（有机化学专业论文）多糖的分离提取及结构分析.pdf

摘要 综述介绍了天然多糖的免疫调节作用和其它生物活性作用，多糖 的分离提取及结构分析，多糖的化学修饰，以及多糖的研究开发趋势。 在本论文工作中分别对白毛藤多糖和无花果多糖进行了研究。 从白毛藤中提取白毛藤多糖，比较了多糖分离提取的多种方法，得出了适 宜的分离条件，并对白毛藤多糖进行了初步的结构研究。 从无花果中提取无花果多糖，比较了多糖结构分析的多种方法， 得出了适合无花果多糖的水解条件( 包括水解试剂、水解时间等) 、 水解产物的展开条件、显色剂，适合于无花果多糖的甲基化方法，得 到了多糖的一些结构信息。 多糖分离提取条件的选择及结构分析方法的确定，为这两种多糖 的深入研究提供了一条非常好的途径。 米经f 莆、导师同童 匆全文公布 a b s t r a c t p o l y s a c c h a r i d e a r em a i n c o m p o n e n t s o f p l a n t sa n d t h e i rd i v e r s i t yo f s t r u c t u r ei sm a t c h e db yt h e i r d i v e r s i t yo ff u n c t i o n i nt h ea n a l y s i so f p o l y s a c c h a r i d e ，w ec o n f r o n tw i t h b o t h q u a n t i t a t i v ea n a l y s i sa n d s t r u c t u r a l ( q u a l i t a t i v e ) d e t e r m i n a t i o n f o r m u l a t i o n ，p r e p a r a t i o na n dp r o c e s s i n gt h a t p o l y s a c c h a r i d ea n a l y s i sa r en e c e s s a r i l ye m p l o y e d t o i n v e s t i g a t et h es t r u c t u r eo f a p o l y s a c c h a r i d ei ns o l a n u ml y r a t u m t h u n b ，d i f f e r e n tm e t h o d so f s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f p o l y s a c c h a r i d e w e r ea p p l i e da n do p t i m a lm e t h o dw a so b t a i n e df o rt h ep o l y s a c c h a r i d eo f t h i sp l a n t t h es t r u c t u r eo ft h ep o l y s a c c h a r i d ew a s i n v e s t i g a t e d ；t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ep o l y s a c c h a r i d ew a sc o n s i s t e do f g l u c o s e f o r i n v e s t i g a t i n g t h es t r u c t u r eo ft h e p o l y s a c c h a r i d e i nf i c u s c a r i c a ，d i f f e r e n tm e t h o d sf o rh y d r 0 1 ) 7 z a t i o n e a n d m e t h y l a t i o n w e r e a p p l i e d t h eo p t i m a lm e t h o da n dr e a g e n t s f o rt h ep o l y s a c c h a r i d eo f f i c u sc a r i c aw e r eo b t a i n e d i nt h i sw o r ks t r u c t u r a li n f o r m a t i o no ft h e p o l y s a c c h a r i d e o ff i c u sc a r i c aw a so b t a i n e d t h i s p o l y s a c c h a r i d e w a s c o n s i s t e do f g l u c o s e a n d g a l a c t o s e 浙江大学理学硕士学位论文 第一章天然多糖的免疫调节作用和研究开发趋势 一概论 多糖。1 是由单糖组成的天然高分子化合物，己知的天然多糖化合物约有3 0 0 多 种，广泛存在于植物、动物和微生物组织中，是构成生命的四大基本物质之一，具有 多种重要的功能，其中两种最重要的功能是作为结构物质和能量物质。如组成植物细 胞壁的纤维素和组成虾蟹的甲壳属于结构物质，使组织具有强度。而植物中的淀粉及 动物中的糖元是储存的食物，它能随代谢的需要转变成能量。 近二十多年来，由于分子生物学和细胞生物学的发展，发现多糖及缀合物参与 细胞的各种生命现象的调节，如免疫细胞间信息的传递和感受，这与细胞表面的多糖 体的介导有密切关系。而且多糖又是细胞表面对各种抗原和药物的受体，因此多糖作 为支持组织和能量来源的传统观念已被突破。 科学家们从大量药理和临床研究发现，从天然产物中分离出的多糖往往是一种 免疫调节剂，它能激活免疫细胞，提高机体免疫功能而对正常细胞没有毒副作用。自 1 9 8 1 年美国发现第一例a i d s 病患者，1 9 8 3 年从患者血清中分离出一种淋巴结病毒 ( h i v ) 以来，多糖作为免疫治疗药物正越来越受到重视，已成为新药研究的热点之 一，而其中最为重要的是从药用植物中提取的水溶性多糖。 现己发现多糖化合物对机体的免疫调节作用主要是通过激活巨噬细胞，激活网 状内皮系统，激活t 和b 淋巴细胞，激活补体以及促进各种细胞因子的生成等方式和 途径来实现的。 这种免疫调节作用具有以下两个特征： 最佳剂量的选择。 对多糖不论进行动物的免疫功能试验还是抑制肿瘤试验都发现有一个最佳剂量 值，剂量过高或过低都会影响试验结果。如用香菇多糖抑制荷瘤小鼠$ 1 8 0 的抗肿瘤 活性分别用5 、0 5 和0 1 m g k g 三个剂量组进行试验，其抑瘤率分别为4 4 o 、9 4 7 和1 9 1 ，以0 5 2 0m g k g 为最佳剂量。多糖在最佳剂量时，其活性最高，超过 和低于最佳剂量，活性就会明显降低，这与一般药物不同。 浙江大学理学硕士学位论文 没有直接细胞毒性 多糖作为药物的最大优点就在于它是非细胞毒物质，对正常细胞几乎无毒副作 用。多糖的抗肿瘤活性是宿主介导性的，因此在体外试验时，肿瘤细胞的存活率几乎 可达到i 0 0 。 多糖的结构与其活性存在显著的相关性，因此，糖链构象的研究有极重要的理论 研究意义，探讨结构与功能之间的关系，构象尤为重要。但多糖链构象的研究比较困 难，有学者。3 利用多种方法如圆二色谱、旋光、粘度、比色等测定多糖的各种特征， 研究了多糖在溶液中的构象情况，以及外在因素如温度、p h , 变性剂、金属离子、化 学修饰剂等影响下，构象的变化。 除了主体构型是决定多糖生物活性的决定因素外，多糖的分子量、溶解度等也能 影响其生物活性，如分子量为9 0 0 0 0 左右的右旋糖酐( d e x t r a n ) 具有一定的活性， 但它的活性随着大于或小于此分子量值而迅速降低。 牛膝多糖是一个从植物中分离提取得到的小分子多糖化合物，它具有明显的免疫 增强作用，但无抗病毒活性。如果在牛膝多糖分子中引入硫酸基团，则具有较强抗乙 型肝炎病毒h b s a g 和h b e a g 的活性。 近来多糖受体的发现对阐明其作用机理有重要意义。当多糖与受体作用时，只有 分子中的几个寡聚糖片段与受体结合，因此可以推测，多糖也许像蛋白质和酶一样， 在分子中存在一个或几个寡糖片段的“活性中心”，但这需要进一步证实。 到目前为止，对多糖的研究重新引起了人们的重视，但与蛋白质和核酸的研究相 比还有很大的差距，还不够深入，这主要反映在以下几个方面： ( 1 ) 多糖的结构与功能的关系至今仍是多糖研究的薄弱环节，大多还是凭科学家 们的分析和推测，而对多糖的溶液构象和晶体结构的研究几乎还是空白。 ( 2 ) 多糖的结构测定方法还远未达到像蛋白质和核酸结构测定那样自动化、微量 化和标准化。由于多糖分子中每个多糖残基都有多个反应点，这使糖苷键具有多种连 接的可能性，而构型又有n 一和b 一两种，这使得多糖的结构测定远比蛋白质和核酸的 结构测定来得困难。虽然近来有人用质谱和核磁共振以及毛细管电泳等技术来测定多 糖的结构，但局限性较大，还未形成成熟的可靠的体系。 ( 3 ) 多糖的合成( 目前实际上只是寡糖的合成) 也远比多肽和多聚核苷酸的合成 浙江大学理学硕士学位论文 复杂和困难。 ( 4 ) 多糖在体内的作用机制还未十分明了。 尽管对多糖的研究还存在上述这些问题，但多糖的应用前景表明了多糖研究的强 大生命力。当今，天然多糖化合物已成为一种免疫调节剂用于肿瘤、肝炎等疾病的治 疗和康复，而艾滋病的肆虐更使天然多糖化合物，特别是它的衍生物，如硫酸化多糖 引起了科学家们的高度重视。近年来，不断发现硫酸化多糖，如硫酸葡聚糖( d e x t r a n s u l f a t e ) 、角叉芽胶( c a r r a g e e n i n ) 、肝素( h e p a r i n ) 等对h i v 均有抑制作用，而现 有的抗艾滋病药物如a z t ，d d c 和t r i c h o s a n t h i n 等因其毒副作用严重而难以推广应 用，而硫酸化多糖则由于其毒副作用小，而极有希望成为新的一类抗艾滋病药物。在 美国已使硫酸化右旋糖酐和硫酸化聚戊糖进入抗a i d s 的临床研究，相信不久的将来， 天然多糖化合物将在疾病治疗和保障人类健康长寿方面作出它的贡献。 二天然多糖的免疫调节作用 人体的免疫系统分散在全身，其中包括在器官( 胸腺、脾脏、淋巴结) 、细胞( 吞 噬细胞、淋巴细胞) 及分子( 补体、抗体及多种细胞因子) 。它们之间靠血液与体液 互相沟通，互相配合，才使人体表现出正常的免疫力。因此可通过调节机体的免疫功 能来达到防治疾病的目的，这就是免疫治疗学的基础。 大量研究表明，天然多糖在抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血糖、抗衰老、抗凝赢等 方面发挥着生物活性作用。实践证明，多糖能很好地抑制肿瘤生成，许多关于多糖抗 肿瘤的研究“”，都表明多糖具有明显的抑制s 1 8 0 肉瘤、艾氏腺小瘤、吉田肉瘤、腹 水型肝瘤等实验肿瘤。多糖的抗肿瘤活性一般是提高增强免疫细胞的活性实现的。多 糖不仅能激活巨噬细胞、t 细胞、b 细胞、自然杀伤细胞、杀伤性t 细胞、淋巴因子 激活的杀伤细胞( l a k ) 等免疫细胞，还能促进白细胞介素一l ( i l 1 ) ，白细胞介素一2 ( i l - 2 ) 、肿瘤坏死因子( t n f ) 和干扰素( i f n ) 等细胞因子的生成以及调节抗体和 补体。多糖对细胞免疫功能的促进和诱生多种细胞因子，是多糖发挥药效作用的机理 之一。因免疫功能，多糖可起到抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等作用。 ( 1 ) 激活巨噬细胞 由于巨噬细胞( c y t o t o x i cm a c r o p h a g e ) 在抵御各种感染和抗肿瘤方面具有主要作 浙江大学理学硕士学位论文 用，因而激活巨噬细胞可提高机体抗病菌和抗肿瘤的能力。 如从紫松果菊( e c h i n c a n ap u r p u r e a ) 中分离出来的多糖( e p s ) 与小鼠骨髓中的 巨噬细胞共同孵育，则巨噬细胞对肿瘤细胞的毒性被大大激活。进一步的实验证明， 由这种植物的细胞培养物分离提取得到一种由阿拉伯糖和半乳糖所组成的多糖可促 进巨噬细胞产生肿瘤细胞坏死因子y ( t n f y ) 和干扰索y ( i f n y2 ) ，从而增强对肿 瘤的毒性。 枸杞多糖( l b p ) “3 能提高巨噬细胞的吞噬功能。进一步的研究表明，l b p 能显 著增加巨噬细胞c 3 b 和f 。受体的数量和亲和力。枸杞多糖2 ( l b p 2 ) 吲体外有剂量依赖性 增强大鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的作用，能剂量依赖性地增强巨噬细胞合成和释放 i l 一1 、t n f 。 故中药多糖可能通过激活巨噬细胞，合成与释放i l l 、t n f 等细胞因予，活化t 、 b 淋巴细胞，增强n k 细胞和l a k 细胞活性，从而起到免疫调节作用。此外，香菇多糖 ”3 以及从人参( c o d o n o p s i sp i l o s u l a ) 、柴胡( b u p l e u r u mc h i n e n s i s ) 、黄芹( a s t r a g a l u s m o n g h o l i c u s ) 、灵芝( g a n o d e r m a l u c i d u m ) 、银耳( t r e m e l l af u c i f r o m i s ) 等植物中分离 提取得到的多糖都能显著增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能“1 。 ( 2 ) 激活网状内皮系统( r e s ) 生物体内的网状内皮系统具有吞噬、排除老化细胞和异物及病原体的作用，常用 碳廓清法测定其活性。 如从三七根( p u n a xn o l o g i s e n g ) 中分离提取的由阿拉伯糖和半乳糖组成的多糖 ( s a n c h i a na ) 可显著地增强网状内皮系统在碳廓清试验中的活性，并增加小鼠、绵 羊红细胞抗体的生成，恢复由环磷酰胺导致的抑制而延迟的过敏反应。 此外，如甘草多糖( g l y c y r r h i z a n ) 、杜仲多糖( e n c o m m a n ) 、竹节人参多糖 ( t o c h i b a n a n ) 以及北五昧子多糖( c p s c ) “、刺五加多糖( a s p s ) 和虫草多糖( c s p s ) 等也都能激活网状内皮系统。 ( 3 ) 激活t 和b 淋巴细胞 癌症和艾滋病患者由于化疗和放疗使其体内免疫系统遭到严重破坏，而中药免疫 调节剂特别是从高等植物中提取的多糖，可部分恢复并加强患者的免疫功能。 如东当归多糖( a i p s ) 可激活b 细胞使之分化成抗体生成细胞，若将a i p s 与绵 浙江大学理学硕士学位论文 羊红细胞一同注射则可激活t 细胞：膜夹黄芹( a s t r a g a l u sm e m b r a n a c e u s ) 多糖可使 癌症病人的免疫系统和t 细胞功能恢复到正常水平；香菇多糖是一个典型的t 细胞激 活剂，它在体内和体外均能促进特异性细胞毒t 淋巴细胞( c t l ) 的产生，并提高c t l 的杀伤活性；从蒙古口蘑中分离得到具有免疫促进和抗肿瘤活性的糖肽复合物“”( 糖 和蛋白质的比例是8 ：1 ) ，能够促进t 细胞增生，抑n d , 鼠s 1 8 0 肉瘤生长。 实验表明，中药多糖可通过促有丝分裂作用，调控t 、b 细胞功能，从而发挥其 免疫调节作用。对于中药多糖的促有丝分裂作用“，推测多糖可能在淋巴细胞上有自 己的受体。近年发现，云苓多糖( p s k ) 在淋巴细胞上有相应的受体。多糖受体的发 现，对阐明其作用机理有重要意义。 当多糖与受体作用时，只有分子中的几个寡聚糖片断与受体结合，因此可以推测， 多糖像蛋白质和酶一样，可能在多糖分子中存在一个或多个寡聚糖片断的“活性中 心”。另外一种可能是多糖的一些部分可与有丝分裂原结合，从而表现出对有丝分 裂原反应的增强作用。 ( 4 ) 激活补体 补体是血液中的一组具有酶原活性的蛋白质系列，能杀死病原微生物或协助、配 合吞噬细胞来杀灭病原微生物。补体由9 种血清球蛋自组成，在一定条件下依次活化， 最终促成被细菌或病毒感染的细胞甚至肿瘤细胞溶解、死亡。 许多高等植物的多糖均有激活补体的作用。实验表明：抗补体活性多糖大多为酸 性杂多糖，其酸性部分主要是半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。如从当归、艾n 十、薏苡仁、 柴胡、紫根等植物种提取的具有抗补体活性的多糖“”都是酸性杂多糖。 同时，多糖分子中的游离羟基对活性也很重要，如车前子多糖过氧化后，其活性 下降甚至消失，但当氧化物还原成多羟基后又显示出活性，而将该多糖去除乙酰基后， 激活补体能力大大提高。 ( 5 ) 对多种细胞因子( c y t o k i n e s ) 的影响 促进干扰素( i n t e r f e r o n s ，i f n ) 生成 东当归多糖在l o u g m l 浓度时，可诱导兔脾细胞生成干扰素；欧洲李( p r u n u s d o m e s t i c a ) 多糖制剂，每天口服5 9 ，连续服用2 0 天以后，可使y 一干扰素的生成至 少提高一倍。 浙江大学理学硕士学位论文 此外，香菇多糖、云芝糖肽、柴胡多糖、刺五加多糖、羧甲基茯苓多糖和银耳多 糖等都能诱生干扰素。 促进白细胞介素( i n t e r l e u k i n s ) 生成 体外试验证明，香菇多糖能促进脾脏t 细胞释放i l 一3 ，释放量为空白对照组的5 倍，同时香菇多糖在体内和体外都能增加腹腔巨噬细胞产生i l l 。 枸杞子多糖( l b p ) 不仅能使正常小鼠产生i l 一2 的能力提高，而且可使老龄小鼠 产生i l 一2 的能力高于正常水平。 此外，商陆多糖( p e p ) 、酿酒酵母葡聚糖( g l u c a n ) 等也都能小鼠腹腔巨噬细胞 产生i l l 。 诱生肿瘤坏死因子( t u m o rn e c r o s i sf a c t o r ，t n f ) t f a 为一种多肽类细胞因子，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，可使肿瘤细胞组 织出血坏死，现已发现某些多糖如从商陆块根中分离出来的酸性杂多糖( p e p ) ，以 8 0 1 6 0 m g k g 剂量给小鼠腹腔注射2 次，就能诱生t n f 。 许多研究表明，中药多糖对白细胞介素( 尤其是i l 一1 、i l 一2 ) 、i f n 、t n f 等细胞 因子有诱生作用，多糖所诱生的细胞因子在中药多糖的免疫调节作用时扮演了重要的 角色。诱生细胞因子既是中药多糖对前述单核巨噬细胞与淋巴细胞免疫调节作用的结 果，也是多糖对单核巨噬细胞与淋巴细胞免疫调节作用的中介。 三天然多糖免疫调节作用的影响因素 影响中药多糖免疫调节作用的因素主要以下两个因素：多糖因素和机体因素。 ( 1 ) 多糖因素： 包括量效关系、中药种类与构效关系等多种因素。 量效关系 中药多糖的免疫调节作用呈现一定的量效关系。一般中药多糖在小剂量有免疫增 强作用，而大剂量有免疫抑制作用“”“。在实验研究与临床应用中把握多糖的最适剂 量有着重要意义，如小剂量中药多糖可试用于恶性肿瘤、免疫缺陷及慢性感染的治疗， 而大剂量中药多糖则可试用于自身免疫病与超敏反应的治疗。 中药种类与构效关系 浙江大学理学硕士学位论文 中药多糖因中药分类不同而有不同的免疫调节机理，还有不同种类的中药多糖 具有相同的免疫调节机理是一个十分值得研究的问题。许多研究表明，大多数中药 多糖都具有相似的作用。 经研究“，当归、黄芪、猪苓、早莲、女贞子等1 2 种中药提取的多糖，发现具 有相似的作用。但不同的中药多糖其免疫调节作用亦不尽相同。如香菇多糖具有较 强的抗肿瘤活性而茯苓多糖则无抗肿瘤作用，有的多糖在较小剂量即呈现免疫调节 作用“7 1 等。 决定不同种类中药多糖的免疫调节作用的差异，关键在与多糖免疫调节作用的 构效关系。多糖分子的立体构型、分子量、取代基、溶解度、粘度等都能影响其生 物活性。其中，多糖分子的立体结构是决定多糖生物活性的决定因素，然而多糖的 结构与功能的关系至今并不十分清楚。 有关中药多糖构效关系的研究具有十分重要的意义，它不但有助于阐明中药多 糖免疫调节作用的差异性，进而深化对中药医药学理论的认识并为新药开发打下坚 实的基础，而且有助于对中药多糖的结构改造与化学合成。 给药途径 中药多糖的给药途径主要有口服、腹腔注射、肌肉注射、静脉注射与淋巴结注 射。理论上不同的给药途径通常会影响免疫调节剂的作用方式或作用强度。目前关于 中药各种不同给药途径对其免疫调节作用的影响的研究尚较缺乏，然而作为临床应用 的重要影响因素，有必要对此进行深入研究。 联合应用 多糖的联合应用包括不同种中药多糖的联合应用，多糖与佐剂、抗原和耐受原的 联合应用，多糖与有丝分裂原的联合应用及多糖与细胞因子的联合应用，甚至多糖与 细胞因子联合应用体外活化l a k 细胞回输疗法。许多报告n 8 ”啪3 认为：中药多糖联合 应用可增强多糖的免疫调节作用。 ( 2 ) 机体因素 经研究。”，地黄低聚多糖( r g o s ) 可明显增高c y 抑制小鼠和荷瘤小鼠脾细胞对 s r b c 的抗体反应，表现为脾细胞中抗s r b c 的空斑形成细胞数明显增多，说明其可促 进免疫抑制小鼠的b 淋巴细胞恢复产生抗体的能力，而对正常小鼠则只在大剂量是有 浙江大学理学硕士学位论文 增强作用，从而可以认为r g o s 增强小鼠免疫功能的作用与机体的免疫功能状态密切 相关，在机体免疫功能低下时其增强作用更为明显。 四天然多糖抗肿瘤机理的其它研究 多糖抗肿瘤作用的免疫学机制研究较多，一般认为多糖提高宿主的免疫功能是其 抗肿瘤作用机理之一。另外，也有学者认为从多糖对肿瘤细胞膜组分、磷脂酰肌醇( p 1 ) 转换、抗癌基因的影响等角度研究其抗肿瘤作用机理”“。 ( 1 ) 对细胞膜组分的影响 肿瘤细胞膜的许多表型改变与伴随的恶性行为密切相关。唾液酸( s a ) 位于细胞 表面糖蛋白和糖脂的聚糖链末端。肿瘤细胞膜中的s a 含量明显减少，这与肿瘤转移、 肿瘤相关抗原的暴露、免疫应答细胞活化等过程相关。刺五加多糖“”和牛膝多糖” 可以提高s ，。细胞膜表面s a 的含量，还可引起s m ，细胞膜磷脂减少，提示这些多糖改 变细胞膜的生化特性与它们抗肿瘤作用有关。 ( 2 ) 对p i 转换的影响 p i 转换是指存在于细胞膜与内质网上的p i 在其激酶催化下发生磷酸反应的过 程。某些肿瘤细胞p i 转换明显加强，这与癌基因活化及其表达产物有关，因此干扰 和抑制p i 转换具有一定抗癌作用。茯苓多糖。”、刺五加多糖眦1 均具有抑制肿瘤细胞 p i 转换的作用，说明一些多糖抗肿瘤机理之一是抑制肿瘤细胞的p i 转换。 ( 3 ) 对抗癌基因的影响 p 5 3 是公认的抗癌基因，与细胞凋亡关系密切，其表达产物的增多意味着癌细胞 活性的丧失。低分子量( 1 0 0 0 2 0 0 0 ) 地黄多糖。6 1 可使小鼠l e w i s 肺癌细胞内p 5 3 细 胞基因表达明显增加，由此推测l r p s 通过对p 5 3 表达的影响来实现其抗肿瘤功能。 近年来，有些学者。7 1 在研究多糖抗肿瘤作用过程中，运用生物标记跟踪了肿瘤在 不同时期的变化，如肿瘤发生期中d n a 加合物的形成、d n a 的氧化性损伤、谷胱甘肽 转移酶活性的诱导；肿瘤形成期中佛波酯诱导的酪氨酸激酶及鸟苷酸脱羧酶活性的提 高、自由基的形成。这对进一步阐明多糖的抗肿瘤作用过程提供了新的思路。 浙江大学理学硕士学位论文 五天然多糖的内分泌调节作用 近期的研究表明，天然多糖在体内的作用，不仅仅只与免疫系统的作用有关，而 且与神经内分泌系统的作用也密切相关。 如牛膝多糖被发现在体内能增强l p s 诱导m 中分泌t n f y 的作用，而在体外则没 有这种增强效应；另外牛膝多糖能促进p m ( p 产生n o 和提高n o 合成酶n o s 的活性。( n o 是第二信使，具有类似神经递质的信息传递功能。美国的三位科学家罗伯特、路易斯 和弗里德因发现n o 是心血管系统中传播信号的分子，某些细胞可以产生n 0 ，这些n o 从细胞中穿出后，作用于其他细胞，并能控制其他细胞的行为，而被授予1 9 9 8 年的 诺贝尔医学奖。) 有关中药多糖对神经内分泌免疫系统作用的研究必将有助于从机体整体上阐明 中药多糖的免疫调节作用。 六天然多糖的抗病毒、抗衰老等作用 ( 1 ) 抗病毒活性 研究。”表明，许多多糖对各种病毒有抑制作用，如艾滋病毒( h i v - i ) 、单纯疱疹 病毒、巨细胞病毒、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒和鸟肉瘤病毒。香菇多 糖对泡状口炎病毒引起的小鼠脑炎有显著治疗和预防作用，其抗病毒作用与诱生干扰 素和提高n k i 有关。甘草多糖对多种病毒均有明显抑制作用，它起到直接灭活多种病 毒的作用“。 多糖的抗病毒作用现已引起医学界的高度重视，尤其是硫酸多糖的强抗病毒活 性。近年来硫酸多糖对h i v - i 的抑制作用研究较多。大多数研究表明，这些多糖类化 合物通过与h i v 病毒的g p 一1 2 0 或c d 4 受体结合发挥作用。多糖与g p 一1 2 0 或c d 4 受体 结合后，可以阻断病毒对宿主细胞的吸附，防止合细胞的形成。 在艾滋病的病理过程中，病毒在细胞与细胞之间的传播同合细胞的形成有关。硫 酸细菌糖胺聚糖对h i v 有体外抑制活性1 ，它阻止合细胞的形成，阻断病毒对宿主细 胞的吸附。加之硫酸细菌糖胺聚糖的抗病毒活性与抗凝血活性比值较高，引起出血的 副作用小，使其极有可能用于临床。 硫酸基团是抗病毒活性的一个先决条件，如葡聚糖本身不具有抗病毒活性，但硫 浙江大学理学硕士学位论文 酸葡聚糖则具有抗h i v 活性：再如香菇多糖硫酸化后形成香菇多糖硫酸酯，其抗h i v 的活性增强，目前发现抗h i v 活性最强的香菇多糖硫酸酯的结构系分子内含有每葡萄 糖单位1 7 个硫酸根。硫酸根的数目、分布和空间构象的不同对硫酸多糖的抗病毒活 性有不同的影响。 ( 2 ) 抗衰老活性 免疫系统与机体的衰老有密切的关系。随年龄的增大，免疫功能下降或紊乱， 结果胸腺萎缩，t 细胞损耗，从而导致衰老，寿命缩短。多糖能从整体上提高机体免 疫功能，从一定程度延缓衰老，防治老年病。 ( 3 ) 降血糖活性 从t r e m e l l aa u r a n t i a d e 的果肉中提取出的一种水溶性酸性多糖( t a p ) ，在正 常小鼠和两种糖尿病小鼠模型( 链佐星诱导的糖尿病和遗传性糖尿病) 中，表现出显 著的降血糖作用。另外从真菌p e s t a l o t i a 的发酵滤液中提取得水溶性中性多糖( p s - n ) 。”对链佐星诱导的糖尿病小鼠也有明显降血糖作用。 有文献报道多糖的侧链结构对于其降血糖活性至关重要( 见表1 1 ) 。 表1 1 不同多糖对正常小鼠血糖水平的作用 给药o 、5 、l o 、2 4 h 后相对血糖水平 样品 分子量每个葡糖链剂量( “8 k g ( 咀0 h 时为1 0 0 )1 十日口、u h 1 ，g ， ( 1 0 4 )的支链数目腹腔注射) 一 051 02 4 注：样品1 ：( 1 6 ) a d - 吡哺葡聚糖在c a 位有1 个a d - 吡喃葡糖基侧链；样品2 ：( 1 - - 6 ) 0 一d 一 毗喃葡聚糖，在c a 位有一个a 一和b 一吡喃葡糖基侧链；样品3 ：线性( 1 6 ) 一a d - 吡喃葡聚糖：样品4 ：( 1 6 ) 一0 1 ) - 毗喃葡聚糖，有甘露糖侧链 浙江大学理学硕士学位论文 但具体的构效关系还有待进一步研究证明。 “) 抗凝血活性 肝素作为凝血性疾病的治疗和预防已有数十年，它主要通过增强抗凝血酶( 肝素 辅助因子i i ，h c i i ) 的作用来抗凝血。肝素作为抗凝剂，其构效关系已经比较清楚， 主要是五糖。”通过硫酸根和羧基的氢键与抗凝血酶的d 一螺旋中h r g 。l y s 。，a - 螺旋 中h r g 蚰、a r g mp - 螺旋中l y s m 、g 1 u m 以及由氨基端形成的裂缝中的h r g 。捞口l y s ，相 结合，构象改变使抗凝血酶的活性大大提高。结合位点的阐明可以为开发出不良反应 更小，活性更强的肝索类似物抗凝剂提供结构化学的基础。”。 另外，多硫酸戊聚糖、硫酸木聚糖、糖胺聚糖肝素均是用于预防和治疗血栓的重 要的抗凝剂。 七天然多糖的构效关系研究 ( 1 ) 理化性质的影响 多糖的生物活性与其空间结构、分子量、分支度及溶解度有关。 空间结构的影响 多糖的结构与功能的关系至今并不十分清楚，但高级结构对功能的影响比一级结 构还重要，这一点已为科学家们所肯定。而决定高级结构的重要因素是多糖分子链内 和链外的氢键。 经x 射线分析”，具有明显抗肿瘤活性的香菇多糖具有三股右旋螺旋型立体结构， 裂褶多糖具有由p 6 。的螺旋对称体形成的类似三螺旋结构。如果在香菇多糖或裂褶多 糖中加入尿素或二甲亚砜，使分子的立体构型发生改变，则其活性丧失。 另一方面，主链结构同是b l ，3 又有b l ，6 侧链的葡聚糖，有些具有强的活性， 而有些却无活性。如香菇多糖以l m g k g 剂量给药，抗s 1 8 0 肉瘤活性几乎为1 0 0 ： 云芝多糖抗肿瘤活性 9 0 ；猪苓多糖抗肺鳞瘤活性为8 0 。而茯苓多糖和昆布多糖， 其化学结构虽然与香菇多糖相似，但它们无抗肿瘤活性。昆布多糖给药剂量高达 2 5 m g k g ( 为香菇多糖的2 5 倍) ，其抗s 。的活性仅为1 5 。 但如果将茯苓多糖中的一些b 一1 ，6 支链，用类似于过碘酸氧化、s m i t h 降解的方 法将其切去，结构获得了具有强烈抗肿瘤活性的多糖，称为次茯苓多糖。如果再将次 浙江大学理学硕士学位论文 茯苓多糖o 一羟甲基化，其活性就更高。 表1 2 列出多糖的抗肿瘤作用和它的一级结构。 分子量的影响 多糖的生物活性很大程度上取决于其分子量大小。一般说来。“分子量在1 0 0 2 0 0 k 之间的多糖片段有较高的生物活性，而相同来源的分子量在5 l o k 之间的多糖 片段无生物活性。如分子量大于l o o k 的裂褶多糖具有较强的抗肿瘤活性，而其低分 子量( 小于5 0 k ) 的片段无任何生物活性。 表1 2 各种多糖的一级结构及其对小鼠s m 的抗肿瘤效果 但也有部分分子量小、无规则结构的多糖片段。7 3 具有抗s 1 8 0 瘤活性例如p y t h i u m a p h a n i d e r m a t u m 葡聚糖是分子量为1 0 k 和2 0 k 的无规则结构混合物，具有抗肿瘤活性。 分支度的影响 分支度的大小也能影响多糖的生物活性。一般认为”1 分支度0 2 o 3 3 左右的分 子有较高的生物活性。例如从c r y p t o p o r u sv o l v a t u s 提取的分支度为o 2 5 的多糖有 较高的抗肿瘤活性，而分支度分别为0 7 5 和0 0 6 的a u r i c u l a r aa u r i c u l a j u d a e 多 糖和g a n o d e r ml u c i d u m 多糖抗肿瘤活性较低。 水溶性的影响 经大量实验证明，多糖的侧链基团与其生物活性密切相关。对于具有螺旋结构的 多糖来说，一方面侧链可以使螺旋结构更加稳定，另一方面分布于螺旋结构周围的亲 浙江大学理学碗士学位论文 水基对维持多糖的生物活性是极其重要的 例如将b - 1 ，3 葡聚糖侧链上的葡糖基转化成3 ，6 一脱羟基衍生物，则其抑瘤活 性消失：而将b - 1 ，3 葡聚糖支链糖基转化成多元醇，可提高其活性。由此说明提高水 溶性有利于增强多糖的生物活性。 通过磺酰化、硫酸化、磷酸化或羧甲基化等化学修饰方法可以提高多糖的水溶性。 例如，昆布多糖是无抗肿瘤活性的线形分子，将其烷基磺酰化后会增强抗肿瘤活性， 但修饰度过高会引起活性下降或消失。 采用酸碱水解、酶解及超声波破碎等方法降低多糖分子量，也可以提高其水溶性， 降低分子粘度，获得临床上可以应用的分子片段。从工程菌啤酒酵母及丝状真菌黑曲 霉。”中分离提取出的1 ，3 一b d - 葡聚糖，利用阶段性化学衍生法( 羧甲基化) 和超声 波破碎相结合处理，获得分子量在9 0 l o o k 的易溶多糖衍生物，提高了其临床应用 价值。 ( 2 ) 对活性决定部位的研究 多糖的生物活性体现在其与受体相互识别、相互作用的过程中。当多糖与受体作 用时，往往是其中的特异性寡聚糖片段与受体相结合。由此推测，多糖象蛋白质和酶 一样，可能在多糖分子中存在一个或几个寡糖片段的活性中心。 经研究发现“”“，具有抗补体活性的甘草多糖、柴胡多糖、当归多糖的活性部分 都具有带中性侧链的鼠李糖半乳糖醛酸分支区，同时用锂降解法继g c e i m s 分析发 现活性作用部位是中性侧链。当这些活性中心被替代或受到空间阻碍时，多糖的生物 活性受到很大影响。如从当归中获得的主要由6 一半乳糖( g a l ) 组成的寡糖醇片段有 抗补体作用，但用相应标准寡糖代替则不具备生物活性。 从茅苍术根茎中分离的有刺激肠免疫系统的活性多糖“”，用结合有抗原的凝胶柱 分析发现，该多糖含有一a r a 一3 ，6 - g a l 元件和大量抗高碘酸钠氧化的3 - g a l 侧枝，这些 结构为活性所需。具有抗补体作用的大车前( p l a n t a g om a j o rl ) 多糖”，被发现其 活性部位为以l ，4 - b - d 一木聚糖为主链，在2 位氧上含有b d - 吡喃木聚糖，o l 一阿 拉伯呋喃糖等短侧链的分子片段。另外一种车前( p l a n t a g om u c i l a g ea ) 多糖具有 抗补体作用的部位是以1 ，4 - b d - x y l p 为主链，3 位氧处带有b d - x y l p 、d d - g l c p a 1 3d l - a r a f 和a - d - g a l pa 1 3 一l - a r a f 残基。 浙江大学理学硕士学位论文 综上所述，目前对多糖的免疫药理及构效关系研究以进入了分子和受体水平，但 总体上对多糖的结构及其生物活性的作用机理研究尚不十分清楚，对多糖的认识深度 也远不及蛋白质和核酸。这主要是因为多糖的结构十分复杂，目前尚没有较成熟有效 的检测手段，尤其对于多糖的晶体结构研究仍属于空白。 另外值得注意的是，在研究植物多糖的药理活性时，应避免受细菌脂多糖的感染， 因此在选材上应注意材料的来源，n o s e 等“”利用无菌培养获得的甘草根作为原材料， 研究发现甘草多糖可以诱导小鼠腹腔巨噬细胞产生n o ，避免了脂多糖的干扰。 八天然多糖的开发应用 近二十年来，天然多糖因其独特的功能和很低的毒性，因而在临床应用中显示出 越来越广泛的前景，主要体现在以下几个方面。 ( 1 ) 抗肿瘤药 将多糖作为抗肿瘤药是由于人们对当前癌症化疗药物的不满意。虽然化学家们合 成了无数个对癌症细胞有相当强杀伤作用的化合物，但它们在杀死癌细胞的同时也同 样损伤正常细胞，i 临床上表现出很多副作用，特别是化疗药物会对患者免疫系统造成 损害。因此多糖类免疫调节剂在肿瘤的治疗上很有吸引力，尤其是它可与一些抗癌药 如5 - f u 、环磷酰胺等合用，可使因化疗导致受损的免疫功能得到恢复，增强抗肿瘤的 作用。 如香菇多糖( 1 e n t i n a n ) 是从食用蘑菇( l e n t i n u se d o e s ) 中分离提取的。在日 本于1 9 8 6 年上市，我国卫生部也于1 9 9 5 年批准生产香菇多糖制剂。香菇多糖与免疫 抑制剂伏福定( u f t ) 合用，用于治疗胃癌。临床试验表明，每周静注香菇多糖2 0 m g ， u f t 每天6 0 0 m g ，有5 0 患者的生命得以延长，其中1 0 “患者可延长两年以上，4 年 随访结果：存活率分别为2 4 3 2 、1 2 7 9 、9 5 1 和3 8 ，而单服u f t 则仅为3 7 、 3 7 、o 和o 。 目前，除香菇多糖外已有不少天然多糖作为抗肿瘤免疫药物经卫生部批准，正式 用于临床，如裂褶多糖( s c h i z o p h y l l a n ) 、云芝多糖( p s i 或p s p ) 和猪苓多糖等。 据不完全统计，来源于植物的抗癌制剂已占抗癌制剂总数的3 2 5 。 多糖作为广谱免疫促进剂起抗癌剂的作用，它最大的优点是毒副作用少，对正常 浙江大学理学硕士学位论文 细胞影响很小，并且多糖与化疗药物有协同作用，还可对抗化疗药物的骨髓抑制等不 良反应。 ( 2 ) 治疗艾滋病等抗病毒药 近年来发现硫酸化多糖，如硫酸葡聚糖( d e x t r a ns u l p h a t e ) 、角叉菜胶 ( c a r r a g e e n i n ) 、肝素( h e p a r i n ) 、硫酸软骨素( c h o n d r o i t i o n ) 等对h i v 有抑制作 用。 其作用机制可能有三种途径：一是硫酸化多糖能抑制逆转录酶的活性，而h i v 是 一种逆转录酶：二是能抑制靶细胞与病毒的结合；三是能增强机体免疫功能，这可能 是多糖在整体状况下抗h i v 的重要机理之一。 硫酸化多糖抑制h i v 的作用不仅与浓度呈量一效关系，而且与分子中硫酸盐的含 量有关：含量越高，其抗h i v 的作用愈强；不含硫酸盐的葡聚糖对h i v 的复制无抑制 作用。 硫酸化多糖从多个环节和步骤上千扰h i v 对宿主细胞的侵袭，并对h i v 有高的选 择性抑制作用。体外试验表明，硫酸化葡聚糖与a z t 有协同抗h i v 作用。由此推测， 若硫酸化葡聚糖( 右旋糖酐) 与a z t 合并用于爱滋病人，可以减少a z t 的用药剂量和 降低毒副作用。 目前现有的抗艾滋病药物，如a z t 、d d c 、天花粉蛋白等的毒性均较大，存在着严 重的毒副作用。为此，国外近来采用称谓“鸡尾酒”式的复合用药来提高治疗效果和 减轻副反应，取得了较好结果，而多糖类的免疫调节剂是很有希望成为这类“鸡尾酒” 的一种调制剂。 此外，多糖还能应用于治疗多种免疫疾病如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌或病 毒引起的慢性疾病。多糖通过类似的免疫调节机制增强宿主免疫能力，以抵抗病原体 的侵袭。 ( 3 ) 延缓衰老药 持免疫功能学说的科学家认为：免疫功能具有增龄性变化，即年龄增大，其免疫 功能下降或紊乱，结果胸腺萎缩，t 细胞损耗，从而导致机体衰老，寿命缩短。多糖 能从整体上提高机体的免疫功能，从一定程度延缓衰老，防治老年病。由于天然多糖 可以增强老年人的免疫功能，因此很有希望将它们作为延缓衰老药应用于临床。 浙江大学理学硕士学位论文 近十年来，化学家们已从扶本固本等补益类中药中得到了多种多糖类化合物，不 但能促进机体的免疫功能，而且证实了有些多糖确实有抗老延寿的作用。如刺五加多 糖可延长果蝇平均寿命1 i 7 2 3 o ( p 2 0 0 万) 上同一根柱，求出柱的空体积v o ，根据v v 0 与l o g m 之间存在着线性关系，可绘制标 准曲线。最后，将待测样品按上述不变的条件上柱，求得待测多糖的v e 。通过标准曲 线上的v g v o ，查得待测多糖的分子量对数，便可求出m 。 ( 2 ) 渗透压法 利用膜渗透压计( m o 仪) 可以测定分子量范围在l 5 0 万之间的多糖分子量。 本法不需用标准品。 ( 3 ) 蒸汽压渗透法 利用蒸汽压渗透计( v p 0 仪) 可以测定分子量范围在5 0 0 1 0 0 0 0 之间的多糖分子 量，方法简单、快速。蒸汽压渗透法用于一些寡糖的分子量测定是很有利的，但它最 大的缺点是测定的结果是数均分子量，丽由糖复合物( 特别是糖蛋白) 得到的寡糖在 多数情况下是不均一的，因此不能精确地了解某一糖链混合物中各个组分的分子量。 ( 4 ) 端基法 用端基法测定分子量的基本原理，是测定单位重量样品中所含可测端基之数，即 每克样品的可测端基的克当量数，或是每毫克中的毫克当量数，从而计算样品的分子 量。 但是用端基法测分子量要求样品的化学结构须具备如下两个条件：每一个分子 链须具有可以用化学方法作分析的基团，以便采用一定的定量分析方法，对该端基作 定量分析。样品的每一个分子链，它所含可测端基的数目，不但须明确，而且数目 应固定不变。 ( 5 ) 粘度法 对于粘度大的多糖，可采用粘度法求分子量。粘度法所需设备较简单，操作较易 掌握，因此常用于多糖的分子量测定。粘度法分子量测定，先测定样品特性粘度【n 】， 然后通过换算方程，即经验式 n 】= k m 8 计算分子量。 ( 6 ) 凝胶渗透色谱法( g p c ) 及高效凝胶色谱法( 髓g p c ) 浙江大学理学硕士学位论文 按这种方法分离样品时，样品分子与固定相表面之间无相互作用，完全根据溶质 分子能否渗透进入g p c 柱填料颗粒网孔而达到筛分大小分子的目的。凝胶渗透色谱法 ( g p c ) 及高效凝胶色谱法( h p g p c ) 测定分子量的范围很宽。 g p c 填料性能有疏水性的，如交联聚苯乙烯，常用于分离分级酯溶性高分子化合 物：也有亲水性的凝胶，常用于分离水溶性高分子化合物，如蛋白质、酶和多糖等。 上述凝胶填料一般都可以分离多糖，目前较好的l o n p a k 系列和t s k 系列韵柱主要用 于分离多糖，用水作洗脱剂。t s k 系列柱既可以分离蛋白质，又可以分离多糖，用缓 冲液如磷酸盐缓冲液作洗脱剂。 此外还有超离心法、光散射法、玻璃纤维纸电泳。聚丙酰胺凝胶电泳测分子量， 及超滤法等估计分子量。 利用不同方法测定多糖分子量可以从不同角度对多糖分子量进行确证，同时也是 对多糖纯度的考察。在测定过程中应注意标准品的选择，尽量使用与被测多糖结构相 似的标准品，因为不同结构的标准品虽然其绝对分子量相同而在一定的条件下所表现 的分子量会有所不同。 多糖分子量的测定没有一种绝对的方法，其分子量只代表相似链长的平均分布而 不是确切的分子大小。往往用不同的方法会得到不同的分子量。 二多糖的结构分析 多糖的结构分析手段很多，其中包括化学降解、酶降解、免