（有机化学专业论文）电聚合26吡啶二甲醛膜电极的制备及其应用研究.pdf

册舢舢f f 舢f | f f f fy 1 , 7 , , , u 4 i l l l o l i lr l l 3 i i t l l l o l l l l i l 8 r r i l l 。 电聚合2 , 6 一吡啶二甲醛膜电极的制备及其应用研究 摘要 d n a 探针的固定是d n a 电化学生物传感器制备的首要问题，固化量和活性 直接影响着传感器的灵敏度。目前d n a 固定方法主要有直接吸附法、共价键合法、 聚合膜法、自组装膜法和蛋白质结合法等方法。本论文采用聚合物膜法制备了 d n a 电化学生物传感器，研究了其性能并进行了应用实验。主要内容如下： 在玻碳电极上电聚合2 ，6 吡啶二甲醛，制备成聚2 ，6 一吡啶二甲醛膜( p p y ) 电极， 并研究和优化了电聚合的实验条件。以聚2 ，6 吡啶二甲醛膜电极为基底，再共价 键合硫堇至聚2 ，6 吡啶二甲醛膜的表面上制备成修饰电极( t h p p y g c e ) 。用电化 学交流阻抗表征了该修饰电极的制备过程：以差示脉冲伏安法研究了该修饰电极 对鲱鱼精d n a 的作用，发现该修饰电极对d s d n a 具有选择性的伏安响应。在优 化的实验条件下，修饰电极氧化峰电流与d s d n a 浓度的对数在1 o 1 o 1 0 弓m g c l 范围内呈现良好的线性关系，检测限为0 0 6 m g l 。将该修饰电极用于检测鲱鱼精 d n a 的化学损伤，其峰电流与d n a 的损伤程度成正比。该修饰电极制备简单、 检测快速，重现性和稳定性较好。 以t l l p p y g c e 为基底，再利用戊二醛将d n a 固定于该修饰电极上，并用于 d n a 的杂交。应用差示脉冲伏安法和电化学交流阻抗谱对d n a 的固定和杂交进 行了表征。以硫堇为电化学指示信号，用微分脉冲伏安法对存在于许多转基凶植 物中的花椰菜花叶病毒( c a m v 3 5 s ) 启动子基因片段进行了定量测定，发现在 1 0 1 0 _ 1 0 1 o 1 0 - 6 m o l l 叫浓度范围内，c a m v 3 5 s 启动子目标基因的浓度与硫堇 还原峰电流的降低值呈良好的线性关系，检测限为3 4 1 x 1 0 _ 1 1 m o l l 。 以t p p y g c e 为基底，再利用纳米金( n a n o a u ) 将d n a 固定于该修饰电极 上，应用微分脉冲伏安法和电化学交流阻抗谱对d n a 的| 壶i 定和杂交进行了表征。 微分脉冲伏安法的检测结果显示本法检测目标d n a 有较高的灵敏度。用本法检 测转基因植物外源p a t 基因片段，线性范罔为1 o 1 0 叫i 1 o 1 0 - 6 m o l l - 1 。检测限 为3 3 6 x1 0 1 2 m o l l - 1 。 关键词：聚2 , 6 一吡啶二甲醛膜电极戊二醛硫革纳米会脱氧核糖核酸 p r e p a r a t i o na n da p p l i c a t i o no f p o l y ( p y r i d i n e 一2 ，6 一d i c a r b a l d e h y d e ) f i l m e l e c t r o d e a bs t r a c t t h ek e ys t e pi nt h ep r e p a r a t i o no fd n ab i o s e n s o r si st h ei m m o b i l i z a t i o no f s s d n aa tt h ee l e c t r o d e m a n ym e t h o d sh a v eb e e ne m p l o y e df o rt h ei m m o b i l i z a t i o no f d n a ，i n c l u d i n ga d s o r p t i o n ，s e l f - a s s e m b l y m o n o l a y e r , c o v a l e n tb i n d i n g ，b l e n d i n ga n d e l e c t r o p o l y m e r i z a t i o n t h i sp a p e rf o c u s e so nf a b r i c a t i n gn o v e le l e c t r o c h e m i c a ld n a b i o s e n s o r sb yu s i n ga ne l e c t r o p o l y m e r i z a t i o nm e t h o d t h ep a p e ri ss u m m a r i z e da s f o l l o w s ： i no r d e rt op r e p a r ean e we l e c t r o c h e m i c a ld n a b i o s e n s o r , at h i o n i n e p o l y ( p y r i d i n e 一2 , 6 一d i c a r b a l d e h y d e ) m o d i f i e de l e c t r o d e ( t h p p y g c e ) w a sp r e p a r e db ye l e c t r o p o l y - m e r i z i n gp y r i d i n e 一2 ，6 一d i c a r b a l d e h y d eo nag l a s s yc a r b o ne l e c t r o d e ，a n dc o v a l e n t l y i m m o b i l i z i n gt h i o n i n eo nt h es u r f a c eo fp o l y ( p y f i d i n e 一2 ，6 一d i c a r b a l d e h y d e ) f i l m t h e p r e p a r e dp r o c e s sa n de l e c t r o c h e m i c a lr e s p o n s e so ft h p p y g c ew e r ei n v e s t i g a t e db y u s i n ge l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p ya n dd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y t h ec h a r a c t e r i s t i cr e s p o n s e so ft h p p y g c ef o rt h ed s d n ao nt h ep o t e n t i a la n d c u r r e n tw e r ef o u n di nf a v o ro fd i s c r i m i n a t i o no ft h es s d n aa n dd s d n a u n d e rt h e o p t i m u mc o n d i t i o n s ，t h ec u r r e n ti n t e n s i t yw a sp r o p o r t i o n a lt ot h el o g a r i t h mo fd s d n a c o n c e n t r a t i o no v e rt h er a n g ef r o m1 0t o1 o x10 - 3 m g lm e t ew i t hac o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n to fo 9 9 8 8 a n da0 0 6m g ld e t e c t i o nl i m i t t h em o d i f i e de l e c t r o d ew a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e c tt h eo x i d a t i v ed a m a g et od s d n am e d i a t e db yf e n t o n r e a c t i o n t h el e v e lo fd n a d a m a g ec a nb ed i s t i n c t l ys h o w e db yo b s e r v i n gt h ec h a n g e o fc u r r e n ti n t e n s i t ya n dt h es h i f to fp o t e n t i a l t h em o d i f i e de l e c t r o d ea l s oh a sag o o d s t a b i l i t y a n dt h er e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o ni sl e s st h a n4 8 3 f o r5e l e c t r o d e o nt h eb a s i so ft h p p y g c e ，t h ea m i n og r o u p so ft h i o n i n ew e r eu s e dt o c o v a l e n t l ya t t a c hd n ap r o b e sm a i n l yv i at h ea i do f9 1 u t a r a l d e h y d ec r o s s l i n k i n g t h e d i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r ya n de l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p yw e r e u s e dt or e p r e s e n td n ai m m o b i l i z a t i o na n dh y b r i d i z a t i o n t h em o d i f i e de l e c t r o d ew a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e c tt h ec o n c e n t r a t i o no fc a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u sp r o m o t e r f r a g m e n t ( c a m v 3 5 s ) i nm a n yt r a n s g e n i cp l a n t sb yt h ed i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec u r r e n ti n t e n s i t yw a sp r o p o r t i o n a lt ot h e c o n c e n t r a t i o no fc a m v 3 5 si nt h er a n g e d e t e c t i o nl i m i tw a s3 4 1 10 一m o l l o f1 0 0 x 1 0 一0 1 o o x l o 一6m o l l a n dt h e o nt h eb a s i so ft 1 1 p p y g c e t h eg o l d n a n o p a r t i c l e sw e r eu s e dt oa t t a c hd n a p r o b e s t h es s d n a n a n o - a 训t h p p y g c ew a sa p p l i e dt oh y b r i d i z i n gd n a t h e p r 印a r e dp r o c e s sw a si n v e s t i g a t e db yu s i n ge l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n c es p e c t r o s c o p y a n dd i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r y t h em o d i f i e de l e c t r o d ew a sm o r es e n s i t i v et h a n t h a tp r e p a r e db yg l u t a r a l d e h y d ec r o s s l i n k i n g t h ed i f f e r e n t i a lp u l s ev o l t a m m e t r yw a s s u c c e s s f u l l ya p p l i e dt od e t e c tt h ec o n c e n t r a t i o no ft h es o u r c ep a tg e n ef r a g m e n to f t r a n s g e n i cp l a n t s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec u r r e n ti n t e n s i t yw a s p r o p o r t i o n a lt ot h ec o n c e n t r a t i o no fp a tg e n ef r a g m e n t ，t h el i n e a rr a n g ei s1 0 x10 一 m o l l 1 t o1 o x10 - 6 m o l l 一，a n dt h ed e t e c t i o nl i m i ti s3 3 6 xl o - 1 2 m o l l k e y w o r d s ： p o l y ( p y r i d i n e 一2 ，6 一d i c a r b a l d e h y d e ) f i l me l e c t r o d e t h i o n i n e d n a g l u t a r a l d e h y d eg o l dn a n o p a r t i c l e s 目录 第一章前言1 1 1d n a 生物传感器简介_ 工1 1 1 1d n a 的化学组成与结构1 1 1 2d n a 电化学传感器的基本原理2 1 1 3d n a 生物传感器的设计3 1 1 4 d n a 在基底材料上的固定方法3 1 1 5d n a 杂交的信号转换5 1 1 6 杂交条件6 1 2小分子与d n a 的相互作用6 l ：2 ：1 小分子与d n a 的相互作用方式6 1 2 2 小分子与d n a 相互作用的研究方法8 1 2 3 杂交指示剂9 1 3 纳米会在d n a 生物传感器研究中的应用1 1 1 3 1 纳米技术的d n a 传感器一1 1 1 3 2 纳米会颗粒简介1l 1 3 3 纳米会颗粒的制备1 2 1 3 4 纳米金提高| 卉| 载的d n a 鼙1 2 1 3 5 纳米会标记d n a 的应用13 1 4d n a 电化学传感器应用1 4 1 5d n a 电化学传感器的发展趋势16 1 6 本论文选题背景和研究思路1 6 第二章硫堇聚2 ，6 吡啶二甲醛膜电极监测d n a 分子的扩增。1 8 2 1 引。占18 2 2 实验部分1 9 2 2 1 仪器与试剂19 2 2 2 非水性参比电极的制备1 9 2 2 32 , 6 吡啶二甲醛聚合液的制备1 9 2 2 4 硫堇聚2 , 6 吡啶二甲醛膜修饰电极的制备1 9 2 3 测试方法2 0 2 4 结果与讨论2 0 2 4 1 修饰电极的制备2 0 2 4 2 修饰电极的电化学表征2 2 2 4 3 修饰电极与鲱鱼精d n a 之间的作用机理2 3 2 4 4 修饰电极与鲱鱼精d s d n a 之间的作用时间的影h 吼2 4 2 4 5 溶液p h 值对鲱鱼精d n a 检测的作用影响2 5 2 4 6 鲱鱼精d s d n a 于电极表面的伏安行为研究2 5 2 4 7 重现性与稳定性2 7 2 5 本章小结2 7 第三章d n a 在戊二醛硫堇聚2 ，6 一吡啶二甲醛膜修饰电极上固定和 杂交及其c a m v 3 5 s 基因片段的电化学阻抗谱测定2 8 3 1 引言2 8 3 2 实验部分2 9 3 2 1 仪器与试剂2 9 3 2 2g a t h p p y g c e 电极的制备2 9 3 2 3d n a 探针的固定与杂交3 0 3 2 4 循环伏安法3 0 3 2 5 交流阻抗法3 1 3 2 6 差示微分脉冲伏安法3 l 3 3 结果与讨论3 1 3 3 1 修饰电极的制备及表征3 l 3 3 2 各修饰电极的交流阻抗谱图3 2 3 3 3 实验条件的优化3 3 3 3 3 1 固定方法的选择一3 4 3 3 3 2 固定时间的选择一3 4 3 3 3 3 杂交方法的选择3 4 3 3 3 4 杂交温度的选择3 5 3 3 3 5 杂交时问的选择3 5 3 3 4c a m v 3 5 s 基因片段的电化学方法测定3 5 3 3 4 1c a m v 3 5 s 基因片段的电化学交流阻抗测定3 5 3 3 4 2c a m v 3 5 s 基因片段的电化学差示微分脉冲伏安测定3 6 3 3 4 3c a m v 3 5 s 基因片段杂交检测的灵敏度3 8 3 3 5d n a g a t h p p y g c e 传感器的重现性与稳定性3 9 3 4 本章小结4 0 第四章d n a 在纳米金硫堇聚2 ，6 吡啶二甲醛膜修饰电极上的固定 和杂交及其p a t 基因片段的电化学阻抗谱测定4 l 4 1 引言扁二4 1 4 2 实验部分4 1 4 2 1 仪器与试剂4 l 4 2 2a u 纳米粒子的制备4 2 4 2 3n a n o a u t h p p y g c e 电极的制备4 2 4 2 4d n a 探针的固定与杂交4 3 4 2 5 交流阻抗法4 3 4 2 6 差示微分脉冲伏安法4 3 4 3 结果与讨论4 4 4 3 1 修饰电极的制备与表征4 4 4 3 2 各修饰电极的交流阻抗谱图4 5 4 3 3 实验条件的优化4 6 4 3 3 1 固定方法的选择4 6 4 3 3 2 固定时问的选择4 7 4 3 3 3 杂交方法的选择4 7 4 3 3 4 杂交温度的选择4 7 4 3 3 5 杂交时f h j 的选择4 7 4 3 4p a t 基因片段的电化学方法测定4 8 4 3 4 1p a t 基因片段的电化学交流阻抗测定4 8 4 3 4 2p a t 基因片段的电化学差示微分脉冲伏安测定4 9 4 3 4 3p a t 基因片段杂交检测的灵敏度5 0 4 3 5d n a n a n o - a u t h p p y g c e 传感器的重现性与稳定性5 2 4 4 本章小结5 3 参考文献一5 4 结论6 3 致谢6 4 l 一 攻读学位期间已发表和待发表的相关学术论文题录6 5 独创性声明“ 青岛科技大学研究生学位论文 第一章前言 脱氧核糖核酸( d e o x y r i b o n u e l e i c a c i d ，d n a ) 是组成生物体的重要物质，是遗 传信息的携带者和基因表达的物质基础，d n a 的复制是生物遗传的分子基础。 所以d n a 对于生物的生长、发育和繁殖等活动起着十分重要的作用，故对其结 构的分析在整个生命科学研究中有着极其重要的地位。同时，对特定序列d n a 的分析以及对d n a 链中碱基突变的检测在抗癌药物的研制和药理分析、环境的 检测和控制、法学鉴定以及流行病、传染病、遗传疾病、肿瘤等的早期诊断和治 疗方面都具有十分深远的意义。 随着基因工程技术的飞速发展，传统的生化分析方法已不能满足其分析测试 的需要。因此许多交叉学科的分析手段在生命科学领域的应用引起了广泛的关 注。近年来，对d n a 常见的分析方法有电化学法、荧光光度法、光散射技术及 色谱法等。其中d n a 电化学传感器是目前d n a 传感器中较成熟的一种，文献报 道也是最多的【1 5 】。电化学d n a 传感器是近些年迅速发展起来的一种全新的生物 传感器，其用途是通过检测基因及一些能与d n a 发生特殊相互作用的物质，利 用d n a 分子间的特异性互补配对规律，研究对特定核酸序列( 基因片段) 实现快速 分析的方法，为分子生物学研究提供了全新的基因检测技术 6 - 9 。电化学分析技术 具有仪器简单、价格低廉、选择性好、测定快速准确及方法灵敏度高等特点，且 不需诱导放射源或光源，不受检测液浑浊度影响，易微型化【协1 3 1 。已被广泛应用 于研究d n a 的结构形态f 1 4 1 、碱基序列【1 5 1 、d n a 损伤【1 6 1 7 1 、基因诊断f 1 8 , 1 9 、病毒 检测【硎及蛋白质链的分析1 2 1 l 等诸多领域。因此，d n a 电化学传感器是一类非常 有发展前途的基因传感器。d n a 电化学生物传感器也可望在转基因产品的分析 和检测方面得到应用。随着转基因产品走进人们日常生活 2 2 , 2 3 1 ，转基因产品的安 全性及其对生态环境的影响引起了民众、各国政府和国际组织的广泛关注。因此 转基因产品的分析检测已经提上了重要同程。d n a 电化学传感器可能为人们提 供一种准确、快速、简便而又廉价的新方法进行转基因产品d n a 的检测。 1 1d n a 生物传感器简介 1 1 1 d n a 的组成和结构 d n a 是一种许多单元组成的线性大分子，它的基本结构重复单元是脱氧核 苷酸，组成结构如上图所示。d n a 在碱基组成上遵从c h a r g a f f 规则，即腺嘌呤a 和胸腺嘧啶t 的量相等，鸟嘌呤g 和胞嘧啶c 的量相等，而嘌呤的总数等于嘧 电聚合2 , 6 吡啶二甲醛膜电极的制备及其应用研究 啶的总数。 d n a 是以4 种脱氧核苷酸为基本单元组成的多聚核苷酸，脱氧核苷酸之间 通过磷酸二酯键相连接。脱氧核苷酸由脱氧核糖、磷酸根和碱基3 种成分组成。 脱氧核糖是2 ，位没有羟基的五碳糖。碱基连接于脱氧核糖的1 位，磷酸基团连接 于脱氧核糖的3 ，位羟基或5 ，位羟基。构成d n a 分子的基本单元的脱氧核苷酸通 q 过3 ，5 ，一磷酸二酯键相连形成d n a 分子。d n a 的结构分为一级结构和空间结 构。d n a 由多条脱氧核糖核苷酸链构成，每条链均以磷酸基( 磷酸酯键) 桥从一个 核苷的3 ，连接到相邻核糖的5 ，位置上，这就是d n a 的一级结构。空间结构又分 为二级结构和三级结构，其中二级结构就是由j a m e sw a t s o n 和f r a n c i sc r i c k 在 1 9 5 3 年确定的d n a 的双螺旋结构，它是现代生物学诞生的标志。d n a 双螺旋结 构十分稳定，主要有三种力量来维持结构的稳定：( 1 ) 补碱基对之间的氢键；( 2 ) 碱 基堆积力，它主要是由于芳香族碱基的电子之间相互作用而引起d n a 分子中 的碱基层堆积，结果在d n a 分子内部形成一个疏水的核- 1 1 , ( h y d r o p h o b i cc o r e ) ；( 3 ) 磷酸残基上的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键。其中第二种力是主要 结合力。在二级结构的基础上，d n a 还可扭曲或卷曲形成三级结构。 1 1 2d n a 电化学传感器的基本原理 d n a 传感器的基本概念是指以d n a 为分子识别元件，与相应的换能器结合， 实现对特定化学物质的作用并产生相应的可检测信息( 光、电效应、热效应、场效 应和质量变化等1 【2 4 1 的传感装置。它与传统的标记技术方法相比，具有快速、灵 敏、无污染、操作简便、具有分子识别功能等优点，已成为当今生物传感器领域 中的前沿性课题之一。 d n a 电化学生物传感器的工作原理是：在合适的条件下，固定在电极表面 的已知序列的单链d n a 片段( d n a 探针1 溶液中的待测d n a 序列发生杂交，利 用两条互补的单链d n a ( s s d n a ) 相互作用，进而形成双链d n a ( d s d n a ) 。同时借 助于能够识别s s d n a 和d s d n a 的杂交指示剂在杂交前后的电化学信号的变化， 来定性检测目标基因是否存在；或者将待测基因片段固定在电极表面，然后与溶 液中的已标定杂交指示剂的d n a 探针进行杂交，来检测待测基因序列。一般而 言，在一定范围内，指示剂的响应信号与待测d n a 的浓度呈线性关系，以此来 检测d n a 的含量，达到定量测量的目的。 d n a 电化学生物传感器的基本结构包括一个能固定d n a 探针的电极及一个 换能器。d n a 探针是此类传感器的生物敏感元件，它是s s d n a 的片段或整链， 长度从十几到上千个核苷酸不等，一般使用已被公认的，可以识别待测序列所需 的最短序列，其碱基序列与待测d n a 片段的碱基序列互补。换能器即是杂交指 2 青岛科技大学研究生学位论文 示体系，它的功能是将d n a 杂交信息转化为电压、电流或电导等可以测定的电 化学信号，并且对固定化的s s d n a 和d s d n a 具有选择性响应，杂交前后的差异 可用具有电活性的指示剂来识别，从而达到检测靶序列或特定基因的目的。根据 实践经验，在选择d n a 探针时应遵循以下原则：探针长度为1 8 一- - 5 0 个碱基， 过长的d n a 探针会导致较长的杂交时间、较低的杂交效率，而过短的探针将缺 少杂交的特异性。g 、c 碱基的组成在4 0 6 0 之间最好，g 、c 碱基的比率 在此范围之外，非特异性杂交将会增加。在探针分子内不存在互补区，若存在 互补区可导致“发卡 结构，抑制探针杂交。应避免在探针序列中连续出现一 个碱基多次重复( 其长度 4 ) 如g g g g g 等。因此，制备d n a 电化学生物传感器 的两个关键问题是：探针在电极表面的固定技术；杂交信号的检测技术，即灵敏、 高效的电活性指示剂的选择。 1 1 3d n a 生物传感器的设计 利用d n a 传感器测定目标d n a 的整个过程通常包括以下四个步骤：( 1 ) 单 链d n a 的固定。将s s d n a 连接或者固定到一个稳定的表面，通常使用固体电极， 形成d n a 修饰电极；( 2 ) 杂交过程。将d n a 修饰电极放入被测溶液，当互补d n a 链与之相遇时，它们将在电极表面杂交形成d s d n a ，杂交条件必须严格控制；( 3 ) 杂交信号的转换，即如何将杂交信息转化为可测定的信息，如电信号、化学发光 信号等。( 4 ) 信号的检测。化学发光d n a 传感器通常是基于对固定在d n a 探针 上的标记物化学发光性质的检测来达到对目标d n a 进行检测的目的【2 5 。2 7 】。其中 s s d n a 在电极表面的固定和d n a 探针标记物的选择是此类传感器的关键问题， 也是制约d n a 传感器发展的瓶颈。 1 1 4d n a 在基底材料上的固定方法 d n a 探针的固定是d n a 电化学生物传感器制备的首要问题，固化量和活性 往往直接影响着生物传感器的灵敏度，一般情况下借助有效的物理方法或化学方 法把d n a 较为牢固的连接在电极上。d n a 电化学生物传感器所使用的基底电极 有金电极、玻碳电极、碳糊电极和裂解石墨电极等。目前d n a 固定方法主要有 直接吸附法、直接共价键合法、蛋白质结合法、聚合膜法等方法。 1 1 4 1 直接吸附法 这种方法是将d n a 浸泡吸附或恒电位吸附于电极表面，该方法既不需要试 剂也不需要对核酸进行特殊修饰。如在硅烷化的i t o 电极表面通过浸泡再干燥能 够固定s s d n a ，制得的传感器能够实现对目标d n a 的检测，方法简单快速【冽。 3 电聚合2 , 6 吡啶二甲醛膜电极的制备及其庸川研究 恒电位吸附法如w a n g 2 9 1 等n $ 电化学吸附法将d n a 探针修饰到碳糊电极上，他 们先将电极在+ 1 7 v 下活化约1m i n ，增加电极表面的粗糙度和憎水性，然后将电 极浸入含有d n a 的电解质溶液中在0 5v 吸附富集2m i n ，再用磷酸盐缓冲溶液 冲洗，即可分别固定肽核酸( p n a ) g ld n a 至电极表面。对肿瘤抑制基因p 5 3 进 行检测，获得满意的结果。这种依靠电极表面和d n a 分子之间的静电作用的固 定方法，使d n a 探针躺在电极表面，碱基指向溶液，利于下一步杂交，但这种 方法制备的传感器变性后很难重复使用。s u 【删等将单链d n a 吸附于氧化铅电极 表面来研究d n a 的杂交。林祥钦【3 1 】在纳米金粒子表面通过施加1 5v 的高电位 也能很好的吸附s s d n a ，得到的传感器对目标d n a 具有很好的识别作用。吸附 法的优点是简单，但电极表面d n a 分子的定向难以确定，电极稳定性不够，d n a 容易脱落。 1 1 4 2 直接共价键合法 这种方法中大多数采用碳质电极作为基底电极，其优点是表面易于引入各 种功能团，有利于s s d n a 的共价结合。m i k k e l s e n 3 2 1 采用碳糊电极作为基体电极， 采用组合的方法将硬脂酸或十八烷基胺修饰在电极上，然后于高浓度的d n a 水 溶性碳化二亚胺的体系中，使d n a 键合到电极表面上，由此制备了d n a 探针电 极，检测了囊性纤维变性基因的f 5 0 8 的序列。他，f i 3 3 3 4 1 还曾以玻碳电极为基体 电极，并用1 - 3 甲氨基丙基1 3 乙基碳化二亚胺盐酸j 嗡( e d c ) 和n 羟基硫代琥珀 酰胺( n h s ) 活化电极，使其与脱氧鸟嘌呤核苷残基相结合，从而使d n a 连接到电 极表面上。刘盛辉【3 5 3 6 】在氧化玻碳电极表面，以一种水溶性的乙基( 3 甲基丙基) 碳二亚胺盐酸盐和n 羟基磺基琥珀亚胺作为偶联活化剂，小牛胸腺d n a 和多聚 脱氧胞苷酸、多聚脱氧鸟苷酸片段通过活化的电极表面形成磷酰胺键共价结合到 电极表面。他们还用乙基( 3 二甲基丙基) 碳二亚胺盐酸盐和羟基丁二酰亚胺活化 已被氧化的光谱纯石墨电极，并将7 5 个碱基d n a 片段共价固定到电极表面i a t , a 踟。 1 1 a 3 蛋白质结合法 抗生素是一种较大的含有四个结合位点的蛋白质，而则是生物素是一种小分 子，它与抗生素之间存在着很大的亲和力，几乎等同于共价键的作用。这种作用 在d n a 传感器领域也得到了应用，e b e r s o l e 把抗生素首先接到石墨电极上，然 后再固定被生物素衍生化的d n a 探针p 9 】。 1 1 4 4 聚合物膜法 聚合膜法是指利用聚合物膜把d n a 探针固定在电极表面的方法，它可以综 合利用共价键合法和吸附法将d n a 固定于膜内从而对电极进行修饰【删。聚合物 4 青岛科技大学研究生学位论文 薄膜修饰电极【4 1 l 因其所含的浓度大的电活性中心，可利用的三维场势，不溶不熔 的稳定性能，简单的修饰方法而迅速成为化学修饰电极的研究重点。聚合物膜修 饰电极不仅可将聚合物溶液在电极表面上滴涂制备，也可由含氧化还原的单体在 电极表面上电化学聚合成膜，还可以将聚合物作为掺杂剂通过组合法与碳粉制备 为化学修饰碳糊电极。目前聚合物膜大致可分为三类：氧化还原型、离子交换型 以及电子导电型。氧化还原型聚合物膜，其特点为氧化还原体就是聚合物骨架上 的一个部分。离子交换型聚合物薄膜，此类聚合物膜的特点是电极表面的聚合物 膜具有离子交换的性质。重要的阴离子交换剂有季碱化聚h 乙烯吡啶) 、聚( 4 乙 烯吡啶) 、聚( l - 赖氨酸) 等，重要的阳离子交换剂是n a t i o n 和磺化聚苯乙烯。n a t i o n 是由美国杜邦公司生产的一种阳离子交换剂，是一种过氟磺酸化的离聚体，其中 起离子交换作用的是磺酸基团，形成“亲水畴 ；而氟碳骨架部分则形成了虮噌 水畴”由于这种结构的关系，使其对阳离子的选择性高，并且结合牢固。聚合物 膜研究的另一方向是电子导电型聚合物即电子导电型聚合物膜。聚噻吩、聚苯胺、 聚吡咯是三大主要的导电聚合物。近年来，电子导电型聚合物膜修饰电极的研究 引起人们的极大兴趣。目前，用电化学合成电子导电型聚合物膜修饰电极的主要 方法有：循环伏安扫描法、恒电位法和恒电流法等，在低电流密度条件下用恒电 流法制备的聚苯胺膜修饰电极，具有表面均匀、电化学氧化还原可逆性好、与基 体电极粘接牢固等优点。常见的导电聚合物有( 1 ) 聚合电子导电型聚合物膜在聚合 膜法固定d n a 时，利用电化学聚合电子导电型聚合物膜途径来固定最为常见。 常见的有聚苯胺 4 2 4 3 1 、聚噻吩 4 4 1 、聚吡咯1 4 5 t4 6 1 等。( 2 ) 壳聚糖。除了聚苯胺、聚 噻吩、聚吡咯等聚合物外，一些天然高聚物如壳聚糖也引起了人们的关注。壳聚 糖具有良好的生物相容性，且具有三维多孔结构，其表面富含的氨基与羟基使其 可以和d n a 形成相对稳定的复合物膜层 4 7 - 5 0 】。( 3 ) 其他聚合物。除聚苯胺、聚噻 吩、聚吡咯及壳聚糖外还有其他的聚合物膜也可以作为固定平台。k n o l l 5 l 】通过 脉冲激发方法将丙烯胺聚合在支持基底上来固定d n a 并用于杂交检测，通过 f t i r 、a f m 、s p r 等方法来研究膜的结构、氨基的密度及d n a 的杂交反应，发 现低电位沉积的聚合物膜非常稳定且能够用于d n a 杂交的研究。 1 1 5d n a 杂交的信号转换 在合适的条件下，d n a 探针电极浸入含有目标d n a 链的溶液中后，d n a 即可与电极表面的d n a 探针杂交形成d s d n a 。在电化学d n a 传感器的设计中， 必须采用一种电活性分子即杂交指示剂，来检测所发生的杂交信息，它能选择性 地与d s d n a 相结合，并能在电极上产生某种可测定的电信号进而反映d n a 的杂 交信息。用于杂交信号转换的杂交指示剂主要有：嵌入剂、d n a 分子小沟结合 5 电聚合2 , 6 吡啶二甲醛膜电极的制备及其虑川研究 剂、电活性标记物及具有化学放大功能的酶作为标记物。 1 1 6 杂交条件 影响杂交的因素有温度、溶液浓度、酸碱度、杂交时间、探针长度等 5 2 1 。因 此在进行杂交实验时应充分考虑到使杂交达到最优化而选用的各种条件。i t o 等1 5 3 】 考察了酸碱度对d n a 杂交的影响，发现在中性溶液中d n a 杂交效果最好。他们 还发现将d s d n a 固定在电极上后加热变成单链后杂交，比s s d n a 直接在电极上 杂交的量多。l u c a r e l l i 等【5 4 】研究发现过高的离子强度会导致在电极表面非特异性 吸附的增加。要消除d n a 探针与其共存干扰物的结合，杂交温度是一个重要的 因素。有时有些s s d n a 探针可能会与非完全互补的d n a 链结合，但这样形成的 产物的稳定性比完全匹配的d n a 之间形成的双链d n a 的稳定性要差很多，而且 受温度影响很大，即在适当高的温度下，不完全匹配的d n a 链难以稳定存在。 因此，可以通过选择合适的温度来提高方法的选择性。 1 2 小分子与d n a 的相互作用 1 2 1 小分子与d n a 的相互作用方式 核酸结合与小分子的部位是核酸的碱基、磷酸骨架或戊糖环。核酸由平行堆 积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架和两条由核苷酸链形成的大沟、小沟组成f d , 分子识别的位点。小分子与d n a 的作用方式主要有三种：非共价结合、共价结 合和剪切作用【5 5 1 。 1 2 1 1 非共价结合 非共价结合包括静电结合、沟内结合和嵌插结合，如图1 - 1 所示。小分子通 过沟内或嵌插作用结合在核酸的螺旋沟或碱基对中，加上静电力的作用，经常会 诱发许多生物效应，阻碍核酸信息的正常表达。同时，这三种力还凭借范德华力、 氢键、疏水作用等使相互作用加强。 ( 1 ) 静电作用。小分子与d n a 分子的带负电荷的核糖磷酸基骨架之间通过静 电作用的方式而结合。如图1 - 1 ( 1 ) 所示。张贵珠等 5 6 1 对巯嘌呤金属配合物与小牛 胸腺d n a 的作用方式进行了深入的探讨，发现两者结合以静电作用为主。杨周 生等【了7 】研究了邻二氮菲c d 2 + 与d n a 的相互作用，证明其作用方式为静电结合。 r o d r i g u e z 等【5 8 l 用循环伏安法和电致化学发光法研究了o s ( b p y ) 3 2 + 与d n a 之间的 相互作用，证明两者的作用形式是以静电结合为主。 6 青岛科技人学研究生学位论文 ( 1 ) ( 2 )( 3 ) 图1 - 1 d n a 与小分子非共价结合作用模式：(