（药物分析学专业论文）纤溶菌固态发酵条件优化及酶的分离纯化研究.pdf

一j “ e，量冒；c ￥ j|1 ，r；， 河北大学 学位论文独创性声明 f f i f f 删 y 1 7 9 8 4 8 8 ” 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河北大学或其他教 育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名： 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月日解密后适用本授权声明。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方格内打“ ) 保护知识产权声明 本人为申请河北大学学位所提交的题目为( 的学位论文，是我个人在导师() 指导并与导师合作下取得的研究成果， 研究工作及取得的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费 资助下完成的。本人完全了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定 的各项法律、行政法规以及河北大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大 学的书面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内 容。如果违反本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人： 作者签名： 导师签名： 摘要 摘要 血管栓塞性疾病是临床上死亡率较高的疾病之一，研发安全、高效的溶血栓药物一 直是医药科技行业关注的热点。医学中溶栓疗法是这类疾病主要的治疗方法，目前上市 的溶栓药物或多或少都存在一些不足，研发新型的溶血栓药物迫在眉睫。 本课题利用单因素实验和正交分析的方法，比较系统的优化了纤溶菌固态发酵条 件，并对产出的纤溶酶进行了初步的分离纯化： l 、h l l 芽孢杆菌产纤溶酶的最适固态发酵条件是：面粉：大豆( 质量比) = l ：8 ，培养 基加水量最适值0 7 5 m l g 物料，培养基就用初始p h ；优化培养条件为：接种量2 m l 1 0 0 9 物料，通气量为l s g 2 5 0 m l 三角瓶，n a c l0 2 m g k g ，c a c l 20 1m g k g ，m g c l 20 3m g k g ， 培养时间为6 0 h ，温度3 7 。采用优化条件培养，纤溶酶产量平均达6 8 4 2 6 尿激酶单位 恒物料o 2 、纤溶酶的纯化可以采取7 0 饱和度的硫酸铵分级盐析，超滤脱盐工作压力为 o 11 m p a 。经过硫酸铵分级盐析、超滤脱盐、s e p h a d e xg 1 0 0 柱层析、冷冻干燥后，得 到冻干酶粉的比活力为6 3 9 9u m g ，活性回收率7 4 3 5 。 关键词纤溶酶酶活性固态发酵条件优化纯化 a b s t r a c t 霉ii l a b s t r a c t t h r o m b u si sak i n do fd i s e a s ew h i c hl e a d st ot i pt o pd e a t hr a t ei nc l i n i cf o r t h em o m e n t s c i e n t i s t so fm e d i c i n ea r ea l w a y sp a y i n ga t t e n t i o nt os e a r c h i n go fd e l i q u e s c e n tt h r o m b u s m e d i c a m e n ti nt h ew o r l d a n dp e o p l eh a v eb e e nd e v e l o p i n gt h en o v e lm e d i c i n et ot h i sd a y f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fh l lw e r eo p t i m i z e dt h r o u g hs i n g l ef a c t o rt e s ta n do r t h o g o n a l d e s i g ns t u d y 1 t h ec o n c l u s i o nw a sa sf o l l o w s ：c , o l l l m o nf l o u ra n ds o y b e a n1 ：8 ，a d d i t i v ew a t e r0 7 5 m l p e rg r a mm a t e r i e la n di n i t i a lp hn a t u r e ，2 m l l o o m go fi n o e u l u mo f6 0 h ，t e m p e r a t u r e3 7 c ， c u l t u r em e d i u mt h i c k n e s sls g 2 s 0 m l ，n a c l0 2 m g k g ，m g c l 20 3m g k g ，c a c l 2o 1 m g k g ， t e m p e r a t u r e3 7 c ，p hn a t u r a l ，f e r m e n t a t i o np , 翻o d6 0 h ，i nt h e s ec o n d i t i o n st h es t r a i na v e r a g e e n z y m ea c t i v i t yi s5 8 0 5 2u r o k i n a s eu n i t s 2 t h ee n z y m ew a sp u r i f i e dw i t hu l t r af i l t r a t i o nc o n c e n t r a t i o na n da m m o n i u ms u l f a t e f r a c t i o n a t i o n p u r i f i c a t i o nw i t h7 0 a m m o n i u ms u l f a t ea n d0 11m p a p r e s s u r eu l t r af i l t r a t i o n t h ea c t i v i t yr e c o v e r yi s7 4 3 5 k e y w o r d sf i b r i n o l y t i ce n z y m ee r l z y m ea c t i v i t y c o n d i t i o n s p u r i f i e d 目录 目录 第l 章前言l 1 1血栓性疾病概述l 1 1 1 血栓形成机理1 1 1 2 现有溶栓药物的研制过程和特点”4 1 2 溶栓药物的的发展前景f 2 1 2 2 】6 1 3 纤溶活性的测定方法【2 3 】7 1 3 1纤维蛋白平板法“7 1 3 2 四肽底物法【2 6 l 7 1 3 3c l t 法【2 7 】7 1 3 4 血清纤维平板法【2 8 】7 1 3 5 e l i s a 法7 1 4 本课题研究的内容及目的和意义8 1 4 1 本课题研究的主要内容”8 1 4 2 本课题研究的目的和意义”8 第2 章纤溶菌菌株( h l i ) 固态发酵条件的优化9 2 1 材料9 2 1 1h l l 菌株( 药物分析实验室提供) 9 2 1 2 主要培养基”9 2 1 3 主要试剂9 2 1 4 主要仪器9 2 1 5 主要原材料1 0 2 2 研究方法“lo 2 2 1 纤溶活性测定方法1 0 2 2 2 p h 的测定使用酸度计1 0 2 2 3固态发酵条件的优化1o 2 3 结果与分析1 l i i i 目录 2 3 1 纤溶酶活性标准曲线见图2 1 1 1 2 3 2 固态发酵条件的优化l l 2 3 3 讨论18 第3 章纤溶酶的分离纯化研究1 9 3 1 材料1 9 3 1 1采用的材料及试剂19 3 1 2 主要仪器l9 3 2 研究方法2 0 3 2 1 酶的浸提、分级盐析2 0 3 2 2 超滤脱盐2 0 3 2 3 s e p h a d e xg 10 0 柱层析分离2 0 3 2 4 蛋白质浓度的测定采用l o w r y 法。2 l 3 2 5 p h 的测定p h 计2 l 3 3 结果与讨论2 l 3 3 1 分级盐析曲线2 l 3 3 2 超滤脱盐2 2 3 3 3 s e p h a d e xg 一1 0 0 柱层析分离结果2 2 3 3 4 干燥2 2 3 3 5 讨论2 3 第4 章结论一2 4 参考文献。2 5 封e 谢2 7 i v 第1 章前言 第1 章前言 1 1 血栓性疾病概述 心脑血管疾病对于人类健康的危害日趋严重，尤其是急性心肌梗死( a c u t e m y o c a r d i a li n f a r c t i o n ) a m i ) 【l 】等血栓性疾病由于其本身的性质更是极大地危害了人类 的健康，手术复杂，并发症高，医疗成本高居不下等问题导致了很高的致死率和致残率。 在中国，随着改革开放的深入，经济飞速发展，人民的生活水平逐步提高，膳食结构发 生了改变，再加上我国人口老龄化的问题日益严重，血栓性疾病已经成为威胁人类生命 最大的因素【2 】。研制新型的抗血栓药物，摸清这类药物的药理和人体的药代作用，药量 和药效的关系等课题成为了相关专家的热门课题。 1 1 1 血栓形成机理 相关的医学研究已探明，一般血栓形成主要与以下因素有关：血流速度变化、血小 板数量变化、血管壁变化、血液凝固状态变化、血液流变学变化。这些归根结底都涉及 人体血液循环的两个系统：凝血系统和溶栓系统【”】。 凝血系统和溶栓系统是人体血液中的两个作用完全相反的反应过程，但在健康人的 血液系统中，两者相互制衡，保持着动态的平衡。 凝血系统包含血小板以及纤维蛋白原，凝血酶原等多种凝血因子。 当身体受到外部创伤时，凝血系统发挥作用，血管壁内会形成血小板血栓或者血小 板堵塞物，暴露出内皮下的结缔组织和基底膜，血管壁收缩，血流速变慢利于止血；血 小板聚集、粘附，产生聚集和释放反应，同时释放多种凝血因子，启动内源性凝血系统 和外源性凝血系统，激活凝血酶原转化为凝血酶，促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，血 小板释放血小板第三因子和血小板第四因子，促进凝结，纤维蛋白进而发生交联，形成 交联纤维蛋白多聚体，及时止血，修复伤口( 整个过程如图1 1 ) 。 河北大学医学硕士学位论文 暴 下 织 人体创伤 ；出内皮 l 结缔组 i 基底膜 1r 图1 - 1 血栓成冈图 f i g 1 1s k e t c hm a po f t h r o m b u ss h a p ep r o c e u 溶血栓系统包含纤溶酶原，纤溶酶原活化素，纤溶抑制物，纤溶酶等。当血管中堆 积脂肪造成堵塞时，溶栓系统发挥作用，能够及时疏通，保证人体血液循环的正常进行。 2 第l 章前言 正常的人体血液循环系统中，纤维蛋白原和纤维蛋白保持着一定的动态平衡，可以 有效的及时保证止血，避免内出血症状的发生。血液中纤溶因子主要以纤溶酶原的形式 存在，在某些特定的条件下，由于纤溶酶原被激活了一部分，产生有效作用后，血液中 残留的纤溶酶就会很快被血浆中的抗纤溶酶所中和，只要纤溶酶原的激活量不是太大， 血液中产生的纤溶作用一般不会导致纤维蛋白及纤维蛋白原溶解。但是当血栓形成以 后，一部分纤维酶原就有可能渗入血栓凝块内部，被凝块内的纤溶酶原活化素及凝血酶 激活成为纤溶酶，导致纤溶酶局部堆积，存在于血浆中的抗纤溶酶由于无法进入凝块内 部，就不能及时将产生的纤溶酶灭活，这样在纤溶酶作用下血栓就会分解。 图1 2 所示的就是血栓溶解的过程。 但是，当人体出现反常情况，打破了凝血系统和溶栓系统的这种动态平衡时，凝血 系统和溶栓系统任何一方活动力超强，都会使人体有病态的反应出现。或者有可能出现 凝血作用亢进和溶栓作用降低从而导致血栓的形成，或者则有可能出现相反的情况，人 体就会表现出内出血的症状。 3 河北大学医学硕十学位论文 纤维蛋白原 降解 r i 纤维蛋白原降解物( f d p ) 纤维蛋白 降解 r i 纤维蛋自降解物( f 刚l 图1 2 血栓中纤维蛋白溶解图示 f i g 1 - 2 s k e t c hm a p o ff i b r i nd i s s o l v ei nt h r o m b u s 1 1 2 现有溶栓药物的研制过程和特点 目前，全球关于溶栓药物的发展相对于同等地位的其他方面的研究起步较晚，进展 较慢，但是，随着血栓性疾病人数的日益增多，对人类健康造成的危害日渐严重，尽快 找到更加有效的抗栓治疗方法已经成为重中之重【5 】。在中国，对于心、脑血管的血栓性 疾病的治疗思路一般是如下三种：提供抗血小板药物，抗凝血治疗，溶解血栓治疗。而 其中，溶栓治疗的效果较为突出，及时给予溶栓药物可以有效的降低血栓性疾病对于人 体脏器损害的范围和程度，提高病人康复的可能性。 4 第1 章前言 在最近的临床研究中，人类已经逐步研制出一些高效的特异性的溶栓药物，再结合 其他安全有效的治疗方法形成体系的综合溶栓疗法，或对于血栓性疾病的治疗和康复这 一世界性的难题的攻克有着重大的作用。 在溶栓药物的制备研究过程中，国内有关文献对芽孢杆菌液体发酵产纤溶酶有一 些报道，董明盛f 6 】通过筛选出的产纤溶酶的芽孢杆菌，优化发酵条件进行培养，得到的 酶活力结果平均为5 8 3 u m l ；彭勇在四川大学筛选出一株高产的解淀粉芽孢杆菌，优 化条件后培养所得到的发酵液酶的活力是8 5 0u m l ；齐海萍在2 0 0 4 年 7 1 从豆豉中筛选 到一株枯草芽孢杆菌，经过基因诱变，优化培养基和培养条件后，纤溶酶的产量很高， 测定得到纤溶酶的活力值为8 3 0u ，m l 。 在有关酶的分离提纯的研究过程中，李立刚8 】采用了离心过滤，超滤脱盐，离子交 换层析等方法对纳豆枯草杆菌( h l 9 8 6 ) 发酵液中纳豆激酶进行了提取纯化，用c a c l 2 和 n a 2 c 0 3 对发酵液进行前处理，制得了纯度较高的酶蛋白，回收率为6 1 7 ；张淑梅【9 】利 用的是柱层析的方法，用d e a e c e l l u l o s d e 5 2 和s c p h c d a x 6 1 0 0 两个柱对所得的酶进行 分离纯化，取得了较好的实验结果；李炳锦【1 0 j 也采用的是柱层析的方法，利用 b u t y l t o y o p e a r l 柱层析法，对于纳豆粗提物中的纳豆激酶进行了分离纯化，得到的结果 比较令人满意：郝淑凤【1 1 】通用的是色谱柱法和电泳法，其色谱柱为s c r i n es e p h a r o s e 2 b 和s c p h a c r y ls - 2 0 0 ；慕娟1 2 】利用凝胶过滤法，其采用的凝胶为s e p h a d e x g 1 5 0 ，得到的 结果比较理想。 在目前的试验和生产中，我们获取溶栓酶的主要途径就是通过微生物的发酵，而人 体和动物体也是获取溶栓酶的途径之- - 1 3 】，最近的研究中，人们从许多种微生物中筛选 出了能够高产纤溶酶的菌株，其中包含放线菌( a c t i n o m y c e st h e r m o v u l g a r i s ) 、芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss p ) 、镰孢菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ) 和青霉菌( p e n i c i l l u mc h r y s o g e n u m ) 等【1 4 1 7 】 o 最近的医药学研究中，人们逐步归纳出两类溶栓剂的作用机理，纤溶酶原激活剂将 人体内的纤溶酶原激活，生成活性的纤溶酶，后者作用于血浆中的血栓骨架纤维蛋白， 从而溶解血栓以链激酶( s k ) ，葡激酶( s a k ) 为代表，此外，还存在着另一类纤溶酶类 物质，可以直接作用于血浆中的纤维蛋白，使纤维蛋白降解，达到溶解血栓的目的。如 蚯蚓纤溶酶( 1 u m b r o k i n a s e ) 【1 8 l 、蛇毒纤溶酶【1 9 1 。 在溶栓药物的研究过程中，大致经历了以下几个阶段，每个阶段的溶栓药物都各有 气 河北r 人学医学硕十学位论文 其优缺点，有不同的代表性的药物，也分别具有不同程度的溶栓疗效： 最初的溶栓药物由于发展刚刚起步，虽然具有较强的溶栓作用，但是对于人体的纤 维蛋白原没有一定的特异性，在临床应用中常常诱发病人严重的出血反应，形成血液的 高纤溶状态，同时，该类药物的半衰期短，临床应用具有很大的缺点，这一时期的溶栓 药物以尿激酶( u r o k i n a s e ，u k ) 和链激酶( s t r e p t o k i n s e ，s k ) 为代表。 接下来的溶栓药物较之前具有了一定的改进，对于人体的纤维蛋白原产生了一定的 特异性，溶栓作用的效果比较满意，但是半衰期的问题没有彻底解决，纳豆激酶( n k ) 是这一类溶栓药物较为典型的代表。 目前的溶栓药物是人类总结了前阶段溶栓药物的特点，扬长避短，彻底解决了药物 在人体内的半衰期短的问题，在临床中，可以对于病人一次性给药，提高了药物血浆中 血栓的纤维蛋白的亲和力，有效降低了纤溶性出血的症状和血管的再闭塞现象，发展成 较好的溶栓药物，该类溶栓药物的代表是茴香酰纤溶酶原链激酶复合物( a p s a c ) ，这个 药物于美国f d a 一九九零年批准用于临床，该药品极大地增强了溶栓选择性，半衰期 能够达到了1 0 2 分钟，方便了临床的使用，而且在临床应用中大大的降低了血管的平均 再闭塞率【删，同时，病人对这类药品的过敏反应也 | 导到了有效的降低，综合上述特点， 这类溶栓药物已经逐步成为现代溶栓疗法中最为重要的选择，该类药物的研发前景极为 广阔。 1 2 溶栓药物的的发展前景【2 i ，2 2 】 进入2 0 世纪以来，世界经济逐渐复苏，亚洲和中国经济的崛起，整个人类的生活 水平都有了很大的提高，膳食结构有了很大的改变，同时经济发展的负面反应也逐渐体 现出来，环境问题日渐突出，人们的生活节奏加快，压力逐渐增大，从而导致了血栓性 疾病的肆虐，而且由于血栓性疾病的高致残率和致死率，对人类的健康产生了极大的危 害。在血栓药物的研究发展过程中，生产成本，剂型安全，高效是重中之重。在目前相 关工业化生产中，只有蚯蚓溶纤酶、蝮蛇抗栓酶等少量溶栓成分能够研制成临床药品， 大部分实验室发现的溶纤因子还不能生成药品投入到临床使用，因此这类药品的溶栓机 理，量效关系，在人体内的药代动力学研究非常必要，生产中改善提纯工艺，增大产量， 降低成本等问题也急需解决。 6 第1 章前言 1 3 纤溶活性的测定方法【2 3 】 目前常用的纤溶活性的测定方法可大致归纳为如下5 种： 1 3 1 纤维蛋白平板法 该方法由a s t r u p 2 4 】最早使用，而后d 。0 朗，2 习对这个方法进行了进一步的改进，最 早主要应用于n k 活性的测定，但是这个方法的准确性太差，因为它的原理是用溶圈面 积来表示酶的活性，具有很大的误差。 1 3 2 四肽底物；去【2 6 】 该方法主要用于n k 的活性测定，这是因为n k 的催化中心和结合中心同枯草杆菌 蛋白酶e ( s u b t i l i s i n e ) 极为相似，二者的同源性接近于1 0 0 。 1 3 3c l t 法【2 7 】 c l t 法是通过测定溶解纤维蛋白的时间来测定n k 的酶的活力值，这种方法的特点 是测定时间短，方法简单迅速，测定的分辨率很高，范围较广，常用于粗酶的活性测定， 但是在测定过程中，由于操作中灵敏度逐步提高，溶解时间何时开始，何时终止，这个 时间不好判定，因此需要较好的精确地计时装置。 1 3 4 血清纤维平板法【2 8 】 血清纤维平板法是根据血清中纤维的吸光度的差异来表达纤溶酶的活性： ( 1 ) 纤维最初形成时，在6 5 5 n m 处的吸光度最大。 ( 2 ) 加入n k ，溶解血浆纤维，导致吸光度有所下降。 ( 3 ) 最终测定二者之间的线性关系。 这个方法中，制作人工血栓很关键，反应初始，应将小孔中血栓的吸光度保持在0 2 l 以上。 1 3 5e l i s a 法 即酶联免疫吸附法，此方法是近年来比较常用的方法，它的灵敏度和特异性都很高， 它是由传统的平板法演化改进而来【2 9 1 ，同时，该方法有机的结合了圆二色性谱等其他方 法，对于深入探索n k 的具体结构有很大的辅助作用。但是，这个方法操作成本非常高， 而且操作比较复杂，要求严格，不能大规模推广。 7 河北大学医学硕+ 学位论文 1 4 本课题研究的内容及目的和意义 1 4 1 本课题研究的主要内容 目前我国对于纤溶菌的培养多集中在液态发酵领域，液态发酵在工业生产中体现出 一定的缺点，开始有部分专家将眼光转到固态发酵的研究上来，但是文献中对于纤溶菌 固态发酵培养条件的研究依旧是风毛麟角。本课题采用改进的筛选方法，筛选分离出高 产高活性纤溶酶的优势菌株，测定其体外纤溶活性利用纤维蛋白平板法，优化了固态发 酵的条件，调整了培养基的成分，最终确立了系列最适固态发酵条件，测得了产出发酵 液酶活力，对制备所得粗酶进行了初步的分离纯化。 1 4 2 本课题研究的目的和意义 血栓塞性疾病导致了入口的高死亡率，医学药学专家都在致力于攻克这一难关，积 极寻求高效，安全的溶血栓药物。微生物的发酵产生纤溶酶是工业化生产纤溶酶类药物 的主要途径，微生物在这方面具有不可替代的优点，可以方便的控制生长条件，生产周 期极短，产量很高，生产成本易于控制。目前人类对于工业发酵认识较深，发酵工业的 技术日臻成熟，发酵产物提取工艺也日趋完善。本课题确定了最适固态发酵条件，确定 了培养基的成分，进一步研究了发酵过程中各个因素的变化，为高安全性口服型溶栓酶 的工业化生产提供了理论依据。 同时，研究表明，纤溶酶在人体内发挥溶栓作用时，基本不水解血液中血浆纤维蛋 白，所以不容易引起纤溶性出血 3 0 , 3 1 l ，对人类健康安全有利，研发工作实用性强，将对 血栓患者的康复起到积极作用。 第2 章纤溶菌菌株( h l l ) 同态发酵条件的优化 第2 章纤溶菌菌株( h l l ) 固态发酵条件的优化 1 9 4 0 年以来，随着抗生素的逐步兴起，标志着微生物发酵工业进入崭新的阶段。 发酵对于人类极为重要，是生物技术产业化的基础，工业化研究中，发酵条件优化是极 为重要的研究课题。至今，发酵工业在产品更新、设备更新和技术应用上都有了突飞猛 进的提高1 3 2 。如何优化发酵过程，改善发酵条件，发酵过程中如何处理涉及到微生物 生理学的一些影响因素，研究各个因素之间的关系和变化等问题逐步凸现出来。 2 1材料 2 1 1h l l 菌株( 药物分析实验室提供) 2 1 2 主要培养基 ( 1 ) 斜面培养基制作：利用葡萄糖3 0 9 ，加酵母膏2 0 9 ，加琼脂2 0 9 ，然后用l o 豆汁 配制，p h 取其自然。( 1 0 豆汁制作步骤：称取黄豆1 0 0 9 ，用1 0 0 0 m l 水浸泡2 4 小时， 文火煮沸3 0 r a i n ，而后取汁定容到1 0 0 0 m e ) ( 2 ) 发酵培养基的制作：把大豆用水浸泡2 4 小时后，捣碎去掉皮，把它与面粉原料按 照比例混匀，加水量定为0 7 5 1 0 0 m l g 物料，p h 值取其自然。 ( 3 ) 活化种子培养液的制作：培养液中各种组分的比例定为n a 2 h p 0 40 1 ，葡萄 糖l ，m g s 0 4 0 0 5 ，蛋白胨l ，n a h 2 p 0 4o 1 ，p h 调整7 o 7 2 。 2 1 3 主要试剂 尿激酶( 5 0 万国际单位支1 2 5 9 ) ( 丽宝生物化学制药有限公司) 纤维蛋白原、凝血酶( s i g m a 公司产品) 酪蛋白、琼脂糖( 购自中国药品生物制品检定所 2 1 4 主要仪器 镀铬游标卡尺( 江西工具厂) 低速离心机( 北京离心机厂) l r h 1 5 0 b 生化培养箱( 广东医疗器械厂) p h s 一3 c 数字酸度计( 北京市光学精密仪器厂) m a 2 4 0 d 型电子天平( 上海第二天平仪器厂) 9 河北大学医学硕十学位论文 光学显微镜( 奥林巴斯c h 2 ) 7 2 4 可见分光光度仪( 上海市光学仪器制造公司) 2 1 5 主要原材料 黄豆，面粉 ( 市售) 无机盐离子：c a 2 + ( c a c l 2 ) 、n a + ( n a c l ) 、m 9 2 + ( m gc 1 2 ) ( 分析纯，保定试剂公司) 。 2 2 研究方法 2 2 1 纤溶活性测定方法 2 2 1 1 标准酶活力测定【3 3 】 取不同单位的标准尿激酶( 2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0 ，1 2 0 ，1 4 0 ，1 6 0i u m l ) 各1 0 u l ， 在新配置的纤维蛋白平板上点样，放置1 0 m i n ，置入3 7 ( 2 恒温培养箱，1 6 小时后取出 测定生成的溶圈直径，计算出各个溶圈面积。以以标准酶活力为横坐标，溶圈面积为纵 坐标，作图，图中可计算出尿激酶活力单位与溶圈面积关系公式，从而得到样品相当于 尿激酶的酶活力。 2 2 1 2 样品酶活力测定 前文实验中，固体发酵产生的纤溶酶没有标准品，用2 2 1 1 所述方法称取待测样品 l u l ，点样在新配置纤维蛋白平板上，3 7 保温1 6 小时后测定溶圈直径，计算溶圈面 积，折算成尿激酶单位，由此得到样品酶的活力。 2 2 2 p h 的测定使用酸度计 2 2 3固态发酵条件的优化 先进行6 个单因素实验【3 4 1 ，确定各单因素水平，正交实验确定最适发酵条件。 1 0 第2 章纤溶菌菌株( h l l ) 固态发酵条件的优化 2 3 结果与分析 2 3 1纤溶酶活性标准曲线见图2 1 3 5 3 o 2 5 知 墓” 瓣1 o o 5 o o o2 0 0 艮0 璺相：恐。1 6 0 ”o 图2 - 2 尿激酶标准纤溶圈图 尿激酶活力单佃u ，m l ”、”叫r h 凹 图2 - 1 纤溶酶活性标准曲线 f i g 2 - 2s t a n d a r e df n b r i n o l y t i cf i g u r eo fu k f i g 2 - 1s t a n d a r e dc u r v eo ff i r b r i n o l y t i ce n z y m e 由图2 1 可得到：溶圈面积与尿激酶活力( i u m l ) 的关系式为 y = 4 5 1 4 7 x ( r = o 9 8 1 7 ) 其中x ：溶圈的面积( c m 2 ) ，y ：尿激酶活力( i u m l ) ，r ：准确率。 根据此公式可计算出样品相当的尿激酶单位，即酶活力。 2 3 2 固态发酵条件的优化 2 3 2 1 单因素水平实验结果 ( 1 ) 碳源和氮源的确定 氮源和碳源可提供细胞代谢所需的能量，用于构成细胞的组分，碳源形成代谢产物 的骨架。在制备生产中，碳源和氮源的消耗都非常大，所以工业化生产中，选取适宜的 碳源和氮源首先要考虑到成本问题。 发酵生产制备蛋白酶的过程中，选取代谢缓慢的碳源有利于蛋白酶的生产，如果选 取蔗糖、葡萄糖这些代谢迅速的碳源，实际生产过程中可能对于生产蛋白酶有阻遏作用 【3 8 1 。本课题采取面粉作为碳源，一方面提高纤溶酶的产量，又可降低生产成本，面粉不 仅含有微生物生长所必需的碳水化合物，还含有丰富的维生素和金属离子，其中的生物 素和b 族维生素以及钙、镁、铁、锌等离子微生物生长中不可或缺的重要因子。 ( 2 ) 确定适宜物料比例 工业生产中，确定适宜的碳源和氮源的比例对于最终目的产物的获得至关重要。若 河北大学医学硕士学位论文 氮源不足，菌体生长就会缓慢；如果氮源过多，则菌体生长过于旺盛，不利于代谢产物 积累；如果碳源不足，则容易引起菌体自溶和衰老。碳源和氮源的适合的配比不仅影响 菌体的生长，目的产物的获得，对于微生物的代谢途径影响也很大。 3 0 0 蒸 p 3 i 2 鞋 1 0 0 c i 1 30 2 j1 4 0 08 0 0 面粉t 大豆 图2 3 不同物料比对纤溶酶产量影响 f i g 2 3e f f e c to f t e m p e r a t u r e0 1 1a 毗咖cm o d u c t i o no f t h em a t e r i a le x t r a c t a n t 在本课题中，我们采用调整面粉与大豆质量比的方法来调节固态发酵培养基中碳氮 源的适合配比。操作中，选用不同的面粉与大豆质量比( e p 面粉：大豆质量比为l ：8 ，l ：4 ，l ：l ， 4 ：l 和8 ：1 ) 的培养基进行固态发酵。发酵时间定为6 0 小时，发酵中接种量为2 m l 1 0 0 9 物料，p h 自然，培养基加水量定为l m l g 物料，发酵结果见图2 - 3 ，当面粉：大豆( 、湘 为l ：8 时，纤溶酶产量达到最高值4 0 5 8 u g 。由此我们以下的实验均采用面粉：大豆的质 量比为1 ：8 。 1 2 第2 章纤溶菌菌株( h l l ) 固态发酵条件的优化 ( 3 ) 培养基初始p h 值对于纤溶酶产量的影响 试验中，我们取不同初始p h 的发酵培养基进行固态发酵，其它条件同上，( 用酸碱 调节水的p h ，再用其来调节培养基的水分) 。发酵结果参考图2 4 ，以面粉和大豆为原 料进行固态发酵，产生纤溶酶的最适宜初始p h 为5 0 ，而在操作中我们发现，大豆面粉 固态发酵培养基的自然p h 就在5 0 - 5 3 范围内，所以不必调整培养基p h 值。 5 0 0 3 54 04 55 05 56 0 培养基初始p h 图2 _ 4 培养基初始p h 对纤溶酶产量的影响 f i g 2 4e f f e c to fi n i t i a lp ho nf n b r i n o l y t i ce 1 1 z y m ep r o d u c t i o n ( 4 ) 温度对纤溶菌产酶的影响 发酵过程中温度的控制非常关键，微生物代谢产生的热量不易快速散出，一般细菌 最适生长温度为3 2 3 7 ，为了保持酶的最高活性，特别是产酶的过程中，温度不易过 高。试验中，我们选择不同温度梯度( 3 2 、3 5 。c 、3 7 、4 0 。c 、4 2 ) ，lm l g 物料的 培养基加水量，其它条件如同上述，比较不同发酵温度对纤溶酶产量的影响。图2 5 是 我们的培养结果，可知：温度过低，生长缓慢，发酵周期延长；而超过一定的温度时， 生长速度快，发酵周期缩短，但酶的活性明显下降。从图中我们的结论是最适发酵培养 温度是3 7 。 1 3 0 0 0 0 0 o 0 0 4 3 2 1 龚s6，n)稠鞋址 河北大学医学硕士学位论文 3 23 43 63 84 04 2 培养温度( ) 图2 - 5 温度对菌株产酶的影响 f i g 2 - 5e f f e c to ft e m p e r a t u r eo i le n z y m ep r o d u c t i o no fs t r a i n ( 5 ) 培养基加水量对纤溶酶产量的影响 研究表明，多数细菌正常生长所需水活度范围在0 7 5 0 9 5 之间，营养物质只有溶于 水才能被菌体吸收，分泌，渗透，排泄等菌体的生理活动都要以水为媒介，水还要直接 参加微生物代谢中的众多反应。因此，培养基加水量成为影响微生物对营养物质利用及 代谢产物生成的极其重要的因素，加水量直接关系到微生物生长状态及发酵过程中的氧 气供应，从而直接影响产酶量。 蒸 p 丁 咖| 翟 图2 - 6 培养基加水量对纤溶酶产量的影响 f i g 2 - 6e f f e c to ft e m p e r a t u r eo he n z y m ep r o d u c t i o no fa d d i t i v ew a t e r 操作中，我们配制物料不同加水量( m l g 物料) ( o 5 0 ，0 7 5 ，1 0 0 ，1 2 5 ，1 5 0 ，2 0 0 ) 的培养基，p h 自然，其它条件同上，培养后观察加水量对纤溶酶产量的影响。 图2 - 6 中，我们可以看到，在大豆面粉发酵培养基中，当加水量为0 7 5 m l g 时，发 酵所得到的产物的量最多，试验中我们发现，当加水量过小时，菌体没有可以充足利用 1 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 5 4 3 2 1 开霉6，n)嘲髓k 第2 章纤溶菌菌株( h l l ) 固态发酵条件的优化 的水分子导致产酶量低；若加水量过高，则不利于通风，菌体生长没有充足的氧气供应， 菌体也不利于生长，培养结果显示每克物料加入0 7 5 m l 水时产酶量达到最大值。 ( 6 ) 发酵时间的影响 在发酵时间对纤溶酶产量的影响试验中，我们首先确定采用浅盘固态发酵，3 7 1 2 恒 温培养，加水量设定为0 7 5 m l g 物料，其它条件同上所述，培养过程中，每隔1 0 h 取 样，测得产酶曲线。 由图2 7 可知，菌体在6 0 小时时产酶量达到最高值；7 0 小时酶活有所下降：超过 8 0 小时后，我们得到的发酵浸提液经测定，酶的活性下降剧烈，操作中我们发现在发酵 6 0 小时后，培养基中产生的纤溶酶堆积，而这些堆积的纤溶酶又被菌体生长所利用，所 以酶活下降剧烈，所以我们把发酵时间定为6 0 小时。 ，、 蒸 芎 咖2 0 0 鞋 z u4 uo u5 u 发酵时间，h 图2 7 发酵时间对纤溶酶产量的影响 f i g 2 - 7e f f e c to ft e m p e r a t u r eo n 既l z y m cp r o d u c t i o no ft i m e 2 3 2 2 利用正交实验确定最适发酵条件 ( 1 ) 接种量和通气量 本课题中，我们用培养基的厚度来量化通气量这个指标，工业生产中，固态发酵需 要配合适宜的发酵周期，首先要选择适宜的接种量，而恰当的通风量既可以带走发酵过 程中产生的热量，同时还能满足微生物代谢中对于氧气的需求【3 5 1 。 在以上的单因素发酵试验过程中，我们发现，接种量和通气量极大影响着h l l 菌 株时纤溶酶的产量，接种量和通气量二者之间也存在着交互作用，在本课题中，我们利 用正交试验来确定适宜的通气量和接种量。 1 5 河北大学医学硕士学位论文 如表2 1 即h l l 菌株正交实验设计。 表2 - 1h l i 菌株正交实验因素表 t a b 2 lo r t h o g o n a le x p e r i m e n t a lf a c t o ro f r i l ls t r a i n 水平 a ：培养基厚度( g ，2 5 0 m l 三角瓶)b 接种量b ( m l 1 0 0 9 物料) l1 0 2 2 1 84 32 5 8 表2 - 2 菌株正交实验结果 t a b l e l 2 - 2r e s u l to f o r t h o g o n a lt e s to f s 拓a m 序号 a ：培养基厚度 接种量b ( m l 1 0 0 9 物料) a * b 产酶量( u g 物料) 【酸墨娅l 三塑趣1 11 0 2 l3 6 7 9 21 0 42 4 2 6 8 31 0 8 34 7 9 4 4 1 8 235 8 0 5 51 8 414 0 0 1 6 1 882 4 3 5 8 72 52 21 6 8 5 82 54 33 3 3 2 92 5 8l 9 8 6 k l 4 2 8 3 5 73 6 9 3 0 0 3 7 9 31 0 k 2 4 7 2 1 4 33 8 6 7 0 0 3 6 8 6 3 3 k 31 9 6 7 6 8 3 4 1 2 6 73 4 9 3 3 3 r2 7 5 3 7 6 4 5 4 3 3 2 9 9 7 7 注： k l 、l 辽、k 3 分别表示实验结果的极差分析数据，r 表示实验的极差值 由表2 2 可知，r 1 r 2 ，这表明通气量对纤溶酶的产量影响最大，表中最优的产酶 条件为a 2 b l ，即通气量为1 8 9 2 5 0 m l ，接种量是2 m l 1 0 0 9 物料，所得到的产酶量达 5 8 0 5u g 物料。 ( 2 ) 金属离子对h l l 菌株产酶影响 本课题中我们首先确定了三种金属离子：钠离子，钙离子和镁离子，利用前文所述 的优化好的培养基，添加定量n a c l 、c a c l 2 和m g c l 2 1 6 第2 章纤溶菌菌株( h l i ) 固态发酵条件的优化 如表2 3 为l 9 ( 3 ) 4 正交实验设计 表2 - 3h l i 菌株正交实验因素表 t a b 2 3o r t h o g o n a le x p e r i m e n t a lf a c t o ro f r i l ls t r a i n 表2 4 菌株正交实验结果 t a b l e 2 - 4r e s u l to fo r t h o g o n a lt e s to fs t r a i n lo 10 1o 13 9 5 2 20 1o 20 24 1 9 6 30 10 30 34 5 5 3 4 0 20 10 25 9 0 5 5o 20 2o 36 0 9 9 6o 20 30 16 5 4 6 70 3o 10 33 9 9 4 8 0 30 2o 14 9 9 3 90 30 30 22 9 6 6 k l4 1 6 7 0 04 6 2 6 0 05 1 3 0 3 3 l ( 2 6 1 8 0 1 0 5 0 2 6 0 04 3 2 2 0 0 硒3 9 4 9 6 74 6 5 4 6 74 8 4 4 3 3 r2 2 3 0 3 34 1 0 0 08 0 8 3 3 注： k i 、k 2 、k 3 分别表示实验结果的极差分析数据，r 表示实验的极差值 表2 4 是我们得到的实验结果，n a c lr 值为2 2 3 0 3 3 ，对酶产量影响最大，其浓度 为0 2 ( m g k g ) 时，产酶量以及酶活力达到最高值，往后依次是m g c l 2 和c a c l 2 ，图中可 以看n - a 2 8 3 c 1 组合产酶活力最高，向优化好的培养基中添加n a c l0 2 m g k g ，c a