（植物学专业论文）osphr2和atphr1基因功能比较分析.pdf

o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 摘要 在拟南芥磷信号转导系统中，a t p h r l 起到重要作用。研究a t p h r l 及其 在水稻中同源基因o s p h r 2 的基因结构功能，有利于进一步研究p h r l 的作用 机理。我们通过转基因的方法获得o s p h r 2 和a t p h r i 增强表达的拟南芥株系， 通过对其表型，生理，基因表达以及两基因的生物信息学等方面分析揭示 o s p h r 2 与a t p h r l 功能的差异。结果如下： 1 生物信息学分析发现，o s p h r 2 与a t p h r l 在氨基酸序列上有很高的同源性， 都具有高度保守的m y b - - c c 结构域，但是在c c 结构域中，两者有一些 区别。例如在a t p h r i 蛋白序列的第3 4 7 个氨基酸为a y r ，这是一个重要的 酪氨酸激酶磷酸化位点，而在o s p h r 2 中，所对应的位点氨基酸为c y s ，因 而酪氨酸激酶磷酸化位点消失；同时在a t p h r l 蛋白的第3 7 2 个氨基酸为 l y s ，这是一个重要的s u m o 位点，而在o s p h r 2 中所对应的氨基酸为p r o ， 因而缺少了s u m o 位点；另外在超二级结构上，a t p h r i 的c c 结构域为 一长吡螺旋结构，而o s p h r 2 的c c 结构域中存在转角。 2 o s p h r 2 增强株系在高磷情况下与野生型( c 0 1 ) 相比表现为，植株变得矮小， 果荚变小，种子结实率差，而a t p h r i 增强株系与野生型相比则没有显著差 异；低磷情况下这种差异不显著。 3 o s p h r 2 增强株系在高磷情况下与c o l 相比表现为，花色素苷积累，地上部 有效磷含量积累，总磷含量没有显著差异；而a t p h r i 增强株系与野生型相 比没有显著差异。在低磷情况下，o s p h r 2 增强株系与a t p h r l 增强株系及 野生型的花色素苷含量，有效磷含量，总磷含量，没有显著差异。 4 o s p h r 2 增强株系在高磷情况下，磷饥饿诱导基因如a t l p s l 。a t 4 仍然强烈表 达，a t p a p 2 的表达量也有增加；a t p h r l 增强株系中，a t l p s l ，a t 4 表达与 c o l 相比虽有增强，然而没有o s p h r 2 增强株系效果明显：但p h 0 2 却没有 显著的变化。在l p 情况下，仍汪碾r 2 增强株系与a t p h r i 增强株系及野生 型c o l 的a t 船，和a t 4 的表达量均无显著差异。 关键词：拟南芥，o s p i t r 2 , at p h r l ，磷信号分析 m o s p h r 2 与a t p h r ! 基因功能比较分析 a b s t r a c t a t p h r lp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei nt h ep is i g n a l i n gs y s t e mi na r a b i d o p s i s t o c o m p a r et h ef u n c t i o no f a t p t t r la n do s p h r 2 , t h eh o m o l o g o u sg e n eo ta t p h r l = i n r i c e ，w ed e v e l o p e dt r a n s g e n i cp l a n t so fa r a b i d o p s i s ( c 0 1 ) w i t ho v e re x p r e s s i o n so f a t p h r la n do s p h r 2r e s p e c t i v e l y u s i n gt h et r a n s g e n i cl i n e sa n db i o i n f o r m a t i c s a n a l y s e s ；w ef o u n de c t o p i cf u n c t i o no fo s p h r 2i na r a b i d o p s i s t h er e s u l t s 黜 s u m m a r i z e da sf o l l o w s ： 1 b i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i si n d i c a t e st h a t , o s p h r 2i sh o m o l o g o u st 0a t p h r l t h e y h a v et h es i m i l a rm y b - c cd o m a i n , w h i l et h e r ea l es o m ed i f f e r e n c e si nt h ec c d o m a i nb e t w e e nt h e m i nt h ea t p h r i ，t h e3 4 7a m i n oa c i di st y r o s i n e ，w h i c hi s a ni m p o r t a n tt y r o s i n ek i n a s e p h o s p h o o , l a t i o ns i t e ht h eo s p h r 2 。t h e c o r r e s p o n d i n ga m i n oa c i di sc y s t e i n e ，c o n s e q u e n t l yt h e r ei sn ot y r o s i n ek i n a s e p h o s p h o r y l a t i o ns i t e i nt h ea t p h r l ，t h e3 7 2a m i n oa c i di sl y s i n e ，w h i c hi sa l l i m p o r t a n ts u m o y l a t i o ns i t e ，b u tt h ec o r r e s p o n d i n ga m i n oa c i di sp r o l i n ei nt h e o s p h r 2 i nt h es u p e r - s e c o n d a r ys t r u c t u r e t h ec cd o m a i no ft h ea t p h r li sa l o n g 眦h e l i x , b u tt h e r ei sat u r ni nt h em i d d l eo f c cd o m a i no f t h eo s p h r 2 2 u n d e rh i 班p il e v e l ( h p ：1 0 0 0 r t mp i ) ，t h eo s p h r 2o v e re x p r e s s i o na r a b i d o p s i s p l a n t ss h o w e dr e d u c t i o no fp l a n tg r o w t hc o m p a r e dt ot h ew i l dt y p e ，i n c l u d i n g l o w e rp l a n th e i g h t ，s h o r t e rl e g u m e sa n dl o w e rs t e r i l i t y o nt h ec o n t r a r y , t h e a t p h r io v e re x p r e s s i o n p l a n t ss h o w e dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e si np l a n t g r o w t hc o m p a r e dt ot h ew i l dt y p e u n d e rl o wp il e v e l ( l p ：3 5 州p i ) ，h o w e v e r , n os i g n i f i c a n tp h e n o t y p i cc h a n g ew a sf o u n da m o n gt h ew i l dt y p e ，p h r l ，o v e r e x p r e s s i o nl i n e so f o s p h r 2a n d a t p h r l 3 t h eo s p h r 2o v e re x p r e s s i o np l a n t ss h o w e dh i g h e ra n t h o c y a n i n sa c c u m u l a t i o n a n dh i g h e ri n o r g a n i cp ic o n c e n t r a t i o ni ns h o o t su n d e rh pl e v e lc o m p a r e dt ot h e w i l dt y p e ，b u tn o tt h et o t a lp ii np l a n t s t h e r ei sn oo b v i o u sd i f f e r e n c ei n a t p h r io v e re x p r e s s i o np l a n t sc o m p a r e dt ow i l dt y p eu n d e rh pl e v e l u n d e r l o wp il e v e l t h e r ei sn od i s f i n c td i f f c r e n c ei na n t h o c y a n i n sa c c u m u l a t i o n , i n o r g a n i cp ic o n c e n t r a t i o n , t h et o t a lp ia m o n gt h ew i l dt y p e ，o s p h r 2a n d i v o s p l t r 2 与出p h r i 基因功能比较分析 a t p h r lo v e re x p r e s s i o np l a n t s 4 t h ep i - s t a r v a t i o n - i n d u c i b l e g e n e s , s u c h 舔a t l p s l ，a t 4a n da t p a p 2 ，w e r e i n d u c e di no s p h r 2o v e re x p r e s s i o np l a n t su n d e rh pl e v e l t h e s ei n d u c t i o n s w e r es o m ed e g r e er e p r e s s e di na t p h r io v e re x p r e s s i o np l a n t s w h i l et h e r ei s n oo b v i o u sc h a n g ef o rt h ep h 0 2g e n e u n d e rl pl e v e l ，n od i f f e r e n tt r a n s c r i p t l e v e l sw e t eo b s e r v e di na t l p s i ，a t 4a n da t p a p 2a m o n gt h ew i l dt y p e ，o s p h r 2 a n d a t p h r lo v e re x p r e s s i o np l a n t s k e y w o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，o s p h r 2 ，a t p h r l ，p i s i g n a l i n g v o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 缩略表 缩写词英文全称中文名称 a c p 5a c i dp h o s p h a t a s e5 酸性磷酸酶5 c r e lac y t o k i n i nr e c e p t o r 细胞分裂素受体 h p 碰曲p i 高磷 l p l o w p i 低磷 p a p 2p r o d u c t i o no f a n t h o c y a n i np i g m e n t 2 花色素苷2 p h f l p h o s p h a t et r a n s p o r t e rt r a f f i cf a c i l i t a t o rl 磷酸转运体协助运输因子 p s ip i - s t a r v a t i o n - i n d u c i b l eg e n e s磷饥饿诱导基因 d a g d a y a f t e rg e r m i n a t e 萌芽后天数 o s p h r 2 与a t p h r l 基因功能比较分析 致谢 本论文在导师吴平教授的精心指导下完成，在硕士论文完成及即将毕业之 际，首先感谢我的导师吴平教授，在两年的硕士生涯中，我深深的感受到一位 优秀的导师对一个学生成长的重要意义。导师是一个孜孜不倦追求真理，探讨 科学问题的人；他的忘我工作精神和严谨的工作态度，使我终身受益。 其次，要感谢周洁师姐，她做实验的细心，教师弟师妹的耐心，永远值得 我的学习；要感谢张忠臣师兄，是他最初教给了我许多实验方法技能；感谢陈 新老师和胡彬同学在o s p h r 2 和a t p h r l 蛋白三级结构上分析的帮助，同时还要 感谢实验室的莫肖容老师，李燕老师，吴运荣老师，吴忠长老师，毛传澡老师， 石江华博士后，感谢他们在实验过程中的指导与帮助。 再次，要感谢齐晓朋，张麝龙，程龙军，郝西，王晓飞，余晓波，王栩鸣， 丁沃娜，杜冠魁等师兄师姐在实验过程中给与的指导帮助；感谢王文峰，倪君， 张波涛，张秋卉，钟崴麒，岳润清，朱振兴，孟一君，张锦伟，王继荣，汪高 航，谈雅静等同学，非常高兴与他们一齐愉快的度过了这一段美好的时光。 最后，感谢我的父母，弟弟及所有曾经关心过我帮助过我的亲戚朋友，没 有你们就没有今天的我，衷心的祝愿你们：身体健康，一切顺利。 李毅毅 2 0 0 7 年5 月于紫金港 o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 第一章文献综述 在不同植物之间磷信号途径具有相对特异性，在拟南芥中发现a t p h r l 在 磷胁迫信号途径中起关键调节作用，研究a t p h r i 基因及其同源基因的结构功 能是深入研究p h r l 功能的一种策略。 1 拟南芥中p h r l 基因及其调控基因的发现 在低磷条件下生长时，拟南芥表现出典型的缺磷症状，例如植株矮小，叶 深，花色素苷积累，根构型改变，与磷吸收相关的转运蛋白增加等；因此拟南芥 为在植物自身框架里研究磷饥饿反应提供了便利。 r u b i o 等( 2 0 0 1 ) 采用磷饥饿诱导报道基因a t l p s l p r o m o t e r ：g 硼来筛选磷饥饿 反应表达缺陷的突变体，并获得了 p h r l 两株突变体。该突变体在缺磷情况下， 4 t 雕，以及其他一系列磷诱导基因t 4 ，a t p t l ，a t a c p 5 ，r n s l ，a t l p s 3 ) 的表达 下降，并伴随着花色素苷的积累减少，根冠比有所减少，同时发现无论在有磷无 磷情况下，植物体内的无机磷含量都有所减少；但是在：p h r l 植株中根毛发育等磷 饥饿反应特征与野生型相比并没有发生改变。通过序列比对分析揭示了p h r l 是 一个m y b - - c c 类的转录因子，与衣藻p s r l 同源，而p s r l 被认为是一个与磷反 应相关的转录因子；通过构建g 即j 垆h r ，载体，进行亚细胞定位，发现p h r l 定 位于细胞核内；又通过凝胶阻滞电泳，发现p h r l 结合磷信号基因启动子序列上 的一段保守序列- - - g n a t a t n c ( p 1 b s ) ，这些结果表明，p h r l 是磷信号传递中下 游的一个转录激活子，影响一系列的磷饥饿反应基因。b 4 匠a t p h r l 的增强表达并 无显示磷信号途径与表型的显著改变( r u b i oe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 e s p e r a n z a 等( 2 0 0 5 ) 利用类似的筛选方法在正常供磷情况下，获得p h f l 突变 体。p h i l 突变体削弱了磷的转运，在正常供磷情况下，也表现出许多磷饥饿性状， 如根茎比增加，花色素苷积累，根毛增多等，并且诱导许多磷饥饿基因的表达， 如彳t 臃，a t 4 ，a t a c p 5 等；另外他还发现该突变体能增加对砷的抗性。删基 因在所有组织中均表达，尤其在根，花，开始衰老的叶片中。p 忍f 坞自码一个与 s e c l 2 蛋白相关的植物特殊蛋白，它定位在内质网膜上，协助p t i 运出内质网， n o r t h e r n 杂交发现，p h r l 也调控p h f ，的表达( g o n z ae s p e r a n z a ，e ta l ，2 0 0 5 ) 。 o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 m i u r a 等( 2 0 0 5 ) 在拟南芥中发现了突变体s i z l ，该突变体对磷饥饿超敏，表现 为主根缩短，侧根与根毛数量增加；定位发现彳t s i z i 是位于拟南芥第5 条染色体 上的；通过拟南芥数据库发现a t s i z l 与酵母中s i z l ，s i z 2 及人类的p i a s 蛋白同源， 编码s u m oe 3 连接酶，在s u m o 化过程中起重要作用；另外通过体内体外的蛋 i ! t w e s t e r n 杂交实验发现a t s i z l 的功能就是s u m oe 3 连接酶。比较突变体中磷信 号基因表达量的变化发现：a t p t 2 ，a t p s 2 ，a t p s 3 基因的表达量在正常供磷情况 下突变体s i z l 的表达量增强，表明a t s i z l 对这些基因有负调控作用。另外一些磷 饥饿信号基因如4 删峪，a t r n s l 等在在磷饥饿条件最初阶段时比野生型表达量下 降，而4 t l p s i ，a t r n s i 是受p h r l 调控的，这表明p h r l 通过s u m o 化来调节这几 个基因的，研究发现p h r l 有两个s u m o 化位点。但是在长期磷饥饿的情况下， a t l p s l 和a t r n s l 的表达量与野生型表达量相差不大，表明p h r i 的s u m o 化在低 磷诱导的反应中并没有起主要作用；但是，4 倒刁在植物适应磷饥饿方面调节根构 型方面起这重要作用，表明a t s i z i 通过其他途径调节植物低磷情况下根构型的变 化( k e n j im i u r ae ta 1 2 0 0 5 ) 。 2 磷信号系统的研究 t i o e e o n i ( 2 0 0 4 ) 系统阐述了磷饥饿情况下，植物的生存策略和应对机制。植 物通过改变内在代谢机制提高磷的利用效率和增加磷的吸收运输能力，通过改变 根系结构来增加根与土壤的接触面积；并分析几个磷信号相关基因的相互关系， 提出植物体内磷信号感应，转运和调节途径( c a r l aa t i o c c o m ，2 0 0 4 ) ( 图1 1 ) 。 2 o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 图11 拟南芥中磷信号传导途径( c m - l a a t i o c c o n i , 2 0 0 4 b ) 。 最近，非编码r n a 作为调控子在植物基因表达调控中的作用已被发现，如 m i c m 鼢队通过调节基因表达参与了植物生长发育等许多重要生理过程。 c h i o u 等( 2 0 0 6 ) 发现磷饥饿情况下，m i r 3 9 9 表达上调，而e 2 在根中明显下调， 但在地上部中只有略微下调即使m i l l 3 9 9 在根部与地上部中积累相同，e 2 在根 部抑制效果仍然远远高于地上部；m i r 3 9 9 的超表达抑制e 2 的转录本的积累。通 过转基因的方法，构建m i r 3 9 9 超表达载体，发现m i r 3 9 9 超表达缺磷情况下引起植 物地上部磷水平比正常情况高出5 6 倍，这种表型与e 2 突变引起的功能丧失的 表型相似，使得植物的地上部分出现磷毒害症状。出现这种症状的原因一方面是 磷吸收增加，另一方面是地上部磷向下运输受到抑制，衰老叶片向幼嫩叶片磷转 运也受到抑制，因而是幼嫩叶片首先表现出磷饥饿症状。这表明在磷饥饿情况下 m i r 3 9 9 的诱导能使得e 2 的表达下调，增加磷的吸收，促进磷的转运，从而调节 植物体内磷的平衡；而m i l l 3 9 9 的正常供磷情况下的超表达则破坏植物体内磷的 平衡( c h i o u , e ta l , 2 0 0 6 x 图1 2 ) 。 3 o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 图12m i r 3 9 9 和e 2 连接酶在野生型和m i r 3 9 9 超表达植株中调节植物体内磷平衡的假说 ( c h i o u , e ta l 2 0 0 6 ) 。 b a r i ( z 0 0 6 ) 等利用图位克隆的方法克隆了删基n ( a t 2 e , 3 3 7 7 0 ) 。分析表明 p h 0 2 基因大约5 5 k b 的大小，包含9 个外显子，编码4 1 k b 的转录本，其中包括1 1 k b 的5 端非编码序列和一个大约9 0 7 个氨基酸的蛋白质。进一步研究发现，该蛋白 是受m i r 3 9 9 调节的e 2 连接酶。m i r 3 9 9 也强烈受低磷诱导，供磷情况下又很快被 抑制，在缺磷和m i r 3 9 9 超表达株系中p h 0 2 的转录水平变化与m i r 3 9 9 的转录水平 变化相反，但尸_ 肋2 的表达可能还受磷的另一种系统的调节。在：p h r l 突变体中， 缺磷情况下m i r 3 9 9 的表达量受到抑制，一些在p h r l 缺磷情况下受到抑制的磷信 号响应基因，：庄：p h 0 2 供磷情况下却发生上调，这表明m i r 3 9 9 p h 0 2 途径是p h r l 下游的磷信号的一个分支，调控一些磷信号响应基因，及磷在植物地上部与地下 部的分配。通过嫁接发现无论地上部的基因型是什么，只要根的基因型是p h 0 2 时，地上部表现出磷积累症状。同时在a t h i 基因芯片中找到许多磷饥饿诱导表 达的基因在正常供磷的p h 0 2 突变体中与野生型相比表达增强，在缺磷处理情况下 与野生型相比并无变化。表明在咖2 突变体中正常供磷情况下部分磷缺失信号系 统仍然起作用。通过对拟南芥中磷转运体表达分析研究，发现正常供磷情况下 p h 0 2 e 9 的p h t l ；8 和p h t i ；9 中表达量与野生型相比增加，同时也发现有些磷转运 体在正常供磷情况下砌d 2 中的表达量与野生型相比反而减少，这表明有些磷转运 体受p h 0 2 的诱导，有些又受到它的抑制。p h 0 2 基因在所有组织中都有所表达， 尤其是在衰老的叶片和成熟的种子中，另外缺氮和长期光照也会引起尸卸9 2 的转 录提高，可能这些条件都加快植物衰老。p h 0 2 的5 端非编码区包含2 1 个核苷酸， 4 o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 与m i r 3 9 9 上的序列互补，m i r 3 9 9 引起j p _ 阿d 2 转录后降解，并且在其它高等植物中 也找到类似情况，表明该信号调控系统是一种保守机制( b a r ie t a l ，2 0 0 6 ) ( 1 3 ) 。 、p i ，厂、 h 一 i 酱 p f 弩 上 7 。 t ，1 4 0 2 一蠹怒蕊 ： 馏。, 1 a n d 8 1 z l ； n r 1 、 p - 0 2 - - - - _ - p h 0 2 a n s c r i p t ( u s c ) l t a r g e tp r o t e i n s r s u b s e to fp s ig e n e s i n c l u d i n g 嗍：8a n dp h t l ：9 图1 3p h r l , m i r 3 9 9 , p h 0 2 之间的关系( b a d e t a l 2 0 0 6 ) 。 o ，p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 第二章o s p h r 2 与a t p h r l 结构比较分析 1 材料与方法 1 1 材料 生物信息学分析相关软件：d n a s t a r ，c l u s t a l x l8 3 b i o e 湎t g e l l e d o c 3 2 ，a c c e l r y sd s v i s u a l i z e r l 5 等 生物信息学分析相关网站：n c b i ，e b i , t a i r , p l a c e , p f a m , e x p a s y 等 1 2 方法 1 2 1o s p h r 2 蛋白序列的获得 在t a u 丛p ；凼凸璎逊i 亟q 画坠盟凹网站中输入p h r l 可以找到a t p h r l 相关信息，然后将其蛋白序列放入n c b i ( h t t p ：w w w n c b i , n l m n i k g o v b l a s t ) 进行蛋白比对，在水稻中找到与a t p h r l 氨基酸序列结构最相近的基因。 1 2 2o s p l t r 2 与a t p h r l 蛋白结构分析 将a t p h r i ，o s p h r 2 蛋白序列做成f a s t a 格式，然后将其放入 e b i ( h t t p ：w w w e b i a c u k c l u s t a l w ) i 网站，进行蛋白比对发现其高度同源序列，然 后将结果用c l u s t a l x l 8 3 打开后，存储为m s f 格式，再用g - e n e d o c 3 2 打开，即 可清楚看到蛋白比对结果。 然后分别将 a t p h r i ，o s p h r 2的蛋白序列放入 p f a m ( h t t p ：p f a m i a n e l i a o r g h m m s e a r e h s h t m l ) 网站检查其结构域类型。 再将a t p h r l ，o s p h r 2 的蛋白序列放k e x p a s y ( h t t p ：c n e x p a s y o r g p r o s i t e ) 中，检查其蛋白相关作用位点。 6 o s p h r 2 与m p 喇t ，基因功能比较分析 2 结果与讨论 通过蛋白序列b l a s t 分析发现在水稻中找到与其结构最相近的基因。发 现a k 0 6 3 4 8 6 和a k l 0 0 0 6 5 与其最相近，视其为a t p h r i 的同源序列，并分别 命名为o s p h r l ，o s p h r 2 ( 由于o s p h r i 与野生型c o l 相比没表型变化，所以 我们重点研究了o s p h r 2 ) 。为了研究o s p h r 2 和a t p h r i 之间的结构差异，我 们将2 个蛋白的氨基酸序列比对，发现m y bd n ab i n d i n g 结构域和c o i l - c o i l e d 结构域在这两个蛋白中高度同源。在高度同源序列内部也发现不同之处，例如： 在a t p h r i 的3 4 0 - 3 4 7 处存在t y r o s i n ek i n a s ep h o s p h o r y l a t i o ns i t e 。而在o s p h r 2 所对应的位点的c ( c y s ) 代替y ( t y r ) ，因而酪氨酸激酶磷酸化位点消失。在 a t p h r l 的3 7 2 处存在s u m o y l a t i o ns i t e ，而在o s p h r 2 的所对应的位点的g ( g l y ) 代替k ( l y s ) ，s u m o y l a t i o n 位点消失( 图2 1 ) 。 图2la t p h r i 和o s p h r 2 蛋白氨基酸序列比较分析，其中红色线下为m y b 结构域，绿色 线下为c c 结构域，红色箭头指示的为t y r o s i n ek i n a s ep h o s p h o r y l a t i o ns i t e ，绿色箭头为 s u m o y l a t i o ns i t e 为了进一步研究两者的结构差异，我们对a t p h r i 和o s p h r 2 蛋白的三级 结构分析，发现a t p h r i 蛋白的c o i l - c o i l e d 结构域处为觚螺旋，而在o s p h r 2 蛋白的c o i l - c o i l e d 结构域中问出现转角( 图2 2 ) 。通过研究该区域氨基酸发现， 在a t p h r i 蛋白的该区段内存在较多芳香族氨基酸如y ( t y r ) ，f ( p h e ) 和残基比 较复杂的氨基酸如n ( a s n ) ，k ( l y s ) ，因而其内阻要大于o s p h r 2 中该区段的氨基 酸，预测这可能是两者结构差异的原因。 7 o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 图2 2a 为o s p h r 2 预测蛋白的三级结构，b 为a t p h r l 预测蛋白的三级结构，其中，彩色 的结构为m y b 结构域，黄色结构为c o i l - c o i l e d 结构域，红箭头指示的氨基酸为t y r o s i n e k i n a s ep h o s p h o r y l a t i o ns i t e ，黄色箭头的为s u m o y l a t i o ns i t e 8 o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 第三章a t p h r l 基因增强表达载体的构建 1 材料与方法 1 1 材料 拟南芥：c o l 野生型的c d n a 大肠杆菌菌株：d h 5 a 农杆菌菌株：e h a l 0 5 载体：p c a m b i a l 3 0 0 ：3 5 s 工具酶：l at a qd n ap o l y m e r a s e ，p f ut a qd n ap o l y m e r a s e ，限制性内切酶 b a m i - i i ，s a i l ，t 4 d n a p o l y m e r a s e ( 以上酶均有t a k a r a 公司生产) 试剂；卡那霉素( k a n ) 5 0 m g m l ，潮霉素( h y g ) 2 0 m g m l t 凝胶回收试剂盒( u - g e n e ) ， 溶液h5 0 m r n o l l 葡萄糖，2 5 m m o l lt r i s h c l ( p h s o ) ， 1 0 m m o l le d t a ( p n s 溶液n ：o 2 m o f ln a o h ，1 s d s 溶液1 1 1 5 m o l l 乙酸钾6 0 m l ，冰乙酸11 5 m l ，d d i - 1 2 02 8 5 m l 培养基：l b ( 1 0 9 t r y t o n e p o w e r l ，5 9 y e a s t e x = 仃a c t l ，1 0 9 n a c i l ，固体加a g a r b 1 5 9 l ，含k _ a n 的培养基5 0 m g m l 的k a nl m l l ) ， s o c ( 2 0 9t r y t o n ep o w e r l ，5 9y e a s te x t r a c t l l ，05 e a n a c v t , , l m o llk c l 2 5 m l ，1 m o l lm g c l 21 0 m l ，l m o u l 葡萄糖2 0 m l ) y e p ( i o gt r y t o n ep o w e r l ，1 0 9y e a s te x t r a e t l ，5 9 n a c f l ，固体加1 2 1 5 9 a g a r b l ) 仪器：p c r 仪( d n ae n g i n eg r a d i e n tc y c l e r , m o - r a d ) ，电泳槽( s u b - c e l l g t , b i o r a d ) ，超净工作# ( a i r t e c h ) ，凝胶成像系统( f r - 2 0 0 a 全自动紫外与 可见光分析装置，s m a r t v i e w 生物电泳图象分析系统，复日科技) ，室温离心机 ( c e n t r i f u g e5 4 1 5 d ，e p p e n d o r f ) ，可控温离心机( c e n t r i f u g e5 8 1 0 r ，e p p e n d o r f ) ， r x z 型智能人工气候箱 o s p h r 2 与a t p l 4 r 1 基因功能比较分析 1 2 方法 1 2 1 目的基因爿t p h r i 的获得 在n c b i 网站中找至i j a t p h r l 基因的e d n a 序列，然后设计引物。我们计划在 引物的两端设计两个酶切位点，上游引物为b a m h l ，下游引物为s a l l 。 上游引物：5 a t a g g a t c c t c c t t g g t c c t g g a i i g3 下游引物：5 a r a g t c g a c g a l l = a t c c a g c a a a a g a c c3 测序引物：5 t g c 沱g a a c c a g t t t c t g a t g3 利用c o l 野生型拟南芥的c d n a 作为模版p c r 获得a t p h r l 基因( 引物有 i n v i t r o g e n 公司合成) 。 反应体系：2 0 p l 1 0 x l ap c rb u f f e r ： 2 r a d n t p ( 2 5 r a m ) ：3 2 m a t p h r l - u p p e r ( 2 0 u m ) ：0 2 m a t p h r l - l o w e r ( 2 0 u m ) ：0 2 一 l at a t ： o 1 m p f u t a q ： o 1 m t c m p ：2 1 a d d h 2 0 , 1 2 2 埘 反应条件： 9 5 9 5 5 6 7 2 7 2 5 r a i n 3 0 s 3 0 s 9 0 s 3 0 c y c l e s 5 r a i n 将p c r 产物跑胶( 1 的a g a r o s e ) ，割胶，回收纯化。回收采用u - g e n eh q & q 凝胶回收试剂盒( 方法见试剂盒说明书) 。 1 0 o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 1 2 2 载体构建 回收产物用b a m h l 和s a i l 双酶切，同时对质粒p c m v m 认1 3 0 0 ：3 5 s 也 用b a m h l 和s a l l 双酶切， l o x tb u f f e r ：4 5 u 1 b a m h l ：0 3 l l s a l l ：0 3 u l a l p h r l ：3 0 砖 d d h 2 0 ：2 1 9 u 1 l o tb u f f e r ： b a m h l ： s a l l ： p c a m b i a l 3 0 0 ：3 5 s ： d d h 2 0 ： 再将酶切产物连接， 3 7 2 h o u r s 4 5 1 t l o 3 m 0 3 m 3 o m 2 1 9 山 1 0 t 4d n a p o l y m e r a s eb u f f e r ： p c a m b i a l 3 0 0 ：3 5 s ( b a m h l s a l l ) ： a t p h r l ( b a m h l s a l l ) ： t 4d n a p o l y m e r a s e ： 1 6 连接过夜 1 2 3 热击转化大肠杆菌 1 取感受态e e o l id h 5 a 细胞冰上冻融。 2 将l o 山连接产物放入感受态e c o l id h 5 a 细胞，冰中放置3 0 r a i n 。 3 4 2 1 29 0 s 后放到冰中静置5 r a i n 。 4 加入5 0 0 # s o c 培养基( 不含任何抗生素) ，3 7 cl o o r p m ，培养l h o u r 。 5 4 0 0 0 r p m ，2 m i n 离心富集，弃上清4 0 0 i d ，剩下的用枪头吹打几下，使菌悬 浮。 叫训 o s p h r 2 与a t p h r i 基因功能比较分析 6 取1 0 0 l _ d ，涂含k a n 的l b 平板，正向放置5 m i n 后，用封口膜封好，倒置培 养过夜。 将长出的单克隆挑入2 m l 含k a n 的l b 液体培养基中，培养8 1 0 h o u r s ，然后提质粒。 1 2 4 碱裂解法抽提质粒 1 将1 1 5 m l 菌液离心1 2 0 0 0 r p m ，离一t ：, s m i n 。 2 弃上清，在沉淀中加入1 0 0 m 的用冰预冷的溶液i ，剧烈振荡，使沉淀悬浮， 完全分散。 3 加, x , 2 0 0 m 溶液( 新配置) ，盖紧管1 ：2 ，快速颠倒数次，确保离心管的整个内 表面与溶液兀接触，将离心管置于冰上2 m i n 。 4 加入1 5 0 i _ t l 预冷的溶液，盏紧管1 ：3 ，颠倒混合1 0 s ，冰上放置1 0 m i n 。 1 2 0 0 0 r p m ，离1 ) , 5 m i n 。 5 将上清转移到另一新的离心管中，加入等体积的氯仿异戊醇( 2 4 ：0 ，颠倒混 匀，1 2 0 0 0 r p m ，离，1 ) , 5 m i n 。 6 将上清转入另一新离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，一2 0 冰箱 放置1 0 m i n ；1 2 0 0 0 r p m ，离一t 二, 5 m i n ，弃上清。 7 加入l m l 的7 5 的乙醇，洗涤沉淀；8 0 0 0 r p m ，离一d , 5 m i n , 弃上清。 8 将沉淀放入3 7 c 烘箱中，干燥1 5 m i m 然后加入2 0pl 含r n a s e a 的双蒸水溶解， 3 t c 烘箱中3 0 r a i n ，取出后放于4 冰箱中。 用b a m h l ，s a l l 双酶切鉴定目的基因是否连进去，测序分析鉴定，将保真性最 高的克隆作为下步转入农杆菌载体。 1 2 5 电击转化农杆菌 农杆菌感受态细胞制备 l 。挑取单克隆接种于2 m l y e p ( 含5 0 m g l 链霉素) 液体培养基，2 8 ( 2 ，2 5 0 r p m ， 振荡培养过夜( 如用5 m l y e p ，需培养3 6 h o u r s ) 。 2 将菌液按i ：1 0 0 转移至2 0 0 m l y e p ( 含5 0 m g ! 链霉素) 培养液中，2 8 c ，2 5 0 r p m ， 振荡培养至0 1 3 = = 0 3 ( 约4 5 h o u r s ) 。 o s p h r 2 与a t p t t r i 基因功能比较分析 3 转入5 0 m l 的无菌离心管，4 3 2 ，4 0 0 0 r p m 离心1 0 r a i n ，弃上清。 4 用2 0 m l 冰浴的f i e p e s ( i m m ，p h ：7 o ) 重悬。 5 4 3 2 ，4 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，弃上清。 6 重复4 、5 步骤2 3 次。 7 用2 m l 冰浴的1 0 甘油重悬。 8 每管1 0 0 9 1 分装于1 5 m l 无菌的e p p e n d o r f 管中，一7 0 保存。 注：l m mh e p e s 的配制：称取0 1 1 9 9 h e p e s ( m w2 3 8 3 ) 粉末，加水溶解，定 容至5 0 0 m l ，用n a o h 调p h 至7 0 ，灭菌后待用( h e p e s 需现用现配) 。 电击法转化农杆菌感受态细胞 1 取出农秆菌感受态细胞于冰上冻融。 2 加2 1 a l 质粒d n a 于1 0 0 $ t l 感受态细胞中，用枪头轻