（微生物学专业论文）铜绿假单胞菌铁反应基因调控的研究.pdf

铜绿假单胞菌铁反应基因调控的研究 中文摘要 对大多数细菌而言，铁是一个必不可少的营养元素。尽管地球上铁含量丰富，但在 大多数环境中铁对生物体而言是难以获得的。铁限制是宿主防御病原菌侵害的第一道防 线：另一方面过多的铁又会导致氧化伤害。为了避免铁吸收过程中各种过度放任导致的 不良后果，微生物进化了复杂而又巧妙的遗传和生化机制以控制铁的吸收、代谢和平衡。 群体感应系统是一个细胞密度依赖的全局性基因表达调节系统，它与铁调节系统相互作 用编织出复杂的调控网络。 铜绿假单胞菌是一种重要的机会致病菌，可引起包括囊胞性纤维症病人的慢性肺感 染等多种感染性疾病，是主要的医源性感染源。该菌具有庞大的基因组和复杂多样的调 节机制，来调控各种毒性因子的表达和生理生化活动以适应环境变化。 本文分别对该基因组中两个铁反应基因，编码双组分反应调节子的p a 2 5 7 2 和编码柠 檬酸铁吸收途径s i g r n a l 因子i 拘p a 3 8 9 9 进行功能研究。首先分别构建两基因的铜绿假单胞 菌p a 0 1 的敲除突变体，并利用无启动子的l u x a b c d e 发光基因作为报告基因进行启动子 活性研究。研究发现p a 2 5 7 2 对铁载体的合成基因p 幽d 4 和p 肼以及未知功能基因 p a 3 8 4 9 的表达有影响；p a 3 8 9 9 齐j p 记斫i ：l o p r l 基因也有一定的作用，预示着两个基因分 别与铁载体吸收系统有一定的调控关系。两基因对其他铁反应基因，q s 系统及其调节的 毒性因子基因没有明显调节作用；而q s 系统对p a 2 5 7 2 和p a 3 8 9 9 分别具有促进和抑制作 用。研究还发现铁对q s 系统及其毒性因子基因的表达具有一定促进作用；铁对生物被膜 的产生是不利的，高铁条件下突变体p a o l ( a 2 5 7 2 ) 干f l p a o l ( a 3 8 9 9 ) 的生物被膜产量也 较野生型p a 0 1 的少。 t o l - o p r l 基因在维持外膜完整性，转膜运输以及革兰氏阴性菌的细胞分裂方面起着 重要的作用。在铜绿假单胞菌中，t o l o p r l 基因簇由独特的三个操纵子组成：d 矿一t o l q r a ， t o l b 和o p r l o r f 2 ，它们均受到铁的调节。t o l q r a 复合物和铁运输系统的e x b b d t o n b 具 有相似性，其功能可以部分互相代替。本文研究了d r f 一t o l q r a 操纵子的启动子及其表达 图特性，并对o r f l 的功能进行了研究。通过放射标记和荧光标记的引物延伸反应，以及 以l a c z 和l u x a b c d e 为报告子的启动子活性研究，发现t o l q r a 上游有两个不同的启动子， 一个位于d 印的前面是组成型的，一个位于d r f 内部是受铁调控的。在生长稳定期， 细厶叩儿操纵子均受到q s 系统的抑制。与幻z q 和幻现突变体不可存活不同，可存活的d 矿 敲除突变株是可以构建的，该突变体的细胞和克隆形态均有变化。首次证明铜绿假单胞 菌中，o r f l 在t 0 1 o r , r l 复合物中起着并非必不可少的作用。 关键词 铜绿假单胞菌，铁调节，铁载体，群体感应，t o - o p r l i n v e s t i g a t i o no nt h er e g u l a t i o no fi r o n r e s p o n s i v eg e n e s i np s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a b s t r c t i r o ni sa ne s s e n t i a le l e m e n tf o rm o s to r g a n i s m s ，i n c l u d i n g b a c t e r i a d e s p i t ei t s a b u n d a n c eo ne a r t h ，i ti sb i o l o g i c a l l yu n a v a i l a b l ei nm o s te n v i r o n m e n t s i r o nl i m i t a t i o ni st h e f i r s tl i n eo fd e f e n s ef o rh o s ta g a i n s tp a t h o g e n s o nt h eo t h e rh a n d ，r e d u c e df o r mo fi r o ni s l l i 曲l yt o x i cf o rm o s tm i c r o o r g a n i s m s t oo b t a i nab a l a n c ei ni r o nc o n c e n t r a t i o n ，m i c r o b e s e v o l v e dc o m p l e xa n ds m a r th e r e d i t ya n db i o c h e m i s t r ym e c h a n i s m st oc o n t r o li r o nu p t a k e ， m e t a b o l i s ma n dh o m e o s t a s i s b a c t e r i a lq u o r u ms e n s i n gi sad e n s i t yd e p e n d e n tg l o b a l r e g u l a t o r ys y s t e m i r o nr e g u l a t i o na n dq u o r u ms e n s i n gi n t e r t w i n ei nb a c t e r i at of o r ma c o m p l e xr e g u l a t i o nn e t w o r k p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ai sa l li m p o r t a n to p p o r t u n i s t i cp a t h o g e nt h a tc a u s e sv a r i o u s d i s e a s e si n c l u d i n gc h r o n i cl u n gi n f e c t i o n si nc y s t i cf i b r o s i sp a t i e n t sa n di sam a j o rs o u r c eo f n o s o c o m i a li n f e c t i o n s i tp o s s e s s e sa ne n o r m o u sg e n o m ea n dc o m p l e xr e g u l a t i o nm e c h a n i s m s w h i c hc o n t r o lv a r i e t yo fc e l l u l a rp r o c e s s e sa n db a c t e r i a lb e h a v i o r si n c l u d i n gt h ep r o d u c t i o no f v i r u l e n c ef a c t o r sa n dp a t h o g e n i c i t yd u r i n gb a c t e r i a li n f e c t i o n t h i sr e s e a r c hf i r s t l yi n v e s t i g a t e dt h ef u n c t i o n so ft w oi r o nr e g u l a t e dg e n e s ，p a 2 5 7 2 ， e n c o d i n gap r o b a b l et w o c o m p o n e n tr e s p o n s er e g u l a t o ra n dp a 38 9 9 ，e n c o d i n gp r o b a b l e s i g m a - 7 0f a c t o ri nt h ed i f e r r i cd i c i t r a t eu p t a k ep a t h w a y t h em u t a n t so f t h e s et w og e n e sw e r e c o n s t r u c t e di np a o 1 ，a n dl u x c d a b e - b a s e dp r o m o t e r - r e p o r t e rf u s i o n sw e r ea l s oc o n s t r u c t e d t oe x a m i n et h ee x p r e s s i o no fr e l e v a n tg e n e si nt h e s em u t a n t s t h er e s u l t si n d i c a t et h a t p a 2 5 7 2a f f e c t e dt h ee x p r e s s i o no fs i d e r o p h o r es y n t h e s i sp r o t e i n sp c h d c b aa n dp v d f ，a n da s w e l la st h ec o n s e r v e dh y p o t h e t i c a lp r o t e i ne n c o d e db yp a 3 8 4 9 ；p a 3 8 9 9c o n t r o l l e dt h e e x p r e s s i o no f p v d fa n do p r l t h e s eo b s e r v a t i o n ss u g g e s tt h a tt h e s et w og e n e sa r er e l a t e dt o s i d e r o p h o r e m e d i a t e di r o nu p t a k es y s t e m i np a o1 ，t h e s et w og e n e sd i dn o ta f f e c t t h e e x p r e s s i o n so ft h eq u o r u ms e n s i n g ( q s ) s y s t e mo rt h ev i r u l e n c ef a c t o r s i n s t e a d ，t h e s et w o g e n e sw e r er e g u l a t e db yq sa n di r o na f f e c t e db o t ht h ee x p r e s s i o no fq ss y s t e ma n dv i r u l e n c e f a c t o r sa n dt h ef o r m a t i o no fb i o f i l m i ni r o n r i c hc u l t u r em e d i u m ，t h eb i o f i l mf o r m a t i o no f p a o l ( k 2 5 7 2 ) a n dp a o l ( a 3 8 9 9 ) w e r er e d u c e dc o m p a r e dt op a 0 1 t h et o l - o p r lg e n e sp l a yi m p o r t a n tr o l e si nm a i n t a i n i n go u t e rm e m b r a n ei n t e g r i t y ， t r a n s m e m b r a n et r a n s p o r t a t i o n ，a n dc e l ld i v i s i o ni ng r a m n e g a t i v eb a c t e r i a i np a e r u g i n o s a , t h et o l - o p r lg e n e sa r eo r g a n i z e du n i q u e l yi nt h r e eo p e r o n s ，0 , 7 一t o l q r a ，t o l ba n d 印儿一o r f 2 ， a n da r er e g u l a t e db yi r o na v a i l a b i l i t y t o l q r ai ss i m i l a rt oe x b b d t o n bc o m p l e xa n dc a n i m p e r f e c t l yr e p l a c et h ef u n c t i o no ft h el a t t e ri ni r o nt r a n s p o r ts y s t e mi np a e r u g i n o s a i nt h i s s t u d y ，t h ep r o m o t e r sa n de x p r e s s i o np r o f i l e so ft h et o l - o p r lo p e r o n sw e r ec h a r a c t e r i z e d ，t h e f u n c t i o no f o r f l i n v e s t i g a t e d p r i m e r e x t e n s i o n sw e r ec a r r i e do u tb y u s i n gb o t h i s o t o p e l a b e l l e d a n df l u o r e s c e n c el a b e l l e d p r i m e r s a n dt h e e x p r e s s i o np r o f i l e s w e r e d e t e r m i n e db yu s i n gb o t hl a c za n dl u x c d a b eb a s e dt r a n s c r i p t i o n a lf u s i o n s t h er e s u l t s r e v e a l e dt w od i s t i n c tp r o m o t e r sa tt h eu p s t r e a mr e g i o no ft o l q r a ；o n el o c a t e di nf r o n to fo r f l w a sc o n s t i t u t i v ew h i l et h eo t h e rw i t h i nt h ed 矿c o d i n gr e g i o nw a si r o n r e g u l a t e d e x p r e s s i o n p r o f i l e si n d i c a t e t h et o l - o p r lo p e r o n sw e r ea l s od o w n - - r e g u l a t e db yt h eq u o r u m - - s e n s i n g s y s t e m sd u r i n gt h el a t es t a g eo fg r o w t h u n l i k et o t qa n dt o l a ，av i a b l ed 矿k n o c k o u ts t r a i n w a ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d t h em u t a n te x h i b i t e da l t e r e dc e l la n dc o l o n ym o r p h o l o g y ， p r o v i d i n gf i r s te v i d e n c et h a to r f lp l a y san o n e s s e n t i a lr o l ei nt h et o l - o p r lc o m p l e xi np a e r u g i n o s a k e yw o r d s p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a ，i r o nr e g u l a t i o n ，s i d e r o p h o r e ，q u o r u ms e n s i n g ，t o l 一叩儿 i v c f f u r e c f q s a h l s p q s c p s l b p a d m s o p c r c y s t i cf i b r o s i s f e r r i cu pt a k er e g u l a t o r 缩略语 e x t r ac y t o p l a s m i cf u n c t i o n q u o r u ms e n s i n g n a c y l h o m o s e r i n el a c t o n e s p s e u d o m o n a sq u i n o l o n es i g n a l l i g h tp r o d u c t i o ni nc o u n t sp e r s e c o n d l u r i a - b e r t a n i p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a d i m e t h y ls u l p h o x i d e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 囊胞性纤维症 铁吸收调节子 特殊胞质功能 群体感应 n 乙酰高丝氨酸内脂 假单胞菌喹诺酮信号分子 每秒发光量 l b 培养基 铜绿假单胞菌 二甲基亚砜 聚合酶链式反应 h e p e sh y d r o x y e t h y lp i p e r a z i n ee t h a n e s u l f o n i ca c i d 羟乙基哌嗪n 一2 一乙磺酸 e d d h a e t h y l e n e d i a m i n e d i ( o h y d r o x y p h e n y l a c e t i ca c i d ) 乙二胺二邻羟苯基大乙酸 图目录 图1 f u r 和p r r f 在铁平衡调节中相互作用模型5 4 1 一7 图2 s i d r e r o p h o r e 介导的铁吸收和信号传递【5 8 】8 图3 p a e r u g i n o s a 群体感应网络模型【6 9 】1 0 图4 p m s 4 0 2 图谱2 8 图5 质粒p e x l 8 一a r n p l 习谱1 2 7 1 3 0 图6 质粒p z l 9 1 8 一l a c zg m 图谱3 1 图7 突变体的构建流程3 2 图8 p r k 4 1 5 质粒图3 8 图1 0 p a 0 1 ( a 2 5 7 2 ) 突变株构建过程琼脂糖电泳检测图4 3 图11 铁反应基因在p a 0 1 和p a o l ( a 2 5 7 2 ) 中的表达4 5 图1 2 不同铁浓度p a 2 5 7 2 在各p a 0 1 菌株中的表达4 7 图1 3 不同铁浓度p a 2 5 7 2 在p a 0 2 1 4 菌株中的表达4 8 图1 4 高铁条件下p a 0 1 ( a 2 5 7 2 ) 的泳动4 9 图15 p a 0 1 ( h 3 8 9 9 ) 突变株构建过程琼脂糖电泳检测图51 图1 6 不同铁浓度下p 臁p a 0 1 和p a o l ( a 3 8 9 9 ) q b 的表达5 2 图1 7 低铁条件下p a 3 8 9 9 在不同p a o 菌株中的表达5 3 图1 8 低铁条件下p a 3 8 9 9 对印儿表达的影响5 4 图1 9 不同铁浓度下q s 系统基因在p a 0 1 野生型中的表达5 7 图2 0 不同铁浓度下q s 系统毒性因子在p a 0 1 中的表达5 8 图2 1 不同铁浓度殆c ，p c h d 矛r l p v d f 基因在p a 0 1 中的表达5 9 图2 2 不同铁浓度下各p a o 菌株的生物被膜量6 0 图2 3 不同铁浓度下各p a 0 1 菌株的总生物量6 1 图2 4 从p a 0 1 中提取的总砌蛆电泳图6 5 图2 5 p 1 ( d r f 一t o l q r a 启动子) 区域的引物延伸分析6 6 图2 6 p p ( o p r l d 啦启动子) 引物延伸分析6 7 图2 7 p l c o n 和p l i n d 启动子的活性6 9 图2 8 t o l - o p r l 基因簇启动子区域p c r 扩增的琼脂糖凝胶电泳图7 0 图2 9 群体感应系统对t o l - o p r l 表达的影响7 2 图3 0 o r f l 突变在克隆大小上的影响7 3 表目录 表1 本实验所用的菌株和质粒1 9 表2 1 1 个铁反应启动子的基因3 3 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许 论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所等机构将本学位论 文收录到中国学位论文全文数据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名：二琵豳指导教师签名： 2 7 年f 月，。e t2 鲫降占月z e l 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导j i l ：i t r 导下进行的研究工作 及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西 北大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 = 出 思。 学位论文作者签名：吧阳 2 硼7 年f 月o 日 f 两北大学博士毕业论文 第一章绪论 1 1 铜绿假单胞菌介绍 铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ，p a ) 是一种广泛分布于自然界的革兰氏 阴性菌，属于假单胞菌属。在世界各地的土壤、沼泽、沿海栖息地以及动植物组织中都 可以发现它【。医院的潮湿环境中，比如食品、花朵、水槽、盥洗室、拖把、透析设备 中，甚至在消毒剂溶液中也可发现它。pa e r u g i n o s a 是常见的机会致病菌，是引起人类 感染的重要病原菌之一，占所有医源性感染的1 0 2 0 【2 ，3 】，是重要的医源性细菌感染源。 它可以引起尿道感染、呼吸系统感染、皮炎、软组织感染、菌血症、骨及连接部位感染、 肠胃感染和一系列系统感染，特别是能引起免疫力低下的严重烧伤患者、癌症及艾滋病 患者的感染，并常常导致严重甚至致命的后果【4 j 】。尸a e r u g i n o s a 可以在特殊遗传病患者 的肺中存活数十年，是肺囊胞性纤维症( c y s t i cf i b r o s i s ，c f ) 病人的最大致死病原菌， 9 0 以上的c f 病人死于铜绿假单胞菌的慢性感染【6 】。 p a e r u g m o s a 酏b e 产生的多种致病因子，从多个角度对易感人群表现高度致病性【7 】， 这些致病因子包括：菌体结构中的菌毛【8 】、鞭毛以及微荚膜中的多聚糖藻酸盐【9 】；内毒 素：脂多糖【1 0 】；外毒素a 【1 1 】和胞外酶s 也是该菌的主要毒性因子，可抑制易感细胞蛋 白质合成；蛋白分解酣1 3 】：包括弹性蛋白酶【1 4 】、胶原酶、l a s a 15 1 ，碱性蛋白酶【1 6 】等， 均具有蛋白分解，血管及多种组织损伤以及中性粒细胞抑制的功能；细胞溶解素有杀白 细胞素、溶血素和非溶血素磷脂酶c 【1 7 】等，有损伤血细胞、组织细胞，抑制中性粒细胞、 淋巴细胞功能等作用；还有铁载体( s i d e r o p h o r e ) p y o c h e l i n y ( i p y o v e r d i n e 【1 8 】，使细菌能够 突破宿主的低铁环境。pa e r u g i n o s a 还可以在岩石、土壤、人体组织及其他物质的湿润 表面形成生物被膜，在人体中产生生物被膜也是感染难以治愈的一个重要因烈1 9 , 2 0 1 。 pa e r u g i n o s a 具有庞大的基因组和复杂多样的代谢方式，可以适应各种生存环境。 pa e r u g i n o s a 具有4 6 8 个转录调节子占有总开放阅读框( o r f ) 的8 4 【1 1 ，具有超过6 0 个对基因调控非常重要的双组分系统，群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ) 系统控制的很 多关键的毒性因子的产生【4 ，2 1 ，2 2 1 。因此很多毒性因子的表达都是在不同的铁浓度、氮源、 温度、通透性等各种外界环境和各种内在调控机制的共同作用下产生的。 第一章绪论 1 2 铜绿假单胞茵对铁的吸收 对包括细菌在内的大多数生物体而言，铁是一个必不可少的关键性金属元素。它广 泛存在于三羧酸循环、呼吸作用、d n a 合成和代谢物合成等代谢途径中酶的活性位点上。 尽管地球上铁含量非常丰富，但对于在中性或碱性生境中生存的细菌而言却没有足够的 自由状态的铁可以获得。典型的细菌( 如大肠杆菌) 需要0 3 1 8 p , m 铁维持最佳状态生存， 然而土壤中铁含量低于0 i # m ，哺乳动物宿主体内只有1 0 园脚。铁在中性p h 的氧化环境 中形成不溶性氧化铁( f e 3 + ) ，其溶解度只有1 0 。8 脚；在生物系统中，大多数铁被铁载 体或血色素载体等铁螯合物螯合而不能自由的被吸收。因此，获取铁是病原菌能否成功 侵入哺乳动物宿主中的关键因素，而限制可利用铁的存在也是宿主防御病原菌侵害的第 一道防线。虽然铁对很多生物体而言是必不可少的金属元素，但另一方面，过多的铁会 使好氧微生物发生铁催化的f e n t o n 反应( f e l i + h 2 0 2 一f e i h + o h 一+ o h ) ，产生的活性氧会导 致很多大分子受到氧化伤害。故而微生物需要一些途径去感应摄取的铁含量，终止进一 步的铁吸收，同时降低潜在毒性物质的含量。 在大多数情况下，pa e r u g i n o s a 是一个专性耗氧和有机氮的细菌，所以在生存过程 中需要大量的铁。为了避免铁吸收过程中各种过度放任导致的不良后果，p a e r u g i n o s a 在内的多种微生物都发展了复杂而巧妙的遗传和生化机制以控制铁的吸收、代谢和平 衡。与一些仅受有限限制生境的简单病原菌相比，pa e r u g i n o s a 有着一整套策略去获取 铁并调节铁代谢，因此是一个很好的模式微生物去研究铁获取和铁代谢相关的过程及其 调节方式。 1 2 1 铜绿假单胞菌可利用多种铁源 1 二价铁( f e l l ) 在有氧和中性p h 时，铁的溶解度很低。但是在微需氧或厌氧时，铁会以易溶的二价 铁状态存在。高度可溶的铁离子利用自由扩散方法透过革兰氏阴性菌的外膜小孔，运用 依赖t o 曲的a b c 亚铁离子转运装置转运二价铁通过细胞质膜和或利用f e o 运输装置【2 3 】 转运。p a e r u g i n o s a 含有的二价铁吸收系统，f e o a b ( f e r r o u si r o nu p t a k es y s t e m ) ，受到f u r 的调控【2 4 】；和三价铁吸收途径不同，f e o 系统不是t o n b 依赖型。 2 铁传递蛋白( t r a n s f e r r i n ，t f ) 和乳铁传递蛋白( l a c t o f e r r i n ) 螯合铁 铁传递蛋白在哺乳动物血清中被发现，乳铁传递蛋白在哺乳动物淋巴和粘膜分泌物 中被发现，它们均是铁螯合蛋白。这两种铁螯合蛋白对f e 3 + 具有高度亲和性( 亲和常数 西北大学博士毕业论文 k a 1 0 2 0 m 。) ，在一般情况下它螯合的铁是不可利用的，因此该蛋白对铁的结合是人 类对细菌，真菌，病毒的天然防御屏障【2 5 1 。但在某些情况下，pa e r u g i n o s a 可以分泌一 些酶对这些铁螯合蛋白进行分解，进一步吸收利用铁，尽管这不是对铁的主要利用方式。 例如p 口p 雠伽傩以可以合成并分泌碱性蛋白酶a p r a 对铁传递蛋白进行降解【2 6 2 7 1 ，分泌的 细胞外蛋白( p r p l ) 可降解乳铁传递蛋白和其它铁结合蛋白使其释放出铁【2 8 1 ，再通过铁 载体媒介的铁吸收系统对该铁进行利用。 3 其它外源铁载体螯合铁 pa e r u g i n o s a 还可以利用很多细菌或真菌的外源铁载体，它有3 0 多个依赖t o n b 的外 源铁载体受体，其中f o x a 和f i u a 两个受体和异源铁载体f e r f i o x a m i n eb 和f e r r i c h r o m e 有关 【2 9 1 。p f e a 和p i r a 是p 以p 州砌口媒介危r r i e n t e r o b a c t i n 吸收的受体【3 0 , 3 1 】。 4 血红素( h e m e ) 和血红素结合蛋白 血红素是铁的原卟啉分子，在大卟啉环中心含有一个铁原子，是许多酶的辅基。 因为具有高毒性( 是一个疏水分子可参与到膜内，促进非酶促的氧化还原反应) ，血红 素几乎没有自由状态，多是以血红素结合蛋白的形式存在。血红素结合蛋白有血红蛋白 ( h e m o g l o b i n ) ，血液结合素( h e r n o p e x i n ) 和肌血球素( m y o g l o b i n ) ，豆血红蛋白 ( 1 e g h e m o g l o b i n ) 和载有血红素的白蛋白。血红素和血红素蛋白是许多细菌的主要铁源 【3 2 】，它们可以作为pa e r u g i n o s a 的唯一铁源，被pa e r u g i n o s a 分泌的血红素载体 ( h e m o p h o r e ) 通过础“( 8 e u d o m o n a s _ h e m eu t i l i z a t i o n ) 和h a s 也_ e m e _ a s s i m i l a t i o ns y s t e m ) 两个 血红素系统吸收，而_ 目h a s a 可以捕捉不论氧化或还原状态( f e 3 + 或f e 2 + ) 的h e m e 【3 3 】。 5 培养基中的f e ”柠檬酸盐可以通过f e c a 受体系统结合并转运进入细胞质。 6 p a e r u g i n o s a 可以利用自身分泌的铁载体( s i d e r o p h o r e s ) 吸收利用三价铁【3 3 】，这 是p a e r u g i n o s a 重要的三价铁吸收方式。 1 2 2p h u 和h a s 途径获取不同来源的血红素 血红素载体仅仅在革兰氏阴性菌中被发现。它们是特殊的细胞外蛋白，能够获取不 同来源的血红素并把它带到特殊的外膜受体上。pa e r u g i n o s ar f l l素载体的表达、分泌 和吸收是肋“( d e u d o m o n a sh _ e m eu t i l i z a t i o n ) 和h a s ( h e m e _ a s s i m i l a t i o ns y s t e m ) 两个系统控制 的，这两个系统均受到f u r 蛋白的调控。 h a s 操纵子编码的蛋白有外膜受体h a s r ，胞外血红素结合蛋白( 又叫血红素载体 h a s a ，其功能是运送血红素给h a s r ) ，基因而口奶和坷，可能是用于分泌血红素载体( h a s a ) 一3 一 第一章绪论 的一部分a b c 运输蛋白。h a s a 型血红素载体，是高度保守的蛋白家族，但不是其他任 何已知蛋白的类似物。h a s 型系统在pa e r u g i n o s a ，& m 口阳嚣c 8 刀s 【3 4 1 。pf l u o r e s c e n s , y e r s i n i a p e s t i s 以及ze n t e r o c o l i t i c a 几个细菌中被鉴定，发现h a s 操纵子在不同的种属中有 着相似的遗传组织。分泌h a s a 型血红素载体的a b c 运输蛋白复合物包括了三个膜蛋白， 一个是内膜a t p 酶，称为a b c 蛋白，是a t p 结合盒蛋白的一员，可以提供物质输出的能 量。第二个蛋白也是内膜蛋白，是一个膜融合蛋白。第三个蛋白是外膜组分蛋白，属于 t o l c 家族。t o l c 是三元的多功能蛋白，与药物泵和大肠菌素输入有关；它具有一个小的 包埋在外膜内的口桶和个大的形成内膜和外膜通道的周质域。血红素载体，像大多数 由a b c 输出蛋白分泌的蛋白一样，有一个可获得的a 螺旋c 端分泌信号。其胞质伴侣s e c b ， 是血红素载体分泌所必需的。信号与a b c 蛋白的相互作用，修饰了a t p 酶的活性，诱导 含有被分泌蛋白和三个分泌蛋白的多蛋白复合物的形成。s e c b 缺乏或分泌装置缺乏时， 血红素载体在细胞质中积累，可以折叠并结合血红素，但是它不能完成随后的分泌。这 说明带有c 端分泌信号蛋白被共翻译分泌的一个矛盾状态。编码血红素载体和它的分泌 装置的基因紧密共调节阻止了细胞内血红素载体的积累；由于血红素载体的积累是有毒 害的，因此多余的血红素会被看家的细胞质血蛋白清除【3 2 1 。 p h u 操纵子编码了外膜受体基因( p h u r ) ，周质结合蛋白基因仞五甜乃，以及细胞质 血红素结合蛋白( p h u s ) 和a t p 依赖的透过酶( p h u u v w ) 的基因 3 5 。细菌的血红素受体 ( p h u r ) 能够识别不同的血红素及其结合蛋白，从而获取血红素，并通过依赖t o n b 的途 径传递至外胞周质血红素转运体( ( p h u t 或h t p ) 3 2 】，h t p 可以在内外膜之间穿梭。血红素 转运至细胞内膜后，依赖a t p 的透性酶( p h u u v w ) 转移到细胞质血红素结合蛋白 ( p h u s ) t 3 6 ，37 1 。细胞质结合蛋白p h u s 通过三个连续的氧化步骤，运送血红素到血红素加 氧酶( p a h o ) 处进行n a d p h 依赖的降解反应，降解原卟啉配体，产生胆绿素并伴 随着c o 分子和铁的释放【3 8 】。 1 2 3s i d e r o p h o r e 媒介的铁吸收系统 尸a e r u g i n o s a 吸收外界三价铁最有效的方法之一就是利用铁载体( 或叫铁螯合分子， s i d e r o p h o r e ) 介导的铁吸收系统，该类系统也是受f u r 调节的。在铁限制条件下，铁载体 介导的铁吸收系统产生并分泌两种主要的铁载体，p y o v e r d i n 矛i p y c h e l i n 。p y o v e r d i n 是一 种黄绿色水溶性荧光染料，有强大的f e 3 + 捕捉性能和有效的f e 3 + 运输功能3 9 1 ，与铁1 ：1 结合。p y c h e l i n 龊黄绿色荧光物质，但有较低的f e 3 + 亲和性【1 8 1 ，在铁螯合吸收方面效 西北大学博士毕业论文 率较低，与铁以2 ：1 结合。 pa e r u g m o s a n - n - 可合成多种p y o v e r d i n ，其生物合成基因分布在染色体的不同区域， ：有p v c a b c d 基因簇、p v d a j f l p v d d 基因。另外几个基因p v d z , ，p v d i , p v d j 和p v d d ，编码着非 核糖体细胞质缩氨酸合成酶【4 0 , 4 1 】。这几个酶可以在氨基酸之间形成核糖体合成酶所不能 形成的肽键。p v d h 可催化2 ，4 一d i a m i n o b u t y r a t e ( d a b ) 形成，后者被用来合成p y o v e r d i n 前体 肽【4 2 】。p v d a 和p v d f 催化f o h o m ( n 5 h y d r o x y o m i t h i n e ) 的合成，因为p y o v e r d i n 的合成 需要o h o m 的环( 4 3 l 。p v d a 和p v d d 以) 及f p v a ，p v d e 和p v d s 在一条染色体上，分别和 f e r r i p y o v e r d i n e 的吸收，p y o v e r d i n e 的分泌和调节有关。 p y o c h e l i n 以及其前体水杨酸( s a l i c y l a t e ) 和d i h y d r o a e r u g i n o a t e ( d h a ) 的生物合成是由 p c h d c b a f 6 1 p c h e f g h i 【4 4 ，4 5 1 基因的表达产物催化合成的。调节蛋白基l 习p c h r 与其合成 酶基因成簇存在于染色体上，受体基因加纠就在旁边。 s i d e r o p h o r e s 合成后被分泌到细胞外，在体外高度螯合三价铁后结合在细胞外膜受体 上，经内膜运输系统运输铁s i d e r o p h o r e 复合物进入细胞质，释放后提供给铁利用蛋白。 如f e 3 十- p y o c h e l i n 进入细胞质后，释放出的铁可被f e r r i c h r o m e 吸收m 。 1 2 4 铁的跨膜运输 细胞外，多数铁载体对铁具有高亲和性，因此可以从大多数化学物质和生物体复合 物中通过简单的置换平衡提取铁。h a s a 型的血红素载体结合自由的血红素并捕获大量血 红素结合蛋白中的血红素，h a s a 型的血红素载体具有着较大范围基质的特性与血红素从 血红素蛋白被动运输到高亲和性的血红素载体上的特性是一致的。 由于铁载体和血红素都太大不能通过已知的细胞膜孔扩散，而且它们通常在细胞外 的介质中具有较低浓度，因此特殊的高亲和力受体蛋白可以从介质中结合f e 3 + 或血红素 并通过跨膜运输进入胞内，而这个过程需要依赖t o n b 复合物( t o n b ，e x b b ，和e x b d ) 传递来自细胞质膜的能量【4 7 】。t o n b 蛋白从细胞内膜e x b b 和e x b d 处获取电化学势能后穿 梭到细胞外膜，与载有配基( 如，f e ”一铁载体或血红素载体) 的受体相互作用，提供动 力使配基进入周质空间。然后t o n b 再返回至j e x b b 和e x b d 处重新获取能量，进行新一轮 的能力提供。因此铁载体和血红素的运输过程是个逆浓度梯度工作的能量激活过程。 铁载体p y o v e r d i n p f 膜受体是f p v a 和后来发现f p v b l 4 8 1 ，p y o c h e l i n 唯- - 的外膜受体是 f p t a 4 9 】，血红素受体是p h u r 和h a s r ，柠檬酸铁的受体是f e c a 。所有这些血红素、铁载 体、或铁或血红素结合蛋白的外膜受体都具有共同的特性，即这些受体的n 端附近，有 5 一 第一章绪论 五个保守残基叫“t o n bb o x ”，可以和t o n b 复合物相互作用。虽然在n 末端它们有较低的 主要序列同源性，但它们在结构上是可以比较的，即这些外膜受体都具有“塞子和p 桶” 的结构。口桶含有的2 2 个隘根据膜平面有一个倾斜，在细胞外有一个大的长环，周质一 侧有短的拐弯。这些膜蛋白还具有一个球状域，象塞子一样完全关闭桶的内侧。塞子位 于p 一桶的内表面，它们之间有氢键和盐桥连接成稳定的结构。塞子域