（植物学专业论文）转atdcl2、atdcl4和atrdr6基因水稻研究.pdf

d i s s e r t a t i o nf o rm a s t e r l i i ii ii iii ii i i iii llu l y 1 8 0 4 312 s t u d i e so nt r a n s f o r m a t i o no f r i c ew i t hat d c l 2 , at d c l 4a n d c a n d i d a t e ：q i o n g i ih e 彳以瑚6g e n e s s u p e r v i s o r ：j i a n p i n gc h e n f e i y a n d i s c i p l i n e ：b o t a n y c o l l e g eo fc h e m i s t r y & l i f es c i e n c e ， z h e ji a n gn o r m a lu n i v e r s i t y , j i n h u a32 10 0 4 m a y2 1 ，2 0 1 0 本研究获抗病转基因水稻新品种培育重大专项 2 0 0 9 z x 0 8 0 0 1 - 0 0 2 浙江省自然科学基金资助 y 3 0 8 0 4 17 t h i sw o r kw a s f i n a n c i a l l ys u p p o r t e db y m a j o rp r o je c to fn e wv a r i e t i e so f g e n e t i c a l l ym o d i f i e do r g a n i s mo f c h i n a ( 2 0 0 9 z x 0 8 0 01 0 0 2 ) a n dn a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o no f z h e j i a n gp r o v i n c e ( y 3 0 8 0 4 17 ) 摘要 转a t d c l 2 、a t d c l 4 和a t r d r 6 基因水稻研究 摘要 d c l 2 、d c l 4 、r d r 6 是r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 机制关键基因，在r n a i 的起始、维持和沉默扩散过程中起关键作用。i 州a i 是植物体天然的抗病毒防御体系， 利用r n a i 技术进行植物抗病毒研究是近年来植物病毒学领域研究热点之一。在目前利 用r n a i 开展抗病毒研究中，主要是通过导入病毒来源的双链r n a ( d o u b l e s t r a n d e d r n a ，d s r n a ) 或发夹r n a ( h a i r p i nr n a ，h p r n a ) 诱发针对同源病毒的高效r n a i 效 应，最终表现出植物体对病毒高度甚至免疫抗性。本研究中尝试通过过量表达r n a i 机 制中参与病毒抗性的关键基因、增强r n a i 在起始阶段对病毒复制时形成的d s r n a 的 切割作用，从而赋予植物体对病毒更高的抗性。这拓宽了目前利用r n a i 进行抗病毒研 究的思路，有助于丰富植物抗病毒种质创制的策略。 在r n a i 机制研究中，以拟南芥为材料开展的参与r n a i 的生物大分子结构和功能 研究最为深入，因此我们克隆拟南芥d c l 2 、d c l 4 和r d r 6 基因开展本研究工作。克 隆、测序结果表明，a t d c l 2 编码区由4 1 2 5 个核苷酸构成，a t d c l 4 编码区由5 6 6 0 个 核苷酸构成；a t r d r 6 编码区由3 5 9 1 核苷酸构成。随后将3 个基因分别连入真核表达 载体p c v l 3 0 0 ，并将载体转入农杆菌。利用农杆菌介导的遗传转化将a t d c l 2 导入水 稻幼胚及成熟胚诱导的愈伤组织中，最终获得以幼胚为材料的转基因株系有9 株，经 p c r 、p c r - s o u t h e mb l o t 鉴定证明其中有8 株为阳性植株，以成熟胚诱导的愈伤作为受 体的转d c l 2 再生植株有8 2 株，其中p c r 阳性植株7 0 株。利用农杆菌介导的遗传转 化将a t d c l 4 导入水稻幼胚及成熟胚诱导的愈伤组织中，最终获得以幼胚为材料的转基 因株系有8 l 株，经p c r 、p c r - s o u t h e mb l o t 鉴定证明其中有7 9 株为阳性植株，以成熟 胚诱导的愈伤作为受体的转d c l 4 再生植株有8 6 株，其中p c r 阳性植株7 6 株；农杆 菌介导的a t r d r 6 转化水稻成熟胚诱导的愈伤实验中，最终获得1 2 8 株再生植株，其中 p c r 阳性植株1 1 3 株。r t - p c r 结果表明外源基因能够正常表达。 在克隆a t d c l 2 过程中，我们发现a t d c l 2 3 非翻译区序列的长度不一，对所有序 列进行元件扫描分析表明，它们含有不同的顺式元件。为深入分析不同a t d c l 23 u t r 是否影响了其上游编码区的表达，我们选取其中的x 6 ，m 1 l ，m 1 2 和m 6 为研究对象， 把它们融合到g f p 的下游，利用r e a l t i m ep c r 分析融合不同3 u t r 的g f p 在烟草叶 片中的瞬时表达情况。结果表明g f p x 6 的g f pm r n a 的积累量要比没有融合序列的 g f p 的对照高出l 倍以上，g f p m 6 的m r n a 表达量为对照的7 0 ，g f p m l l 和 g f p m 1 2 都只有对照表达水平的3 0 。结果说明不同的3 u t r 确实影响了其上游编码 区的表达水平。综合分析3 u t r 调控基因表达结果与各自的序列结构、转录因子搜寻 发现：m l l 与x 6 相比，在3 端延长的5 3n t 序列中包含了一个s b f 1 结合位点和一个 a r e 元件。我们分别或同时突变这两个元件，再分析对o f p 瞬时表达的影响，结果表 明m l l 中s b f 1 结合使点和a r e 元件都起到了下调与其融合的编码基因表达的作用。 摘要 为了检测m 6 比m 1 2 多出的加尾信号序列与g f p m 6 基因表达上调( 与g f p m 1 2 相比) 是否有关，我们把m 6 的第二个p o l y ( a ) j i l , l 毫信号突变后进行瞬时转染，结果表明，突 变后m 6 ( m 6 t ) 的表达量仅为m 6 的4 0 ，这说明在m 6 中，p o l y ( a ) 加尾信号序列上调 了g f p 的表达。 关键词：r n a i ；a t d c l 2 ；a t d c i a ；a t r d r 6 ；转基因水稻；3 u t r a b s t r a e t s t u d i e so nt r a n s f o r m a t i o no fr i c ew i t h a t d c l 2 ， a t d c l 4a n da t r d r 6g e n e s a b s t r a c t d c l 2 ，d c l 4a n dr d r 6p l a yt h ek e yr o l e sd u r i n gr n ai n t e r f e r e n c ep a t h w a yf o r i n i t i a t i n ga n dm a i n t a i n i n gt h es i l e n c i n g ，a n dt h es y s t e m i cm o v e m e n to fs i l e n c i n gs i g n a a sa n a t u r a lp l a n ta n t i v i r a ld e f e n s es y s t e m ，r n a ii su s e df o rp l a n ta n t i - v i r u sr e s e a r c hc o m m o n l y i nr e c e n ty e a r s i nt h ep r e v i o u ss t u d i e s ，d o u b l e s t r a n d e dr n ao rh a i r p i nr n ao f t e nd e s i g n e d f r o mv i r a lg e n es e q u e n c ew a st r a n s f e r r e di n t op l a n tt oi n d u c er n a iw h i c hw o u l dt h e np l a y t h ef u n c t i o nd e s t r o y i n gt h er e p l i c a t i o no fv i r a lr n aw h e nv i r u si n f e c t e dt h ep l a n t s i nt h i s s t u d y , w ea t t e m p tt oo v e r e x p r e s st h ek e yg e n e so fr n a it oi m p r o v et h er e s i s t a n c eo fp l a n t s a g a i n s tv i r u s e sb ye n h a n c i n gt h es i l e n c i n ge f f e c to nv i r u sr n a t h i si sad i f f e r e n ts t r a d e g y c r e a t i n gt h er e s i s t a n tp l a n t sa g a i n s tv i r u s e st h r o u g hr n a it e c h n o l o g y i nt h es t u d i e so fr n a im e c h a n i s m f u n c t i o n sa n ds t u r t u r e so fg e n e sf r o ma r a b i d o p s i s a r eu n d e r s t a n d e dc l e a r e rt h a nt h o s ef r o mo t h e ro r g a n i s m s t h e r e f o r e ，w ec h o s eg e n e sd c l 2 ， d c l 4a n dr d r 6f r o ma r a b i d o p s i sf o rf u r t h e rr e s e a r c h a r a b i d o p s i sg e n e sd c l 2 ( a t d c l 2 ) e n c o d i n ga4 12 5a m i n oa c i dp r o t e i n ，d c l 4e n c o d i n ga5 6 6 0a m i n oa c i dp r o t e i n ，a n di m r 6 e n c o d i n ga3 5 9 1a m i n oa c i dp r o t e i nw e r ef i r s tc l o n e dt h r e eg e n e sw e r et h e nc o n s t r u c t e di n t o b i n a r yv e c t o rp c v l3 0 0r e s p e c t i v e l y c a l l u si n d u e e df r o mi m m a t a r ee m b r y o sa n dm a t u r e e m b r y o sw e r eu s e df o rt r a n s f o r m a t i o nw i t ha g r o b a c t e r i u mc o n t a i n i n gp c v - a t d c l 2v e c t o r a f t e rg 418s e l e c t i o na n dr e g e n e r a t i o n 9l i n e so ft r a n s g e n i cr i c ep l a n tf r o mi n u n a t u r e e m b r y o sa n d8 2l i n e sf r o mm a t u r ee m b r y o sw e r eo b t a i n e d b yp c r p c r s o u t h e r nb l o t a n a l y s i s ，8o f9l i n e sr e g e n e r a t e df r o mi m m a t u r ee m b r y o sc a l l u sw e r ep o s i t i v e 7 0o f8 2l i n e s r e g e n e r a t e df r o mm a t u r ee m b r y o sc a l l u sw e r ep o s i t i v e i nt r a n s f o r m a t i o nw i t ho c v - a t d c l 4 v e c t o r , 7 9o f8ll i n e sr e g e n e r a t e df r o mi m m a t u r ee m b r y o sa n d7 6o f8 6l i n e sr e g e n e r a t e d f r o mm a t u r ee m b r y o sw e r ed e m o n s t r a t e dt ob ep o s i t i v ei i n e sb yp c r p c r s o u t h e r nb l o t i n t r a n s f o r m a t i o nw i t hp c v - a t r d r 6v e c t o r , l l3o f12 8l i n e sr e g e n e r a t e df r o mm a t u r ee m b r y o s c a l l u sw e r ed e m o n s t r a t e dp o s i t i v eb vp c r 觚a l y s i s w h e nc l o n i n ga t d c l 2 ，w ef o u n d3 u t r so fa t d c l 2w i t hd i f f e r e n tl e n g t h sb e t w e e n 6 4a n dl5 4n ta n dt h e r e f o r ec o n t a i n i n gt h ed i f f e r e n te l e m e n t s t od e t e c tw h e t h e rt h ea t d c l 2 3 u t 黜r e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no ft h e i ru p s t r e a mc o d i n gs e q u e n c e s ，w es e l e c t e dx 6 ，m i1 ， m12a n dm 6s e q u e n c e sf o rf u r t h e rr e s e a r c h f o u rs e q u e n c e sw e r ef u s e dd o w n s t r c a mo fg f p c o d i n gs e q u e n c er e s p e c t i v e l y , a n dt h e ni n s e r t e di n t ot h eb i n a r yv e c t o rp c v i3 0 0f o rt r a n s i e n t e x p r e s s i o na n a l y s i so fg f pi nn b e n t h a m i a n al e a v e sb ya g r o b a c t e r i u mi n f i l t a t i o n r e s u l t s s h o w e dt h a tg f pm r n aa c c u m u l a t i o nf r o mt h ex 6c o n s t r u c t sw a sa b o u tt w i c et h a to ft h e c o n t r 0 1 g f p m 6m r n a sw e r ea b o u t7 0 a n dg f p ml la n dg f p ml2m r n a sw e r eb o t h i a b s t r a c t a ta b o u t o n l y3 0 o ft h ec o n t r o l ，w h i c hs u g g e s t e dt h e3 u t r sd i f f e r e n t i a l l ya f f e c t e d e x p r e s s i o nl e v e l so ft h e i ru p s t r e a me n c o d i n gs e q u e n c e s f u r t h e r , c o m p a r e dw i t ht h ex 6 ，m 11 c o n t a i n e dap u t a t i v es b f - 1b i n d i n gs i t ea n da l la r ee l e m e n t t oa n a l y s i st h ef u n c t i o n a lr o l e s o ft w oe l e m e n t s0 1 1g e n ee x p r e s s i o nr e g u l a t i o n ，w em u t a t e dt h et h ep u t a t i v es b f - ib i n d i n g s i t eo r a n da r ef o ra n a l y z i n gt h ee f f e c to ft h e s em u t a t i o n so nt r a n s i e n te x p r e s s i o no fg f p t h er e s u l t ss h o w e dt h a tm u t a n t so ne i t h e rt h ep u t a t i v es b f - 1b i n d i n gs i t eo rt h ea r e r e g i o n m a d eg f pg e n ee x p r e s s i o nu p r e g u l a t e d c o m p a r e dt om 12 ，m 6w a so n l ys l i g h t l yl o n g e rb u t c o n t a i n e das e c o n dp o l y ( a ) c o n s e n s u ss i g n a ls e q u e n c e ，w h i l ef l u o r e s c e n c ea n dm r n al e v e l s f r o mt h eg f p - m 6w e r eg r e a t e rt h a nt h o s ef r o mg f p - m12 t oe x a m i n et h ei n v o l v e m e n to f t h es e c o n dp o l y ( a ) c o n s e n s u ss i g n a ls e q u e n c ei ng e n ee x p r e s s i o n ，w em u t a t e dt h es e c o n d p o l y ( a ) c o n s e n s u ss i g n a li nm 6a n de x p r e s s e di t ( m 6 t ) t r a n s i e n t l y c o m p a r i n gt om 6 ，m 6 t d o w n - r e g u l a t e dt h ee x p r e s s i o no fg f pb ya b o u t4 0 ，s u g g e s t i n gt h a tt h ep o l y ( a ) c o n s e n s u s s i g n a ls e q u e n c ei nm 6c o n t r i b u t e st ou p r e g u l a t i n gt h ee x p r e s s i o no fg f pr e l a t i v et om 12 k e y w o r d s ：r n a i ；a t d c l 2 ；a t d c l 4 ：a t r d r 6 ；t r a n s g e n i cr i c e ：3 u t r 目录 目录 摘要i a b s t r a c t 1 1 1 目录、， 符号说明v i i i 第一章文献综述l 1 1r n a 干扰研究进展l 1 1 1r n a 干扰的发现l 1 1 2r n a i 干扰机制2 1 1 2 1 启动阶段2 1 1 2 2 效应阶段2 1 1 2 3 扩增阶段3 1 1 3r n a i 干扰相关的主要蛋白因子4 1 1 3 1d i c e r 酶4 1 1 3 2a r g o n a u t e ( a g o ) 蛋白家族5 1 1 3 3r n a 依赖的r n a 聚合酶( r n a - d e p e n d e n tr n a p o l y m e r a s e ，r d r p ) 6 1 1 4r n a i 的生物学功能7 1 1 4 1 转录水平上调节基因表达7 1 1 4 2 在翻译水平调节生物体发育与生理代谢7 i 1 4 3 防御病毒入侵7 1 2 本文研究目的和意义8 第二章材料与方法9 2 1 基冈的克隆9 2 1 1 试齐0 9 2 1 ：11 义 器9 2 1 3 植物材料9 2 1 4 菌株及载体：9 2 1 5 大肠杆菌感受态细胞的制备( c a c l 2 法) 1 0 2 1 6 质粒的提取o 1 0 2 1 6 1 质粒的纯化：1 0 2 1 6 2 碱裂解法粗提质粒l l 2 1 7t r i z o l 法提取总r n a l l 2 1 8 反转录合成e d n a 第一链1 2 2 i 9 基因的扩增1 2 2 1 1 0d n a 片段的切胶回收。1 3 2 1 “目的片段的连接与转化1 3 2 1 1 1 1 连接体系1 3 2 1 1 1 2 转化1 4 2 1 1 2 阳性克隆的鉴定。1 4 2 1 1 2 1p c r 检测1 4 2 1 1 2 2 质粒检测1 4 2 1 1 2 3 酶切鉴定1 4 v 目录 2 1 1 2 4d n a 序列测定1 5 2 2 遗传转化15 2 2 1 试剂15 2 2 2 仪器15 2 2 3 菌株及载体15 2 2 4 农杆菌所用培养基1 5 2 2 5 农杆菌感受态细胞的制备及转化。1 6 2 2 6 农杆菌转化子的鉴定1 6 2 2 7 转基因所片j 的培养基1 6 2 2 7 1 所用培养基母液1 6 2 2 7 2 植物激素的配制1 7 2 2 7 3 水稻幼胚、成熟胚遗传转化各阶段所需的培养基。t 7 2 3 转基因植株的检测1 8 2 3 1 转基因水稻d n a 的提取。l8 2 3 2 转基因水稻总r n a 的提取1 9 2 3 3p c r 检测19 2 3 4r t - p c r 检测- 2 0 2 3 5p c r - s o u t h e r nb l o t 2 0 2 3 5 1 标记探针。2 0 2 3 5 2 转膜。2 0 2 3 5 3 杂交2 0 2 3 5 4 检测。2 l 第三章农杆菌介导a t d c l 2 、a t d c l 4 和a t r d r 6 基因对水稻的遗传转化2 2 3 1 材料与方法2 2 3 1 1a t d c l 2 、a t d c l 4 和a t r d r 6 基因的克隆2 2 3 1 2 农杆菌介导的遗传转化2 3 3 1 2 1 菌液的准备：2 3 3 1 2 2 转化受体的准备。2 3 3 1 2 2 1 水稻幼胚愈伤组织的诱导与培养2 3 3 1 2 2 2 水稻成熟胚愈伤组织的诱导与培养2 4 3 1 2 3 愈伤组织与农杆菌的共培养2 4 3 1 2 3 1 水稻幼胚为试材的愈伤组织共培养2 4 3 1 2 3 2 水稻成熟胚为试材的愈伤组织共培养2 4 3 1 2 4 抗性愈伤的筛选与分化。2 4 3 1 。2 4 1 水稻幼胚为试材的愈伤的筛选与分化2 4 3 1 2 4 2 水稻成熟胚为试材的愈伤的筛选与分化2 5 3 1 2 5 生根壮苗和移栽2 5 3 1 3 转基因再生水稻的分子生物学检测2 5 3 1 3 1p c r 及r t - p c r 检测2 5 3 1 3 2p c r - s o u t h e r nb l o t 2 5 3 2 结果与分析2 5 3 2 1a t d c l 2 、a t d c l 4 和a t r d r 6 基因的克隆2 5 3 2 2 转化及转基因植株的获得2 6 3 2 3t o 代转基因植株的分子生物学检测2 8 v i 目录 3 2 3 1p c r 检测2 8 3 2 - 3 2p c r - s o u t h i e r nb l o t 分析。3 0 3 2 3 3r t - p c r 分析3l 3 3 讨论3 2 3 3 1 启动子的选择3 2 3 3 2 转化受体的选择。3 2 3 3 3 培养基的改良。3 2 3 3 a 其他培养条件的优化3 3 3 3 5 转基因水稻的获得3 3 第四章a t d c l 2 基因的3 u t r 分析。3 4 4 1 材料与方法3 5 4 1 1 实验材料3 5 4 1 2a t d c l 2 基因3 u t r 的克隆3 5 4 1 3 序列分析3 6 4 1a 载体构建3 6 4 1 5 农杆菌瞬时转染烟草3 7 4 1 6r e a l - - t i m efc r 检测g f p 表达量的差异3 7 4 1 73 u t r 突变分析3 8 4 2 结果与分析。3 8 4 2 1a t d c l 2 基因的3 u t r 区的克隆3 8 4 2 2 序列分析3 8 4 2 3 不同3 u t r 对g f p 表达量的影响分析3 9 4 2 4 突变分析4 0 4 3 讨论q 1 1 第五章结论与展望4 2 5 1 结论4 2 5 1 1 获得多株转a t d c l 2 基因的水稻再生植株 oo,oooo,oo h , oooo,oooooooooooo o , o o e 4 2 5 1 2 获得多株转a t d c l 4 基因的水稻再生植株4 2 5 1 - 3 获得多株转a t r d r 6 基因的水稻再生植株4 2 5 1 4 a t d c l 2 基因的3 u t r 区具有序列多样性。4 2 5 1 5 不同的a t d c l 23 u t r 对g f p 表达量有影响4 2 5 1 6 a t d c l 23 u t r 中的三个元件对g f p 表达有调节作用4 2 5 2 展望4 2 5 2 1 转基因植株后代的抗性遗传分析4 2 5 2 2a t d c l 2 3 u t r 的深入研究4 3 参考文献4 4 致谓 5 2 攻读学位期间取得的研究成果5 3 浙江师范大学学位论文独创性声明5 4 v i i 符号说明 英文缩写英文全称 a g o a r g o n a u t e a i 也 c a m v c h s d c l d s r b d d s r n a g f p h p p d q a n t p o l y ( a ) p t g s r d r p r l s c r n a i s i r n a a u r i c hr e g i o n c a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s c h a l e o n es y n t h a s e d i c e r - l i k ep r o t e i n 符号说明 d o u b l e s t r a n d e dr n a b i n d i n gd o m a i n d o u b l es t r a n dr n a g r e e nf l u o r e s c e n c ep r o t e i n h a i r p i nr n a n u c l e o t i d e s p o l y a d e n y l a t i o n p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g 中文名称 a g o 蛋白 a u 富集元件 花椰菜花叶病毒 苯基乙烯酮合成酶 d i c e r 类似蛋白 双链r n a 结合结构域 双链刚a 绿色荧光蛋白 发卡结构的r n a 核苷酸 多聚a 尾巴 转录后基因沉默 r n a - d e p e n d e n tr n ap o l y m e r a s e r n a 依赖性的r n a 聚合酶 r n a i n d u c e ds i l e n c i n gc o m p l e x r n a 诱导沉默复合物 r n ai n t e r f e r e n c e r n a 干扰 s m a l li n t e r f e r i n gr n a 小干扰r n a t a - s i r n a t r a n s - a c t i n gs i r n a t g s t u c v 3 u t r 反式作用小干扰r n a t r a n s c r i p t o i o n a lg e n es i l e n c i n g转录水平的基因沉默 t u r n i pc r i n k l ev i r u s 3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n v i l l 芜菁皱缩病毒( 3 非翻译区 第一章文献综述 第一章文献综述 本研究相关的d c l 2 、d c l 4 、r d r 6 是r n a 干扰( r n ai n t e r f e r e n c e ，r n a i ) 机制关 键基因，在r n a i 的起始、维持和沉默扩散过程中起关键作用。本章对r n a i 及参与其 中的生物大分子作简要概述。 1 1r n a 干扰研究进展 r n a i 是由双链r n a ( d o u b l es t r a n d e dr n a ，d s r n a ) 分子介导的、在m r n a 水平上 关闭相应序列基因表达、使其沉默的过型。r n a i 的核心机制是d s r n a 被类似r n a 酶i i i 的d i c e r 酶切成2 1 2 6n t 的小干扰r n a ( s m a l li n t e r f e r i n gr n a s i r n a ) ，这些s i r n a 与以a r g o n a u t e ( a g o ) 为主的蛋白因子结合形成r n a 诱导沉默复合物( r n a i n d u c e d s i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) 。随后r i s c 在其中的s i r n a 引导链作用下与同其互补的r n a 结合，进而r i s c 中的多种蛋白发挥功能将之降解1 2 1 。r n a i 是一种典型的转录后基因 调控方式，又称转录后基因沉默( p o s t t r a n s c r i p ti o n a lg e n es i l e n c i n g ，p t g s ) 、r n a 沉默 ( r n as i l i e n c i n g ) 。该机制广泛存在于真核生物体内，目前在果蝇( d r o s o p h i l a ) i 孔、 锥型虫( t r y p a n o s o m e s ) 1 4 j 、涡虫( p l a n a r i a ) 嘲、斑马鱼( z e b r a f i s h ) 【6 】、拟南芥( a r a b i d o p s i s t h a l i a n a ) p j 、小鼠哺j 、人体内【9 】均发现了r n a i 现象。r n a i 作为一种古老而保守的基因 沉默机制，在真核细胞的发育调控、抗病毒防御、修复遗传损伤、调节正常的基因等生 命过程中起着重要的作用。 1 1 1r n a 干扰的发现 基因沉默现象最初在植物中发现。1 9 9 0 年，n a p o l i 等拟将苯基乙烯酮合成酶 ( c h a l c o n es y n t h a s e ，c h s ) 基因转入矮牵牛花以通过提高色素