（微生物学专业论文）农杆菌介导的瑞氏木霉转化及绿色荧光蛋白的表达研究.pdf

山东大学硕士学位论文 k n 旺 a s b p e g f p h p h i m k d k b l b l b ( t - d n a ) m m m p a g e p c r 玲r g r b ( t - d n a ) s d s s p t a i l p c r y e p 缩略词表 a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n a c 治t o s y r i n g o n e b a s ep a i r ( s ) e n h a n c e dg r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n h y g r o m y c i nbp h o s p h o t r a n s f e r a s e i n d u c t i o nm e d i u m k i l o d a l t o n k i l o b a s e ( s ) l u r i a - b e r t a n i ( m e d i u m ) l e f tb o r d e r ( t - d n a ) m o l l m i n i m a lm e d i u m p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n o r o t i d i n e 一5 - m o n o p h o s p h a t ed e c a r b o x y l a s e r i g h tb o r d e r ( t - d n a ) s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s p e c i f i cp r i m e r s t h e r m a la s y m m e t r i ci n t e r l a c e d p c r y e a s te x t r a c t - p 印t o n e 5 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：- 三逸虬 e l 期：二趔l 雌 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：五坶导师签名：陋日 期：么避蝴 山东大学硕士学位论文 摘要 瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 是一种腐生性丝状真菌，具有良好的合成 和分泌蛋白的能力，可以用于纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶以及蛋白酶等多种 酶类的生产，具有重要的经济价值。同时，瑞氏木霉作为低等真核生物具有结构 简单、生长迅速、操作简便的优点，也是研究真菌遗传、代谢作用的重要生物材 料。 目前，瑞氏木霉全基因组测序工作已经完成，促进了瑞氏木霉功能基因组学 的发展。建立根癌农杆菌介导的瑞氏木霉转化系统，在基因组范围内进行t - d n a 随机插入突变，建立瑞氏木霉的突变体库，利用正、反向遗传学方法对不同表型 突变体进行基因水平的研究，获得与突变性状相关的基因。控制重要性状基因功 能的阐明有助于深入了解瑞氏木霉特有的生命现象，对瑞氏木霉分子生物学研究 和指导菌株遗传改造具有重要作用。 绿色荧光蛋白作为一种新型的标记基因，被广泛用做原核细胞和真核细胞 的报告基因。在受到紫外光或蓝光激发时可高效发射清晰可见的绿色荧光，具有 稳定、灵敏度高且无需底物或辅助因子参与等优点。自绿色荧光蛋白在大肠杆菌 ( e s c h e r i c h i ac o l i ) 和秀丽隐杆线虫( c a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ) 中成功表达后，绿 色荧光蛋白及其他荧光蛋白已得到广泛的应用，包括对多种真菌的研究，以绿色 荧光蛋白作为分子标记有利于对瑞氏木霉基因表达和蛋白定位等诸多方面的研 究。 本文成功建立了农杆菌介导的瑞氏木霉t - d n a 转化系统，利用农杆菌 a g l l 介导转化瑞氏木霉q m 9 4 1 4 ，得到一批瑞氏木霉t - d n a 插入突变株。将 来自于质粒p a n 7 1 的潮霉素b 磷酸转移酶基因( h p h ) 表达盒插入到t i 质粒 p b l l2 1 中，构建了双元载体p b i h p h 。将该双元载体导入农杆菌a g l l 后，与 瑞氏木霉孢子或原生质体共培养，在含潮霉素平板上得到抗性转化子。通过p c r 和斑点杂交分子验证，表明t - d n a 上的h p h 基因已插入到瑞氏木霉转化子染色 体中。利用t a i l p c r 方法，从转化子中成功克隆到t o d n a 插入位点侧翼序列， 序列测序结果证明t - d n a 随机插入到瑞氏木霉染色体中。目前已经筛选得到经 过分子验证的突变株2 0 0 余株，证明农杆菌介导的转化技术是一种有效的随机 插入突变方法，对于瑞氏木霉功能基因组学研究具有重要意义。 山东大学硕上学位论文 为实现绿色荧光蛋白在瑞氏木霉中的表达，本文将p i g l 7 8 3 质粒中的绿色 荧光蛋白基因( e 加) 表达盒片段与含乳清酸核苷- 5 - 磷酸脱羧酶基因( p y r g ) 的 质粒p a b 4 1 共转化瑞氏木霉尿嘧啶营养缺陷型突变株m 2 3 ，经p c r 验证筛选 得到2 株转化子。r t - p c r 和s d s p a g e 分析结果表明e g i v 基因在这2 株瑞氏木 霉转化子中都能成功转录和翻译。荧光观察结果显示在瑞氏木霉菌丝和孢子中都 可以观察到强烈的绿色荧光。 在进行农杆菌介导的瑞氏木霉转化实验时，为克服以潮霉素作为筛选标记 存在的筛选背景高，筛选效率低等问题，以t i 质粒p c m b i a 0 3 9 0 为骨架构建了 携带乳清酸核苷5 磷酸脱羧酶( p y r g ) 单选择标记基因的双元载体p c m b i a p ， 以及绍彦和p y r g 双选择标记基因的双元载体p c m b i a - o e p ，以便比较不同载体 在转化中的应用效果。将双元载体p c m b i a p 导入农杆菌e h a l 0 5 后，在乙酰 丁香酮诱导下，含双元载体p c m b i a p 的农杆菌与zr e e s e im 2 3 共培养，初步 筛选得到2 0 余株转化子。p c r 验证结果表明p y r g 基因已经插入到转化子染色 体中。含双元载体p c m b i a o e p 的农杆菌与zr e e s e im 2 3 共培养后筛选得到了 1 2 株目的转化子。对转化子菌丝进行的荧光检测，可以观察到绿色荧光，证明 a m t 转化成功，t - d n a 确实插入到zr e e s e i 染色体上且e g f p 基因成功表达，对 转化子性质的进一步分析正在进行中。 ，一， 本文建立了农杆菌介导的瑞氏木霉t - d n a 转化和插入突变系统，实现了绿 色荧光蛋白在瑞氏木霉中的成功表达。目前正在探索建立高效、快捷、高通量的 转化子筛选技术，以尽可能多地获得瑞氏木霉a m t 插入突变株，建立瑞氏木霉 t - d n a 标签突变体库，并对突变体进行进一步的分子鉴定和遗传分析。 关键词：瑞氏木霉；农杆菌介导的转化；双元载体；t - d n a 标签；插入突变； 绿色荧光蛋白 2 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t s a p r o p h y t i cf u n g u s t r i c h o d e r m ar e e s e ic a l l p r o d u c e a c o m p l e t e s e to f e x t r a c e l l u l a rc e l l u | a s e sf o rt h ed e g r a d a t i o no fc e l l u l o s ea n dh e m i c e u u l o s e i ti sa b i o t e c h n i c a l l yi m p o r t a n tf i l a m e n t o u sf u n g u s a sal o w e re u k a r y o t e ，zr e e s e ih a s s i m p l es 仃u c t u r ea n df a s tg r o w t hr a t e ，s oi t sak i n do fs i g n i f i c a n tb i o m a t e r i a lf o r t h e s t u d yo ff u n g ih e r e d i t ya n dm e t a b o l i s m t h eg e n o m es e q u e n c eo fzr e e s e ih a sb e e nc o m p l e t e d ，a n di t su s e f u lf o r t h e d e v e l o p m e n to ff u n c t i o n a lg e n o m i c s i no r d e rt or e s e a r c ht h em o l e c u l a rm e c h a n i s mo f h e r e d i t ya n dm e t a b o l i s m ，i ti si m p o r t a n tt oe s t a b l i s ht h ea g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ( a m t ) s y s t e m ，f o r mm u t a n tl i b r a r ya n da n a l y s et h ed i f f e r e n tm u t a n t s t ow o r ko u tt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no ft h e s eg e n e s t h i si si m p o r t a n tt ot h em o l e c u l a r b i o l o g yr e s e a r c ha n dg e n e t i cm o d i f i c a t i o no ft r e e s e i g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ( g f p ) i sw i d e l yu s e di nt h es t u d yo fp r o k a r y o t ea n d e u k a r y o t ea san e wr e p o r t e rg e n e t h eg r e e nf l u o r e s c e n c ei se x c i t a t e db yu v o rb l u e l i g h t i ti ss t a b l e ，h i g hs e n s i t i v ea n di td o e s n tn e e ds u b s t r a t e so rh e l p e rf a c t o r s s i n c e s u c c e s s f u l l ye x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o l ia n dc a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ，g f pa n do t h e r f l u o r e s c e n tp r o t e i n sh a v e b e e nw i d e l yu s e df o rm a n ys t u d i e s i nt h i ss t u d y , f i l a m e n t o u sf u n g u szr e e s e iq m 9 414w a ss u c c e s s f u l l yt r a n s f o r m e d w i t ha g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sa g l 1 t - d n ab i n a r yv e c t o r p b i h p hw a s c o n s t r u c t e db yi n t r o d u c i n gt h eh y g r o m y c i nbp h o s p h o t r a n s f e r a s eg e n e ( 助矗) i s o l a t e d f r o mp a n 7 1i n t op b i n l 2 1 c o - c u l t i v a t i n go fa t u m e f a c i e n sc o n t a i n i n gp b i h p h w i t hzr e e s e ic o n i d i ao rp r o t o p l a s t s ，h y g r o m y c i nb r e s i s t a n tc l o n e sw e r es e l e c t e da n d t h ei n t e g r a t i o no ft h e 幼j i ig e n ei n t ozr e e s e ig e n o m ew a sd e t e r m i n e db yp c ra n dd o t b l o ta n a l y s i s t - d n ab o r d e r sa n dt h ef l a n k i n gg e n o m es e q u e n c e sw e r es u c c e s s f u l l y r e s c u e df r o mt h ep u t a t i v et r a n s f o r m a n t sb yt a i l p c r n o w , t - d n at a g g e dzr e e s e i m u t a n t sh a db e e no b t a i n e df r o mt h ea m tt r a n s f o r m a t i o n i t s u g g e s t s t h a t a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o ni sap o t e n t i a l l yp o w e r f u lt o o lf o rt h eg e n e t r a n s f e rt e c h n o l o g yo ft r e e s e i p l a s m i dp i g17 8 3i st r a n s f o r m e di n t ot w os a cf u n g i ，a n d 嘶g e n ei nt h i sv e c t o r 3 山东大学硕士学位论文 c a l lb ee x p r e s s e ds u c c e s s f u l l y i nt h i ss t u d y , t h ee e d og e n ec a s s e t t ew a so b t a i n e d ，a n dz r e e s e im 2 3w a sc o t r a n s f o r m a t e dw i t ht h i sc a s s e t t ea n dp l a s m i dp a b 4 1 t w o t r a n s f o r m a n t sw i ms t a b l eh e r e d i t yo ft h e 劝g e n ew e r es e l e c t e db yp c r a n a l y s i s t h er t p c r , s d s p a g er e s u l t si n d i c a t e dt h a te g o , g e n ew a st r a n s c r i p t e da n d t r a n s l a t e ds u c c e s s f u l l y d e t e c t i n gw i t hf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，g r e e nf l u o r e s c e n c e c a nb ef o u n di nh y p h aa n ds p o r e so ft r e e s e it r a n s f o r m a n t s t oi m p r o v et h es c r e e n i n ge f f i c i e n c y ，e g o , g e n ea n do r o t i d i n e - 5 - p h o s p h a t e d e c a r b o x y l a s e ( p y r g ) g e n ew e r eu s e da sm a r k e rg e n e s t w ob i n a r yv e c t o r sw e r e c o n s t r u c t e dw i t hap c a m b i a 0 3 9 0b a c k b o n e t h eb i n a r yv e c t o rp c m b i a p c o n t a i n i n gp y r gg e n e ，w a st r a n s f o r m e di n t oa t u m e f a c i e n s e h a l0 5 a f t e r c o c u l t i v a t i o nb e t w e e na m m e f a c i e n sa n dzr e e s e i r e s i s t a n tt r a n s f o r m a n t sw e r e s e l e c t e d p c ra n a l y s i se s t a b l i s h e dt h a tp y r gg e n ew a si n c o r p o r a t e di n t ot h eg e n o m e a n o t h e rd o u b l e - s e l e c t i v e - m a r k e rb i n a r yv e c t o ri sp c m b i a o e p , c o n t a i n i n gt h ep y r g a n de g o , g e n e s zr e e s e im 2 3w a sc o c u l t i v a t e dw i t ha t u m e f a c i e n sc o n t a i n i n g p c m b i a - o e er e s i s t a n tt r a n s f o r m a n t sw e r es e l e c t e da n dd e t e c t e dw i t hf l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e g r e e nf l u o r e s c e n c ec a nb ef o u n di nh y p h ao fz r e e s e it r a n s f o r m a n t s t h e a n a l y s i so ft r a n s f o r m a n t si su n d e r g o i n ge x p e r i m e n t a lp r o c e d u r e s a g r o b a c t e r i u m - m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ( a m t ) s y s t e mw a sc o n s t r u c t e da n d e n vg e n ew a se x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi nzr e s s e i a ne f f i c i e n ta n dh i g ht h r o u g h p u t s c r e e n i n gs y s t e mi sh o p e dt ob u i l du pa n dw et r yt om a k ed e e pa n a l y s i st oz r e e s e i t r a n s f o r m a n t s k e yw o r d s ：t r i c h o d e r m ar e e s e i ，a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n ( a m t ) ， 4 b i n a r yv e c t o r , t - d n at a g ，i n s e r t i o n a lm u t a g e n e s i s ，g r e e nf l u o r e s c e n t p r o t e i n ( g f p ) 山东人学硕士学位论文 第一章绪论 丝状真菌分布广泛，能利用多种碳源和氮源生长，这种代谢多样性使其具有 产生多种初级和次级代谢产物的能力。丝状真菌与工农业生产、医疗实践、环境 保护和生物学基本理论研究等方面都密切相关，其中许多具有重要工业价值的真 菌，具备良好的蛋白质合成及分泌能力，是公认的安全生产菌株。一些丝状真菌 如黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 和米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 被广泛用于酶制剂 ( 如蛋白酶和淀粉酶) 和有机酸( 如柠檬酸等) 的生产；顶头孢霉( c e p h a l o s p o r i u m a c r e m o n i u m ) 和产黄青霉( p e n i c i l l i u mc h r y s o g e n u m ) 分别是重要的抗生素头孢 菌素和青霉素的生产菌；另外，一些丝状真菌( 如白僵菌b e a u v e r i ab a s s i a n a 、绿 僵菌m e t a r h i z i u ma n i s o p l i a e 、哈氏木霉t r i c h o d e r m ah a r z i a n u m 等) 可用于作物病 虫害的生物防治等。丝状真菌与工农业生产的密切关系，极大地激发了科学家对 丝状真菌的研究兴趣。 丝状真菌作为低等的真核生物，具有结构简单、繁殖迅速、易于操作等优点， 同时又具有真核特征性细胞结构和基因结构，以及与高等真核生物类似的基因表 达调控机制，因此近年来丝状真菌分子生物学逐渐成为现代分子生物学研究的一 个热点。其中，构巢曲霉( a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 和粗糙脉孢霉( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 由于其相对简单性而被作为模式菌株进行研究。 瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i , a r l a l t l o r p h ：h y p o c r e a j e c o r i n a ) 是在二战时期 从所罗门群岛的棉制油布中分离得到的一种嗜温腐生性丝状真菌，具有良好的降 解纤维素材料的能力。由于该菌由r e e s ee t 博士筛选鉴定，因此被命名为 t r i c h o d e r m ar e e s e i ( r e e s ea n dl e v i n s o n1 9 5 2 ) 。作为工业菌株，zr e e s e i 能够生 产分解不同植物材料的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶等( 汪天虹等，2 0 0 0 ) ， 其中一些瑞氏木霉突变株的纤维素酶产量可达4 0g 1 ，而最主要的纤维素酶c b h i ( c e l l o b i o h y d r o l a s ei ，纤维二糖水解酶i ) ，可以达蛋白分泌总量的5 0 ( d u r a n d 甜a 1 1 9 8 8 ) 。瑞氏木霉作为工业生产菌株生产维素酶、半纤维素酶已有多年的历 史，这些酶类被广泛应用于纺织、造纸、制浆等工业领域( b i e l ya n dt e n k a n e n 1 9 9 8 ) 。除具有极好的合成和分泌蛋白的能力以外，zr e e s e i 还具有真核的蛋白分 泌机制和与哺乳动物系统相似的蛋白质翻译后修饰、加工性能，如高甘露糖型和 7 山东大学硕士学位论文 n 糖基化( h u ip je la 1 2 0 0 2 ) 。目前，瑞氏木霉已经被作为新型的真核表达系 统生产各种同源或异源蛋白。 与构巢曲霉和粗糙脉孢霉等模式菌株相比，瑞氏木霉的分子生物学研究虽然 起步较晚，但是由于其适于蛋白生产的诸多优点，而且对人类没有毒性，瑞氏木 霉也已成为相关研究人员开展真菌细胞学、遗传学和生理生化研究的重要生物材 料( f o r e m a ne ta 1 2 0 0 3 ；s c h m o l le ta 1 2 0 0 3 ) 。美国能源部( n o e ) 资助支持了 瑞氏木霉基因组的测序工作，目前全基因组序列已经完成并公布 ( h t t p ：g e n o m e j g i - p s f o r g t r i r e 2 t r i r e 2 h o m e h t m l ) 。瑞氏木霉全基因组测序的完 成为利用功能基因组学方法研究具有重要生物学意义的功能基因奠定了基础。建 立携带基因标签的瑞氏木霉插入突变体库是功能基因组学发展的趋势，对不同表 型的突变体进行正、反向遗传学分析可以促进揭示瑞氏木霉生长、代谢、发育的 分子机理。 1 1丝状真菌转化系统 丝状真菌是重要的工业生产菌株，与工农业生产关系密切。作为基因工程受 体菌，丝状真菌具有蛋白分泌能力强，能够正确进行翻译后加工且蛋白分泌机制 与高等生物类似等优点，因此在丝状真菌中建立一个有效的转化系统具有相当重 要的价值。近年来，丝状真菌的遗传转化系统在理论和应用上均取得了较大的成 就，应用缺陷型标记转化酿酒酵母以及酿酒酵母大肠杆菌穿梭载体的成功利用 标志着真菌遗传转化的开始。c a s e 等于1 9 7 9 年首次报导了在丝状真菌c r a s s a 中的基因转化( c a s ee ta 1 1 9 7 9 ) ，随后在越来越多的丝状真菌中实现了遗传转化。 目前为止，已经在1 0 0 多种丝状真菌中成功地进行了转化，为人们从基因水平研 究丝状真菌的遗传背景和进一步的菌株改造提供了良好的条件。 1 1 1 丝状真菌转化方法 外源d n a 导入丝状真菌中最普遍使用的方法是c a c l 2 p e g 介导的原生质 体转化( c e e se ta 1 1 9 9 1 ) ；与c a c l 2 p e g 法相比，电转化技术( e l e c t r o p o r a t i o n ) 简化了操作步骤；另外，基因枪转化法( b i o l i s t i c s ) 、限制性内切酶介导转化法 ( r e s t r i c t i o ne n z y m em e d i a t e di n t e g r a t i o n ，r e m i ) 、农杆菌介导转化法 山东大学硕士学位论文 ( a g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n sm e d i a t e dt r a n s f o r m a t i o n , a t m t ) 等近年来在丝状真 菌中得以应用，并有其自身的特点。 c a c l 2 p e g 介导的原生质体转化是以原生质体作为感受态细胞，与转化d n a 混合后，在一定浓度的c a c l 2 、聚乙二醇( p e g ) 等的作用下进行，制备高效的 原生质体是进行转化的前提和基础( 黄卫，2 0 0 0 ) 。原生质体作为受体细胞具有 群体数量大，容易获得纯合性的转化子等优点，但是原生质体的制备操作繁琐、 再生频率低，限制了c a c l 2 p e g 法在真菌中的广泛应用。 电转化法是利用短暂的电场脉冲作用，使原生质体膜或细胞膜形成可逆的瞬 间通道，从而使d n a 进入细胞。但是电转化法对丝状真菌的转化效率并不高， 因此很少有在丝状真菌转化中采用电转化法的报导。 基因枪法是上世纪8 0 年代末逐步发展起来的，其原理是将外源d n a 吸附在 微小的金粒或钨粒表面，在基因枪激发的瞬间力量作用下将外源基因直接导入受 体细胞中。基因枪法具有快速、简便、安全、高效等特点，目前已经应用于多种 丝状真菌( b a i l e y e ta 1 1 9 9 3 ；h e r z o gr we ta 1 1 9 9 6 ) 。 限制性内切酶介导的转化技术是在转化混合物中添加限制性内切酶，提高异 源整合频率的方法。r e m i 插入突变技术具有操作简单，转化效率高，单拷贝插 入概率大等优点，已成功地应用于一些真菌的转化( s a n c h e ze ta 1 1 9 9 8 ；s u n k y u n g p t 口正2 0 0 4 ) 。 农杆菌介导转化法是利用农杆菌t i 质粒上的t - d n a 将外源基因转移到真 菌基因组中的方法。该方法具有转化效率高，遗传稳定性好等优点，自1 9 9 8 年 首次成功转化泡盛曲霉( a s p e r g i l l u sa w a m o r i ) 等多种丝状真菌后( m i c h i e l s ee ta 1 2 0 0 5 ) ，该方法已经成为最常用的真菌遗传转化方法。 1 1 2 丝状真菌遗传转化系统的选择标记 丝状真菌遗传转化中常见的选择性标记主要有三类，营养缺陷型标记基因、 药物抗性标记基因和碳源、氮源、硫源利用标记基因等。 最初的丝状真菌转化多是利用营养缺陷型菌株来进行，通过将营养缺陷型互 补基因转入受体菌，与受体菌中的缺陷基因互补，从而使受体菌表现出野生型生 长而作为选择标记。目前，常用5 氟乳清酸抗性来构造尿嘧啶营养缺陷型基因， 9 山东大学硕士学位论文 与编码乳清酸核苷5 磷酸脱羧酶的来自粗糙脉孢菌的p y r - 4 基因和来自构巢曲霉 的p y r g 基因形成互补( r u i z d i e ze ta 1 2 0 0 2 ) 。 药物抗性标记是一类使用方便的显性选择标记，无需筛选突变株作为受体菌 株。常用的抗性标记包括g 4 1 8 ( g e n e t i c i n ) 、潮霉素( h y g r o m y c i n ) 、寡霉素 ( o l i g o m y c i n ) 、博来霉素( b l e o m y c i n ) 、腐草霉素( p h l e o m y c i n ) 、卡那霉素 ( k a n a m y c i n ) 等，其中g 4 1 8 和潮霉素抗性基因用于许多丝状真菌的转化系统。 碳源、氮源和硫源利用基因包括乙酰胺酶基因( a m d s ) 、硝酸盐还原酶基因 ( n i a d ) 等，此类标记基因具有与受体细胞染色体同源的序列，可以插入受体细 胞染色体上的特定位点，从而破坏该位点附近基因的表达而产生突变型表型，是 真菌转化中常用的筛选标记。 1 1 3 丝状真菌转化载体 丝状真菌的转化载体通常有两种：自主复制型载体和整合型载体，其中由于 丝状真菌的转化大多为整合型转化，整合型载体在丝状真菌转化中占多数。 自主复制型载体在受体细胞中可以独立存在，不与宿主染色体整合。由于载 体上带有真核系统特异的复制起点，可以在受体细胞中复制形成多拷贝，但是在 没有选择压力的条件下容易丢失。自主复制型载体多存在于细菌和酵母中，在丝 状真菌中发现的仅有几例，且多存在于线粒体中。 整合型载体主要通过同源重组和异源重组两种方式整合到丝状真菌的染色 体上。而同源重组又产生两种类型转化子，一种为载体d n a 与受体染色体同源 序列之间通过单交换导致载体d n a 整合到染色体d n a 上；另一种类型是载体 d n a 与受体染色体同源序列之间发生双交换，导致染色体基因被目的基因所取 代。异源重组常产生多位点多拷贝整合的转化子，目的基因在染色体上形成不连 锁的重复。在丝状真菌转化中多数为同源整合，但是异源整合也占有一定的比例， 两者的比例与受体菌和转化载体有关( b i n n i n g e re ta 1 1 9 8 7 ) 。 1 2 农杆菌介导转化( a m t ) 丝状真菌研究进展 农杆菌可以转移肿瘤诱导质粒( t i 质粒) 的部分片段( t - d n a ) 到植物基 因组中使其产生冠婴瘤。自d eg r o o t 等人于1 9 9 8 年首次将农杆菌介导的转化技 1 0 山东大学硕士学位论文 术成功应用于a a w a m o h 等多种丝状真菌后，大量农杆菌介导的丝状真菌转化 获得成功( m i c h i e l s ee ta 1 2 0 0 5 ) 。农杆菌介导转化( a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ，a m t ) 技术与传统的转化方法相比，具有转化效率高、遗传稳定 性好、随机单拷贝插入等特点，可进行同源整合，也可以随机插入，a m t 技术 将极大的推进功能基因组学的发展。 1 2 1 农杆菌介导转化( a m t ) 技术概述 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化 性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆 菌和发根农杆菌中分别含有含有一种独立于染色体之外，并在农杆菌细胞中稳定 遗传的环状d n a ，即t i 质粒和黜质粒，其上有一段t - d n a ，t i 质粒和础质粒 在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性，但实际工作中，绝大部 分采用t i 质粒。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将t - d n a 插入到植物 基因组中，并稳定地保留在植物细胞染色体内，变为植物细胞新增加的一群基因， 最终能通过有性世代遗传给子代。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。 人们将目的基因插入到经过改造的t - d n a 区，借助农杆菌的感染实现外源 基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植 株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些 单子叶植物( 尤其是水稻) 中也得到了广泛应用，a m t 技术已经逐渐成为植物 遗传转化中的常规技术。 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化是近年来发展的一种新方法，与传统的转化 方法相比，该方法具有操作简便、转化效率高和易得到稳定转化子等特点。自农 杆菌介导的转化技术成功应用于a a w a m o d ，a n i g e 厂，a n i d u l a n s 等多种丝状真 菌后( d eg r o o te t a l 1 9 9 8 ) ，在根癌农杆菌介导下已实现了多个属种真菌的遗传 转化，并显示出良好的应用前景。 1 2 2 农杆菌的t i 质粒 t i 质粒是在根癌农杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链 d n a 分子，大约在1 6 0 2 4 0k b 之间，其中的t - d n a 大约在1 5 3 0k b 。t i 质粒特 山东大学硕士学位论文 定部位与植物核内d n a 组合表达信息，控制根瘤的形成，t i 是英文肿瘤诱发 ( t u m o r - i n d u c i n g ) 的缩略式。根据其诱导的植物冠瘿瘤中所合成的冠瘿碱种类， t i 质粒可分为四类：章鱼碱型( o c t o p i n e ) ，胭脂碱型( n o p a l i n e ) ，农杆碱型 ( a g r o p i n e ) 和农杆菌素碱型( a g r o c i n o p i n e ) 或称琥珀碱型( s u c c i n a m o p i n e ) 。 t i 质粒可分为四个功能区域：t - d n a 区( t r a n s f e r r e d d n ar e g i o n ) ，t - d n a 是根癌农杆菌侵染植物细胞时，从t i 质粒上切割下来转移到植物细胞的一段 d n a ，称为转移d n a ，该d n a 片段上的基因与肿瘤的形成有关；v i r 区 ( v i r u l e n c er e g i o n ) ，该区段上的基因能激活t - d n a 转移，使农杆菌表现出毒性。 t o d n a 区与v i r 区在质粒d n a 上彼此相邻，约占t i 质粒d n a 的三分之一； c o n 区( r e g i o ne n c o d i n gc o n j u g a t i o n s ) ，该区段上存在着与细菌接合转移的有关 基因( t r a ) ，调控t i 质粒在农杆菌之间的转移，冠瘿碱能激活t r a 基因，诱导t i 质粒转移，因此称之为接合转移编码区；o r i 区( o r i g i no f r e p l i c a t i o n ) ，该区 段基因调控t i 质粒的自我复制，故称之为复制起始区。 但是野生型t i 质粒直接作为基因工程的载体存在一些障碍，如分子量过大， t i 质粒存在各种限制性酶切位点等，为了便于重组d n a 操作，研究人员对t i 质粒进行了改造，构建一系列合适的t i 衍生载体。首先除掉了野生型t i 质粒 t - d n a 区的一段d n a 片段，如参与植物生长素和细胞分裂素基因等；此外在 t i 质粒上加上ec o l i 复制起始位点和筛选标记，构建根癌农杆菌大肠杆菌穿梭 质粒，使其不但可在农杆菌中复制，而且便于在ec o 中重组操作与保存。 1 2 3t i 质粒的转化机理 农杆菌感染过程中t - d n a 转移的机理在许多综述中有详细叙述( c h r i s t i e 1 9 9 7 ；k a d o2 0 0 0 ；z h ue ta 1 2 0 0 0 ) ，推测真菌的t - d n a 转移原理与植物中基本类 似( 图1 1 ) 。 乙酰丁香酮( a s ) 诱导毒性基因( v i r ) 的表达，协基因产物将t i 质粒上的 一段单链切下，产生单链线性d n a ( t - d n a ) ，t - d n a 两侧有2 4 b p 的重复序列， 称为左边界( l b ) 和右边界( i 也) 。v i r d 2 蛋白在v i r d l 蛋白存在的情况下，识 别t - d n a 的重复序列末端，在这两个2 4b p 的重复序列的第二和第三碱基之间 的末端链上产生了缺刻，这些缺刻作为t - d n a 区末端线性单链置换的起始和终 1 2 厂 一一 。? 一、翟夕一 ， p ， 一 ”g ? 7 y t 7 , 、 j + 一 一。f 图i - i 农杆菌t i 质粒转移机理示意图 f i g 1 一is c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no f t ip l a s m i dt r a n s f o r m a t i o n 山东大学硕士学位论文 通过分级反应来扩增特异产物。t a i l p c r 包括三个连续的p c r 扩增反应( 图 1 2 ) 。第一次反应包括5 次高特异性、1 次低特异、1 0 次较低特异性反应和1 2 个热不对称的超级循环。5 次高特异性反应，使s p l 与已知的序列退火并延伸， 增加了目标序列的浓度；1 次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列 上；1 0 次较低特异性反应使2 种引物均与模板退火，随后进行1 2 次超级循环。 经上述反应得到了不同浓度的3 种类型产物：特异性产物( i ) 型和非特异性产 物( i i 型和i i i 型) 。第二次反应则将第一级反应的产物稀释1 0 0 0 倍作为模板，通 过1 0 次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量 极低。第三次反应将第二次反应的产物稀释作模板，利用普通p c r 反应或热不 对称超级循环，通过上述3 次p c r 反应可获得与已知序列邻近的目标序列。 钳ls r zs p j c 诤- 嘲蠢cd e a b i d0 0 0 ld n a 憎n | 飘曲_ 曙p 婢w i t h s i p l j a b 魏糊哪群黧卅勘s 就m i n i 柚 l 硎钟p 娃喇i 粥喇 d l 骞i 嘲kp o ti m 孽l m e d 弘橛秘 l a h 峙m i d 麓硝咖曝 图1 2t a i l -