（微生物学专业论文）酿酒酵母bdf1p转录因子在高盐胁迫反应中调控机制的研究.pdf

山东大学博士学位论文 英文缩写 a d s a m p b p c a n c r d e c i 也 d a p i d h r d t ，r e d t a h h d h o g - m a p k k b 符号说明 英文名称 a c q u i r e di m m u n o d e f i c i e n c ys y n d r o m e a m p i c i l l i n b a s ep a i r c a l c i n e u r i n c a l c i n e u r i n d e p e n d e n tr e s p o n s ee l e m e n t c y c l ic a m pr e s p o n s el i k ee l e m e n t 4 。，6 - d i a m i d i n o - 2 p h e n y l i n d o l e d i h y d r o r h o d a m i n e1 2 3 d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n ed i a m i n d e t e t r a a c e t i ca c i d h o u r h u n t i n g t o n sd i s e a s e 1 1 i 曲o s m o l a r i t y 罾y c e r am i t o g ma c t i v 出x l p r o t e i nk i n a s e 啦弘a l i i 】g 位m 洲p a t h w a y k i i o b a s e k d ak i l o d a l t o n l b ( m e d i u m ) l e u m m i n m w n m r o d o r f 1 0 l u r i a b e r t a n i ( m e d i u m ) l e u c i n e m o l l m i n u t e m o l e c u l a rw e i g h t n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e o p f i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf l a m e 中文名称 获得性免疫缺陷综合征 氨苄青霉素 碱基对 钙调磷酸酶 钙调磷酸酶依赖的反应 元件 环磷酸腺苷c 心佃反应元 件 4 ，6 二脒基2 苯基吲哚 双氢罗丹明1 2 3 二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 小时 亨廷顿病 高渗透性甘油促分裂原 激酶信号转导途径 千碱基 千道尔顿 细菌用培养基 亮氨酸 摩尔每升 分钟 分子量 核磁共振 光密度值 开放阅读框 山东大学博士学位论文 英文缩写 p b s p c d p c r p e g p m s f r o s r p m p t p i 卿c r s c e r e v i s i a e s d s s o d t e m t o r 小i e i ， 删 y e p d y n b 英文名称 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e p r o g r a m m e dc e l ld e a t h p o l y m e r a s ec h a i nr e a t i o n p o l y e t h y l e n eg l y c o l p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d e r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s r e v o l u t i o n g sp e rm i n u t e p e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n p c r s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s u p e r o x i d ed i s m u t a s e t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y t a r g e to fr a p a m y c i n t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e m e d i a t e dn i c ke n dl a b e l i n g u r a c i l y e a s te x t r a c tp e p t o n ed e x t r o s e y e a s tn i t r o g e nb a s e 中文名称 磷酸盐缓冲液 细胞程序性死亡 聚合酶链式反应 聚乙二醇 苯甲基磺酰氟 活性氧 每分钟转数 通透性转运孔道 反转录p c r 酿酒酵母 十二烷基硫酸钠 超氧化物歧化酶 透射电镜 雷帕霉素靶分子信号 脱氧核糖核苷酸末端转移 酶介导的缺口末端标记 尿嘧啶 酵母菌完全培养基 酵母基础氮源 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人 承担。 论文作者签名：垫l 鱼熏 e t期：垫旦墨：21 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：垒! 鱼墨导师签名：遥趔豹汩 期：垫坚 山东大学博士学位论文 酿酒酵母b d f l p 转录因子 在高盐胁迫反应中调控机制的研究 中文摘要 在自然条件下，生物的生存依赖于对外界环境改变的及时识别以及对新环境 所作出的相应反应。生物对不良环境刺激因子的应答反应，并最终形成对胁迫环 境的抵抗力就是环境胁迫反应( e n v i r o n m e n t a ls t r e s sr e s p o n s e ，e s r ) 。生物胁迫反 应是研究基因功能和了解生命活动本质的便利模型。同时，对生物胁迫反应的研 究在培育抗逆植物、改造工业微生物的生产形状以及对细胞癌变的机理与治疗等 方面的研究具有重要作用。 酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 是最简单和最早完成全基因组测序的真 核生物( h t t p ：g e n o m e m 憾，s t a n f o r d e d u s a c c h a r o m y c e s ) 。酿酒酵母易培养、生 活周期短，遗传背景清晰，同时以酿酒酵母为基础的分子生物学研究技术平台日 趋完善，很容易制备各种突变体等遗传学研究材料，使研究方便可行，是理想的 真核生物模式种。 高盐环境一直是人们关注的重要的胁迫因子之一，以酿酒酵母为模型开展盐 胁迫机理研究，在国际上一直是生物学研究的热点之一。目前，对酿酒酵母胁迫 反应机制已经有了较深入的了解，高盐胁迫对酵母细胞的毒害作用包括两个方 面，一是n a + 离子毒害；二是产生渗透压胁迫，使质膜的跨膜渗透压降低而导致 细胞膨胀压的丧失。同时，一些重要的盐胁迫信号传导途径和离子通道蛋白相继 被发现。例如：在高浓度n a c i 条件下，高渗透性甘油促分裂原激酶信号转导途 径( h i g ho s m o l a r i t yg l y c e r o lm i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s es i g n a l i n gt r a n s d u c t i o n p a t h w a y ，h o g - m a p k ) 通过促进甘油积累抵抗渗透胁迫刺激。钙调磷酸酶 ( c a l c i n e u r i n ，c a n ) 信号途径通过转录因子c r z l p t c n l p 激活酵母细胞e n a l ( 编 码重要p 型a t p a s e 离子外排泵) 的表达，促进n a + 外排。同时t r k i 2 p 负责的 k + n a + 离子吸收系统，通过提高k + 离子亲和性，优先积累k + 限制n a + 的吸收， 减少对细胞的毒害作用n a + 。本课题组前期利用转座标签随机插入突变技术，首 山东大学博士学位论文 次在酿酒酵母中发现b d f l p ( b r o m o d o m a i nt r a n s c r i p t i o nf a c t o r l ) 转录因子与高 盐胁迫有关。 b d f l 基因的缺失并不会引起致死效应，属于非基础性的基因转录调控因子。 b d f l p 转录因子在蛋白质结构上包含：2 个“溴”结构域( b r o m o d o m a i n ) 和一个位于 c 末端的e t ( e x t r a t e r m i n a l ) 结构域，属于b e t 转录因子家族。b r o m o d o m a i n 结 构域是近1 0 年来发现的广泛存在于多种真核生物中的组蛋白赖氨酸乙酰化位点 结合结构域，由6 0 1 1 0 个高度保守的氨基酸残基组成，目前对于含 b r o m o d o m a i n 结构域蛋白功能的研究还处于起步阶段。 本研究利用基因敲除( g e n ek n o c k o u t ) _ ；f i 化学药物阻断的方法，对盐胁迫条件 下h o g m a p k 途径、c a l c i n e u r i n 途径、e m ，基因、以及刀，基因与b d f l 基因之间的遗传学关系进行了分析。实验结果表明，当b d f l 基因分别与h o g l 、 c 仰j c ? d 2 、e n a l 和t r k l 基因同时缺失或阻断时，酵母细胞的盐耐受性均进 一步减弱，该结果提示b d f l 基因在酵母盐胁迫应答反应中与上述途径基因可 能分别涉及不同的酵母盐胁迫途径。 基因表达谱分析技术为酵母盐胁迫反应分子机制及其相关基因功能的研究 提供了全新和有效的研究手段。利用酵母全基因组芯片分别绘制了盐胁迫条件下 野生型菌株和b d f l a 菌株的基因表达谱，分析比较相互间的不同，在全基因范围 内寻找受b d f l p 影响的盐胁迫反应相关基因。野生型菌株和b d f l a 菌株细胞经 0 6mn a c i 处理4 5m i n 后，提取酵母总r n a , 合成c d n a 并分别用c y 5 一d c t p 和c y 3 d c t p 标记，与含有5 9 3 5 个开放阅读框( o p e nr e a d i n gf r a m e ，o r f ) 的酵 母全基因组芯片进行杂交并扫描。采用g e n e p i xp r o4 0 图像分析软件( a x o n i n s t r u m e n t s 公司) 对芯片图像进行分析，计算r a t i o 值( 两种荧光强度的比值 e y 5 c y 3 ) ；然后对芯片上的数据用l o w e s s 方法进行归一化；最后用t - t e s t 和以两 倍差异( 即r a t i o 值大于等于2 0 ，小于等于0 5 ) 的标准来确定差异表达基因。 为了消除荧光偏向性带来的假阳性，盐处理和对照的酵母细胞r n a 样品在反转 录过程中进行荧光交换实验，同时对于每个菌株盐处理( w 3 0 3 盐处理w 3 0 3 和 b d f l a 盐处理b d f l a ) ，都作两次独立的生物学重复实验，分析两次独立实验中表 达变化趋势一样的基因，基因变化的数值取两组数据的平均值。在此基础上，随 机挑选差异表达的基因，利用实时荧光定量r t - p c r ( r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v e 2 山东大学博士学位论文 r t - p c r ，q p c r ) 进行验证，实验结果显示对所测定的基因与基因芯片技术检测 结果一致，不仅变化方向一致，而且表达值非常接近，说明芯片结果具有良好的 准确性。 本实验共筛选出差异表达基因2 1 7 个，有1 4 4 个差异表达基因分别在野生型 菌株与b d f l a 菌株呈现相同的变化趋势( 上调基因1 1 9 个，下调基因2 5 个) 。 采用m i p s 数据库的在线软件f u n c t i o n a lc a t a l o g u ed a t a b a s e ( h t t p ：m i p s $ i f d e p r o j f u n c a t d b s e a r c h _ m a i n _ _ f r am e h t m l ) 进行生物学功能分类对 上述1 4 4 个差异表达基因进行功能分类发现，以上差异表达基因主要集中在甘油 代谢、海藻糖代谢、离子通道蛋白、氧化胁迫反应、热休克蛋白和功能未知蛋白 等方面。其中e n a l 基因在野生型菌株和b d f l a 菌株中的盐胁迫诱导表达倍数相 似( 5 2 5 和6 3 2 ) ，说明b d f i 基因缺失并未对盐胁迫条件下e m ，基因的正常 表达产生影响，与前面遗传学分析结果一致，即b d f l 和e n a l 基因分别涉及不 同酵母盐胁迫途径。同时，基因芯片数据显示甘油合成关键酶基因g p d l ( 编码 3 磷酸甘油脱氢酶) ，经盐胁迫处理后，在野生型菌株和b d f l a 菌株的基因表达 水平均显著上升，其诱导表达倍数分别高达3 5 7 9 和3 5 5 2 倍。酵母胞内甘油含 量测定结果表明，经0 6mn a c i 处理4 5m i n 后，野生型菌株和b d f l 菌株中甘油 积累均有大幅提高且含量相近，此结果与上述通过基因芯片在转录水平上测定结 果一致。 b d f 2 是酿酒酵母8 d f ，基因的同源基因，采用长臂同源多聚酶链式反应 ( l f h p c r ) 方法制备含有遗传霉素耐药基因( k a n m x 4 ) 的b d f 2 基因敲除片段并转 化酵母，构建了b d f 2 a 菌株。梯度生长实验表明，与野生型菌株相比，b d f 2 基 因缺失并不造成盐敏感表型，说明b d f 2 基因是酵母盐抗性的非必须基因。基因 芯片结果显示，b d f l 基因缺失导致盐胁迫条件下b d f 2 基因表达下调，提示两 基因间的表达可能存在相互影响，盐胁迫条件下两基因间的遗传学关系有待进一 步研究。 线粒体是真核生物能量代谢的中心，在物质代谢、细胞凋亡过程中发挥了 重要的作用。基因芯片结果显示，经0 6 m n a c i 处理4 5r a i n 后，与野生型菌株相 比，b d f ，基因缺失造成盐胁迫条件下大量线粒体功能相关基因表达下降。其中 包括：线粒体核糖体基因( 掀以，3 ，掀p 4 、m r p 7 和m r p l l ) ，细胞色素c 基 山东大学博士学位论文 因c y c i ，线粒体延伸因子基因m e f l 和线粒体缬氨酰t r n a 合成酶基因v a s l ， 该结果提示，b d f l p 可能在维持盐胁迫条件下线粒体的正常功能方面发挥重要作 用。 线粒体膜电位( m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n ep o t e n t i a l ，甲m ) 和胞内活性氧 ( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 含量是评价线粒体功能的的重要指标。利用还 原型线粒体特异性荧光探针m i t o t r a c k e rr e dc m x r o s 对盐胁迫处理后野生型菌 株和b d f l a 菌株中线粒体膜电位的变化进行了检测。实验结果表明，经0 6m n a c i 处理4 5m i n 后，m i t ot r a c k e rr e dc 慨o s 探针在野生型菌株细胞中仍处于聚集 状态，呈现网状分布的荧光线条，而大约2 0 左右的b d f l a 菌株细胞呈现弥散状 分布的荧光，说明这些细胞的线粒体跨膜电位下降或消失。利用d h r 荧光探针 ( d i h y d r o r h o d a m i n e1 2 3 ) ，对经0 6m n a c i 盐胁迫处理4 5m i n 的野生型菌株和 b d f l a 菌株的胞内r o s 含量进行了测定。实验结果表明，经盐胁迫处理后的野 生型酵母细胞在荧光显微镜下呈现微弱红色荧光，而b d f l 基因缺失菌株显现明 亮的红色荧光，荧光强度相对定量分析表明，b d f l a 菌株细胞的相对荧光强度比 野生型菌株细胞高出1 5 倍以上，说明b d f l 基因缺失可导致盐胁迫条件下胞内 活性氧r o s 的积累。超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 是酵母体内 活性氧清除体系中最重要的抗氧化酶，酶活测定结果表明，0 6mn a c l 处理4 5 m i n 的盐胁迫条件下野生型菌株和b d f l a 菌株中s o d 酶活性均呈上升趋势，且 b d f l a 菌株的s o d 酶活性比野生型菌株高出3 8 个活力单位以上。该结果表明， 盐胁迫条件下b d f l a 菌株细胞中r o s 的大量积累并不是由于超氧化物歧化酶的 活性受到抑制引起的。 细胞凋亡( a p o p t o s i s ) 是指细胞在一定的外界刺激或病理条件下，受基因控制 的一种细胞自主的有序的死亡。线粒体功能紊乱与酵母细胞凋亡的发生密切相 关。利用d a p i 染色和透射电子显微镜( t e m ) 对盐胁迫处理后，野生型菌株和 b a f l a 菌株细胞的细胞核和染色质形态进行观察。结果显示，与野生型菌株相比， b d f l a 菌株细胞的细胞核裂解，染色质发生凝集，核膜皱缩，呈现明显的细胞凋 亡特征，说明盐胁迫条件下b d f l 基因缺失可引发线粒体依赖的酵母细胞凋亡。 关键词：酿酒酵母：盐胁迫：8 d f ，基因；b r o m o d o m a i n ；基因芯片 4 山东大学博士学位论文 r e g u l a t i o no ft h eb d f lpt r a n s c r i p t i o nf a c t o r i nt h es a l ts t r e s sr e s p o n s eo fs a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e a b s t r a c t c e l l u l a ro r g a n i s m sh a v ed e v e l o p e ds e v e r a la u t o n o m o u s m e c h a n i s m st oa d j u s t t h e m s e l v e st on e wc o n d i t i o n s ，b e c a u s et h e ya r ec o n s t a n t l yc h a l l e n g e db yc h a n g i n g e n v i r o n m e n t a lc o n d i t i o n s ，u n d e rs t r e s sc o n d i t i o n s ，t h ec e l l su n d e r g o e sas e r i e so f c h a n g e st op r o t e c tt h ee x t e r n a ls ys t e mf r o mt h ed e t r i m e n t a le f f e c t so fs t r e s s ，w h i c h w e r er e f e r r e dt oa st h ee n v i r o n m e n t a ls t r e s sr e s p o n s e s ( e s r ) t h es t u d i e so fy e a s t s t r e s sr e s p o n s e sh a v ep r o v i d e dap o w e r f u lt o o lf o ri n v e s t i g a t i o no ft h eg e n e sf u n c t i o n a n de l u c i d a t i o no ft h en a t u r eo fi m p o r t a n tl i f ea c t i v i t i e s i na d d i t i o n ，r e s e a r c ho ns t r e s s r e s p o n s eh a si m p o r t a n tr o l ef o rt h ei m p r o v e m e mo f t h es t r e s sr e s is t a n c eo fp l a n tc o r p s a n di n d u s t r i a lm i c r o b i a l ，a n dh a sal a r g ei m p a c to nm e d i c a li s s u e s s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ew a s t h ef i r s te u k a r y o t i co r g a n i s mw h o s e w h o l eg e n o m e w a sc o m p l e t e l ys e q u e n c e d ( h t t p ：g e n o m e - w w w s t a n f o r d e d u s a c c h a r o m y c e s ) t h e r a p i dg r o w t h ，e a s eo fg e n e t i cm a n i p u l a t i o n ，a n daw e l l d e f i n e dg e n e t i cs y s t e mo ft h e y e a s ts a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a em a k ei ti d e a lf o rf u n d a m e n t a la n da p p l i e ds t u d i e si n e u k a r y o t i cs p e c i e s s a l t - s t r e s sa d a p t a t i o nm e c h a n i s m sa r eb e i n gi n t e n s i v e l ys t u d i e di nm o d e lo r g a n i s m s s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e u n d e rh i g h s a l tc o n d i t i o n s ，t h ey e a s tc e l l sa r em a i n l y c h a l l e n g e db yi o na n dh y p e r o s m o t i cs t r e s s s e v e r a lm e c h a n i s m si n v o l v e di ny e a s ts a l t s t r e s sr e s p o n s eh a v eb e e ni d e n t i f i e d f o ri n s t a n c e ，u n d e rn a c is t r e s s ，t h eh i g h o s m o l a r i t yg l y c e r o lm i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s es i g n a l i n gt r a n s d u c t i o np a t h w a y ( h o g m a p k ) i sa c t i v a t e d ，w h i c hm e d i a t e st h ep r o d u c t i o na n da c c u m u l a t i o no ft h e o s m o l y t eg l y c e r 0 1 c a l c i n e u r i nf u n c t i o n st h r o u g ht h ec r z l p t c n l pt r a n s c r i p t i o nf a c t o r t oi n d u c es e v e r a ls a l ts t r e s s - r e s p o n s i v eg e n e se x p r e s s i o n ，s u c ha st h ee n a1g e n e w h i c he n c o d e sap l a s m am e m b r a n ep - t y p en a + - a t p a s ei o ne x t r u s i o n p u m p 山东大学博士学位论文 a d d i t i o n a l l y ，t h et r k l 2 pt r a n s p o r ts y s t e mi n c r e a s e da f f i n i t yf o rk + a n dp r e v e n t e n t r yo fe x c e s sn a + ，t oi n c r e a s en a c it o l e r a n c e y e a s tm u t a n t sw i t hi m p a i r e dk + t r a n s p o r ts y s t e ms h o w e di n c r e a s e ds e n s i t i v i t yt os a l ts t r e s sd u et oa c c u m u l a t eo fm o r e n a + t h a nw i l dt y p es t r a i n t h e c e r e v i s i a eb d f lg e n e ，w h i c he n c o d e sa b r o m o d o m a i n c o n t a i n i n gt r a n s c r i p t i o nf a c t o r , w a si s o l a t e di nal a r g e s c a l es c r e e nf o r s a l t - s e n s i t i v i t ym u t a n t sf o l l o w i n gt r a n s p o s o nm u t u g e n e s i s b r o m o d o m a i nt r a n s c r i p t i o nf a c t o r1p r o t e i n ( b d f lp ) c o n t a i n st w ob r o m o d o m a i n s a n da ne t ( e x t r a - t e r m i n a l ) d o m a i n i ti sam e m b e ro ft h eb e tp r o t e i nf a m i l y i ny e a s t ， b d f lpw a sn o te s s e n t i a lf o rc e l lv i a b i l i t y b r o m o d o m a i n sa r ee v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e d a n da c ta sa c e t r y l l y s i n eb i n d i n gd o m a i n st h a tp r o c e s st h em o l e c u l a ri n f o r m a t i o n c o n v e y e db yl y s i n ea c e t y l a t i o nm o d i f i c a t i o n t ou n d e r s t a n d i n gt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o n s o fb r o m d o m a i n c o n t a i n i n gp r o t e i n si nc e l l u l a rp r o c e s s e sw e r ec u r r e n t l ya taf l e d g l i n g s t a g e b yu s i n gg e n ek n o c k o u ta n dd r u g sb l o c kt e c h n i q u e s ，t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n b d f la n ds e v e r a ls i g n a l i n gt r a n s d u c t i o np a t h w a y s g e n e sh a v eb e e nk n o w ni n s a l t t o l e r a n c e ，w a si n v e s t i g a t e d t h e s ei n c l u d e dh o g - m a p kp a t h w a y 、c a l c i n e u r i n p a t h w a y 、e n a la n dt r k lg e n e s g e n e t i ca n a l y s i si n d i c a t e dt h a t t h ef u n c t i o no f b d f l pi ns a l tt o l e r a n c ei si n d e p e n d e n to ft h eh o g m a p kp a t h w a yo rt h ee a l c i n e u r i n p a t h w a y , k + t r a n s p o r t a t i o ns y s t e m a n di sn o tm e d i t a t e db ye n a lp ，t h em a jo r d e t e r m i n a n to fn a + e x t r u s i o ns y s t e m t h ey e a s tg e n o m e - s c a l ee d n am i c r o a r r a yp l a t f o r mp r o v i d e sa ne f f e c t i v er e s e a r c h t o o lt oi n v e s t i g a t e dt h eg l o b a lc h a n g e si ng e n ee x p r e s s i o nu n d e rag i v e ns a l ts t r e s s c o n d i t i o n t og a i nf u r t h e ri n s i g h ti n t ot h er o l eo fb d f l pi n s a l tt o l e r a n c eo nag l o b a l s c a l e ，d n am i c r o a r r a ya n a l y s i sw a sc o n d u c t e d t h eg l o b a lg e n ee x p r e s s i o nc h a n g e s i nt h ew i l d - t y p ea n dab d f l am u t a n tr e s p o n d i n gt oas a l ts t r e s st r e a t m e n t ( 0 6m o l l n a c i ，4 5m i n ) w e r em e a s u r e d ，r e s p e c t i v e l y t o t a ly e a s tr n a w a si s o l a t e da f t e rt r e a t e d b y 0 6m o l ln a c if o r 4 5m i n ，a n dt h ee d n aw e r el a b e l e dw i t hc y 5 一d c t pa n d c y 3 一d c t p ，r e s p e c t i v e l y t h e nt h ec y 5 c y 3 - l a b e l e de d n a w e r eh y b r i d i z e do nt h e y e a s tg e n o m e w i d ed n am i c r o a r r a y sc o n t a i n i n g5 9 3 5o r f s o b t a i n e di m a g e sw e r e a n a l y z e dw i t hag e n e p i xp r o4 0 as p a c ea n di n t e n s i t y - d e p e n d e n tn o r m a l i z a t i o n 6 山东大学博士学位论文 b a s e do nt h el o w e s sp r o g r a mw a se m p l o y e d w ed e t e r m i n e dt h el e v e l so fg e n e e x p r e s s i o nb a s e do nt h es t a t i s t i c a lm e t h o ds t u d e n t st - t e s ti nc o m b i n a t i o nw i t ha2 - f o l d c u t o f f g e n e sw h o s er a t i oc h a n g e d 2 - f o l dw i t i lp 2 f o l d ) i nw i l dt y p ea n db a i l ：, d e l e t i o nm u t a n ta f t e rs a l tt r e a t m e n t 6 m o l ln a c i 4 5 r a i n ) 7 1 山东大学博士学位论文 t a b l e3 - 6c o n t i n u e d o r fg e a e d e s c r i p t i o n f o l dt i t a n i c 。 w t + - - n a c i b d f l a + - n a c l 山东大学博士学位论文 t a b l e3 - 6c o n t i n u e d o r f g 饥e d e s c r i p t i o n f o l dc t 试n g e 8 w t + - n a c i b 4 q5 + 一n a c i y g r 0 9 4 w v a s l v a l y l - t r n as y n t h e t a s e ( 线粒体缬氦酰一1 r n a 合成酶基 0 7 00 4 7 因) y g r l 0 3 w n o p 7 l r g 砌8 9 c c r h l y h r 2 1 5 wp h o l2 y m 5 3 w y l l n l w 玎l 1 2 3 ws b 懂l n r 0 3 cl y s l h 乙0 2 6 w 戳q r 2 y j l l 5 撕 j 强0 4 8 w l 强1 0 4 c j i i ；= 【，d d 船承d ，蛳 y 碌砸9 2 c y j l l 5 2 w c y c j s o d j ( m p ， n u d e o l a rp r o t e i nr e v o l v e di nr r n ap r o c e s s i n ga n d6 0 s n i b o s o m a ls u b t m i tb i o g e n e s i s ( 参与r r n a 加工和6 0 s 核 糖体合成的核蛋白) f a m i l yo f p u l a t i v e 曾y c o s i d a s e sm i g h te x e r tac o m m o nr o l e i nc e l lw a l lo 唱a n i z a t i o n ( 细胞壁合成相关糖苷酶) e n o l a s ei ( 2 - 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d i p h o s p h a mr e 血i c t a s e 。s m a l ls u b u n i t ( 核苷 二磷酸还原酶小亚基) p r o t e i nr e q u i r e df o ri t e n 觚c eo fe x a c tp l o i d y ( 染色体 倍数稳定性相关蛋白) h y p o t h e d c a lp r o t e i n ( 功能未知基因) c v t o c h m m e - ci s o f o r ml ( 细胞色素c ) c u , z ns u p e m x i d ed i 锄血睇( 铜锌超氧化物歧化酶) f - a c t i nc a p p i n gl m o t c i na l p h as u b u i l i tr 纤维型肌动蛋白加 帽蛋白a 亚基) g e 鹏r a la l 血i l oa c i dl l l l c a s e ( 氨基酸通透酶) n u c l e o l a r , s e r i n e - r i c hp r o t e i nw i t har o l ei np r e r i b o s o m e a s s e m b l yo rt r a n s p o r t ( 富台丝氮酸蛋白，在前核糖体颗 粒组装和运输中发挥作用) o 2 7 6 2 6 o 7 3 o 5 8 0 6 2 1 0 7 o 2 8 1 5 7 5 7 2 1 7 7 o 8 2 o 8 9 2 5 8 1 上o o 6 9