（植物学专业论文）拟南芥vhac基因启动子的结构与功能研究.pdf

摘要 液泡h - a t p a s e 是一类特殊的膜结合转运蛋白，广泛分布于植物的液泡膜等内膜 系统上。在逆境环境中，液泡i f - a t p a s e 可通过自身调节使植物获得适应环境变化的 有关特性。液泡h + - a t p a s ec 亚基是膜的v 。部分的主要组件，以六聚体的形式构成了 质子连动途径，对植物的发育及环境变化较为敏感，有证据表明其在植物抗逆中具有 重要功能，但有关其机制尚不清楚。研究v _ a t p a s ec 亚基基因启动子对于阐明v h a c 基因功能、明确液泡t f - a t p a s e 在植物抗非生物胁迫中的作用机理以及开发利用新型 植物启动子具有重要的理论意义和实践价值。 本文从生物信息角度比较分析r 拟南芥液泡 r - a t p a s ec 亚基5 个同源基因启动 子，结合液泡h + - a t p a s e 的生理功能，探讨了其可能的表达、调控机制。并以v m c 3 为例，在克隆v m c 3 基因启动子3 不同长度片段和指导g u s 基因在拟南芥中表达的 基础上，研究了v i a c 3 基因启动子的表达特性及理化调节。 结果如下： lv 姒一c 基因启动子存在很多顺式元件，包括热激、干旱、伤害、光和激素响应元 件。这些特异的顺式元件是造成不同亚型v h a c 基因在不同环境及不同组织中的 表达水平存在差异的重要原因，也是植物适应逆境环境的主要机制之。 2 对不同长度的v h a - c 3 基因启动子指导的g u s 基因在拟南芥中的表达特性表明： a c 3 起始密码子a t g 上游7 7 2 b p 的序列内存在着v h a c 3 基因的基本启动子元 件。 3v h a c 3 基因启动子可指导g u s 基因在烟草和拟南芥体内的瞬时性和稳定表达，可 做为植物基因工程的重要调控元件。 4 v i a c 3 基因的a t g 上游2 2 3 4 b p 一1 4 9 6 b p 之间存在正调控的顺式元件，这些正调控 顺式元件可抵消下游v m c 3 基因a t 6 上游1 4 9 6 b p 一7 7 2 b p 的负调控作用。 关键词：拟南芥、液泡h + _ a t p a s e 、v h a c 基因、启动子、基因表达调控 s t u d yo ns t r u c t u r ea n df u n c t i o no fv i - - i a - cg e n ep r o m o t e r so f a b s t r a a t v a c u o l eh 一a t p a s ei sas p e c i a lm e m b r a n e b o u n dt r a n s p o r tp r o t e i nl o c a t e do nt h e t o n o p l a s ta n dv a r i o u si n n e rm e m b r a n e s u n d e rs t r e s sc o n d i t i o n s v _ a t p a s ec a na d a p tt o v a r i o u se n v i r o n m e n t sb ya u t o r e g u l a t i o n v - j 蛆t a s es u b u n i tci sam a j o rc o m p o n e n to f t h e m e m b r a n o u sv 0s e c t o ra n df o r m st h ep r o t o nc o n d u c t a n c ep a t h w a yt h r o u g hh e x a m e r , a n d s e n s i t i v et op l a n t d e v e l o p m e n ta n de n v i r o n m e n t a lc h a n g e s t h e r ea r ee v i d e n c e st h a t v j t p a s es u b u n i tci s n e c e s s a r yd u r i n g r e s i s t a n tr e s p o n s e s b u ti t s r e g u l a t i o na n d e x p r e s s i o nm e c h a n i s ma r es t i l lu n c l e a r s t u d yo fv - a t p a s es u b u n i tcg e n ei ss i g n i f i c a n tt o c l a r i f yv h a - cg e n e s 、f u n c t i o n , u n c o v e rv _ a t p a s e 、sa c t i o nm e c h a n i s md u r i n ga b i o t i c s t r e s s e sr e s i s t a n c ea n dd e v e l o pn e wu s e f u lp l a n tp r o m o t e r s t ou n d e r s t a n d 扩觇4 一cg e n e se x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o nm e c h a n i s m w ec o m p a r e d a n da n a l y z e dt h e i rs e q u e n c eb yb i o i n f o r m a t i c sa p p r o a c hu s i n g a c 3a sas a m p l e w e c l o n e dd i f f e r e n tl e n g t hf r a g m e n t so f a c 3p r o m o t e ra n df u s e di t s3 、t e r m i n u sw i t h1 3 - g l u c u r o n i d a s e ( g u s ) r e p o r t e rg e n e u s i n gt h i ss y s t e m ，w ec h e c k e dt h e 枷v i t ya n dt h e r e g u l a t i o no f v h a - c 3g e n ep r o m o t e r o u rr e s u l t ss h o w e dm a t ： 1 v h a cg e n ep r o m o t e rc o n t a i n sm a n yc i s d e m e n t s ，i n c l u d i n gh e a ts h o c k ，d r o u g h t ， w o u n d i n g ，l i g h ta n dp l a n th o r m o n e sr e s p o n s i v ee l e m e n t s t h e s ep e c u l i a rc i s e l e m e n t s a r e v e r yi m p o r t a n t f o rv h a - c g e n e s d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n u n d e rv a r i o u s e n v i r o n m e n t sa n di t se x p r e s s i o nl e v e l si nv a r i o u st i s s u e s ，a n dt h e ya r ea l s oo n eo ft h e i m p o r t a n tm e c h a n i s m sf o rt h ep l a n tt oa d a p tt os t r e s s 2 t h ee s s e n t i a le l e m e n tf o rt h eb a s a la c t i v i t yo fv h a c 3i sl o c a t e dw i t h i nt h e 一7 2 2 b p f r a g m e n t su p s t r e a mo f t h et r a n s l a t i o ns t a r tc o d o no f v h a c 3 3 b e c a u s ev h acg e n ep r o m o t e rc a nd i r e c tg u sg e n e 、st r a n s i e n ta n dp e r m a n e n t e x p r e s s i o n ，t h ep r o m o t e rc a l lb e a ni m p o r t a n tr e g u l a t i o ne l e m e n ti n p l a n tg e n e e n g i n e e r i n g 4 t h eu p s t r e a m 一2 2 3 4 b pt o 一1 4 9 6 b pf r a g m e n tv h a - c 3g e n e sp r o m o t e rh a su p r e g u l a t e d c i s e l e m e n t s ，w h i c hc a no f f s e tt h ed o w nr e g u l a t i o ne f f e c tt h a ti sc o n d u c t e db yi t s d o w n s t r e a ms e q u e n c eb e t w e e n - 1 4 9 6 b p t o - 7 7 2 b p k e yw o r d ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；v a c u o l eh + - a t p a s e ：v n h - cg e n e s ；p r o m o t e r ；g e n e e x p r e s s i o nr e g u l a t i o n d ir e c t e db y a p p fi c a n tf o r p r o f w a n gr u i g a n g p r o f s h a oj i n w a n g k s t e rd e g r e e ：dia n gs h u y u a n ( b o t a n y ) ( c o l l e g eo f a g r o n o m y , i n n e rm o n g o l i a a g r k u l t u l a lu n i v e r s i t y h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c h i n a ) a b a a c 0 1 a c l l a d h l a r s k l a l p 5 r c 3 c a m c a m v d c c d e d t a g u s a g e n t g u s k a n l b u - p m a s m e s m j 4 m u g m s n o s o c s p a t a t i n p c r r u b p 3 5 s s d s s i l w e t7 7 t a 2 9 缩略词 a b s c i s i ca c i d 脱落酸 番茄果实特异性启动子 水稻肌动蛋白1 ( a c u n l ) 乙醇脱氢酶基因启动子 编码一种渗透诱导蛋白的基因 拟南芥脯氨酸合成过程中的一种还原酶的基因 碳同化的一种途径，光合的最初产物是三碳化合物 c r a s s u l a c e a na c i dm e t a b o l i s m 景天酸代谢途径 c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s 花椰菜花叶病毒 ，v7 n7 一d i c y c l o h e x u l c a r b o d i i m i d e 二环己碳二亚胺 e t h y i e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 中分离出来的，目前有一些基因盒可以允许在g u s a 基因的附近插入启动子区，产生转录融台基因或翻译融合基因 g e n t a m y c i ns u l f a t e 庆大霉素 b g l u c u m n i d a s eb 一葡萄糖苷酸酶 k a n a m y c i ns u l f a t e 硫酸卡那霉素 l u r i a b e r t a n i 微生物用培养基 甘蓝型油菜脂类转移蛋白 甘露氨酸合成酶基因 2 一( n 吗啉) 一乙基磺酸 m e t h y u a s m o n a t e 茉莉酸甲酯 4 - m e t h y l u m b e l l i f e r y l b d g l u c u r o n i d e4 一甲基伞形酮酰一b d 葡萄 糖醛酸苷 m a r a s h i g ea n ds k o o g 植物组织培养基 胭脂碱合成酶基因 章鱼碱合成酶基因 马铃薯块茎启动子 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 r i b u l o s e1 。5 - b i p h o s p h a t ec a r b o x y c a s e1 5 - 磷酸核铜糖羧化酶 花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基硫酸钠 一种商品名 花药绒毡层特异性启动子 t _ d n a x - g l u c u b i 3 # 忑p a s e v h p p c t r a n s f e r r e dd n a 转化d n a 5 - b r o m o 4 c h l o r o 一3 1 n d o l y l - b d - g l u c u r o n i ca c i dc y c l o h e x y l am m o n i u ms a l t 5 - 溴- 4 一氯- 3 - 吲哚b d 半乳糖酸 泛素核糖体蛋白融合基因 v a c u o l a rh * - a t p 液泡h + - a t p 酶 拟南芥液泡h + - a t p 酶c 亚基基因 内蒙古农业大学硕士学位论文 l 1引言： 植物生物反应器是基因工程的研究热点之一，由于其具有安全、可靠、廉价、 实用等特点，目前已广泛用于食品、医药、工业原料以及环保物质等领域。但植物 生物反应器中外源基因的表达水平较低、转基因沉默、转基因生物安全性等诸多问 题，大大的限制了植物生物反应器的利用。启动子作为重要的转录调节因子是利用 植物表达外源蛋白所不可缺少的，选择适当的启动子和对启动子结构的改造、融合 等是提高外源蛋白表达水平和增加可调控性的主要手段之一【1 2 1 。 1 1 植物启动子 目前广泛使用的植物启动子包括花椰菜花叶病毒3 5 s ( c a u l i f l o w e rm o s a i c v i r u s ，c a m v ) 启动子、玉米u b i q u i t i n 启动子、水稻a c t i n l ( a c t l ) 启动子，以及 来自植物叶绿素a b 结合蛋白、r u b p 羧化酶小亚基、玉米热激蛋白、大豆热激蛋白 等的基因启动子，同时还包括微生物来源的根癌农杆菌t i 质粒的胭脂碱合成酶基因 ( n o s ) 启动子、章鱼碱合成酶基因( 0 c s ) 启动子【3 1 1 4 1 。这些启动子的利用大大地 推进了植物基因工程的发展，然而，这些启动子都存在一定的局限性，如表达水 平、可调控性、组织或器官特异性等，同时，能够用于植物基因工程的启动子数量 还是极为有限，因此筛选植物源、高表达、具有组织器官特异性或特定调控性的植 物启动子是当前植物基因工程研究与利用中急需解决的技术问题。 1 1 1 植物启动子的类型 按作用方式及功能，将启动子分为三类，即组成型启动子、组织器官特异型启 动子和诱导型启动子口1 。 目前在植物表达载体中广泛使用的是组成型启动子，它可以在所有组织中启动 目的基因的表达，具有持续性和非时空特异性，r n a 和蛋白质的表达水平也相对恒 定。c a l n 3 5 s 启动子是应用最广泛的典型的组成型植物启动子，实践证明，它以强 组成性表达于植物的各个部位和整个生育期。 组织器官特异型启动子常常使基因的表达发生在某些特定的组织或器官，其表 达受发育调节。如笋瓜p p 2 基因启动子即为典型的组织器官特异型启动子，它可以 驱动外源基因在异源植物韧皮部及分生组织中的特异性表达【5 1 。 对于诱导型植物启动子来说，又可以分为三种不同的类型：a 型启动子：可 被植物体内合成的某些产物( 包括脱落酸、生长素等) 所诱导。如马铃薯p i n 2 启动 子构建的嵌合体，在转基因水稻中经m j 或a b a 处理后，其g u s 酶活性及m r n a 水平 都大幅度提高，表现出了强烈的诱导表达活性【6 】。b 型启动子：可被高温、低温、 水淹等环境因子所诱导。例如大豆的g m h s p l 7 3 - b 热诱导启动子 _ ”。c 型启动 子：能够对人工合成的化学诱导物做出反应的启动子，如四环素诱导表达系统、类 2 拟南芥、h a _ c 基因启动于的结构与功能研究 固醇诱导表达系统等碎1 。在某些情况下，一种类型的启动子同时兼有其它类型启动 子的特性嘲。 1 1 2 植物启动子的结构及其应用 1 1 2 1 植物启动子的结构 真核生物启动子中已鉴定的特定的启动子序列常常位于5 、端起始密码子a t g 上 游一2 0 b p 一2 2 0 b p 区域内【3 】。植物启动子区域存在各种特征元件，通过同r n a 聚合酶 i i 的识别、结合，从而诱导转录的发生。 高等植物中转录起始位点上游一2 0 b p 一3 0 b p 处存在一个t a t a 框( h o g n e s s b o x ) 启动子元件，大约在_ 8 0 一2 2 0 b p 处存在上游启动子元件( u p s t r e a m e l e m e n t s ) 【3 】。t a t a 框是第一个被确定的可被r n a 聚合酶i i 识别的启动子元件，也 是一些反式作用因子与d n a 相互作用的位点之一。也有一些植物启动子不存在t a t a 框或明显的t a t a 框结构，这些不含t a t a 框的基因的精确转录是受起始因子 ( i n i t i a t o ri n r ) 介导的p l 。上游启动子元件( u p s t r e a me l e m e n t s ) 又分为一般上 游元件( g e n e r a lu p s t r e a me l e m e n t s ) 和特有上游元件( p r o m o t e r s p e c i f i c u p s t r e a me l e m e n t s ) 。一般上游元件在真核基因启动子中普遍存在，对基因转录具 有激活作用，如c a a t 、g c 等。特有上游元件是不同来源的启动子特有的特异调节序 列，如热激蛋白框、愈伤反应框等p l 【”】。 1 1 2 2 植物启动子的应用 随着植物基因工程的发展，用于植物基因工程的调控元件( 启动子) 不断地被 发现，目前常应用于植物基因工程的启动子元件主要是来源于细菌的根癌农杆菌t i 质粒t _ d n a 区域的胭脂碱合成酶基因( n o s ) 启动子、章鱼碱合成酶基因( o c s ) 启 动子 3 】，来自病毒的花椰菜花叶病毒3 5 s ( c a u l i f l o w e rm o s - a i cv i r u s ，c a m v ) 启动 子，来自植物的叶绿素a b 结合蛋白、r u b p 羧化酶小亚基、玉米热激蛋白、大豆热 激蛋白、玉米醇脱氢酶、查尔酮合成酶和来自果蝇的热激蛋白h s p 7 0 等【4 】。 c a m v3 5 s 启动子广泛用于双子叶植物转基因中，它是起始于转录起始点一 9 4 1 b p + 2 0 8 b p 的b g li i 片段，同时在一4 6 b p 一1 0 5 b p 区段存在一个增强子序列，该 启动子包括t a t a 盒、c a a t 盒、倒转重复序列和增强子核心序列四个部分【3 】。人们对 c a f f v3 5 s 启动子进了许多修饰和改进，以提高外源基因的表达水平。然而，在烟草 和番茄中，重复c a m v3 5 s 上游区域( 3 5 s 增强子) 未能提高g u s a 基因的表达，与 3 5 s 启动子相比，由甘露氨酸合成酶基因( m a s ) 启动子的一个区域与c a m v3 5 s 启 动子的增强子区域融合的m a c 融合启动子，能够启动g u s 的高表达，在叶中提高3 5 倍，根和下胚轴提高1 0 一1 5 倍口”。 生产中，常常需要外源基因的诱导表达。比如说，一些外源基因产物，可能影 响植物的生长发育，而利用诱导启动子控制外源基因的时空特异性表达可减少表达 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 产物对植物的不良影响。许多植物诱导启动子可用于诱导表达载体中，其中包括由 损伤或病原体攻击诱导的基因启动子、厌氧诱导的乙醇脱氢酶基因启动子 ( a d h l ) 、光诱导基因启动子和植物生长调节剂诱导的基因启动子等【l ”。a i n l e y 和 k e y 报道了一个严谨型诱导启动子，他们将大豆热休克蛋白基因( g m h s p l 7 5 e ) 启 动子与g u s 编码区融合，构建了个热诱导表达框。在瞬时表达系统中，与 c a m v 3 5 s - g u s 结构相比，热休克启动子_ g u s 结构提高表达8 0 斜”】。 1 1 3 生境因子及理化因素对启动子的表达调节 在环境条件及物理化学因素的刺激下，启动子可以大幅度地改变基因的转录水 平，这类启动子具有增强子、沉默子或类似功能的序列结构，并且这些感受特异性 诱导的序列都具有明显的专一性p 】。甘蓝型油菜脂类转移蛋白( l t p ) 启动子在光诱 导下，可在转基因拟南芥的侧根、花药、柱头和维管组织中表达【l ”。泛素核糖体蛋 白融合基因u b i 3 马铃薯p i n 2 基因启动子可受创伤诱导【l ”。此外，目前已成功地构 建了四环素诱导表达系统、类固醇诱导系统和地塞米松诱导与四环素抑制系统【l 6 】 等。同时得到了一些具有诱导活性的植物来源的启动元件【l ”。 1 1 4 启动子的筛选及其重要性 在转基因植物的研究中，利用具有特异性表达特性的启动子，可以将目的基因 集中于某一时间或目的组织中表达，还可减少非目标组织表达的能量浪费，实现基 因的高表达，也可以培育高效、安全的转基因作物。事实上不可能也没有必要使植 物体所有器官和组织都具有抗性。盐胁迫下，部分器官和组织高效响应就足以维持 一个相对稳定的组织内低盐环境，因此用转基因方法培育抗性品种的关键问题就是基 因表达的特异性，这就需要特定的调控序列，即启动子。 a r s k i 是编码一种渗透诱导蛋白的基因，将它的启动子与报告基因融合，报告基 因只在拟南芥的根中表达【l 御。a t p 5 r 是拟南芥脯氨酸合成过程中的一种还原酶的基 因，把a t p 5 r 的启动子与报告基因融合后，发现在渗透势有变化的组织中报告基因表 达较强i i ”。另外花药绒毡层特异性启动子t a 2 9 、马铃薯块茎启动子p a t a t i n 、番茄 果实特异性启动子a c o i 、香蕉果实特异性启动子等郾】，也都属于组织特异性启动 子。 然而，目前能应用于植物基因工程的启动子还非常有限，而且大多存在某些局 限性。如3 5 s 启动子，尽管已成功指导多种外源基因在不同转基因植物中表达，但 对单子叶植物并不高效口1 】。【2 ”，而且不具有调控性及明显的组织发育特异性，因而不 利于我们对外源基因时空性表达的人为调节。由此可见，高效特异性植物启动子的 筛选是目前急需要解决的问题。 4 拟南芥v h a c 基因启动子的结构与功能研究 1 1 5 植物h * - a i p 酶的分类及其表达调控 r _ a t p a s e 又称为a t p 驱动泵，它位于各种生物膜卜，在植物生理的许多过程 中起重要作用，又称为植物细胞的主宰酶( m a s t e re n z y m e ) 2 4 】。根据蛋白的组成、 转运等特点，a t p 泵可分为五种类型：p 型，一种阳离子泵，定位于质膜中。f 型，此泵由多亚基的f 。和f o 两大部分组成，在线粒体膜、叶绿体膜及细菌质膜上均 发现了结构和功能上相似的f 型泵。v 型，这种泵为质子泵，位于液泡膜上，其 形态结构与f 型的相似，但蛋白组成方面有所差异，并且在环境适应中的一系列复 杂变化中要比f 型的灵敏和显著1 2 5 。2 ”。a 型，这是细菌质膜中一种特异的阳离子 泵。a b c 家族，目前已发现该家族至少有1 0 0 个以上的成员，每个成员都具有高 度保守的a t p 结合盒。这五种类型的a t p 驱动泵中p 、f 、v 和a 型只转运离子和质 子，而a b c 家族除了转运离子外还转运小分子物质【2 ”。 a t p a s e 在生物体中广泛存在，目前关于h - a t p a s e 已有大量的研究，各种a t p 酶对离子、质子及小分子物质的跨膜转运、细胞的生命活动都有重要意义。p 型a t p 驱动泵可维持胃室内的酸性环境：f 型a t p 驱动泵建立了质子梯度，驱动营养物质 进入厌氧菌内；v 型a t p 使溶酶体形成酸性的环境，当溶酶体与吞噬泡等融合后， 酸性水解酶便可分解多种物质；a 型a t p 驱动泵可将细菌内含氧阴离子排出；a b c 家 族可使胞内毒素排出田】。 在烟草天蛾幼虫杯状细胞项膜v - a t p a s e 的b 亚基基因中发现了不同于看家基因 的特征，该基因的结构与已知的编码诱导性或组织特异性蛋白的基因上游区有共同 特征，表明v - a t p a s e 基因的表达可能存在转录水平的调控【2 8 】。在从单核细胞到巨噬 细胞的分化期间，由于广泛的溶酶体系统的发育需要相应数量的v _ a t p 酶，致使v a t p 酶的数量增加，从而促使了巨噬细胞消化病原体，v _ a t p 酶数量的增加也表明 v - a t p a s e 基因存在基因表达转录水平的调控【2 9 】。以上说明，在不同情况下，根据细 胞特异性的要求，需要对v - a t p a s e 的表达进行调控。但h - a t p a s e 对环境和代谢条 件响应的表达及活性的调节的机理目前还是很不清楚。 1 2 液泡h + - _ a i p a s ec 亚基基因调控序列及其功能 1 2 1 胁迫环境下的h + a t p a s e 细胞膜是细胞对外界环境的屏障，当细胞面临环境胁迫需要进行渗透调节以维 持细胞内外渗透势平衡时，必然需要膜传递蛋白的膜运输作用【3 。h * - a t p a s e 是跨膜 运输动力的产生者，因此，近来不少研究集中于胁迫因子对细胞膜h + - a t p a s e 的影 响，以探讨细胞膜h + - a t p a s e 在胁迫条件下调节细胞过程的作用口1 】- 【”】。 耐盐和耐早植株可以在低水势的情况下通过保持细胞中的溶质分子的数量来维 持膨压口4 】_ 【3 “，溶质的转运活性依赖于由h + _ a t p a s e 质子泵建立起来的质子梯度。在 植物中，三种不同的h + - a t p a s e 产生跨膜的质子电化学梯度，p - a t p a s e 将细胞质中 的“穿过质膜泵到细胞外空间，调控胞内p h 值，并且可提供细胞生长所需要的营养 内蒙古农业大学硕士学位论文 5 物质和离子运输的动力【3 7 】。液泡 r - a t p a s e 和液泡n + - p p a s e 不仅可使液泡腔也可能 使其它细胞内分室酸化阱3 。在植物处于逆境时，液泡h + a t p a s e 可以改变结构以适 应环境的变化，从而使植物在逆境下存活3 0 1 1 3 7 1 。有试验发现冷胁迫时，液泡h + 一 a t p a s e 膜外的v 。域解离，膜内的v 。域变化不大，v - a t p a s e 是通过有选择的释放v 。 域外围的蛋白亚基部分降解全酶，从而抗拒寒害【3 9 】。 1 2 2 液泡h + - a t p a s e 的结构 液泡h - a t p a s e 是一种多亚基的寡聚酶，其分子量约为5 6 0 7 4 0 k d a ，与叶绿 体和线粒体中的f 型- a t p a s e 相似，液泡h + | - a t p a s e 也呈现“球茎”结构h “，它是 由两个结构域组成，即v 。域和v 0 域。( 如图1 ) 图1 液泡i r - a t p 酶的结构模型 4 2 】 f i g1 m o d e lo ft h ep l a n tv - a t p a s es t r u c t u r e m 2 l 6 拟南芥v h a - c 基因启动子的结构与功能研究 v 。域是一个5 7 0 k d a 的外围复合体，是突出膜外的亲水头部和柄部，为催化区 域。它由8 个亚基( a - h ) 构成，其中a 亚基和b 亚基有三个拷贝，其余的亚基为单 拷贝，a 、b 亚基参与了核苷酸的连接 4 1 l 。a 亚基是催化亚基，具有a t p 水解活性的 特点；b 亚基是调节亚基，它不仅包含调节位点也参与了催化位点的形成【4 l 】；e 亚基 是一个具有丰富带电残基的亲水性蛋白。v 。域对a t p 的水解很重要 4 1 1 1 4 2 1 。 v o 域是一个2 6 0 k d a 的完整复合体，包埋在膜内，呈柄状，属于质子传导区 域，由5 个亚基构成( a ，d ，c ，c ，c ”) ，它把液泡l _ i + - a t p a s e 与膜整合在一 起，其中c 亚基为疏水亚基，存在六个拷贝，对称排列形成v 0 的核心，它参与质子 通道的形成，该六聚体的中央存在一个通道，在液泡h _ a t p a s e 复合体中该通道被d 亚基堵塞【4 3 】。d 亚基与v 。内在蛋白部分紧密连接，既参与稳定v 。与膜的整合作用， 也参与了v 。与v 。之间的连接，是液泡 r _ a t p a s e 活性必不可少的亚基。v 。域对质子 的跨膜运输起重要作用 4 1 1 1 4 2 1 。 从小麦和牛的有网格蛋白的小泡中的液泡h + _ a t p a s e 的局部解剖学的研究中得 到了液泡h a t p a s e 的模型【”。e 亚基为液泡h + _ a t p a s e 外部的柄结构，a 亚基胞质 的n 一末端位于细胞质中，与h 亚基和a 亚基相连，它的c 一末端与质子运输过程中的 a t p 的水解有关。液泡 r _ a t p a s e 的旋转机制与f - a t p a s e 的相类似，即a t p 的水解 推动了a 3 8 3 六聚体的旋转，并带动a 亚基和外部柄亚基e 亚基，从而使c 亚基 组成的六聚体旋转，使质子达到了运输的目的m 。 1 2 3 液泡h + _ a t p a s e 的功能 液泡h + - a t p 酶位于真核细胞的液泡系统，由于其最早是在液泡中发现的所以叫 液泡( v a c u o l a r ) a t p 酶，简称v - a t p 酶【2 9 】。v a t p 酶是一种运输质子的酶，又被称 为液泡h + - a t p a s e 。由于v _ a t p 酶涉及到分子水平的生态生理的适应性，还被称为 “生态酶”1 4 ”“。它不仅分布于真核细胞的液泡膜上，而且也存在于质膜、内质 网、高尔基体、小泡等其它的分泌系统的膜上。 v _ a t p 酶利用液泡中a t p 的y 磷酸基团裂解时所释放的能量，将质子泵到液泡 腔中，产生h 电化学梯度，它可以酸化液泡，为物质运输提供能量，从而影响膨压 和细胞扩增 4 ”。液泡内的酸度变化与细胞的内吞、分泌和膜流的运行都有关。不同 生理功能所需的胞内环境酸度是不同的，溶酶体的酸度为p h 4 6 - 5 0 1 4 8 1 ，内膜体为 p h 5 0 - 6 0 4 9 】。神经递质吸收是生物能量转换和利用的典型例子，神经末梢含有丰富 的突触小泡，突触小泡依赖于v - a t p a s e 建立的质子电化学梯度驱动递质运输载体， 完成递质吸收过程1 5 ”。 此外，v - a t p a s e 在保卫细胞的信号传导及植物的整个的生长、发育中都具有很 重要的意义。甜菜块根细胞液泡膜上的a t p a s e 活性在蔗糖的吸收和积累中起着重要 作用口”，烟草叶片细胞的液泡膜上的a t p a s e 活性在吸收和积累尼古丁上也起重要的 作用口2 1 。v - a t p a s e 的缺失突变体，d e t 3 ( 即在拟南芥c 亚基的第一内含子中把t 一 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 a ，通过剪接假设破坏了这个一致性的序列，从而使c 亚基及v - a t p a s e 活性降低 5 3 】) 在黑暗中可去黄化，而且对高浓度的c a 2 + 保卫细胞的信息传导和运输失活 5 4 l ， 这说明v - a t p a s e 对植物的发育及信号传导有一定的影响。 液泡h _ a t p 酶在细胞中对维持细胞的平衡有重要作用，而且它与植物抵抗环境 胁迫也有关系【5 5 】。酵母c a 2 + 敏感突变型由于v - a t p a s e 缺陷，而不能维持细胞内c a 2 + 平 衡，从而表现型就表现为不能利用甘油、乳酸和琥珀酸等作为碳源芦5 1 。植物处于逆境 时，v - a t p a s e 可改变其结构，从而适应环境。冷胁迫下，绿豆下胚轴中发现v a t p a s e 的活性被抑制，h + 转运活性显著下降，这种抑制在体内是可逆的，而体外不 可逆【5 “。并发现体内可逆变化中酶活性的恢复依赖于能量供给，而不是蛋白质的重 新合成【57 1 。从而推测v - a t p a s e 在胁迫条件下，各亚基之间存在解离和重组的平衡 【5 引。 盐胁迫下液泡h + - a t p a s e 质子泵在翻译和转录水平上都有所调解，通过对v a t p a s e 亚基的分析发现v - a t p a s e 在盐胁迫下，其信息量增加。在烟草 ( n i t a b a c u m ) 的培养细胞中，a 亚基由于盐胁迫诱导增加了2 - 4 倍 5 9 】；冰叶日中 花( m e c t y s t a l l i n u m s ) 在盐胁迫几小时后，c 亚基立刻增加，当处理1 2 天后， a 、b 、c 亚基分别增加了2 、1 2 、和5 倍【6 。 1 3 拟南芥液泡h + - a t p a s ec 亚基基因调控序列及其应用 1 3 1 拟南芥液泡h + _ a t p a s ec 亚基基因及其表达调控 在v - a t p 酶中，c 亚基是膜的v 。部分的主要组件，以六聚体的形式构成了引导 质子的通道，形成了质子连动途径【6 1 1 【6 ”。几种植物的c 亚基基因已被克隆，根据其 氨基酸序列推测其多肽为1 6 6 1 6 7 k d a 的脂质蛋白，c 亚基是一个包含4 个跨膜 域的高度疏水蛋白，与盯的转运直接相关。在酵母c 亚基上定位在跨膜域上的 ”7 g l u 很重要，如果用其它的氨基酸( 除天冬氨酸) 替代”。7 g l u ，v - a t p a s e 活性丧 失，此氨基酸是v - a t p a s e 活性抑制剂1 ) c c n ( 二环己碳二亚胺) 的结合位点【4 1 】。 在真核生物中，c 亚基是一个多基因家族。该亚基不同种属问的同源性己超过 了6 5 ，可能是一致的最保守的质脂蛋白。目前已知拟南芥是由拥有5 个同源基因 ( v h a c l v h a c 5 ) 编码的。每个种中的v h a c 蛋白高度保守，它们不可能导致活 力的改变，不可能有特定的分类信息，因此推测不同的c 亚基基因可能在空间上有 不同的表达，或在不同发育阶段上对胁迫反应都有不同的表达，并且在体内的作用 要依赖于特异的细胞型。光下生长及黑暗生长的幼苗在v h h c l 的表达上有极大的不 同，而且根中v h a c 1 没有因光的改变而不同。与v h a c 1 相比，v h a - c 3 启动子活性 在幼苗的根及茎尖优先表达，而v h a c 1 在许多组织中有较高的表达，并且受光照和 生长调控作用陌4 】。 v - a t p a s ec 亚基对发育及环境的变化较为敏感，冰叶日中花在盐胁迫下，由于 其c 亚基在m r n a 水平上发生昼夜节律性变化，而使其光和代谢途径由c 3 型转变为 8 拟南芥、h a _ c 基因启动子的结构与功能研究 c a m 型口5 ，6 5 ，“l 。在转型前，v - a t p a s e 大量增加，c 亚基的m r n a 的转录水平和蛋白水 平均有增加眄5 ，“l 。另外，v - a t p a s ec 亚基还是细胞通讯中间隙联结的组分，也是神 经递质释放介导体的组分以及某种罕见的病毒癌基因产物的靶蛋白p 3 1 。 1 3 2 拟南芥液泡h + a t p a s ec 亚基调控序列 v - a t p a s ec 亚基编码基因及其调控序列具有较高的表达强度。盐胁迫下，冰叶 日中花v - a t p a s ec 亚基基因在叶中优先转录，拟南芥c 亚基的两种基因( v h a c 1 和 v h a c 2 ) 在各种组织中呈组成性表达 4 4 】。n a c l 胁迫诱导冰叶日中花的v - a t p a s eh + 转 运活性增加，其根和幼叶中v - a t p a s e 的c 亚基的m r n a 量比未经n a c l 处理的大约增 加2 倍，而成熟叶中只有c 亚基的m r n a 对盐产生响应而增加【6 ”。冰叶日中花的叶片 中v - a t p a s e 的c 亚基i i i r n a 呈昼夜节律性变化，在盐胁迫下变化幅度增大【“i 。 p e r e r a 等【6 1 1 对拟南芥液泡 r _ a t p 酶c 亚基是同源基因中的部分基因的研究结果证实 了光照、盐和营养胁迫等均参与了其基因表达的调节。王瑞刚【1 7 1 也在1 9 9 9 2 0 0 3 年 间，对拟南芥液泡h + - a t p 酶c 亚基部分同源基因的调控性序列进行了研究，发现其 指导的g u s 基因在转基因烟草内的表达水平与组织、器官及发育有关，而且，不同 程度地受光照、温度、n a c l 水平、p h 值、植物激素类物质、糖类物质以及矿质水平 的调控。这些结果说明，液泡h + - a t p 酶c 亚基的确在植物抗非生物胁迫中起到极为 重要的作用。因此，进一步研究液泡h + _ a t p 酶c 亚基基因在非生物胁迫下的表达调 控机制，将有助于阐明该基因在参与植物抗非生物胁迫方面的功能，为植物分子遗 传、植物基因工程，特别是植物抗非生物胁迫基因工程提供理论依据和基因源。 基于此，为了研究v h a c 3 基因表达与调控，本论文克隆了v h a c 3 基因的启动子 区域，将v h a c 3 起始密码子a t g 上游不同长度的启动子片段与g u s 基因相融合，构 建含不同长度的v h a c 3 启动子片段的g u s 表达载体，并检测了v h a - c 3 基因调控序 列指导g u s 基因表达的活性。本研究为阐明n c 基因调控序列启动子的活性及其 在基因工程中的利用提供了证据，同时也为探讨v h a c 基因调控序列在植物抗非生 物胁迫中的调控机理提供了线索，为植物抗非生物胁迫基因工程提供基因源，同时 为开发理化因子、可调控启动元件提供理论及实验依据。 2 材料与方法： 21 植物材料： 2 2 植物培养： 拟南芥( a r a b i d o p s i st h a l i a n a ) c o l u m b i a 生态型 烟草( n i c ot i a n at a b a c u m ) 革新一号 春化：4 。c t 氐温春化种子4 - 6 天； 浸土：把蛭石装入到种植盆中，用营养液( 花无缺) 完全浸 湿，一个月用花无缺饱和一次； 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 播种：把春化好的种子直接种于事先浸过营养液( 花无缺) 的蛭 石中，定期浇营养液，放于人工植物培养室内培养； 生长条件为：温度2 2 。c ，光照1 6 h 。相对湿度约6 0 ； 移栽：当种子萌发7 - 1 0 天，移栽到事先浸过营养液的蛭石中，每 盆( a9 0 8 0 ) 种四棵。 2 3 基因克隆与植物转化： 2 3 1 载体构建： 2 3 1 1用于克隆v h a - c 3 启动子的引物与模板： 根据v h a c 3 基因起始密码子的上游序列设计了用于扩增不同长度启动子片段 的正向引物，分别是： v i a c 3 一l f ：5 - a g t c c g c t c g a g t a a t t g a a t g a a a c a c t c 一3 a c 3 一2 f ：57 - a g t c c g c t c g a g c t t