（植物学专业论文）锌离子荧光探针的设计合成研究.pdf

摘要 生物体内的z n 2 + 是继f e 2 + 之后的第二个禽量较为率富的重金属离予，在生物体 中越到非常敷要的作用。植物体中5 8 9 1 的镩是可溶的。襁植物体系中锌的生 理功能是多方面的。广泛参与丁蛋囱质、酶、碳水化食物、核酸、腊类、生长素的 代谢及綦因转录的调控等擐基本、最重要的生化过程，同时锌对细胞膜的功能和结 构、自由基、细胞凋亡等都有很大影响。 自1 9 8 7 年第一个锌离子荧光探针( t s q ) 诞生以来，陆续研制开发了几种锌 离子荧光探针，如z i n q u i n z i n p y r - 1 ，a c f 1 ，a c f - 2 ，n e w p o r t g r e e n 等。人类利 用这种方便快捷的方式检测z n 2 + ，为研究生物体内z n “的功能和性质以及它的结 合方式，探索锌在生物体中的作用做出了卓越的贯献。但在测定生物活体内的游离 z n n 的浓度方面仍存在一定的豳难。 本实验首次选用在生物体内与z n ”键合能力很突出的物质组氨酸和半胱 氨酸，采用类似予多肽合成的方法，在箕羧基或氨基分别嫁接上一个带有标记的基 团，生成稳窳的共价键亿食物；在此化含物中模拟生理浓度条件加入锌离子，通过 红外图谱、紫外图谱或荧光图谱的变化分析锌离子对标记纂团是否产生影响，再结 合有关数据分析箕是甭适含检测锌离子，即是否可能作为新的锌离子荧光探针。 实验结采表鞠： 采麓多歉合成豹方法褥到了4 个缀氨敬羧基末端的衍生物，而盥产率较高 ( 5 8 7 3 ) 。蕴氮酸耧半虢氨教静衍生鞠能每锌酝位，值锌离子的加入辩紫井圈谱 或荧光凿谱豹彰晌并不显蔷，疆魏不大霹能有效缝标记植物体系孛豹锌离子。 关键镉：缝氨酸；半魏氨魏；镣离子；荧光探锌；紫舞光谱法 荧光光谱法 红外光漤法 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。掇我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包禽其他人 巴经发表绒撰写过的研究成果，也不包含来获得题i i 塑热左燮或其它教育机构的学 位或诞书蕊使用过的材料。岛我一同工作的同虑对本研究所作的任何爨献均已在论 文中作了明确的说明并袭示谢意。 学位论文作者签名；翼鸯钛 签字日期：p 年g 月p 日 学位论文版权使用授权书 零学馒论文作赣完全了耀攫a 壅然去坐有关保馨、使用学位论文的规定，蠢权 保留菇向国家有关部门或机构送交论文的复印传和擞盘。允谗论文拔毒阁蕈倦阅。 本人授权趣i 鑫些盔堂可以将学位论文的全鄣或部分成容缡入鸯关数据库进舒检 索，可以用影印、缩印或扫描簿复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者煞名； 签字暇期：够年多月汐日 零燃名：都 然宇暇期：哆年多月，爨 文献综述 1 锌化学和锌的生物化学 1 1 锌化学 在自然界元素的丰度顺序中，锌排在第2 5 位，在地壳中的平均含量波动于 0 0 0 4 - 0 0 2 之间【“。锌是位于元素周期表第n 副族的过渡金属元素，具有3 d 1 0 4 s 2 的价电子构型，其3 d 电子亚层已全充满，且s 电子与d 电子之间的电离势为1 7 9 8 e v ，相差较大，通常只失去s 电子而成+ 2 氧化态，z n “的原子半径较小为o 6 5 1 0 o 啪，且因其所带电荷较大+ 2 ，所以它对电子的亲和能力很高，是一个强的质子 供体正基于此，锌广泛地存在于各种生物体中。 1 2 锌的生物化学 目前，在动物、植物、微生物中已鉴定出3 0 0 多种酶必须有锌参加才能正常发 挥其功能。按国际生化协会分类命名的六大酶类( 氧化还原酶、水解酶、转移酶、 裂台酶、异构酶、合成酶) 中都有锌酶的存在在生物体系中。锌离予浓度的变化 范围很大，在细胞质中，锌的浓度大约在1 0 9 m o l l 范围内，而在某些小泡中，锌 的浓度可以达到1 0 。3 m o l l 以上( 这浓度差不多和钙的浓度相当) 【2 】在生物体内， 锌离子可广泛地与蛋白质、酶中的某些氨基酸残基的电子质体原子( 如组氨酸眯唑 环中具有孤对电子的那个氮原子、半胱氨酸巯基中的硫原子等) 形成配位键；z n 2 + 有较强的吸引电子能力，从而影响某些键的稳定性；在生理条件下，z n 2 + 不会被氧 化或还原，因此能在氧化还原电位不断变化的生物介质中始终保持二价阳离子态： 与其它金属离子相比，锌离子几乎是无毒的，这是由于生物体对z n ”摄入、排除与 体内分配的调节机制一般都十分有效，使得它们极少出现由于锌过量积累而引起的 中毒现象吐正是由于锌具有如此独特的优越性，因此在生物体内起到不可估量的 作用。 2 植物体系中锌的研究进展 2 1 锌在植物体内的分布、存在形态及缺锌症状 植物正常含锌量约为2 5 一l s o m g k g ( 干重) ，其含量因植物种类或品质不同而有 差异。植物体中锌多分布于茎尖、幼嫩的叶片和根系中，一般根系含锌量高于地上 l 塑! ! 查些盔堂堡主堂垡! 望些2 丝苎 一 一 部分，供锌充足时，锌可在根中积累，其中一部分属奢侈吸收。有报道表明，锌可 在叶绿体、液泡及细胞壁中富集。叶片中的锌大多数以低分子化合物、金属蛋白和 自由离子存在；y o u n g d a h l 等推测根部积累的锌主要固定于细胞壁内结合形成不溶 的形态；细胞内的锌也可能因为束缚态或与磷结合而失去活性；锌在液泡中贮存的 形态，主要以有机酸( 如苹果酸、柠檬酸、草酸等) 、植物蛋白质或多肽复合态形 式存在。因植物种类不同，植物中5 8 - , 9 1 的锌是可溶的，是植物中起生理作用的 主要锌形态，也是反映锌丰缺的较好指标。水溶性锌和低分子化合物锌通常含量高。 也是锌活动的重要形态。 对大多数作物而吉。锌浓度低于2 0 m g k g 为潜在性缺锌，低于1 5 m g k g 为缺锌， 同时伴有明显的缺锌症状。常见的缺锌症状为，叶片出现脉间失绿发黄或白化，叶 片小且常呈畸形，从簇状生长；枝条则茎间缩短，树体生长速度减慢，形成矮化苗： 作物开花成熟期推迟，严重时开花不正常，落花落果严重，果实发育受阻，产量降 低甚至绝收1 4 叫。 2 2 植物中锌的生理功能 植物中锌的生理功能是多方面的，广泛的参与了蛋白质、酶、碳水化合物、核 酸、脂类、生长素的代谢及基因转录的调控等最基本、最重要的生化过程。 2 2 1 锌对碳水化合物代谢的影响 锌对碳水化合物代谢的影响主要是通过影响光合作用和糖的运输来实现的，原 因可能是以下几个方面：锌是碳酸酐酶的组成成分1 ，因此缺锌会导致碳酸酐酶 的活性明显降低，从而影响二氧化碳的同化。在q 植物中，碳酸酐酶催化= 氧化 碳形成碳酸氢根离子( h c 0 3 ) ，然后h c 0 3 在p e p 羧化酶作用下被同化f 9 】。而在 c 3 植物中碳酸酐酶不直接参与c 3 植物的光合作用l ，5 = 磷酸核酮糖羧化酶 ( r u b p c ) 是催化光合作用中二氧化碳固定的酶缺锌会导致其活性降低，从而 影响光合作用。缺锌会导致叶绿体片状结构破坏【1 0 l ，叶肉和维管束鞘叶绿体结构 异常，使叶绿素含量降低，进而导致光合作用下降。缺锌降低植物组织中醛缩酶 的活性。进而影响1 ，6 - 二磷酸果糖的转化缺锌影响蔗糖从叶片向其它部位运输 的原因目前还不十分清楚，但j y u n g 等( 1 9 7 5 ) 在缺锌的蚕豆中发现，淀粉含量、 淀粉合成酶的活性、淀粉粒数都降低i l l l ，在蚕豆的叶子中糖和淀粉的含量增加，尤 2 塑! ! 查些查堂堡圭堂垒i 望些2 堡塞 其是蔗糖的含量；蚕豆根部碳水化合物的浓度却大大降低。根和叶子中碳水化含物 的不同分配表明缺锌影响了蔗糖从叶片向根部的运输f 1 2 1 2 2 2 锌对蛋白质代谢的影响 在金属蛋白中，由于金属离子是处在有蛋白肽键所裹绕的活性部位中，为肽链 上多个氨基酸所配位，因此，活性中心的金属离子所能取得空间构型以及它与配位 原子所成键的键长、键角不单只取决于中心离子的电子构型，也取决于这些可柔曲 的配体所具有的空间化学。因此，曾经测定了一些含锌的金属酶对第一过渡系列金 属元素的相对亲和性，发现z n 2 + 比c 0 2 + 、n i 2 + 、c u 2 + 等离子对这些酶的活性结合部 位有大得多的亲和能力f 1 3 】。 近年来国内外的研究证明：锌是影响蛋白质合成最为突出的微量元素，锌能促 进蛋白质的合成。一般地，缺锌植物中蛋白质含量明显降低，但组成几乎不变，主 要是由于锌是r n a 聚合酶活动的必需元素，锌可阻止核糖核酸作用于核蛋白体 r n a “1 。缺锌降低了r n a 和核糖体水平以及引起核糖体的变形。锌指( 蛋白质中 的锌络合区域) 在高等植物中也已经被发现。锌作为锌指蛋白的组成，可通过改 变染色质的结构或通过中断d n a 的合成来影响基因表达，但锌在基因表达中的作 用还需进一步的研究。 2 2 3 锌在酶中的作用 锌是多种酶的组分和激活剂。如锌是蛋白质酶、肽酶的必要组分；是谷氨酸脱 氢酶、苹果酸脱氢酶及异构酶、醛缩酶、r n a 和d n a 聚合酶等酶类的激活剂。作 为生物催化剂中的金属离子，它的动力学性质无疑是十分重要的。因为这也是决定 这些催化剂的稳定性、活性和功能的一个重要原因。锌离子在这一点上表测也很突 出【1 3 1 。第一：z n 2 + 与n i ”、c u 2 + 一样，是金属酶活性中心的稳固的组成。这对催化 剂金属酶的稳定性很重要第二；n p 对水抓得过紧。不利于水解反应的进行。 c u 2 + 虽具有较强的l e w i s 酸性。但它极快的水交换速率是由于【c u 2 0 ) 6 】2 + 水合离 子中的j a h n t e l l e r 效应，促使了轴向配位水分子的解离的缘故。且c u 2 + 是个极好的 氧化还原电子载体锌离子是生物体中最好的l e w i s 酸。也是组成水解酶的主要金 属离子。当然，在生物体内除了z n 2 + 以外，m n ”、c a 2 + 甚至m 9 2 + 有时也承担着水 解酶的功能大多数锌酶属于水解酶，催化脂类( 磷酸脂和羧酸醑) 、肽类及磷酸 3 塑! ! 查些盔兰堡主堂焦! 望些2 丝壅 一 盐的水解。锌在水解酶中的基本作用是作为l e w i s 酸，极化酯键和肽键，以便水解 反应进行。生物体之所以选择锌作为水解酶的活性中心，原因之一是锌离子是一个 很强的l e w i s 酸，而l e w i s 酸越强，其催化效率越高。 锌的立体化学特性在不同功能的锌酶中也呈现不同的行为。例如，当z d + 在含 锌酶中起催化作用时，锌离子通常总是由三个氨基酸残基配位，而第四个部位由水 或羟基占据着，这是便于底物取代水( 或加入配位球体) 键合于锌离子，发生由锌 离子参与的催化反应。在锌离子起结构作用的锌酶中，锌离子通常是由四个氨基酸 残基配位，并形成稳定的四面体结构。由此可见，在锌酶中z n 2 + 表现它的催化活性 依赖于它的l e w i s 酸的强度、配位构型的适宜性、蛋白金属结合稳定性及水解动力 学等各方面的性质p j 。 2 2 4 锌与植物生长素( i a a ) 的关系 现在一般认为缺锌使植株茎生长受阻，出现簇生病，小叶病，使果实、叶片变 小，而这些都与i a a 的代谢紊乱有关。实验证明锌能促进吲哚和丝氨酸合成色氨 酸，从而间接影响生长素的形成。缺锌导致生长素( i a a ) 含量下降的原因至今仍 有分歧，一般认为其可能性途径有以下几个方面：缺锌抑制了色氨酸向认a 的 转化；缺锌导致生物膜完整性被破坏，透性增加，使得i a a 的分室分作用失控， 影响i a a 的运输；缺锌导致i a a 的生物分解作用加强，促进i a a 的分解c 1 6 】。 2 2 5 锌与生物膜的关系 动物中锌对生物膜的结构和功能起关键的作用 1 7 1 ，高等植物中锌对膜的影响也 已经间接得到了证明。张福锁报道缺锌增强小麦根部k + 、氨基酸、糖和酚类物 质的分泌把缺锌植物重新供锌1 2 小时。渗漏则大大降低从而表明，锌在维持 细胞膜的完整性中起重要作用，锌与磷酯及膜蛋白巯基相互作用来稳定生物膜。 锌除了作为生物膜结构的组成外，还可抑制超氧自由基的产生以及消除超氧自由基 的毒害作用。缺锌引起的最早的生物化学变化是生物膜损伤口”。s o d 是消除超 氧基的关键酶，缺锌时s o d 酶的活性降低口”，过氧化氢酶的活性也降低，导致氧 自由基对生物膜的过氧化损伤，引起有机物和无机物从根细胞渗漏，锌对生物膜的 主要作用就是阻止了膜质和膜蛋白的过氧化 另外，锌与细胞凋亡f 2 2 ，2 3 j 及氮、磷、镉等生命必需的宏量与微量元素的关系也 4 翌j ! 奎些盔堂璺圭堂垒l 皇! 塑望茎 日益受到人们的关注口，”2 6 , 2 7 。 3 生物样品中锌离子荧光分析研究进展 锌是生命必需元素，在生物体代谢和营养方面起到非常重要的作用，锌的过量 与不足都会导致人体代谢异常，产生疾病8 ”。因此，z n 2 + 含量的测定在临床、医药、 食品、环境监测及科研中都有极其重要的意义。 生物体内的z n 2 + 是继f e 2 + 之后的第二个含量较为丰富的重金属离子，是许多 蛋白基本骨架的组成成分( 例如：碳酸酐酶和锌指蛋白) ，同时它还是一个基本的辅助 因子。迄今为止，已发现大约三百种以上的含锌蛋白，承担着二十多种不同的生物 功能，几乎涉及生物体新陈代谢的每一个方面l i 3 1 因为z n 2 + 没有空缺的d 轨道， 所以不具有过渡金属元素通常所具有的d - d 电子跃迁。在可见光区域，含锌酶也不 具有可见光谱。同时，由于z r t 2 + 不存在着不成对的单电子，因此也不表现任何磁性 质，使得测定z n 2 + 浓度存在一定困难。测定全部的z n “，原子吸收分光光度法是 一种非常有效的方法。但在生物组织和体液中大约有8 5 - 9 5 的z n 2 + 以化学结合 形式存在的，只有一小部分以游离z n 2 + 的形式存在，大部分细胞中，细胞内游离 z t 1 2 + 的浓度很低( 1 2 时荧光消失，xe “ e m = 5 0 7 n m 6 5 0 n m ，用5 p m o l lz i n p y r - 1 在3 7 下荧光显微标记c o s 7 细胞时间 可长达半小时z i n p y r - 1 能在可见光下发出荧光同时很好地与4 8 8 n m 的氩离子激 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 光线重叠，这一性质将推进这种探针在激光共聚焦显微扫描技术上的应用。但其 缺点是背景荧光量子产率高( o 3 9 ) 和对p h 较为敏感，导致在生理条件下细胞的 p h 值变化能引起荧光的变化。为此，t o m o y ah i r a n o 等合成了新的荧光探针，6 羟基9 4 ( 4 ，7 ，1 0 - 三甲基- 1 ，4 ，7 ，1 0 四- 十二烷酰基) 】一苯基一3 氢- 咕吨3 一酮( a c f 1 ) 及它的2 ，7 二氯衍生物( a c f 2 ) 5 4 1 ，它是利用6 羟基9 苯基荧光酮作为荧光基 团，但因其量子产率较小，以及由于它是利用大环的多聚胺环接受z n 2 + 。导致其 形成完整配合物的速率较慢。需要1 0 0 分钟。因此t o m o y ah i r a n o 及他的同事们 设计了更为新型的z n a f - 1 ，z n a f - 2 ，m e - z n a f 1 用n ，n ，n ，n 一四( 2 一吡啶 甲基) 1 , 2 乙= 胺( t p e n ) 作为z n ”的接受器；用5 - 或6 - 氨基荧光素作为其荧光 基团。其中。z n a f - 1 ，z n a f - 2 的 e x e m = 4 9 2 n m 5 1 4 r i m ，z n a f 1 的荧光强 度比z n a f 2 的弱，但是z n a f i 比z n a f 2 对z n 2 + 的选择性高，抗c d 2 + 干扰性强， 1 0 倍的c d + 都不能干扰锌的测定，z n a f 1 是目前能将c d 2 + 与z n 2 + 区分开的最好 的探针。m e z n a f 一1 与z n a f - 2 的抗c d 2 + 干扰性相同。z n a f s 能与z n 2 + 立即形成 配合物，在生理p h 范围内稳定性强。z n a f 2 不具有细胞渗透性，但可利用它与 乙酸酐和碳酸铯反应生成z n a f - 2d a ，z n a f 2d a 具有亲油脂性可以透过细胞， 胞液中的脂酶将其转变成z n a f 2 ，所以z n a f 2d a 可以作为探针测定细胞中的 锌。 人类碳酸酐酶i i ( c ai i ) 与z n 2 + 具有高亲和性，通过荧光各向异性利用一 种荧光素的衍生物芳香基氨磺酰探针_ 4 氨基磺酰基 卜( 4 - i , 1 - ( 荧光素基硫脲 基) 丁基) 】苯甲酰胺可以检测纳摩尔级的z n ”。这种探针已被证实只与与锌离 子结合的全酶强烈的结合( k d - 。2 3 n m o l l ) 而不与没有金属离子的酶朊结合。此 外，这种探针显示的各向异性与结合锌的浓度成正比。这种性质可用来检测 1 0 1 0 0 0 n m o l l 范围内的锌。 n e w p o r tg r e e n ( n g ) 5 7 魄一个激发波长在可见光区标记活体细胞的z n 2 + 荧 光探针( e x e m = 4 8 5 n m 5 3 0 n m ) ，n g 作为探针的两种形式为n g - k ( 钾盐形 式) 和n g - a c ( 酯化形式) 。n g - k - z n 的荧光强度通常不受活细胞中大量金属离 子如c a 2 + 、m 9 2 + 、f d + 的影响，但c d 2 + 、p b ”、c u 2 + 能熄灭荧光，c 0 2 + 、n i 2 + 能 增强荧光，同时，其荧光强度还受e d t a 、e g t a 及p h 条件的影响。n g a c 不 r 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 与锌结合，但其具有细胞渗透性，可扩散透过细胞膜，一旦进入细胞，即被细胞 内的酯酶断开而形成一个不具透性的能够结合锌的荧光指示剂。所以，n g 适于 检测细胞内游离的z n 2 + 和能与锌结合较为松散的细胞蛋白等，具有广泛的应用前 景。 最近报道的f l u o z i n 3 t ”】是一个新型的z n 2 + 荧光探针，其激发波长和发射波长 均在可见光区( e x e m = 4 8 8 n m 5 1 2 r i m ) ，具有低背景荧光( 未加入z n ”时荧光 强度几乎可忽略 - o h 或称取已 制备好的o a l g ( 1 0 m t 0 0 1 ) b o c - h i s ( t o s ) - o h ，与0 2 1 9 ( 1 0m m 0 1 ) d c c 及0 1 4 g ( 1 1 m m o t ) 对氯苯胺溶于2 0 m l 干燥的二氯甲烷中，在室温条件下电磁搅拌4 小时，过滤除去生成的脲( d c u ) ，减压蒸馏除去二氯甲烷溶剂，剩余少量残液用 2 0m l 乙酸乙酯溶解，未反应的对氯苯胺用3 0m l 稀盐酸分两次洗涤，再用3 0m l 5 的k h c 0 3 ，分两次除去未反应的b o c - h i s ( t o s ) - o h ，用2 0m l 饱和n a c l 溶液分 两次洗涤，无水n a 2 s 0 4 适量，干燥半小时，减压蒸馏至少许残液，加入少量乙酸 乙酯完全溶解后倒入蒸发皿，与少量无水乙醚一同研磨得白色粉末状物质0 3 8g ， 产率7 3 ，熔点为6 7 6 9 。 i r ( k b r ) ( c m 1 ) ：3 3 1 8 ，3 1 9 6 ，3 1 2 3 。3 0 6 1 ，2 9 7 8 ，2 9 3 i ，2 8 5 5 ，1 6 8 4 ，1 5 9 8 ， 1 5 3 6 。1 4 9 4 ，1 3 8 1 ，1 3 0 6 ，1 2 4 8 ，1 1 7 3 ，1 0 9 0 ，1 0 1 4 ，9 7 0 ，8 3 0 ，6 7 5 。 2 2 2 化合物1 b 的合成 称取0 5 9 8 ( 1 0mt 0 0 1 ) b o c h i s ( t o o - o h d c h as a l t ，按照制各n 叔丁氧羰 基n 1 “一对甲苯磺酰组氨酸( b o c - h i s m s ) - o h ) 的方法制得b o c h i s ( t o s ) o h 或称取已 制备好的o 4 1 8 ( 1 0mt 0 0 1 ) b o c - h i s ( t o s ) - o h ，与0 2 1 9 ( 1 0mt 0 0 1 ) d c c 及o 1 5 g ( i im t 0 0 1 ) 对氮基苯乙酮溶于2 0 m l 干燥的二氯甲烷中，在冰水浴条件下电磁 搅拌4 小时，过滤除去生成的脲( d c u ) ，其它处理方法与化合物a 相同，得淡黄 色粉末状物质0 3 7 9 ，产率7 0 ，熔点为3 8 - 9 1 。 i r ( k b r ) ( c m 。1 ) ：3 3 2 8 ，3 1 1 9 ，3 0 6 1 ，2 9 8 0 ，2 9 3 1 。2 8 5 3 ，1 9 2 1 ，1 6 8 2 ，1 6 2 9 ， 1 6 0 0 ，1 5 2 8 ，1 4 5 2 ，1 4 0 9 ，1 3 6 6 ，1 2 7 3 ，1 1 6 3 ，1 0 9 0 ，9 6 l ，9 2 6 ，8 9 3 ，8 4 1 ，8 1 5 ， 6 7 5 。 2 2 3 化合物1 c 的合成 与化合物a 的合成方法相同，由o 5 9g ( 1 o m t 0 0 1 ) b o e - h i s ( t o s ) - o h d c h a s a l t ，按照制各n - 叔丁氧羰基- n ”对甲苯磺酰组氨酸( b o c - h i s ( t o s ) - o h ) 的方法制得 b o c - h i s ( t o s ) - o h 或称取已制备好的0 4 1 9 ( 1 0mm 0 1 ) b o c - h i s ( t o s ) - o h ，与0 2 1g ( 1 0mm 0 1 ) d c c 及o 1 8g ( 1 1m t 0 0 1 ) 8 - 羟- , 基喹啉反应，得淡绿色粉末状物质 0 3 5g ，产率6 5 ，熔点为7 5 7 7 。 2 1 塑i ! 查兰兰查堂堡主兰垡( 望些2 堡苎 1 r ( k b r ) ( c l n 1 ) ：3 3 3 0 ，3 1 2 5 ，3 0 3 3 ，2 9 2 9 ，2 8 5 2 ，1 6 9 2 ，1 6 2 9 ，1 5 7 6 ，1 5 3 6 , 1 4 3 8 ，1 3 1 2 。1 2 7 2 。1 2 4 6 ，1 0 8 9 ，8 9 3 ，8 1 9 ，6 4 9 0 2 2 4 化合物1 d 的合成 与化合物a 的合成方法相同，由0 5 9g ( 1 0m t 0 0 1 ) b o c h i s ( t o s ) - o h d c h a s a l t ，按照制备n 叔丁氧羰基_ n ”对甲苯磺酰组氨酸( b o c - h i s ( t o s ) - o h ) 的方法制得 b o c h i s ( t o s ) - o h 或称取已制备好的0 4 1 9 ( 1 0mt 0 0 1 ) b o c - h i s ( t o s ) - o h ，与o 2 1 9 ( 1 0m m 0 1 ) d c c 及0 1 8 9 ( 1 1mt 0 0 1 ) 氨基毗啶反应，得白色粉末状物质0 2 8 9 ， 产率5 8 ，熔点为8 0 - 8 3 。 i r ( k b r ) ( e m 1 ) ：3 3 2 8 ，3 1 2 3 ，3 0 3 3 ，2 9 3 3 ，2 8 5 5 ，1 7 0 7 ，1 6 5 5 ，1 6 2 9 ，1 5 7 4 ， 1 5 2 7 ，1 4 5 2 ，1 4 3 6 ，1 3 8 1 ，1 2 2 7 ，i1 7 5 ，1 0 8 8 ，8 9 3 ，8 1 5 ，7 8 0 ，6 7 6 。 2 3 去除组氨酸羧基化合物中的b o o 保护基团 去除方法依据文献 8 9 ，9 0 按下列过程进行。 s c h e m e l - 3 c h r 2 r ab c d 2 3 1 化合物2 a 的制各 称取化合物i a0 2 1 9 ( 约0 4m m 0 1 ) ，溶于3 4m l 三氟乙酸( c f 3 c o o h ) 中， 室温放置1 小时。将溶液减压蒸至少量残液时，倒入蒸发皿中与干燥的乙醚一同研 2 2 翌j ! 查些盔兰堡圭堂垒l 兰些垒壅 磨，过滤，得少量暗褐色粘稠固体0 1 9 ，产率5 8 5 ，熔点为5 3 - 5 5 c 。 i r ( k b r ) ( c m 1 ) ：3 1 2 8 ，3 0 4 2 ，2 9 3 4 。2 8 6 4 ，1 6 7 5 ，1 6 1 7 ，1 5 5 2 ，1 4 9 4 ，1 3 1 4 ， 1 2 0 4 ，1 0 9 2 ，1 0 3 6 ，1 0 1 2 ，8 3 2 ，7 2 2 ，6 8 5 。 2 3 2 化食物2 b 的制备 与化合物2 a 的制备方式相同。称取化合物i b0 2 1 9 ( 约0 4 m t 0 0 1 ) ，与3 4 m l 三氟乙酸( c f 3 c o o h ) 反应，得少量紫黑色粘稠油状物0 1 l g ，产率6 4 。 2 3 3 化合物2 c 的制备 与化合物2 a 的制备方式相同。称取化合物i c0 2 2 9 ( 约0 4mt 0 0 1 ) ，与3 4m l 三氟乙酸( c f s c o o h ) 反应，得少量淡绿色粘稠油状物0 1 4 9 ，产率7 9 。 2 3 4 化台物2 d 的制备 与化合物2 a 的制备方式相同。称取化合物1 c0 1 8 9 ( 约0 4mt 0 0 1 ) ，与3 4m l 三氟乙酸( c f 3 c o o h ) 反应，得少量土色粘稠油状物0 0 9 9 ，产率6 0 。 2 4 紫外光谱研究 对上述生成物为油状物的物质，因为条件所限无法测定其红外光谱，所以选 择在9 5 的乙醇溶液中定性地测定了它们的紫外光谱1 9 ”，借以通过观察其紫外图 谱的不同加以粗略的区分 2 5 组氪酸羧基化台物与锌离子的配位有机合成研究 配位有机合成是获得纯净配合物的一种方法，在金属离子与有机化合物或天然 产物的相互作用研究中被广泛应用为了对所合成的部分产物与z n 2 + 的相互作用进 行研究参考文献资料1 7 3 , 8 5 , 9 0 , 9 2 , 9 3 , 9 4 , 9 5 , 9 6 , 9 7 , 9 8 , 9 9 , 1 ”1 首次对其合成进行了探索。 2 5 1 化合物1 b 与z n ( n 0 3 ) 2 的相互作用研究 在装有电动搅拌、冷凝回流的1 0 0 m l 三口瓶中，加入化合物i bo 1 l g ( o 2 m t 0 0 1 ) 与0 1 mt o o lz n ( n 0 3 ) 2 溶于1 0 m l 无水乙醇中，维持微沸状态1 2 1 5 小时，溶液由 暗黄色变为橙红色。将溶液水浴蒸干后，用乙醚洗涤所得橙红色物质。干燥后得到 化合物3 。 i r ( k b r ) ( c m “) ：3 3 2 9 ，3 1 9 6 。3 1 2 3 ，3 0 6 1 ，2 9 7 8 。2 9 3 1 。2 8 5 3 ，1 7 0 0 r 1 6 8 5 1 6 2 9 ，1 5 9 7 ，1 5 3 3 ，1 4 5 1 ，1 3 8 3 ，1 3 6 8 ，1 3 1 3 ，1 2 7 3 ，1 1 7 3 ，1 0 9 0 ，1 0 1 3 。9 6 1 。 8 4 1 ，8 1 5 ，6 7 5 。 2 3 塑! ! 垒些查堂塑主堂篁! 望些! 丝苎一一一 2 5 2 化合物1 c 与z n ( n 0 3 ) 2 的相互作用研究 称取化合物i c o 1 l g ( o 2 m m o b 与o i m m o lz n ( n 0 3 ) 2 溶于1 0 m l 无水乙醇中， 其他处理方法与化合物a 相同，溶液由淡青色变为深绿色，得到化合物4 。 i r ( k b r ) ( c m 1 ) ：3 3 3 1 ，3 1 4 2 ，3 0 3 5 ，2 9 2 9 ，2 8 5 2 ，2 4 2 7 ，1 6 2 9 ，1 5 7 7 ，1 5 3 6 ， 1 4 3 1 ，1 3 8 5 ，1 3 1 3 ，1 2 4 2 ，1 2 1 i ，1 1 5 9 ，1 0 6 7 ，1 0 4 7 ，1 0 1 8 ，9 6 7 ，8 9 3 ，8 1 6 ，7 6 4 ， 6 9 1 。 3 组氨酸与半胱氨酸氨基化合物的制备及性质研究 3 1 标准氨基酸的o n s 化 为了探讨向氨基酸氨基末端引入生色基团后的一些光学性质，本试验利用目前 在氨基酸鉴别领域比较成熟的方法丹磺酰氯法，选择在生物体内与z n 2 配位能 力较强的组氨酸和半胱氨酸，利用其氨基末端，与荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯 ( d a n s y lc h l o r i d e ，缩写为d n s e 1 ) 在碱性条件下，形成d n s 氨基酸。值得注意 的是，d n s c i 除了与c i 氨基反应外，还能与氨基酸的侧链基团巯基、咪唑基反应， 但二者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时可被完全破坏。标准氨基酸的d n s 化参 照文献 1 0 1 ，1 0 2 按照s c h e m e l 4 和s c h e m e l j 方法进行。 3 1 1 二甲氨基萘磺酰组氨酸( o n s h i s ) 的制各。 s c h e m e l - 4 d n s c l h i s h d n s h i s 取1 0m l 标准组氨酸溶液置于磨口三角瓶中，加入1 0m l 二甲氨基萘磺酰氯 丙酮溶液( d n s - c i 丙酮溶液) ，塞紧，摇匀，置3 7 c 恒温水浴锅中保温l 2 小时， 用稀h c i 调节p h 值为2 3 的酸性条件下，用乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，减 2 4 一 攀恤1 州咆q 馥 塑! ! 查些盔堂堡主兰垡! 望些2 丝苎一 压蒸馏至少量残液时，将其倒入蒸发皿中，避光自然蒸千，得固态淡绿色物质。 3 1 2 二甲氨基萘磺酰半胱氨酸( d n s c y s ) 的制备 s c h e m e l - 5 c o o h 亡h 馨 c o o h 一6 h 6 h ， l s h d n s c 1 c y s d n s c y s 与化合物二甲氨基萘磺酰组氨酸( d n s - h i s ) 的合成方法相同，取1 0m l 标准半 胱氨酸溶液，与1 0m l 二甲氨基萘磺酰氯丙酮溶液( d n s - c 1 丙酮溶液) 反应，得 暗棕色固态物质。 3 2 光谱性质研究 3 2 1d n s h i s 和d n s - c y s 稳定性研究 分别取少量制备的d n s - h i s 和d n s - c y s ，用d m s o i - - 1 2 0 = 8 0 2 0 ( w w ) 溶液 溶解，在2 5 0 4 5 0 r t m 的波长范围内进行定时波长扫描，开始每间隔5 分钟扫描一 次，半小时后改为每间隔1 5 分钟扫描一次，1 小时后改为每间隔3 0 分钟扫描一次， 前后共持续1 2 小时。随后又对该溶液避光保存，7 2 小时后进行了波长扫描。 3 , 2 2 紫外光谱研究 准确称取制各的二甲氨基萘磺酰组氨酸( d n s h i s ) 和二甲氨基萘磺酰半胱氨 酸( d n s - c y s ) g r 0 0 0 1 9 9 乘1 0 0 0 1 8 9 配制成1 1 0 一m o l l 溶液，用d m s o h 2 0 = 8 0 2 0 ( w w ) 溶液定容至5 m l 。再从上述溶液中准确移取l m l 稀释至1 0 m l 配制成1 1 0 4 m o l l 溶液，在2 5 0 , - - 4 5 0 n m 的波长范围内进行波长扫描。 3 2 3 d n s - h i s 和d n s - c y s 的荧光光谱测定 利用所配制的1 1 矿m o l ld n s - h i s 和d n s - c y s 溶液测定二者的激发光谱和 发射光谱。 2 s 河北农业大学硕士学位( 毕i t ) 论文 3 3 组氨酸与半胱氨酸氨基化合物与锌离子的相互作用研究 3 3 1 紫外滴定法 紫外滴定法是配位化学中的一种研究方法。本实验借鉴文献 7 3 的方法，采用 1 1 0 4 m o l l 二甲氨基萘磺酰组氨酸( d n s h i s ) f l od m s o h 2 0 = 8 0 2 0 ( w w ) 溶液 和1 1 0 4 m o l l 二甲氨基萘磺酰半胱氨酸( d n s c y s ) 的d m s o h 2 0 = 8 0 2 0 ( w w ) 溶液作配位体l 的浓度，在i c m 的样品池中准确移取3 m l 配体溶液，每次向样品 池中准确滴加1 5 p l 1 1 0 一m o l lz n ( a c ) 2 的d m s o h 2 0 = 8 0 2 0 ( w w ) 溶液，测 定其吸光度变化情况m ”- 。 3 3 2 荧光光谱法 为了准确反映二甲氨基蔡磺酰组氨酸( d n s h i s ) 和二甲氨基萘磺酰半胱氨酸 ( d n s c y s ) 在d m s o h z o = 8 0 2 0 ( w w ) 溶液中加锌前与加锌后的荧光变化。本实 验测定了在3 m l1 1 0 4 m o l ld n s - h i s 和d n s c y s 的d m s o h 2 0 = 8 0 2 0 ( w w ) 溶液中分别加入3 0 0 儿1 1 0 3 m o l l z n ( a c ) 2 的d m s o h 2 0 = 8 0 2 0 ( w w ) 溶液， 在其充分反应后对二者的激发波长和发射波长进行扫描 7 3 , 9 3 9 4 】。 塑! ! 壅些查兰堡主堂堡! 望些! 丝苎一 结果与分顿 1 组氨酸羧基化合物 本试验首次合成了i a 、1 b 、i c 、1 d 四个组氨酸羧基化合物，制得了相应的 去b o c 保护基团后的物质2 a 、2 b 、2 c 、2 d ，并对其化学结构进行了红外光谱和 紫外光谱分析。 1 1 红外光谱分析 图3 - i 、图3 - 2 、图3 - 3 、图3 - 4 、图3 - 5 、分别为化合物l a 、l b 、1 c 、1 d 、2 a 、 的红外图谱。 w a v e n u m b e r ( e m 1 ) 图3 1化合物1 a 的红外光谱图 8豆鼍g童漾 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 w a v e n u m b e r ( c m “) 图3 - 2 化合物1 b 的红外光谱图 w a v e n u m b e r ( e m “) 图3 - 3 化合物l c 的红外光谱图 u暑g!m魄口丹i上采 ou目#一gl已寥 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 w a v e n u m b e r ( e m 1 ) 图3 - 4 化合物l d 的红外光谱图 w a v e n u m b e r ( e m “) 图3 - 5 化合物2 a 的红外光谱图 oug#lmbj工摹 8c礴兰暑星零 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 由化合物1 a 、i b 、i c 、1 d 、2 a 的红外光谱数据可以看出，所有含苯胺的化 合物l a 、l b 、1 d 、2 a 都表现出其特征的红外吸收。如化合物在3 1 0 0 - - 3 0 0 0c m 。 之间均存在苯环的c h 伸缩振动吸收峰，且在1 6 0 0 1 4 5 0c m 。1 之间存在苯环的一c - c - 骨架振动吸收峰，在3 0 0 0 2 8 0 0c n l 。1 之间存在碳氢化合物的c h 3 、c h 2 的c - h 键 伸缩振动吸收峰，在1 2 3 0 1 1 0 0c m “的附近存在c n - 的吸收峰，在1 3 8 0 - , 1 3 1 0c m 。1 的附近存在r s o = n 的特征吸收峰。 化合物1 a 、l b 、1 c 、1 d 在3 3 3 0 , - - 3 2 0 0c m 。附近均有仲酰胺的- n - h 特征吸收 峰，在1 7 1 0 1 6 5 0c r n 1 附近有c - - - o 的特征吸收峰，在1 4 0 0 1 3 7 0c m 4 附近有叔丁 基的c - h 弯曲振动吸收峰，在1 2 4 8 e m 1 附近有叔丁基的c c 骨架振动吸收峰。化 合物2 a 在3 1 5 0c m 4 及1 6 8 0e m 1 附近均存在伯酰胺的特征吸收峰，且在1 2 4 8 e m 。 附近未出现叔丁基的c - c 骨架振动吸收峰。 化合物l a 、2 a 在1 0 9 2c m 1 处均有对位氯取代苯的中强度敏感谱带，且在 8 3 0 8 1 0c m 1 间存在对二取代苯的特征吸收峰。化合物1 c 在1 3 9 0 1 3 3 0c m 4 附近 出现了缔合酚的特征吸收峰。化合物1 c 、l d 在1 4 3 0c m 。附近出现了缔合态环状 酰胺的n - h 变形振动吸收峰。化合物1 b 在1 3 1 0c m 、1 2 7 3c m 。1 处存在芳香酮的 振动吸收。 1 2 紫外光谱分析 由于所得到的化合物2 b 、2 c 、2 d 为油状物，在目前实验条件下无法给出红外 图谱，因此，选择进行紫外光谱研究。紫外吸收光谱反应分子吸收能量后所产生的 电子跃迁，换言之，它主要反映分子中不饱和基团的性质，而不反映整个分子的结 构【1 ”i 。 图3 - 6 、图3 - 7 、图3 - 8 分别为化合物2 b 、2 c 、2 d 在9 5 乙醇溶液中的紫外 光谱图。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 0 02 5 03 0 03 5 04 0 0 4 5 05 0 05 5 06 0 06 5 0 w a v e l e n g t h ( n m ) 图3 - 6 化合物2 b 在9 5 7 , 醇溶液中的的紫外光谱圈 w a v e l e n g t h ( n m ) 图3 7 化合物2 c 在9 5 乙醇溶液中的的紫外光谱 5 4 3 2 1 o 坼o 翌些查些盔堂堡主堂垡i 生些! 婆塞 2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 07 0 08 0 0 w a v e l e n g t h ( n m ) 图3 - 8 化合物2 d 在9 5 乙醇溶液中的的紫外光谱图 对所得到的2 b 、2 c 、2 d 化合物的紫外光谱图加以比较，可以看出三者在 2 5 0 - 3 5 0 n m 的波长范围内波形变化明显不同，从而说明各个化合物中存在共轭体系 且各不相同。 2 组氨酸羧基化合物与锌离子的配位有机合成研究 配位有机合成是获得纯净配合物的一种方法，在金属离子与有机化合物或天然 产物的相互作用研究中被广泛应用。本试验利用z n ”对电子的亲和能力很高，是一 个强的质子供体的特点，对试验中所合成的部分化合物进行了加入锌后的研究，得 到了两个含锌配合物：化合物3 和化合物4 ，对其化学结构进行了红外光谱分析。 图3 - 9 、图3 - 1 0 分别为化合物3 和化合物4 的红外光谱图。 3 2 5 4 3 2 1 o d w a v e n u m b e r ( c m 1 ) 图3 - 9 化合物3 的红外光谱图 w a v e n u m b e r ( e m “) 图3 l o 化合物4 的红外光谱图 u#_e碧_暑女 q蠢8r雳蟊盘浆 塑韭查些奎兰堡主兰垡l 望些2 丝壅 一一 c h o 。广瓴p o k c h 们一n n 暴砖哪h 3 图3 - 1 1 组氨酸羧基化合物与锌配位的结构图 比较化合物4 和化合物l c 的红外光谱图，可以看出：二者在3 1 0 0 - - 3 0 0 0c r n 1 之间均存在苯环的c h 伸缩吸收峰，且在1 6 0 0 , - , 1 4 5 0c m 1 之间存在苯环的c c 骨 架振动的多个吸收峰，在3 0 0 0 2 8 0 0c m 。之间存在碳氢化合物的c h 3 、c h 2 的c h 振动的多个吸收峰，在1 6 2 9c m 1 处存在酰胺c = o 的伸缩振动特征峰，在3 3 3 0c i n 4 附近均有仲酰胺的- n h 特征吸收峰。在1 3 1 3c m 1 的附近存在r s 0 2 n 的特征吸收 3 4 河北农业大学硬士学位( 毕业) 论文 峰。明显不同的是化合物i c 的红外光谱中的1 3 9 5c m 、1 3 6 6c l n 1 的两个分裂 峰消失，而在1 3 8 5c m 。1 处化合物4 的红外光谱中形成了一个强的吸收峰；说明缔 合酚的特征峰有加强的趋势：化合物4 的红外光谱中在6 9 1 c m 1 附近出现了c 0 0 与金属离子有关的特征吸收峰。在