（植物学专业论文）迷迭香的化学成分及抗氧化活性研究.pdf

本人同意西南林学院有权保留论文的复印件，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文；提交论文一年后，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部或部分内容。( 保密的论文在解密后应遵守此规定)洲5 2 2( 1 ) 乙醇提取迷迭香茎、叶中总黄酮的最佳工艺条件：极差优化工艺条件为：5 5 乙醇在7 5 条件下回流提取3 次，每次2 h ，料液比为1 ：1 6 ；而多元线性回归优化工艺条件为：6 5 乙醇在6 0 条件下回流提取3 次，每次3 h ，料液比为l ：1 6 。( 2 ) 化学成分分析：采用硅胶，反相材料( r p - 1 8 ) ，葡聚糖凝胶( s e p h a d e xl h - 2 0 )柱层析对迷迭香茎、叶的乙醇提取物进行分离纯化，根据物理、化学方法和波谱数据对分离所得的化合物进行结构鉴定。共分得了7 个化合物，分别为白桦酸( 1 ) ，2 a - 羟基齐墩果酸( 2 ) ，齐墩果酸一3 一。一a l _ 吡喃鼠李糖一( 1 _ 3 ) - a - d 一吡喃核糖苷( 3 ) ，2 1 a -羟基齐墩果酸一3 一o t l l 一吡喃鼠李糖一( 1 3 ) 一a d 一吡喃核糖苷( 4 ) ，迷迭香酚( 5 ) ，表迷迭香酚( 6 ) ，芫花素( 7 ) ，包括4 个三萜类，2 个二萜酚类和1 个黄酮类。( 3 ) 精油化学成分分析：采用水蒸气蒸馏和超临界c 0 2 萃取法提取迷迭香茎、叶中的精油，前者提取率为：0 2 3 ，后者为1 2 0 。并用g c - m s 联用仪对其化学成分进行分离和检测，同时用面积归一化法测定了各成分的相对百分含量。共检测出2 4 种成分( 峰面积和匹配度两个指标同时满足o 1 和9 0 ) ，其中水蒸气蒸馏法被检测的成分有1 8 个，超临界c 0 2 萃取法被检测的成分有1 9 个。两者共有成分1 3 个，从总体上来看，两种提取方法得到的精油成分基本一致。( 4 ) 抗氧化活性分析：乙酸乙酯萃取物对菜籽油和猪油的抗氧化活性均优于乙醇提取物抗氧化活性。其中：对于菜籽油：滴定法测定在添加量为0 1 0 时的抗氧化活性效果较佳；而比色法测定在添加量为o 1 4 时的抗氧化活性较好。对于猪油：无论是用滴定法还是比色法测定，在添加量为o 1 0 时的抗氧化活性效果都是较好。关键词：迷迭香，化学成分，分离纯化，抗氧化活性a b s t r a c t ：r o s e m a r y ( r o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl ) i so n eo ft h eh e r b sw h i c hb e l o n g st ot h ef a m i l yl a b i a t a e i th a sb e e na p p l i e di nm e d i c i n e s ，f o o di n d u s t r y ，c o s m e t i c sa n da r t i c l e sf o rd a i l yu s ei nr e c e n ty e a r s t h i sp a p e rs u m m a r i z e st h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t so fr o s e m a r ya n di t sp r a c t i c a lu t i l i t y f u r t h e r m o r e ，t h ep r o s p e c to fi t si m p l e m e n t a t i o ni sd i s c u s s e do nt h eb a s i so f r e v i e w i n gal a r g ea m o u n to f b o o k sa n dd o c u m e n t s t h i st h e s i se l a b o r a t e dt h es t u d i e so nt h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t sa n db i o a c t i v eo ft h es t e m sa n dl e a v e so fr o s m a r i n u so 厉c i n a l i sl u s i n gc o m p a r i s o no fe x t r a c t i o np r o c e s st h r o u g hm u l t i p l el i n e a rr e g r e s s i o na n dr a n g ea n a l y s i sw a ss t u d i e da n do p t i m a lc o n d i t i o nw a sc h o s e no ft o t a lf l a v o n o i d sw i t l la l c o h o lf r o mr o s m a r i n u so f f l c i n a l i sl ：f r o mo ft h es t e m sa n dl e a v e so fr o s m a r i n u so f l t c i n a l i sl ，t o t a l l y7c o m p o u n d sw e r ei s o l a t e db yt h ev a r i o u sc h r o m a t o g r a p h i e so v e rs i l i c ag e lc o l u m n ，r e v e r s ep h a s ec o l u m n ( r p - 1 8 ) ，s e p h a d e xl h 一2 0 ，a n di d e n t i f i e db yp h y s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o d s ，a n dm o d e r ns p e c t r a lt e c h n o l o g y ( m s ，1 d - n m r ) ：a tt h es a m et i m e ，c h e m i c a lc o n s t i t u e n t so f e x t r a c t sf r o mt h es t e m sa n dl e a v e so fr o s m a r i n u so 厉c i n a l i sl w e r es t u d i e db ys t e a md i s t i l l a t i o n ，s u p e r c r i t i c a lc 0 2e x t r a c t i o na n dc a p i l l a r yg c - m sm e t h o d ；u l t i m a t e l y ，t h es t u d i e so nt h ea l c o h o le x t r a c ta n de t h y la c e t a t ee x t r a c to ft h es t e m sa n dl e a v e so f r o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl w a sc o n d u c t e dt h ea n t i o x i d a t i v ee f f i c i e n c y ，t h r o u g hm a k i n gt h es u b s t r a t eb yt h er a p e s e e do i la n dt h el a r d i o d o m e t r yw a su s e dt om e n s u r a t et h ee f f e c to fa n t i o x i d a n t so fe t h y la l c o h o le x t r a c ta n de t h y la c e t a t ee x t r a c to fr o s m a r i n u so f f z c i n a l i sl ( 1 ) o p t i m a lc o n d i t i o nw a sc h o s e no ft o t a lf l a v o n o i d sw i t ha l c o h o lf r o mt h es t e m sa n dl e a v e so f r o s m a r i n u so 庐c i n a l i sl r e s u l ts h o w e dt h a tt h er a n g ea n a l y z e do fc o n c e n t r a t i o no fa l c o h o l5 5 ，e x t r a c t e dt e m p e r a t u r ea t7 54 c ，l i q u i dr a t i oo f1 ：16f o r2h o u r sa n dr e p e a t e d3t i m e sa n dt h em u l t i p l el i n e a rr e g r e s s i o no fc o n c e n t r a t i o no fa l c o h o l6 5 ，e x t r a c t e dt e m p e r a t u r ea t6 0 ，l i q u i dr a t i oo f1 ：16f o r3h o u r sa n dr e p e a t e d3t i m e sw e r et h eo p t i m a lt e c h n i q u ec o n d i t i o n ( 2 ) t h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n ta n a l y s i s ：t h ec r u d ee x t r a c tw e r ee x t r a c t e dw i t ha l c o h o lf r o mt h es t e m sa n dl e a v e so f r o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl w h i c hw e r ei s o l a t e da n dp u r i f i e do nr e p e a t e d l yc h r o m a t o g r a p ho v e rs i l i c ag d ，r p 一18 ，s e p h a d e xl h - 2 0c o l u m n t h e i rc h e m i c a ls t r u c t u r e sw e r ee l u c i d a t e db yp h y s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o d s ，a n ds p e c t r a ld a t a s e v e ni i ic o m p o u n d sw e r ei s o l a t e df r o mt h es t e m sa n dl e a v e so fr o s m a r i n u s0 2 弦c i n a l i sl ，a n dw e r ei d e n t i f i e da sb e t u l i n i ca c i d ( 1 ) ，2 a - h y d r o x y o l e a n o l i ea c i d ( 2 ) ，o l e a n o l i ca c i d 3o0 【一l r h a m n o p y r a n o s y l 一( 1 3 ) 吨- d r i b o p y r a n o s eg l u c o s i d e ( 3 ) ，2 a - h y d r o x y o l e a n o l i ca c i d - 3 一o a - l r h a m n o p y r a - ( 1 _ 3 ) 一a - d - r i b o p y r a n o s eg l u c o s i d e ( 4 ) ，r o s m a n o l ( 5 ) ，e p i r o s m a n o l ( 6 ) ，g e n k w a n i n ( 7 ) a m o n gt h e m ，f o u rc o m p o u n d sw e r ef o u rt r i t e r p e n o i d ，t w oc o m p o u n d sw e r ep h e n o l i cd i t e r p e n ea n do n ec o m p o u n dw a sf l a v o n o i d s ( 3 ) t h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n to f e s s e n t i a lo i l sa n a l y s i s ：t h ee s s e n t i a lo i l so f t h es t e m sa n dl e a v e so f r o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl w e r ee x t r a c t e db ys t e a md i s t i l l a t i o na n ds u p e r c r i t i e a lc 0 2e x t r a c t i o n ，t h ef o r m e re x t r a c t i o nr a t ew a s0 2 3 ，t h el a t t e rw a s1 2 0 ，a n dt h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n to fe s s e n t i a lo i l sw e r ei s o l a t e da n di d e n t i f i e db yc a p i l l a r yg c m sm e t h o d t h er e l a t i v ec o n t e n t so ft h ec h e m i c a lc o n s t i t u e n t sw e r ed e t e r m i n e db ya r e an o r m a l i z a t i o nm e t h o d 2 4c o m p o u n d s ( t h et w oi n d i c a t o r so fp e a ka r e aa n dq u a lw e r et om e e t0 1 a n d9 0s i m u l t a n e o u s l y ) w e r ei d e n t i f i e d t h ee s s e n t i a lo i l so f t h es t e m sa n dl e a v e so f r o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl a m o n gt h e m ，1 8c o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e db ys t e a md i s t i l l a t i o n ，a n d1 9c o m p o u n d sw e r ei d e n t i f i e db ys u p e r c r i t i c a lc 0 2 t h e r ea r e13c o m p o n e n t sb o t ho fe x t r a c t i o nm e t h o d s i ng e n e r a l ，t w oe x t r a c t i o nm e t h o d su s e dt oo b t a i ne s s e n t i a lo i lc o m p o n e n t sa r eb a s i c a l l yc o n s i s t e n t ( 4 ) t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t ya n a l y s i s ：t h em s u l t ss h o w e dt h a t ，t h ea n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fe t h y la c e t a t e e x t r a c tb yr a p e s e e do i la n dl a r dw e r eb e t t e rt h a nt h ee t h y la l c o h o le x t r a c t a m o n gt h e m ：o f o rr a p e s e e do i l ：a tt h ea d d i n go f o 1 0 ，t h ea n t i o x i d a t i v ee f f i c i e n c yw a sb e t t e rb yt i t r a t i o nd e t e r m i n a t i o n ；a n da tt h ea d d i n go fo 14 ，t h ea n t i o x i d a t i v ee f f i c i e n c yw a sg o o db yc o l o r i m e t r i cd e t e r m i n a t i o n 匡) f o rl a r d ：a tt h ea d d i n go f o 1 0 ，w h e t h e rt i t r a t i o nd e t e r m i n a t i o no rc o l o r i m e t r i cd e t e r m i n a t i o n ，t h ea n t i o x i d a t i v ee f f i c i e n c ya r eb o t hg o o d k e yw o r d s ：r o s m a r i n u so f f z c i n a l i sl ，c h e m i c a lc o n s t i t u e n t ，i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，a n t i o x i d a n ta c t i v i t yi vhh2 42 30 h23 02 92 42 33vh3 02 942 迷迭香黄酮类化合物提取工艺优化研究92 1 前言92 2 材料、仪器及试剂92 3 实验方法92 3 1 样品的提取92 3 2 总黄酮的测定1 02 4 结果与讨论1 02 4 1 试验结果数据处理：1 l2 4 2 计算结果及工艺优化1 53 迷迭香化学成分研究1 83 1 前言1 83 2 材料、仪器及试剂1 83 3 实验方法1 83 3 1 化学成分的提取1 83 3 2 化学成分的分离与纯化1 93 4 结构鉴定2 13 4 1 化合物1 的结构鉴定2 l1ll23333477录一一一一一一一一一一一目一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一义3 4 2 化合物2 的结构鉴定2 23 4 3 化合物3 的结构鉴定2 33 4 4 化合物4 的结构鉴定2 43 4 5 化合物5 、6 的结构鉴定2 53 4 6 化合物7 的结构鉴定2 53 5 结果与讨论2 64 迷迭香精油化学成分分析2 84 1 前言2 84 2 材料、仪器及试剂2 84 3 实验方法2 84 3 1 精油提取2 84 3 2 精油成分分析2 94 4g c - m s 联用仪分析2 94 5 结果与讨论3 35 迷迭香提取物抗氧化活性研究3 55 1 前言3 55 2 材料、仪器及试剂3 55 3 实验方法3 65 3 1 样品的提取3 65 3 2 试样的制备；3 75 3 3 抗氧化性能的测定3 75 4 结果和讨论3 85 4 1 迷迭香2 种提取物的得率3 85 4 2 滴定法中迷迭香2 种提取物对菜籽油的保护性作用3 85 4 3 比色法中迷迭香2 种提取物对菜籽油的保护性作用4 25 4 4 滴定法中迷迭香2 种提取物对猪油的保护性作用4 55 4 5 比色法中迷迭香2 种提取物对猪油的保护性作用4 86 结论与展望5 26 1 结论5 26 1 1 迷迭香黄酮类化合物提取工艺优化研究结论5 26 1 2 化学成分研究结论5 26 1 3 精油化学成分分析结论5 26 1 4 抗氧化活性研究结论5 36 2 展望5 3参考文献5 5致谢5 9附录6 0增强纤溶性等方面都有明显作用；迷迭香精油目前已广泛用于化妆品和其它日用品等。在西方国家，对迷迭香的应用很早以前就开始拉，但是国内对它的开发还只是处于起步阶段。因此，对迷迭香化学成分及其应用研究具有巨大的发展前景。1 1 迷迭香化学成分1 1 1 黄酮类对该类成分研究较早，迄今已从其茎、叶中分离、鉴定了2 9 个黄酮类化合物。b r i e s k o mc h 等【2 】从迷迭香的甲醇提取物中分离鉴定了6 一甲氧基木犀草素( 6 一m e t h o x y - 5 ，7 ，3747 一t e t r a h y - d r o x y f l a v o n e ) 、5 ，47 一二羟基一7 一甲氧基黄酮( 5 ，47 一d i h y d r o x y - 7 - m e t h o x y i j a v o n e ) b r i e s k o mc h 等 3 】从迷迭香叶水提取物的乙酸乙酯部分分得木犀草素( 1 u t e o l i n ) 、6 一甲氧基木犀草素、香叶木素( d i o s m e t i n ) 、芫花索一7 一甲醚( 7 - m e t h y le t h e rg e n k w a i l i n ) ，从其水相分得6 一甲氧基一37 ，4 一二羟基黄酮一7 - 0 一葡萄糖甙，从迷迭香叶的乙酸乙酯提取物中分得s a l v i g e n i n ；f e r r e r e sf 等【4 】用m e c c 方法分析迷迭香花蜜含有3 ，5 ，7 ，一三羟基黄酮( p i n o b a n k s i n ) 、8 一甲氧基迷迭香的化学成分及抗氧化活性研究山奈酚( 8 m e m o x y k a e i l l p f 葫0 1 ) 、槲皮索( q u e r c c t i n ) 、山柰酚体a e i i l p 矗湘1 ) 等黄酮类成分。1 1 2 萜类迄今为止，从迷迭香中分离鉴定数量最多的是萜类成分，包括单萜、倍半萜、二萜及三萜类化合物，其中以二萜类化合物最具有开发和应用价值。1 1 2 1 单萜及倍半萜类此类化合物比较复杂，但目前己分析出来的化合物都是常见的精油成分，提取方法除水蒸气蒸馏外，应用较多的尚有超临界提取，采用的分析方法主要为g c 一m s ，其精油成分和相对含量随产地不同而异【5 1 。1 1 2 2 二萜类该类成分主要为二萜酚和二萜醌类化合物，前者为抗氧化主要活性成分。目前已从其茎、叶中分离并鉴定了迷迭香酚( r o s m a n 0 1 ) 、表迷迭香酚( e p i r o s m a n 0 1 ) 、鼠尾草酚( e 锄s 0 1 ) 6 1 、7 一乙氧基迷迭香酚( 7 一e t h o x y r o s m a n 0 1 ) 1 7 1 、g g g 酸( c a m o s i ca c i d )等【8 】；二萜醌类有r o s m a r i q t t i n o n e m 9 、r o y l e a n o n e 和表丹参酿 ( c r y p t o t a n s h i n o n e ) 。另外从其根中分鉴定了落羽松二醌( t a x a d i o n e ) 、7 一口- h y d r o x y - r o y l e a n o n e 、h o r m i n o n e及表丹参酮等【l o 】。1 1 2 3 三萜、甾醇类从该植物中分得的三萜大多为三萜酸类，母核为乌索烷型、齐墩果烷型和羽扇烷型。从其茎叶中分离鉴定了桦木酸( b e t u l i n i ca c i d ) 、1 9 一口一羟基熊果酸( 1 9 一口一h y d r o x y u r s o l i ca c i d ) 、3 p 一羟基乌索烷一1 2 ，2 0 一二烯一1 7 一酸( 3 p- h y d r o x y u r s a - 1 2 ，2 0 一d i e n - 1 7 一o i c - a c i d ) 、齐墩果酸( o l e a n o l i ca c i d ) 、熊果酸( u r s o l i ca c i d )等【l l 】，g a n e v ay 等【1 2 】从保加利亚产的迷迭香石油醚提取物中分得蒲公英赛醇( t a r a x e r 0 1 ) 、羽扇豆醇( 1 u p e 0 1 ) 、i ，一蒲公英甾醇( v t a r a x a s t e r 0 1 ) 、日耳曼醇( g e r m a n i c 0 1 ) 、胆甾( c h o l e s t e r 0 1 ) 、谷甾( s i t o s t e r 0 1 ) 、3 - 0 一乙酰基齐墩果酸( 3 - o - a c e t y l o l e a n o l i ca c i d ) 、3 - 0 一乙酰基熊果酸( 3 一o - a c e t y l u r s o l i ca c i d ) 和一个新的五环三萜r o f f i c e r o n e ( 3 一o x o - 2 0 - l b - h y d r o x u r s 一1 2 一e n e ) 等。21 绪论成分，主要为迷迭香酸( r o s m a r i n i ca c i d ) 、咖啡酸a c i d ) 等t 1 3 1 。直链或支链烷烃和多种氨基酸 1 3 1 4 】。迷迭香在食品工业上常作为食品抗氧化剂和防腐剂抗氧化剂是指能阻止或延缓食品氧化，以提高食品稳定性，延长食品安全储藏期限的食品添加剂。氧化不仅使食品中的油脂变质，还会使食品发生退色，褐变和维生素被破坏，从而降低食品质量和营养价值，甚至产生有害物质，引起食物中毒，因此，为了提高油脂的稳定性，防止酸败，延长油脂安全储藏和含油率高的食品的货架期，在食用油脂和脂肪酸含量高的食品中常添加抗氧化剂。作为食品抗氧化剂应该具备以下条件：一、对于食品有优良的抗氧化效果，低浓度有效；二、使用时和分解后都无毒、无害、对食品的感官性质( 包括嗅、味、颜色等) 没有影响；三、使用中稳定性好，与食品可以共存，便于分析和检测；四、容易制取，价格适中f 1 5 1 。目前，抗氧化剂主要分为：天然抗氧化剂和人工合成抗氧化剂两类，可是在人们长期食用的食品中，人工合成抗氧化剂成分的毒性远远高于天然抗氧化剂。据美国f d a 组织的研究报告表吲h 】，目前最常用的人工合成食品抗氧化剂b h t 对人体的肝脏和肝外器官( 如：肠道粘膜、肺) 的酶有诱发作用，而且b h t 很有可能通过增加微粒体酶将消化了的食品转化为有毒物或致癌物；此外，化学合成抗氧化剂还存在着不可弥补的缺陷一在7 0 以上的热油中极易挥发失效。因此，寻找高效、安全的食品抗氧化剂已成为国际食品界的当务之急。迷迭香干叶作为食品香辛料有迷迭香的化学成分及抗氧化活性研究着悠久的历史，现代研究表明，迷迭香非挥发性成分具有明显的抗氧化作用，其主要有效成分鼠尾草酚的抗氧化活性和b h t 相当，迷迭香酚的抗氧化活性是b h t 和b h a 的5 倍【1 6 1 。迷迭香提取物及其二萜酚类成分同时具有明显的抗微生物活性，据报道，鼠尾草酚和熊果酸能抑制6 种食品中常见的细菌和酵母菌的生长，其中鼠尾草酚对微生物抑制作用远远大于b h a 和b h t ，其活性顺序为：鼠尾草酚 b h a b h t 熊果酸，鼠尾草酚酸对金黄色葡萄球菌( c a u r e u l v ) 最有效，能更好地防止食品变质【1 2 】；u e d a 等【u 】研究表明，o 5 的迷迭香乙醇提取物能抑制c b o t u l i n u m ，0 2 o 5 迷迭香乙醇提取物能抑制b r u b t i l i s 和b c , g l e a s 的生长。鼠尾草酚作为抗氧化和抗微生物添加剂已广泛用于食品和医药工业【1 2 】。日本用迷迭香的9 5 乙醇提取物制成防止香精和香料变质的添加剂，并添加于类胡萝素等天然食用色素，防止其氧化退刨1 2 】。大量的添加试验和毒理学研究表明，迷迭香食品抗氧化剂既具有很好的抗氧化作用，又具有抗微生物作用，且对人体无害，是当代公认的第三代绿色食品抗氧化剂，目前已广泛应用于鱼类、油炸食品、肉类和食用油类的长期储存，如在腊肠中添加迷迭香食品抗氧化剂，由于其抗氧化和抗菌活性，既能延长保质期，又能增加风味；在冻牛肉汉堡包中加o 3 的鲜迷选香茎叶，不但能保护其被氧化，且使其味道更加鲜美，达到改善口感的目的【1 3 】。总之，迷迭香抗氧化剂具有安全、高效、耐热、抗氧化效果好、广谱等特点。同样，迷迭香在功能食品领域中也及具开发潜质，表现在：1 消除人体内过多的自由基，保护细胞膜的结构，延缓人体衰老。2 降低胆固醇，抑制动脉粥样硬化。迷迭香提取物中的有效成分对机体的脂肪代谢产生重要作用，能够明显抑制血浆和肝脏中胆固醇含量的上升，防治动脉粥样硬化。3 减肥。迷迭香提取物刺激并加速人体的脂肪代谢，促进脂类化合物从粪便中排出，达到减肥的功效，配合大黄素等蒽醌类成分可以研制出效果很好的减肥产品。1 2 2 医药卫生1 2 2 1 抗h i v 作用迷迭香中所含的二萜酚类成分能明显地抑制h 一l 蛋白酶的活性，其i c 9 0 分别41 绪论为迷迭香酚0 , 6 0 0 p , g m l ，7 一乙氧基迷迭香酚1 7 9 9 m l ，鼠尾草酚0 0 8 p , g m l ，7 一甲氧基迷迭香酚1 5 p , g m l ，鼠尾草酸0 0 8 9 9 m l ，其中鼠尾草酸的活性最强，且对h 1 v 病毒复制有明显的抑制作用，i c 9 0 为0 3 2 斗g m l 。大量研究表明，其抗h i v 的生物活性与二萜酚的邻位酚羟基有密切关系，对该类化合物进行结构修饰，有望开发出新的抗艾滋病药物【1 6 1 。1 2 2 2 抗肿瘤作用迷迭香提取物对d m b a 和b ( a ) p 与小鼠表层d n a 的共价键形成有明显的抑制作用，对d m b a 和a ( a ) p 诱发的皮肤癌有很好的抑制作用，而且迷迭香提取物能有效地抑制由t p a 对鸟氨酸脱羧酶的激发活性和t p a 对炎症的引发作用，h o n g c x t l 7 1等通过长期和短期的动物模型研究发现，迷迭香提取物和其成分对于诱发肿瘤的生物因素有潜在抑制作用。迷迭香干叶7 0 乙醇提取物对脲酶和k b 细胞有明显的抑制活性，其二萜酚类化合物具有明显的抑制k b 细胞和尿酶作用，且无明显的细胞毒性，其对尿酶、k b 细胞的i c 9 0 分别为迷迭香酚2 3 5 9 9 m l 、7 一乙氧基迷迭香酚8 4 9 9 m l ，鼠尾草酚8 4 p , g m l ，对其成分进行研究，有望开发出新的治疗尿结石和抗癌的药物。在含有亚德里亚毒素的抗肿瘤药物中添加迷迭香含有抗氧化部分的提取物时，能增强该毒素的作用和减少它的心脏中毒，给感染的小鼠注射( 1 p ) 5 m gk g 亚德里亚毒素和注射迷迭香提取物1 0 m g k g 加5 m g k g 亚德里亚毒素的对比实验中间，比单独注射该毒素成活率高【1 刀。1 2 2 3 抗肝炎和保肝作用齐墩果酸有明显的护肝降酶作用，能明显降低转氨酶，对四氯化碳引起的大鼠急性肝损伤有明显的保护作用，能促进肝细胞的再生，防止肝硬化，临床治疗传染性急性黄疸型肝炎和慢性肝炎有显著疗效，使症状改善，降酶，降浊，改善蛋白代谢【1 8 】。1 2 2 4 抗血管方面的作用迷迭香酸能抑制大鼠血栓形成，促进纤维蛋白溶解，当剂量为5 0 m g k g 及1 0 0 m g k g 时，血栓形成的抑制率分别为4 1 9 和5 4 8 ( p 0 0 5 ) ，剂量为1 0 0 m g k g 及1 5 0 r a g k g 时，血小板的抑制率分别为3 0 4 ( p o 0 5 ) 及4 6 4 ( p o 0 1 ) ，血浆优球蛋白溶解时间缩短( p f 0 0 5 ( 3 ，3 ) = 9 2 8 ，所以从回归方程中可知：总黄酮含量( y 与乙醇浓度( a ) 、温度( b ) 、每次回流时间( c ) 和料液比( d ) 之间线性关系很显著。主要影响因素是d ，其次是a ，最后是c 。表2 1 1正交结果用多元线性回归计算处理t a b l e2 11t h em u l t i v a r i a t er e g r e s s i o no f o r t h o g o n a lr e s u l t s总黄酮含量( )实验号实验值计算值误差y9( )l5 6 95 7 71 4 126 2 86 1 8+ 1 5 936 5 56 5 2+ o 4 646 5 06 6 2- 1 8 556 1 96 2 3o 6 566 3 46 2 84 0 9 576 0 78“6 2 696 3 8633+o78注：一”同前页，矿锄表示被删去的样品号。2 。4 2 计算结果及工艺优化2 4 2 1 工艺优化根据正交设计极差计算结果：极差r 的大小显示影响因素的主次。由表l 数据与表2 结果表明，在设置水平内，以迷迭香总黄酮含量为指标，影响因素顺序为d b c a ，但r b 、r d 又较接近。以总黄酮含量直观分析，因素的最佳组合应为d 3 8 3 c 2 a 2 ，即5 5 乙醇在7 5 条件下回流提取3 次，每次2 h ，料液比为1 ：1 6 。验证试验：取2 9 迷迭香按正交设计试验直观分析总黄酮含量的优化工艺为d 3 8 3 c 2 a 2 ，以总黄酮为指标进行考察，3 次实验结果见表2 1 2 。1 5迷迭香的化学成分及抗氧化活性研究由表2 1 2 可见优化提取条件3 次实验均能达到正交试验表中结果的较高值。2 4 2 2 多元线性回归计算分析结果讨论及工艺优化：删去因素b 及误差点后，回归方程线性显著，因此可根据回归方程进行结果解释和工艺优化，d 因素是主要影响因素，与极差计算结果吻合，表明迷迭香在提取过程中组织内的浓度与外周溶液的浓度差异越大，扩散推动力越大，越有利于有效成分的溶出，当内外浓度达到平衡时，扩散停止，有效成分不再溶出。而提取温度在4 5 , 7 5 c 间的变化对指标影响较小。综合考虑且结合生产实际，固定b = 6 0 * c ，确定迷迭香提取的优化条件为d 3 a 3 c 3 8 2 ，即提取温度为6 0 c ，6 5 的乙醇回流提取3 次，每次3 h ，料液比为1 ：1 6 ，代入回归方程。验证实验：取2 9 迷迭香，按多元回归方程优化条件进行验证，提取液按前述含量测定方法测定总黄酮含量，并与回归方程预测值比较，3 次实验结果及预测值见表2 1 3 。表2 1 3 优化的验证试验( n = 3 )t a b l e2 13e x p e r i m e n t a lv e r i f i c a t i o no fo p t i m i z a t i o n ( n = 3 1试验结果显示：迷迭香总黄酮含量3 次实验值均高于正交设计预测值，表明a y回归方程能描述本提取工艺系统，优化是成功的。总之，极差优化工艺条件为5 5 乙醇在7 5 c 条件下回流提取3 次，每次2 h ，料液比为1 ：1 6 ；而多元线性回归优化工艺条件为6 5 乙醇在6 0 c 条件下回流提取3次，每次3 h ，料液比为1 ：1 6 。1 62 迷迭香黄酮类化合物提取工艺优化研究验数据处理结果显示出采用极差分析有如下不足：极差计算只依赖于指标判断实验点的误差大小，此外在进行工艺优化时只能从正交设计表中找出实验条件作为优化条件，未必是真正的优化条件。但若采用多元线性回归弥补正交极差计算的不足。而回归方程既能明确每个因素对指标的影响，实验点的实验误差。因而，更有利于结果解释和工艺条件的优化，较之单分析更为明显、可靠。总之，通过对黄酮类化合物提取工艺的优化，可以类化合物的最佳提取条件，进而对迷迭香抗氧化剂有效成分含量的提高提础。1 7迷迭香的化学成分及抗氧化活性研究3 迷迭香化学成分研究3 1 前言对于迷迭香的研究，国内外有大量报道和专利，其成分主要为二萜酚类、黄酮类、三萜类等。本文主要是对迷迭香茎叶中的化学成分进行提取分离，纯化和结构鉴定。研究方法为采用硅胶，r p 一1 8 ，s e p h a d e xl h 一2 0 柱层析对迷迭香茎叶中的乙醇提取物进行分离纯化，根据化学方法和波谱数据( e s 蹦s ，n m r ) 对分离所得化合物进行结构鉴定。3 2 材料、仪器及试剂材料：样品采自云南，并经西南林学院资源学院植物学教研室鉴定为迷迭香( r o s m a r i n u so f f i c i n a l i sl ) 。柱层析用硅胶( 1 0 0 - 2 0 0 目，2 0 0 , - - , 3 0 0 目，3 0 0 - 4 0 0目) 或硅胶h ( 1 0 4 0 m ) 及薄层层析板( g f 2 5 4 ) 均为青岛海洋化工厂生产。r p 1 8 ，s e p h a d e xl h 一2 0 为p h a r m a c i a 公司产品。仪器：水浴锅( 上海医疗器械五厂) ，电子天平( 北京赛多利斯天平有限公司) ，冷凝回流装置，旋转蒸发仪( r e - 5 2 ，上海安亭电子仪器厂) ，核磁共振谱用b r u k e ra m - 4 0 0 或d r x 5 0 0 型核磁共振仪测定，t m s 为内标物；质谱e s i - m s 用v ga u t os p e c - 3 0 0 0 型质谱仪测定。试剂：石油醚，氯仿，丙酮，乙酸乙酯，正丁醇，乙醇，甲醇，均为分析纯；显色剂为：碘蒸气，5 硫酸的乙醇溶液。3 3 实验方法3 3 1 化学成分的提取迷迭香茎叶( 8 k g ) ，粉碎后经9 5 的乙醇回流提取三次，过滤，回收乙醇，将浓缩的浸膏( 4 1 8 9 ) 悬浮于1 7 l 水中，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，回3 迷迭香化学成分研究收溶剂，得石油醚部分j ( 7 4 9 ) ，乙酸乙酯部分( 1 1 8 9 ) ，正丁醇部分( 7 5 9 ) 以及水溶部分，取乙酸乙酯部分( 1 0 0 9 ) 经多次硅胶柱层析，s e p h a d e xl h 一2 0 凝胶层析，i 冲一1 8 反相柱层析后得到化合物9 个。流程图如3 1 ：迷迭香茎，叶( 8 k g )9 5 乙醇回流提取31次，减压浓缩得浸膏i r水悬浮，并用石油醚、乙酸乙酯、止j 醇萃取土，上石油醚f r 。乙酸乙酯f r 。( 1 1 8 9 )正丁醇f r 。土分别多次柱层析分离上各种单一化合物上鉴定分子结构图3 1 迷迭香分离流程图f i g u r e3 1t h ei s o l a t i o nf l o wc h a to f r o s m a r i n u so 萨c i n a l i sl 3 3 2 化学成分的分离与纯化取乙酸乙酯部分( 1 0 0 9 ) ，选用正相硅胶( 1 0 0 , - 、, 2 0 0 目) 进行粗分，通过t l c 分析选择石油醚：丙酮( 9 ：1 - 7 ：3 ) 梯度洗脱和甲醇洗脱，检测后富集相同部分后，将乙酸乙酯部分分成了5 个小部分，即为：f r l 、f r 2 、f r 3 、f r 4 、f r 5 ，再分别采用不同的分离纯化方法对各个部分进行细分。1 9迷迭香的化学成分及抗氧化活性研究3 3 2 1f r l 部分的分离纯化将f r l 部分用硅胶柱层析分离，用石油醚：丙酮( 9 ：1 ) 洗脱，每5 0 r a l 一个流分，富集相似部分，得到两个部分，第一部分主要为黄绿色油状物质，极性较小且量较少没有进一步分离，第二部分点样检测所含的杂质较少，色素比较浓，进一步分离。采用石油醚：乙酸乙酯= 7 ：1 过硅胶柱，得到化合物1 ( 6 m g ) 。3 3 2 2f r 2 部分的分离纯化将f r 2 部分用硅胶柱层析分离，用氯仿：甲醇( 1 0 0 ：1 ) 洗脱，每5 0 r a l 一个流分，富集相似部分，得到三个部分，第一部分浓硫酸显色为红色点，因量过少没有进一步分离，第三部分点样检测所含的杂质较多且量少，没有进行分离。第二部分选择凝胶柱分离后，进一步分离采用反相柱分离，最后经过重结晶得到化合物5 ( 1 5 m g )和化合物6 ( 2 l i n g ) ( 均为白色片状结晶) 。3 3 2 3f r 3 部分的分离纯化将f r 3 部分用硅胶柱层析分离，用氯仿：甲醇( 9 0 ：1 ) 洗脱，每5 0 m l 一个流分，富集相似部分，得到三个部分，第一部分因量过少没有进一步分离，第二部分为白色粉末状，浓硫酸显色为紫红色，显色点不均匀，尚含杂质，进一步选择凝胶柱分离，然后采用反相柱分离，选择甲醇：水不同比例洗脱，7 2 时分出了一个紫红色的点，得到化合物2 ( 1 l m g ) 。第三部分为淡黄色针状结晶，在紫外灯下波长为2 5 4 n m处有荧光，浓硫酸显色呈淡黄色，尚含杂质，进一步选择凝胶柱分离，得到化合物7 ( 1 4 r a g ) 。3 3 2 4f r 4 部分的分离纯化将f r 4 部分用硅胶柱层析分离，用氯仿：甲醇( 9 ：1 - 7 ：3 ) 梯度洗脱，每5 0 r a l 一个流分，富集相似部分，得到两个部分，第一部分为白色粉末状，浓硫酸显色为紫红色，尚含杂质，进一步选择凝胶柱分离，得到化合物3 ( s m g ) 。第二部分为白色粉末状，浓硫酸显色为紫红色，显色点不均匀，尚含杂质，进一步选择凝胶柱分离，然后采用反相柱分离，选择甲醇：水不同比例洗脱，8 1 时分出了一个紫红色的点，得到化合物4 ( 1 1 r a g ) 。3 迷迭香化学成分研究3 4 结构鉴定3 4 1 化合物1 的结构鉴定化合物1 为白色固体，浓硫酸一无水乙醇溶液显色呈红紫色，由p o s t i v e e s i m s ：m z ：9