（无机化学专业论文）猴的金属硫蛋白β结构域的改造及其结构与性质关系的研究.pdf

中文摘要 f 在哺乳动物金属硫蛋白的6 l 或6 2 个氨基酸残基中，有2 0 个十分保守的半 胱氢酸。它们通常结合7 个二价后过渡金属离子。结合7 个二价后过渡金属离子 的哺乳动物金属硫蛋白形成两个结构域。在n 一端的1 3 - d o m a i n ( m ”3 c y s g ) 和c - 端的d d o m a i n ( m ( “) 4 c y s i i ) 。通过大量哺乳动物金属硫蛋白一级序列的比较， 我们发现d o m a i n 中存在着极为保守的c y s 3 3 c y s 3 4 _ x c y s 3 6 - c y s ”和 c y s 5 7 _ x c y s 5 9 - c y s 6 0 片段( x 为非半胱氨酸类氨基酸) 。这两个片段分别位于 口一d o m a i n 的两端。因此，我们认为一d o m a i n 中四金属硫簇的形成，不仅与 n d o m a i n 中半胱氨酸残基的数目有关，而且可能与半胱氨酸残基的特定分布有 关。为了研究半胱氨酸残基及其在肽段上的分布方式对金属硫蛋白及其金属硫簇 在结构域形成和蛋白整体反应活性中所起的作用，本论文使用分子生物学定点突 变的方法，设计和突变了野生型猴金属硫蛋白m t l ，获得了n 4 c t 2 7 c 和 n 4 c t 2 7 c 三个突变体。将猴金属硫蛋白m t l 多肽链上的a s h 4 和t h r 2 7 突变 成为c y s ，这样可在b d o m a i n 片段两端增加类似于q d o m a i n 片段两端的 c y s c y s x c y s 片段。从而在一级序列上把d d o m a i n 片段模拟成为a d o m a i n 片段。通过使用谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白表达系统，获得了含有猴金属硫蛋白 m t i 肽段的融合蛋白。经过凝血酶酶切及c d 2 + 离子重组，以较高的产率得到 了重组野生型及突变体猴金属硫蛋白m t l 。野生型蛋白的产率为1 0m g l 培养 液，各突变体蛋白均大于8m g 几培养液。杖 瓜通过考察猴金属硫蛋白及其n 4 c ，t 2 7 c 和n 4 c t 2 7 c 突变体蛋白的紫外 光谱和园二色相光谱性质，发现增加的c y s 4 和c y s 2 7 确实参与了金属硫簇的 形成。在结构整体上，突变体蛋白a - d o m a i n 的结构未受b 片段中增加半胱氨 酸残基数目的影响。f 电喷雾质谱研究表明，将t h r 2 7 突变为c y s 2 7 并末导致四 金属硫簇在1 3 - d o m a i n 中地形成，而将a s h 4 突变为c y s 4 则导致了四金属硫簇 的形成。在n 4 c t 2 7 c 突变体中，经改造的1 3 - d o m a i n 中存在着类似于天然 a d o m a i n 中的c 山s l l 簇的四金属硫簇。由蛋白的p h 滴定和与d t n b ( 5 ， 5 - d i t h i o b i s ( 2 - n i t r o b e n z o i ca c i d ) ) 反应活性及热变性的研究，可以认为通过定点突 变所得到的在d - d o m a i n 中增加了半胱氨酸残基的三种新的金属硫蛋白m t i 突 变体，仍然形成了被肽段包裹的金属硫簇。这些新的金属硫簇被肽段以比野生型 b - d o m a i n 紧密的方式包裹。新的金属硫簇的生成在一定程度上消除了0 和 一d o m a i n 在酸稳定性和巯基反应活性上的差别。但由于突变影响了结构域间的 相互作用，以及其他氨基酸残基可能的影响，突变体蛋白的热稳定性不如野生型 蛋白。心 此外，拉曼光谱的测量也说明在猴金属硫蛋白及其n 4 c ，t 2 7 c 和 n 4 c t 2 7 c 荑菱丽中，不存在a _ h e l i x 1 3 - s h e e t 结构。所得到的含镉蛋白 中，也不存在游离巯基和二硫键。本论文还对金属硫蛋白的电化学测量进行了尝 试。 最后，本论文认为，经n 4 c 、n 4 c t 2 7 c 突变，野生型猴金属硫蛋白中的天 然的f 3 - d o m a i n 被改造成为了一种新的，类似于天然0 【一d o m a i n 的包含有c d 4 s l l 簇的堕塑垫该结构域的形成，一定程度上消除了原来p - 和o 【一d o m a i n 在反应 活性上的差别。这支持了我们关于金属硫蛋白结构域中四金属硫簇的形成，不仅 与肽段上半胱氨酸残基的数量有关，还与半胱氨酸残基在肽段上的分布位置有关 的观点。 a b s t r a c t m a m m a l i a nm e t a l l o t h i o n e i n s ( m t s ) a r eah o m o l o g o u sf a m i l yo fm e t a l l o p r o t e i n s c o n s i s t i n gas i n g l ep o l y p e p t i d ec h a i no f6 1o r6 2a m i n oa c i dr e s i d u e s a m o n gt h e m ， 2 0s t r i c t l yc o n s e r v e dc y s t e i n er e s i d u e sb i n ds e v e nb i v a l e n tp o s t - t r a n s i t i o nm e t a li o n s p o l y p e p t i d eo fm a m m a l i a nm e t a l l o t h i o n e i ni s f o l d e di n t ot w od o m a i n s i nt h e n t e r m i n a li sa1 3 - d o m a i no fm c ”3 一c y s 9 ，a n di nt h ec - t e r m i n a li sa ni x - d o m a i no f m ( 1 ”4 一c y s l l b ya n a l y s i s o ft h ep r i m es e q u e n c eo fv a r i o u s m a m m a l i a n m e t a l l o t h i o n e i n s w ef o u n dt h ef r a g m e n t so f c y s 3 3 - c y s 3 4 x c y s 3 6 - c y s ” a n d c y s 5 7 - x c y s 5 9 - c y s 6 0i nd d o m a i na r ev e r yc o n s e r v a t i v e t h e s et w of r a g m e n t sl i ei n t h et w ot e r m i n u so ft h eu - d o m a i n ，r e s p e c t i v e l y t h u s ，w eb e l i e v et h a tt h ef o r m a t i o no f a c l u s t e r ( m i i ) 4 c y s l l ) i nt h ei x d o m a i nr e s u l t sf r o mn o to n l yt h en u m b e ro fc y s t e i n e r e s i d u e si nt h ed o m a i nb u ta l s ot h ed i s t r i b u t i o no fc y s t e i n e so nt h ep e p t i d e t or e v e a l t h ee s s e n c eo fc y s t e i n e sa n dt h e i rd i s t r i b u t i o no nt h ep o l y p e p t i d e ，w h i c ha f f e c t st h e s p e c i f i c i t ya n dd i f f e r e n tr e a c t i v i t yo fi n d i v i d u a ld o m a i na n dt h ew h o l ep r o t e i n ，w et r y t oa l t e rt h e1 3 - d o m a i ni n t o0 【一d o m a i n ，b ya d d i n gm o r ec y s t e i n ei nt h e3 - d o m a i n f r a g m e n tu s i n g s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s t h e r e f o r e ，i n o r d e rt o d e s i g n a n d r e c o n s t i t u t ee - d o m a i nt om i m i ct h ea d o m a i na tt h ea m i n oa c i d ss e q u e n c el e v e l ，w e r e p l a c ea s n 4a n dt h r 2 7r e s i d u e s i np d o m a i no fm o n k e ym e t a l l o t h i o n e i n 一1w i t h c y s t e i n er e s i d u e s a f t e rm u t a t i o n ，w ea d dc y s - c y s - x c y sf r a g m e n t s i nt h et w o t e r m i n u s e so ft h e1 3 - d o m a i n t h e r e f o r e ，a tt h ea m i n oa c i d ss e q u e n c el e v e l ，w ed e s i g n a n dr e c o n s t i t u t eb - d o m a i nt om i m i ct h ed d o m a i n f u s i o ne x p r e s s i o ns y s t e mo f g l u t a t h i o n es - t r a n s f e r a s ew a su s e dt oe x p r e s sw i l dt y p em o n k e ym e t a l l o t h i o n e 1a n d i t sn 4 c ，t 2 7 ca n dn 4 c t 2 7 cm u t a n t s t w oa m i n oa c i d s ，g l ya n ds e r , t a g g e dt h e n t e r m i n a la f t e rc l e a v a g eb yt h r o m b i nf r o mt h ef u s i o np r o t e i n a f t e re x p r e s s i o n ， p u r i f i c a t i o n ，c l e a v a g e w i t ht h r o m b i na n dc a d m i u mi o nr e c o m b i n a t i o n ，t h e r e c o m b i n a n tp r o t e i n sw e r eo b t a i n e d w i t h h i g hy i e l d f o r w i l dt y p em o n k e y m e t a l l o t h i o n e - 1 ，t h ey i e l di sa b o v e1 0m gp e rl i t r ec u l t u r e ，a n df o rt h em u t a n t s ，t h e y a r ea l la b o v e8m gp e rl i t r em e d i u m t h e n ，t h er e s u l t so ft h er e c o m b i n a n tm o n k e yw i l dt y p em e t a l l o t h i o n e i n 一1a n d m u t a n t ss t u d i e db yu v s p e c t r o s c o p ya n dc ds p e c t r o s c o p yi n d i c a t et h a tt h es u l f h y d r y l g r o u p s i n c r e a s e da t c y s 4 a n d c y s 2 7a c t u a l l yp a r t i c i p a t e t h ef o r m a t i o no f m e t a l t h i o l a t ec l u s t e ri nt h em u t a t e d 3 - d o m a i n s t u d i e so fe l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n m a s ss p e c t r o s c o p ys h o w e dt h a ti t i sn o tt h er e p l a c e m e n to f l m r 2 7w i t hc y s 2 7 b u tt h e r e p l a c e m e n ta s n 4w i t hc y s 4w h i c hr e s u l t s i n t h ef o r m a t i o no fan e wf o u r m e t a l s t h i o l a t ec l u s t e ri nt h eo r i g i n a l1 3 - d o m a i n a n di nt h er e c o n s t r u c t e db d o m a i no f n 4 c t 2 7 cm u t a n t ，t h es u l l h y d r y lg r o u pl i g a n d sa r ed i v i d e di nt h es a m ew a ya st h o s e o ft h en a t i v ea d o m a i n t h r o u g ht h es t u d i e so fp ht i t r a t i o na n dt h er e a c t i o nw i t h d t n b ( 5 ，5 - d i t h i o b i s ( 2 一n i t r o b e n z o i ca c i d ) ) ，t h en e wc d sc l u s t e r si ne a c hm u t a n t w e r ef o u n dt ob ep a c k e db yp e p f i d et i g h t e rt h a nt h eo r i g i n a lc d 3 s 9c l u s t e ri nt h e t 3 - d o m a i no fn a t i v em a m m a l i a nm e t a l l o t h i o n e i n t h em u t a t i o n ，t os o m ee x t e n t ， e l i m i n a t e dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e nb a n d 一d o m a i n s h o w e v e r , i n c r e a s eo fc y s t e i n e n u m b e rd i dn o tr e s u l t i nt h et h e r m a ls t a b i l i t yi m p r o v e m e n t t h i ss h o w st h a tm a n y o t h e rf a c t o r ss u c ha st h ep a r t i c u l a rd i s t r i b u t i o np a t t e mo fc y s t e i n er e s i d u e t h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nt w od o m a i n s ，h y d r o g e nb o n d s ，a n dn o n c y s t e i n ea m i n oa c i d r e s i d u e sm u s ta l s ob ec o n s i d e r e dw i t hr e g a r d i n gt h es t r u c t u r ea n dp r o p e r t i e so f m e t a l l o t h i o n e i n f u r t h e r m o r e ，i tw a sp r o v e db yr a m a ns p e c t r o s c o p yt h a tw i l dt y p em o n k e y m e t a l l o t h i o n e - 1a n di t sn 4 c ，t 2 7 ca n dn 4 c t 2 7 cm u t a n t sd on o tc o n t a i n 一h e l i x ， d - s h e e t ，f r e es u l t s y d r y lg r o u pa n dd i s u l f i d eb o n di nt h e i rs t r u c t u r e s t h e e l e c t r o c h e m i s t r ys t u d yo ft h em u t a n t sw a sa l s ot e s t e di nt h i st h e s i s f i n a l l y , i ti sr e a s o n a b l et ob e l i e v et h a tw ea r es u c c e s s f u l i nt h ec o n s t r u c t i o no f 一dd o m a i ni nt h ew i l dt y p em o n k e ym e t a l l o t h i o n e i n 一1 b yt h er e p l a c e m e n to fa s n 4 a n dt h r 2 7i n1 3 一d o m a i no fm o n k e ym e t a l l o t h i o n e i n 一1w i t hc y s t e i n er e s i d u e s t h e f o r m a t i o no ft h i sn e wd o m a i n ，t os o m ee x t e n t ，e l i m i n a t e dt h ed i f f e r e n c eb e t w e e n o r i g i n a lb - a n da - d o m a i n s t h i ss u p p o r t s0 1 1 1 v i e wt h a tt h ef o r m a t i o no fa c l u s t e r ( m ”“4 - c y s n ) i nt h e 旺一d o m a i nr e s u l t sf r o mn o to n l yt h en u m b e ro f c y s t e i n er e s i d u e si n t h ed o m a i nb u ta l s ot h ed i s t r i b u t i o no f c y s t e i n eo nt h ep e p t i d ec h a i n 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名：壹医 论文使用授权声明 本人完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名：j 整导师签名：作者签名：匝l 还 导师签名：嗍型 复旦大学硕士学位论文 引言 金属硫蛋白( m e t a l l o t h i o n e i n s ，m t s ) 是一类独特的低分子量( n 4 c t 2 7 c n 4 c w t m k m t l 。 所有的c d 光谱( f i g u r e2 3 ) 均显示出金属硫蛋白在一2 6 0n n l ，2 4 0n m 和 2 2 4m n 典型的吸收峰。但是，突变体蛋白相对于野生型蛋白略有蓝移( t a b l e 2 2 ) 。突变体蛋白相对于野生型蛋白的c d 峰型没有明显差异。 u v ( f i g u r e3 ) 和c d ( f i g u r e 4 ) 光谱均表明，在野生型和突变体蛋白中有明 显的c d t h i o l a t e 簇生成。由于监测不到二硫键的特征吸收( f i g u r e2 2 a ) ，可以 认为在野生型和突变体蛋白中，所有半胱氨酸残基上的硫均与c d 2 + 离子配位。 在c d 光谱中，野生型和突变体蛋白均显示出典型的金属硫蛋白的c d 谱 型，2 0 0 n m 和2 3 9 m 两个负峰，2 2 3n r n 和2 5 9 l l r l l 两个正峰。其中，2 0 0n l n 的峰强度较大，而2 3 9r l l n 、2 2 3n m 和2 5 9n m 的峰强度较小。如文献【2 0 1 所述， 2 0 0m n 来自肽骨架的吸收：2 2 3n l n 的峰来自肽段与金属硫簇的相互作用；2 3 9 n i l q 和2 5 9n l i l 的峰来自c d s 电荷跃迁。这也印证了c d z + - t h i o l a t e 簇的生成。 s t i u m a n 等人认为金属硫蛋白c d 光谱吸收，主要由0 l d o m a i n 贡献， 3 - d o m a i n 贡献很小【2 1 2 2 j 。因此，野生型和突变体蛋白c d 光谱表明，a d o m a i n 并未因8 片段中增加半胱氨酸残基数目而发生结构上的重大改变。 小结： 本论文通过大量表达，以较高产率得到了在n - 端多了2 个残基( g l y 和 s e t ) 的高纯度的含镉猴金属硫蛋白m t l 及其含镉突变体蛋白。在n 4 c ，t 2 7 c ， n 4 c t 2 7 c 突变体蛋白中，增加的c y s 4 和c y s 2 7 确实参与了金属硫簇的形成。 整体上，突变体蛋白o l - d o m a m 的结构未受 3 - d o m a i n 片段中增加半胱氨酸残基 _-_-_-_-_-_-_-_-_一 复旦大学硕士学位论文 数目的影响。 参考文献： a h r o b i r m s ，d e m c r e e ，m w i l l i a m s o n ，s a c o l l e t t ，n hx u o n g ，wf f u r e y , b c w a n g ，c ，d ，s t o u t ，r e f i n e dc r y s t a l s t r u c t u r eo fc d ，z n m e t a u o t h i o n e i na t2 0a s 仃o nr e s o l u t i o nj m o l ，b i 0 1 2 2 1 ( 1 9 9 1 ) 1 2 6 9 1 2 9 3 2 】j d o t v o s ，i m a r m i t a g e ，s t r u c t u r e o fm e t a lc l u s t e ri nr a b b i tl i v e r m e t a l l o t h i o n e i n ，p r o c n a t l a c a d s c i u s a7 7 ( 1 9 8 0 ) 7 0 9 4 7 0 9 8 3 】m v a s a k ，a p p l i c a t i o no f “3 c dn m r t om e t a l l o t h i o n e i n s ，b i o d e g r a d a t i o n9 ( 1 9 9 8 ) 5 0 l - 5 1 2 4 】t b e r k a ，a s h a t z m a n ，j z i m m e r m a n ，j s t r i c k l e r , m r o s e n b e r g ，e f f i c i e n t e x p r e s s i o no fy e a s tm e t a l l o t h i o n e i ng e n ei ne s c h e r i c h i ac o l i jb a c t e r i 0 1 1 7 0 ( 1 9 8 8 ) 2 1 - 2 6 5 】p k i l l e ，p s t e p h e n s ，a c r y e r , j k e y , t h ee x p r e s s i o no fas y n t h e t i cr a i n b o w t r o u tm e t a l l o t h i o n e i ng e n ei nec o l ib i o c h e m b i o p h y s a c t a1 0 4 8r 1 9 9 0 ) 1 7 8 1 8 6 6 y j w a n g ，e a m a c k a y , m k u r a s a k i ，j h r k a g i ，p u r i f i c a t i o na n d c h a r a c t e r i z a t i o no fr e c o m b i n a n ts e au r i c h i nm e t a l l o t h i o n e i ne x p r e s s e di n e s c h e r i c h i ac o i l e u r j b i o c h e m2 2 5 ( 1 9 9 4 ) 4 4 9 4 5 7 7 】m j c i s m o w s k i ，pc h u a n g ，p u r i f i c a t i o no fm a m m a l i a nm e t a l l o t h i o n e i nf r o m r e c o m b i n a n ts y s t e m si n ：j f r i o r d a n ，b l v a l l e e ( e d s ) m e t a l l o b i o c h e m i s t r y p a r tb m e t a l l o t h i o n e i na n dr e l a t e dm o l e c u l e s ，m e t h o d si ne n z y m o l o g y , v o l 2 0 5 ，a c a d e m i cp r e s s ，n e wy 0 r k ，1 9 9 1 ，p p 3 1 2 3 1 9 8 y = x i o n g ，b r u ，p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fr e c o m b i n a n tm o u s e m e t a l l o t h i o n e i n 1f r o me s c h e r i c h i ac o l i j b i o c h e m 1 2 2 ( 1 9 9 7 ) l1 0 2 11 0 6 9 】n c o l s ，n r o m e r o - i s a r t ，m c a p d e v i l a ，b o l i v a ，p g o n z a l e z d u a r t e ，r g o n z a l e z - d u a r t e ，s a t r i a n ，b i n d i n g o fe x c e s s c a d m i u m ( i i ) t o c d 7 一m e t a l l o t h l o n e i nf r o mr e c o m b i n a n tm o u s ez n 7 m e t a l l o t h i o n e i n1 j i n o r g b i o c h e m 6 8 ( 1 9 9 7 ) 1 5 7 - 1 6 6 1 0 s h h o n g ，m t o y a m a ，wm a r e t ，ym u r o o k a ，h i g hy i e l d se x p r e s s i o na n d s i n g l es t e pp u r i f i c a t i o no fh u m a nt h i o n e i n m e t a l l o t h i o n e i np r o t e x p r e s p u r i l r 2 l 陀0 0 1 ) 2 4 3 - 2 5 0 1 1 、m - h y u ，b c a i ，yg a o ，y x i e ，z - x h u a n g ，e x p r e s s i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o na n d 复旦大学硕士学位论文 1 2 】 【1 3 1 4 】 r e a c t i o no f r e c o m b i n a n tm o n k e ym e t a l l o t h i o n e i n - 1a n di t sc 3 3 mm u t a n t j p i n t c h e m 2 1 ( 2 0 0 2 ) 1 7 7 1 8 5 余文浩，复旦大学博士学位论文( 9 8 0 2 0 3 ) ，2 0 0 1 h c h a s s a i g n e ，r l o b i n s k i ，d e t e c t i o no fa n e n c t sa n dp e a ki d e n t i f i c a t i o ni n r e v e r s e d p h a s eh p l co fm e t a l l o t h i o n e i n sb ye l e c t r o s p r a ym a s ss p e c t r o m e t r y , t a l a n t a4 8 ( 1 9 9 9 ) 1 0 9 - 1 1 8 h c h a s s a i g n e ，r l o b i n s k i ，c h a r a c t e r i z a t i o no fm e t a l l o t h i o n e i ni s o f o r m sb y r e v e r s e d p h a s e h i g h - p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w i t ho n l i n e p o s t - c o l u m na c i d i f i c a t i o na n de l e c t r o s p r a ym a s ss p e c t r o m e t r i cd e t e c t i o n ，j c h r o m a t o g r a p h ya8 2 9 ( 1 9 9 8 ) 1 2 7 - 1 3 6 1 5 】m v a s a k ，i n ：jf r i o r d a n ，b l v a l l e e ( e d s ) ，m e t a l l o b i o c h e m i s t r yp a r tb m e t a l l o t h i o n e i na n dr e l a t e d m o l e c u l e s ，m e t h o d s i n e n z y m o l o g y , v o l 2 0 5 ，a c a d e m i cp r e s s ，n e wy b r k ，1 9 9 1 ，p p 4 4 4 7 f 16 】m v a s a k ，j h r k a j i ，h a 0 h i l l ，z i n c ( i 1 ) ，c a d m i u m ( i 1 ) ，a n dm e r c u r y ( i i ) t h i o l a t et r a n s i t i o n si nm e t a l l o t h i o n e i n b i o c h e m i s t r y , 2 0 ( 1 9 8 1 ) 2 8 5 2 2 8 5 6 17 】n c o l s ，n r o m e r o - i s a r t ，r b o f i l l ，m c a p d e v i l t a ，p g o n z d l e z d u a r t e ，r g o n z 6l e z d u a r t e ，s a t r i a n ，nv i v o c o p p e r _ a n dc a d m i u m - b i n d i n ga b i l i t yo f m a m m a l i a nm e t a l l o t h i o n e i nbd o m a i n ，p r o t e n g 1 2 ( 1 9 9 9 ) 2 6 5 2 6 9 1 8 】中南矿物学院分析化学教研室等编化学分析手册科学出版社，北京， 1 9 8 2 ，p p 3 5 8 1 9 g l e l l m a n ，t i s s u es u l f h y d r y lg r o u p s a r c h b i o c h e m b i o p h y s 8 2f 1 9 5 9 ) 7 0 7 7 2 0 】h r u p p ，u w e s e r , c i r c u l a rd i c h r o i s mo fm e t a l l o t h i o n e i n sas t r u c t u r a l a p p r o a c h ，b i o c h i m b i o p h y s a c t a ，5 3 3 ( 1 9 7 8 ) 2 0 9 2 2 6 21 】a j z e l a z o w s k i ，j a s z y m a n s k a ，a y _ c l a w , m j s t i l l m a n ，s e p e c t r o s c o p i c p r o p e r t i e so ft h eaf r a g m e n to fm e t a l l o t h i o n e i n ，j b i 0 1 c h e m 2 5 9 ( 1 9 8 4 ) 1 2 9 6 0 1 2 9 6 3 2 2 】m j s t i l l m a n ，wc a i ，a j z e l a z o w s k i ，c a d m i u mb i n d i n gt om e t a l l o t h i o n e i n s j b i 0 1 c h e m 2 6 2f 1 9 8 7 ) 4 5 3 8 - 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