在 早期的报道，一般用于对高聚物的分离定性方面，分离时间长，操作繁琐。如 e r o e t s 等运用d e a e s e p h a d e xa - - 2 5 ( 4 5 x 3 c mi d ) 分离、a m b e e e r l i t ex a d 2 ( 4 0 c m x 2t i ni d ) 纯化氨苄西林和阿莫西林中的高聚物，并用t l c 、h p l c 检查聚合物 的纯度，u v 、i r 、n m r 确证阿莫西林主要产生二聚物、三聚物和少量四聚物， 其降解物p i p e r a z i n e d i o n e 也是( 在阿莫西林主峰前出峰) 一种重要产物。氨苄西林主 要产生二聚物、三聚物和四聚物，而其p i p e r a z i n e d i o n e 仅有少量【6 8 1 。v g i r o x a 等也运用了d e a e - - s e p h a d e xa 一2 5 ( 3 6c m x 2 6t i ni d ) 柱，流动相为磷酸盐缓冲 液( p h 7 2 ) 和n a c i 混合液进行梯度洗脱( 磷酸盐缓冲液( p h 7 2 ) ：0 0 5m o ! 【一0 5 m o l l ；n a c i ：0 2m o l l _ 1 7 5m o l u ，流速为6 8m l h 对氨苄西林进行分 离，再用凝胶色谱法对其进行分子量测定来确定聚合度 。 l o 中南入学颈学位论文第一章综述 1 5 3 反相色谱法 反相色谱法是种分离分析药物及其杂质的常用方法，在分离分析1 3 内酰胺 抗生索中的高聚物的报道也有部分。英国药典1 9 9 8 年版在测定阿莫两林有关物质 中采用反相色谱一梯度洗脱方法，其中根据相对保留时间确定峰位置来对阿莫西 林二聚物和三聚物进行限度控制。h a y a ou e n o 等运用r h p l c 对青霉素中聚合物 组分进行分析f 6 9 1 ；e r o e t s 等也分析氨苄话林和阿莫碟林中的聚合物组分【6 8 】。由 于r h p l c 的分离原理是与溶质的极性等有关，与凝胶色谱的分子排阻原理不 同，而1 3 一内酰胺抗生素中不仅含有多组分的高聚物，还含有许多降解产物，利用 r | p l c _ 一梯度洗脱对萁进行分离分析，可分离出一系列峰，各高聚物的峰不是 排序在一起，其周围常出现其他峰，并且离聚物杂质含量低，这对于需要单独测 定离聚物的含量，而又采用一般的紫外检测方法来说，因不易确定高聚物峰的准 确位置而难于准确测定其含壁。在反相色谱法中，还有运用l g m s 分析确定氨 苄两林、阿莫硝林中相关物质 7 0 】，其中确定了二聚体、三聚体等聚合体。 p 一内酰胺类抗生素高分子杂质具有高度不均一性和不确定性，高分子杂质 本身不稳定，对照品不易铡得，经实验表骥：在特定条件下( 一般在以流动相为 水的条件下) ，一内酰胺类抗生素由于分子间的氢键、静电、疏水相互作用等 可形成表观分子量较大的缔合物，在s e p h a d e xg 一1 0 凝胶色谱系统中的色谱行为 与高分子杂质相同，都在k a y - - 0 处表现为单一色谱峰，利用该特点，制定自身 对照外标法。 中南人学硕+ 学位论文第_ 二章h p l c 法测定左乙拉两坦原料药中含量 2 1 引言 第二章h p l c 法测定左乙拉西坦原料药含量 左乙拉西坦( l e v e t i r a c e t a m ，l e v ) 为吡咯烷乙