（植物学专业论文）三氟拉嗪抑制钙钙调素对白杄花粉管生长的调节.pdf

摘要 三氟拉嗪抑制钙一钙调素对白杆花粉管生长的调节 摘要 花粉管是种子植物受精过程中雄性生殖单位的载体，具有典型的极性顶端 生长模式，因此成为研究细胞极性生长机理的理想模式体系。本研究以裸子植 物白杆( p i c e am e y e r ir e h d e tw i l s ) 花粉为材料，并以对花粉萌发和花粉管生长 起关键作用的c a 2 + 作为切入点，分析钙钙调素在花粉萌发及花粉管极性生长中 的作用，同时也为进一步探讨它们在其他植物细胞中的作用机理研究提供重要 参考。 通过细胞化学定位证明，白杆花粉中含有丰富的游离钙离子和钙调素，在 花粉管顶端呈现明显的梯度分布；钙调素特异拮抗剂三氟拉嗪( t r i f l u o p e r a z i n e ， 简称耶p ) 可以在钙离子存在的情况下与钙调素特异性结合，从而抑制钙一钙调 素复合物对下游效应蛋白的激活。微摩尔浓度的吓p 明显抑制白杆花粉萌发以 及花粉管的生长，并导致大部分花粉管畸形生长。t f p 处理后的花粉管( 约8 0 以上) 中游离钙离子梯度消失或梯度不明显，由此说明钙调素参与花粉管顶端 游离钙离子梯度的维持。抑制剂处理显著影响钙调素在花粉管顶端的梯度分布 模式，梯度落差明显减小。 应用鬼笔环肽标记花粉管微丝骨架表明，正常生长的花粉管中微丝骨架沿 花粉管长轴平行的方向呈网络状分布，但是在花粉管顶端仅有杂乱的微丝片断 分布；低浓度下处理之后，微丝骨架分布的方向性丧失并开始卷曲，花粉管 顶端的微丝片断消失，高浓度t f p 处理之后微丝骨架完全断裂，聚集成短粗的 束状。f m 4 6 4 标记花粉管后发现，经t f l p 处理的花粉管顶端胞吞速度明显加快， 最终染料集中分布在紧贴质膜下很小的区域内，同时胞吞过程加快主要表现在 染料进入花粉管细胞的速度加快，而随后染料在细胞内的扩散速度并无明显变 化。以酸性磷酸酶为标志的胞吐活性也显著下降。通过m i t o t r a c k e r 染色发现， 甲处理之后花粉管中线粒体的形态和分布都发生了显著变化；在电子显微镜下 观察显示，抑制剂处理的花粉管中液泡化现象严重，线粒体膨大变形，其内嵴 的结构遭到严重破坏，同时高尔基体和内质网的形态也都发生了不同程度的异 常变化，另外线粒体和液泡还出现了类似于自体吞噬的现象。 中国科学院博士学位论文三氟拉嗪抑制钙一钙调素对白杆花粉管生长的调节 在荧光显微镜下观察发现，在标准培养基中培养的花粉管经苯胺兰染色后， 胼胝质分布于整根花粉管侧壁上，而顶端区域胼胝质分布却很少或不存在。但 经t f p 处理之后，在花粉管细胞壁的个别区域有胼胝质大量沉积，同时在花粉 管中还出现能被苯胺兰特异染色的许多颗粒状物质。此时花粉管顶端细胞壁中 的纤维素含量明显减少。以单克隆抗体j i m 5 、j i m 7 标记果胶质，在激光扫描共 聚焦显微镜下观察发现，标准培养基中培养的花粉管，酸性果胶质分布于整根 花粉管的侧壁中，但在其顶端的含量很低或不存在，与此相反，酯化果胶质只 分布在花粉管的顶端；而经t f p 处理的花粉管中，酸性果胶质均匀分布于花粉 管细胞壁上，酯化果胶质仅出现在花粉管基部的细胞壁中。单克隆抗体l m 2 和 l m 6 标记结果显示，正常生长的花粉管细胞壁中a g p s 呈周期性的环状分布， n 甲处理后a g p s 仅仅分布在花粉管基部的细胞壁中。s d s p a g e 电泳分析显示， 抑制剂处理之后花粉管细胞壁蛋白的表达也发生明显变化。由f t - i r 分析进一步 证实了上述两种果胶质及纤维素在花粉管顶端细胞壁中相对含量的变化趋势。 利用双向电泳技术分离花粉管全蛋白，结果发现正常生长和t f p 处理后的 花粉管的大部分蛋白斑点都处于p ，4 - 8 以及分子量在1 4 9 7k d 的范围内，主要 是一些中等分子量大小、微酸性和中性的蛋白类群。由软件分析显示，除其中 7 6 个蛋白外，大部分蛋白质的表达并未发生变化。将上述7 6 个表达量发生变化 的差异蛋白进行胶内酶解，并经e s i m s m s 分析鉴定，以及质谱数据库搜索， 最终鉴定出5 7 个蛋白，其中2 3 个表达量上调，其余3 4 个表达量下调。根据其 生物学功能可以分为碳水化合物及能量代谢、胁迫及防御反应、细胞扩展、信 号转导等功能蛋白类群。经t f p 处理后，花粉管中碳水化合物及能量代谢过程 整体水平下降，氧化磷酸化水平减低，但是丙酮酸脱羧酶旁路代谢水平却略有 上升。由此暗示，花粉管在生长停滞的环境条件下，该途径可作为能量供应的 替代机制；参与转一碳单位反应的蛋白表达量普遍上调，参与细胞延展( 如细 胞骨架重构、细胞壁多糖合成) 的蛋白表达量下调，此项研究结果与上述的细 胞生物学分析结论基本一致。 综上所述，当钙调素蛋白功能受到抑制后，顶端游离钙离子浓度梯度消失 同时胞质钙离子浓度显著升高；细胞代谢水平( 糖酵解和三羧酸酸循环) 整体 下降，而可能通过丙酮酸脱羧酶旁路来维持最低限度的能量供应；同时花粉管 微丝骨架发生解聚，花粉管细胞壁组成成分合成水平下降，细胞延展相关的能 力减弱，最终导致花粉管生长的停滞。钙钙调素信号存在于白杆花粉萌发和花 i i 摘要 粉管生长这一特定的细胞生物学事件中，并参与花粉管顶端游离钙离子梯度的 维持和定向生长。 关键词：钙调素；细胞壁；白杆；花粉管；极性生长；蛋白质组；三氟拉嗪 i i i 中国科学院博十学位论文三氟拉嗪抑制钙一钙调素对白杆花粉管生长的调节 c a 2 + - c a l m o d u l i ni n h i b i t e db yt r i f l u o p e r a z i n ei s i n v o l v e di nt h er e g u l a t i o no fp i c e a m e y e r ip o l l e nt u b e d e v e l o p m e n t a b s t r a c t t o n gc h e n o t a n ” d i r e c t e db yp r o f e s s o rj i n x i n gl i n p o l l e nt u b e sa r eh i g h l ye l o n g a t e d ，c y l i n d r i c a l l ys h a p e dc e l l sw h o s ep o l a r i z e d g r o w t hp e r m i t st h e mt oa c c o m p l i s hi n v a s i v eg r o w t hw i t h i nf e m a l eg a m e t o p h y t i c t i s s u e st od e l i v e rt h es p e r mc e l l st ot h eo v u l ef o rf e r t i l i z a t i o n ，a n dt h u st h e ya r e c o n s i d e r e dt ob ea l li d e a ls y s t e mf o rt h er e s e a r c ho np o l a r i z e dg r o w t h b ym e a n so f c y t o l o g i c a la n dp r o t e o m i cm e t h o d s ，w ei n v e s t i g a t e dc a z + c a l m o d u l i n ( c a m ) s i g n a l i n gi n v o l v e di np i c e am e y e r ip o l l e ng e r m i n a t i o na n dt u b ee l o n g a t i o nw i t ha v i e wt o r e v e a l i n g i t sm e c h a n i s m u n d e r l y i n g t h e r e g u l a t i o n o fp o l l e nt u b e d e v e l o p m e n ta sw e l la si no t h e rp l a n tc e l l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tb o t hf r e ec a l c i a mi o na n dc a l m o d u l i ne x h i b i t e d t i p - t o - b a s eg r a d i e n ti nt h ep i c e am e y e r ip o l l e nt u b et i p t r i f l u o p e r a z i n e ( 1 1 叩) ，a p o t e n ta n ds p e c i f i cc a ma n t a g o n i s t ，c a nb i n dt oc a l m o d u l i ni nt h ep r e s e n c eo fc a 2 + a n di n h i b i tt h es u b s e q u e n tb i n d i n go fc a z + - c a mc o m p l e xt ot h ed o w n s t r e a m e f f e c t o r s t f pi n h i b i t e dt h ep o l l e ng e r m i n a t i o na n dt u b ee l o n g a t i o na tm i c r o m o l e c o n c e n t r a t i o n sa n dl e dt om o r p h o l o g i c a la b n o r m a l i t i e si nt h em a j o r i t yo ft h ep o l l e n t u b e s i nt h en b t r e a t e dp o l l e nt u b e s ，t h et i p f o c u s e d 【c a 抖】cg r a d i e n tw a s d i s s i p a t e d o rn o to b v i o u s l yd e t e c t e di na b o u t8 0 o ft h et o t a lp o l l e nt u b e s ，i n d i c a t i n gt h a tc a m f u n c t i o n si nt h em a i n t e n a n c eo ft h ew e l l c h a r a c t e r i z e d 【c a + 】cg r a d i e n t i n h i b i t o r t r e a t m e n ta l s od r a m a t i c a l l yd i s r u p t e dt h et i p f o c u s e dc a m g r a d i e n ta n dr e d u c e dt h e s t i f f n e s so fc a mg r a d i e n t i v a b s t r a c t c a z + c a m d y s f u n c t i o nd i s r u p t e d t h ei n t r i c a t e c y t o p l a s m i co r g a n i z a t i o n p h a l l o i d i n l a b e l i n ge x p e r i m e n t ss h o w e dt h a ta c t i nf i l a m e n t s ( a f s ) e x h i b i t e da l la x i a l n e t w o r ka l o n gt h eg r o w t hd i r e c t i o ni nt h ec o n t r o lp o l l e nt u b e ，w h i l e 甲i n d u c e d a f st ol o s et h e i rd i r e c t i o na n db e g a nt ot w i s ta tl o w e rc o n c e n t r a t i o n w h e nt h e i n h i b i t o rc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d ，a f sw e r et o t a l l yd i s r u p t e da n da c c u m u l a t e di n t o c l u s t e r s r e s u l t sf r o mf m 4 6 4s t a i n i n gd e m o n s t r a t e dt h a tt h ee n d o c y t i ca c t i v i t i e s w e r eo b v i o u s l yp r o m o t e di nt h et i pr e g i o na n df i n a l l yt h ef l u o r e s c e n c ea c c u m u l a t e d j u s tu n d e rt h ep l a s m am e m b r a n e t h ea c c e l e r a t i o nm o s t l yo c c u r r e dd u r i n gt h e p r o c e s so fd y ei n t e r n a l i z a t i o nr a t h e rt h a nt h es u b s e q u e n td y ed i f f u s i o n i nt h em e a n t i m e ，t h ea c i dp h o s p h a t a s ea c t i v i t y ( e x o t y t i ca c t i v i t y ) g r e a t l yr e d u c e d m i t o c h o n d d a i nt h et f p t r e a t e dp o l l e nt u b e su n d e r w e n to b v i o u sc h a n g e si nt h e i rm o r p h o l o g ya n d d i s t r i b u t i o n i tw a sf u r t h e rc o n f i n n e db yt e mo b s e r v a t i o nt h a tm i t o c h o n d d aw e r e e n l a r g e da n da n a m o r p h i ca sg o l g is t a c k sa n de r sw e r ea l s os e v e r e l yd i s r u p t e d a n a u t o p h a g y - l i k ea c t i v i t i yw a so b s e r v e di nm i t o c h o n d r i aa n dv a c u o l e sa f t e ri n h i b i t o r t r e a t m e n t c a z + c a m d y s f u n c t i o n a l s oi n d u c e d c h a n g e s i nt h e c o n f i g u r a t i o n a n d d i s t r i b u t i o no fc e l lw a l lc o m p o n e n t s c a l l o s ew e r em o s t l yf o u n da l o n gt h ew h o l e p o l l e nt u b es h a n k w h i l ei to n l yd e p o s i t e dr a n d o m l yi nc e r t a i na r e aa n ds o m ep a r t i c l e s s t a i n e db ya n i l i n eb l u ew e r ef o u n di nt h et u b e c y t o p l a s m c a l c o f l u o rs t a i n i n g r e v e a l e dt h a tc e l l u l o s ed i s t r i b u t e da l o n gt h ew h o l ep o l l e nt u b e w a l lw h i l et h e c e l l u l o s ed e p o s i t i o ng r e a t l yd e c r e a s e di n t h et i pr e g i o n a f t e rt f pt r e a t m e n t ， d e - e s t e r i f i e dp e c t i n sw e r ef o u n da c c u m u l a t e di nt h ew h o l et u b ew a l li n s t e a do fb e i n g d i s t r i b u t e da l o n gt h et u b es h a n k , w h i l ee s t e r i f e dp e c t i n sa c c u m u l a t e di nt h er e g i o n n e a rt h ea p e r t u r er a t h e rt h a nb e i n gd e p o s i t e di nt h ee x t r e m et i p r e g i o n a g p s d e p o s i t i o nw e r em a i n l yd e t e c t e dn e a rt h ea p e r t u r eo ru n e v e n l yd e p o s i t e di n s t e a do f s h o w i n gac h a r a c t e r i z e dr i n g l i k ep a t t e r n s d s p a g ei n d i c a t e dt h ee x p r e s s i o no f c e l lw a l lp r o t e i n sw a sa l s oi n f l u e n c e d t h ec h a n g e si nt h ea m o u n t so fd i f f e r e n tc e l l w a l lc o m p o n e n t sw e r ef u r t h e rc o n f i r m e db yf t i ra n a l y s i s t h et o t a lp r o t e i n sw e r ei s o l a t e df r o mc o n t r o lp o l l e nt u b e sa n dt f p t r e a t e d p o l l e nt u b e sr e s p e c t i v e l y , a n dt h e2 - d em a pr e v e a l e dt h a tm o s to ft h es p o t sw e r e a r o u n dp ，4 - 8 ，w i t hm o l e c u l a rw e i g h t si nt h er a n g eo f1 柚7k da n dw e r em o s t l y v 中国科学院博士学位论文三氟拉嗪抑制钙一钙调素对白杆花粉管生长的调节 _ _ _ _ l _ l 一i i i l l _ - l i l l _ l l i i i i l - l n e u t r a lo rs l i g h t l ya c i d i c s u b s e q u e n t l yt h e s ed i f f e r e n t i a l l yd i s p l a y e ds p o t sw e r e s u b j e c t e dt oi n - g e ld i g e s t i o na n d m a s ss p e c t r o m e t r y s e v e n t y s i xs p o t sr e s p o n d e dt o t f pb ye i t h e ru p - o rd o w n r e g u l a t i o n ，w h e r e a st h eg l o b a lp a t t e r no fp o l l e nt u b e p r o t e i ne x p r e s s i o n w a sl a r g e l yu n c h a n g e d b e c a u s eo ft h el a c ko fg e n o m e i n f o r m a t i o nf o rc o n i f e rs p e c i e sa n dt h el o wa b u n d a n c eo fs o m ep r o t e i n s ，o n l y5 7o f t h e7 6s p o t se x a m i n e dw e r ef o u n dt ob ei d e n t i c a lt ot h o s ea l r e a d yr e p o r t e di nt h e n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o nn o n - r e d u n d a n t ( n c b i n r ) d a t a b a s eb y c r o s s - s p e c i e sm a t c h i n g t h e5 7p r o t e i n si d e n t i f i e dr e p r e s e n t e d4 2d i f f e r e n tg e n e p r o d u c t s ，a n dw e r es u b s e q u e n t l yc l a s s i f i e di n t o1 1d i f f e r e n tf u n c t i o n a lc a t e g o r i e s a c c o r d i n gt ot h e i rp u t a t i v ef u n c t i o n s ，i n c l u d i n gc a r b o h y d r a t ea n de n e r g ym e t a b o l i s m ， s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，s t r e s sa n dd e f e n s er e a c t i o n ，c e l le x p a n s i o n ，t r a n s c r i p t i o na n d t r a n s l a t i o n t f pt r e a t m e n ti n d u c e dt h ed o w n r e g u l a t i o no fo x i d a t i o np h o s p h o r y l a t i o n w h i l ep d c b y p a s ss l i g l l t l yu p r e g u l a t e d ，s u g g e s t i n gt h a tp d cb y p a s sm i g h tf u n c t i o n i nt h eu n f a v o r a b l ec o n d i t i o n sa st h eb a s i ce n e r g ys u p p l y t h ep r o t e i n si n v o l v e di n c e l le x p a n s i o n ( c y t o s k e l e t o n m i m e da n dc e l lw a l lp r o t e i n s ) w e r ea l s od o w n r e g u l a t e d ， w h i c hw a si na c c o r d a n c ew i t ho u rd a t ai nt h ec y t o l o g i c a la n a l y s i s i ns u m m a r y , c a 什- c a ms i g n a l i n gi sn e c e s s a r i l yd r a m a t i z e dt op r o v i d ef o rt h e r a p i dp o l a rc e l lg r o w t hc h a r a c t e r i s t i c sr e s e r v e df o rt h e s eu n i q u e l ym o t i l ep l a n tc e l l s ， d e d u c i n gf r o mt h ei n h i b i t o r ye x p e r i m e n t s n et i p f o c u s e d 【c a + 】cg r a d i e n tw a s d i s s i p a t e da n dt h ec y t o p l a s m i cc a 。+ c o n c e n t r a t i o ng r e a t l ye l e v a t e da f t e rp e r t u r b a t i o n o fc a 2 + c a mf u n c t i o n s ，t h em e t a b o l i ca c t i v i t i e sw e r er e d u c e di ng e n e r a lw h i l et h e p r i m a r ye n e r g ys u p p l ym i g h tc o m ef r o mt h ep d cb y p a s s a sr e v e a l e db yt w o d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i sa n dm a s ss p e c t r o m e t r ya n a l y s i s i nt h em e a nt i m e ，a f s w e r es e v e r e l yd i s r u p t e dt o g e t h e rw i t hd r a s t i cc h a n g e si nt h ea m o u n to fc e l lw a l l c o m p o n e n t s ，w h i c hr e d u c e dt h ep o t e n t i a lc a p a c i t yo fc e l le x p a n s i o n ，a n df i n a l l yg a v e r i s et ot h eg r o w t ha r r e s ti nt h ep o l l e nt u b e s k e y w o r d s ：c a l m o d u l i n ，c e l lw a l l ，p i c e am e y e r i ，p o l a r i z e dg r o w t h ，p o l l e nt u b e ， p r o t e o m i c s ，t r i f l u o p e r a z i n e v i 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院植物研究所有关保留、使用学位论文的 规定，即：植物研究所有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅 和借阅；学校可以提供目录检索以及公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后遵守此规定) 学位论文作者签名：时砸 狮6 年i2 月洲日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年月 日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) 秘密l o 年( 最长1 0 年，可少于1 0 年) 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位 论文的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开 发表的作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的 法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：1 蛾艇 洳口6 年侥月三1 日 第一章文献综述 花粉是具有独特结构和生物学功能的微小生命有机体，一般由2 - 5 个细胞 组成，由于其结构简单，易于离体操作，因此是研究植物细胞生长发育、物质 转运、信号传递等生命过程的理想实验体系。同时花粉萌发和花粉管生长又是 完成种子植物有性生殖的重要环节，这一过程是植物生殖生物学研究领域的重 点和焦点。近年来，随着现代生物学技术的迅速发展和广泛应用，对花粉发育 生物学的深入研究起了巨大的推动作用。其中特别是对花粉发育过程中胞质组 织结构变化、信号转导、调控细胞极性和命运的分子机理以及花粉发育特异基 因的表达和调控等方面均取得了一些重要的研究进展( t a y l o r h e p l e r , 1 9 9 7 ； f r a n k l i n - t o n g ，1 9 9 9 ；s t a i g e r , 2 0 0 0 ；f e i i 6e ta 1 ，2 0 0 4 ) a 以往的研究表明，花粉管的生长模式为典型的极性顶端生长，即其生长过 程仅仅局限在顶端区域。这种生长模式也常见于神经细胞、根毛、真菌菌丝体 以及苔藓等一些细胞巾，但是花粉管不仅具有独特的细胞壁结构，对于植物细 胞形态建成以及细胞壁动态组成等方面的研究具有重要意义；而且它还是用于 研究细胞基本结构( 顶端游离钙离子梯度、细胞骨架系统、细胞壁构建等) 感 受外界信号刺激完成信号转导过程的模式系统，以及研究细胞相互识别、相互 作用、物质跨膜运输和能量转换等过程也是一种极好的材料。因此，长期以来 一直吸引着众多科研人员对花粉管结构与生长研究的关注。近年来，欧盟曾启 动了资助细胞极性生长研究的专项基金t i p n e t ( t i pg r o w t hi np l a n t ：f r o m n u c l e a rt oe x p a n d i n g t i p ，p r o j o dh p r n c t - 2 0 0 2 - 0 0 2 6 5 ) ，以资助分布于欧洲不 同国家涉及细胞生物学、生理学和分子遗传学等领域的十个研究组，旨在促进 不同研究方向的研究组之间进行技术和学术观点的交流。 为了深入揭示细胞极性生长的机理，深入分析钙钙调素信号系统将有助于 我们初步探明花粉萌发和花粉管生长过程中钙信号的转导机制。众所周知，钙 是植物生长发育过程中的必需元素，同时又是细胞中最重要的二级信使。机械 刺激、植物激素、真菌激发子和胁迫等多种刺激因素作用于不同的植物细胞， 最初反应几乎都是引起胞i 内c a 2 + 浓度的变化。钙直接或间接通过一系列钙调蛋白 及其受体调节植物细胞中许多重要的酶和蛋白质，如蛋白激酶、离子通道、细 中国科学院博士学位论文三氟拉嗪抑制钙一钙调素对白杆花粉管生长的调节 胞骨架和离子泵等，以实现外部刺激对植物细胞代谢、生长和分裂等活动的调 控。不同刺激引起的钙信号必须保持其下游信号途径的特异性。钙调蛋白在钙 信号特异性解译和信息传递过程中扮演了重要的角色，而钙调素则是植物细胞 中最重要的一种钙调蛋白。 近年来，国内外许多研究者曾利用花粉管这一极性生长的模式体系开展了 许多重要的研究工作，并取得了一系列令人欣喜的研究成果。特别是随着模式 植物拟南芥、水稻基因组测序工作的完成，以及植物蛋白质组数据库的日趋完 善，对于从整体和动态的水平上研究钙一钙调素信使系统在植物有性生殖过程中 的信号转导具有更为重大的意义。本文将就( 1 ) 花粉管的基本结构与花粉管的极 性生长；( 2 ) 裸子植物花粉管与被子植物花粉管结构差异的比较；( 3 ) 钙一钙调素 信使系统在花粉萌发和花粉管生长过程中的调控作用；( 4 ) 植物蛋白质组学及其 在细胞生物学研究中的应用等方面作一简要综述。 1 1 花粉管的基本结构及其极性生长 有花植物的亲和花粉落在柱头上花粉粒中累积的桉酸、蛋白以及其它具 有生物活性的小分子促进花粉萌发和花粉管的快速生长，当花粉管穿入柱头， 经过花柱、子房等雌蔫组织，最终到达胚珠，并将由细胞分裂产生的一对精子 释入胚囊中，它们分别与卵细胞以及中央细胞融合形成合子和胚乳，从而完成 双受精过程。整个双受精过程受多条信号途径的精细调控，其中涉及到细胞分 子相互识别、胞外信号的跨膜传递和转换、胞内信使系统传递信号、细胞基本 组织结构变化等一系列复杂级联的生物学事件。 在生长的花粉管中各种代谢活动十分活跃，包括旺盛的蛋白、脂类和碳水 化合物合成，因此需要持续的物质和能量供应。由高尔基体分泌产生的囊泡携 带着合成质膜和细胞壁的前体及相关酶系统，在细胞顶端与质膜融合，促使新 的质膜和壁的合成，直接导致花粉管顶端的极性生长。由于花粉管顶端的细胞 壁性质较为特殊，它需要具有足够的刚性抵抗来自胞内膨压以及细胞骨架等细 胞结构的压力，同时又要具有足够的延展性来维持快速的顶端生长，因此花粉 管顶端的极性生长现象是多方面作用力在顶端细胞壁相互组合消长的结果。生 长的花粉管内存在活跃的胞质流动，并呈现出“喷泉式流动”或方向相反的“倒 喷泉式流动”的流动方式：但这种运动在花粉管的顶端区域并不存在，因而使 其顶端常成为透明区。通常被子植物花粉管具有较为明显的分区现象，即从顶 端向基部依次分为三个区域：布满囊泡的顶端透明区、具有各种细胞器、营养 核和生殖细胞的区域及液泡化和胼胝质的区域( 图1 - 1a ) 。 通过对百合、烟草等被子植物花粉管的研究表明，花粉管的顶端生长与胞 质结构组织密切相关，例如分泌型小泡在花粉管顶端的特异性积累，内质网、 高尔基体等细胞罂在花粉管轴向的区域化分布等( f r a n k l i n - t o n g e t a l 1 9 9 6 ：c a i 甜a l ，1 9 9 7 ；p a l o ne ta l ，2 0 0 1 ) 。钙调素是胞内钙信号最基本也是最重要的效应 蛋白，它是引发下游复杂细胞学事件的重要信号传递组件。另外完整的细胞骨 架结构( 包括微丝骨架和微管骨架) 的存在也是维持细胞形态、细胞运动和物 质运输所必需的。但是对于它们在花粉管极性生长过程中的作用机理目前尚不 十分清楚。 糜 图1 - 1 被子植物花粉管基本组织结构丑其极性生长( 引自b u c h a n a n d a l ，2 0 0 2 并修改) a ，被子植物花粉管中基本结构，细胞质呈区带分布；b ，脱色苯胺兰染色显示烟草花粉 管中的肼胝质塞。 f 培1 - 1 g r a p h i c a l i l l u s n a t i o n o f c y t o p l a s m i c o r g a n i z m i o n o f a m g i o s p e r m p o l l e n t u b e 1 c n , i c a lc y t o p l a s m i c o r g 蚰i z a t l o n i n aa n g i o s p e r m p o l l e n t u b e ；1 3 , s c r a i i n - v i v o g e r m i n a t e d n i c o t i a n a p o l l e n t u b e , s h o w i n g c a l l o s e p l u g s i n t h e l l 船t u b e b ya n i l l n e b l u e m i n i n g 1 1 1 花粉管顶端的游离钙离子梯度 花粉管生长的起始与持续是一个极性生长建立与维持的过程，而细胞极性 生长受细胞内o p 的极性分布特征的控制。现已知在行极性生长的植物细胞中 都存在c a “的极性分布现象。花粉管顶端区域存在膜钙、总钙和胞质游离钙离 中国科学院博士学位论文三氟拉嗪抑制钙一钙调索对白杆花粉管生长的调节 子的梯度分布现象( p o l i t o ，1 9 8 3 a ) 。这种现象使花粉管顶端存在持续而有序的 高尔基体小泡的定向分泌、运输及其与质膜的融合，从而使合成花粉管壁和质 膜的前体物质持续地运到花粉管顶端，使其顶端的极性生长得以进行( r o ye ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。破坏这种c a 2 + 梯度就会导致花粉管生长的异常和停滞。 早期p o l i t o ( 1 9 8 3 a ) 的研究显示，在未水合状态下，c a 2 + 均匀分布在整个花 粉粒中；花粉水合和萌发初期，利用金霉素荧光标记观察到在花粉粒萌发孔附 近有较高浓度的钙聚集，由此暗示，花粉粒内钙极性分布的建立。j a f f e 等用4 5 c a 2 + 示踪的方法，首次证实正在生长的百合花粉管顶端存在钙离子内流现象，同时 顶端还有c a 2 + 积累( j a f f ee ta 1 ，1 9 7 5 ) 。此后，r e i s s 和n o r b i l i n g 用双波长探针 q u i r t 2 - a m 对麝香百合花粉管中游离c a 2 + 梯度进行了定量测定，结果表明，花粉 管顶端的游离c a 2 + 浓度为1 0 0n m ，而基部仅为2 0n m ( r e i s s & n o r b i l i n g 。1 9 8 6 ) 。 o b e r m e y e r 和w e i s e n s e e l 用q u i n 2 - a m i 贝! 量百合花粉管中的游离c a 2 + 浓度，发现花 粉管顶端c a 2 + 浓度为1i z m ，顶端后1 0 0 m 处的浓度仅为5 0n m ；而用f u r a 2 - a m 测得最顶端钙离子浓度为1 7 2 6 , m ，顶端向后1 0 0 “m 处c a 2 + 浓度为6 0 1 0 0n m ， 这一测定结果比r e i s s 和n o r b i l i n g 的结果高出一个数量级( o b e r m e y e r w e i s e n s e e l ，1 9 9 1 ) 。上述两者测量结果的差异，可能是与采用的荧光探针及其导 入的方法、检测手段以及材料的生理状态、培养基成分等有关。另外，p i e r s o n 等人对同一花粉管中钙离子浓度进行了重复测量，其顶端钙离子水平存在着较 有规律的振荡( o s d l l m i o n ) 现象，变化范围为7 5 0n m 3 , m ，而且胞内钙水平 的波动与生长速率的波动呈正相关，但稍有滞后( p i e r s o ne ta 1 ，1 9 9 6 ) 。钙水平 的持续波动可能也是导致测量结果不一致的重要原因之一。值得提出的是， l a z z a r o 等人在通过显微注射f u r a 2 d e x t r a n 对裸子植物欧洲云杉( p i c e aa b i e s ) 花 粉管顶端钙离子梯度进行研究时发现，花粉管最顶端的游离钙离子浓度为4 5 0 n m ，而钙梯度基部的游离钙离子梯度为2 2 5n m ( l a z z a r oe ta 1 2 0 0 5 ) ，这与被 子植物花粉管中游离钙离子梯度的落差相比，欧洲云杉花粉管顶端钙梯度明显 较为缓和。 1 1 2 细胞骨架系统 微丝、微管作为细胞骨架的主要成分广泛存在于真核细胞中，与其马达蛋 白构成细胞内重要的动力系统，参与细胞器及囊泡运输、细胞形态建成、染色 4 第章文献综述 体迁移、细胞壁构建、细胞分裂与分化等各种生命活动，因而微丝、微管的研 究一直足细胞生物学活跃的前沿领域。同样在花粉管这一典型的极性生长体系 中，无论生殖细胞和营养核的移动，还足细胞器或囊泡的运动，都与花粉管内 的细胞骨架系统相关，因此，微丝、微管骨架系统在花粉萌发和花粉管生长中 也起着重要的作用( 图1 - 2 ) ( 朱 毁和徐世雄，2 0 0 2 ) 。 图1 - 2 被子植物花粉管顶端的囊泡分布 及其沿微丝骨架的转运( 引白b u c h a n a ne t a l 。2 0 0 2 ) f i g1 - 2 t h e d i s t r i b u t i o n o f v e s i c l e s i n t h e t i pr e g i o no f p o l l e n t u b e i n a n g i o s r l e r m s p e