（微生物学专业论文）植物乳杆菌产胞外多糖的研究.pdf

中文摘要 中文摘要 乳酸菌胞外多糖( e p s ) 是乳酸菌在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的一种糖 类化合物。在食品发酵过程中，由乳酸菌生产的e p s 能提高乳制品的粘度和组织 状态，因此被广泛应用于稳定剂、凝胶剂和增稠剂。 本论文介绍了有关e p s 的国内外研究进展，对乳酸菌e p s 的生理功能、影响 其产量的因素和应用进行了综述；然后对植物乳杆菌产生的e p s 进行了发酵条件 的优化、分离纯化和成分分析。 利用单因素试验研究了葡萄糖、硫酸锰、蛋白胨的添加量，接种量、p h 值、 发酵时间、发酵温度对植物乳杆菌产e p s 的影响。用部分因子分析法筛选对e p s 产量影响显著的因子。发现葡萄糖添加量、p h 值、发酵时间对e p s 的产生影响显 著。用b o x b e h n k e n 设计确定最佳培养条件：葡萄糖添加量为4 6 8 、硫酸锰 0 0 0 6 、蛋白胨l 、接种量3 、p h 值为6 3 2 、发酵时间为2 7 5 1 h 、发酵温度 3 0 。e p s 产量比优化前提高了约1 5 倍。 为了提高e p s 的提取率，对e p s 的提取工艺进行优化。优化结果表明最佳提 取工艺为：采用3 倍体积的无水乙醇来沉降e p s 。s e v a g e 法脱蛋白2 次，s e v a g e 液体积是发酵上清液2 倍时脱蛋白效果最佳。蛋白质脱除率达到8 9 5 1 ，e p s 损 失率为1 8 1 2 。将粗多糖用d e a e 5 2 离子交换层析进一步纯化。 对e p s 进行定性分析，薄层层析法确定e p s 是由鼠李糖、甘露糖和葡萄糖组 成的。红外光谱分析结果显示样品为典型的多糖。 关键词：植物乳杆菌；胞外多糖；分离纯化；成分分析 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t e x o p o l y s a c c h a r i d e ( e p s ) ，o n ek i n do fc a r b o h y d r a t e s ，w a ss e c r e t e db yl a c t i ca c i d b a c t e r i ad u r i n gi t s g r o w t hm e t a b o l i s m e p sp r o d u c e db yl a c t i ca c i db a c t e r i ac a n i n c r e a s et h ev i s c o s i t ya n do r g a n i z a t i o n a ls t a t u so fd a i r yp r o d u c t s ，a n di tw a s w i d e l yu s e d a ss t a b i l i z e r , g e l l i n ga g e n ta n dt h i c k e n e r - t h er e s e a r c h i n gp r o g r e s so fe p sa th o m ea n da b r o a dw a si n t r o d u c e di nt h ep a p e r p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，f a c t o r sa f f e c t i n gt h ep r o d u c t i o no fe p sa n da p p l i c a t i o n sw a s s u m m a r i z e d t h eo p t i m i z i n gf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s ，p u r i f i c a t i o na n dc o m p o n e n t a n a l y s i so fe p sw e r ei n v e s t i g a t e di nt h i sr e s e a r c h g l u c o s e ，m n s 0 4 ，p e p t o n e ，p h ，f e r m e n t a t i o nt i m e ，i n o c u l u mc o n c e n t r a t i o na n d f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e ，w h i c ha f f e c tt h ey i e l do fe p sp r o d u c e db yl a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，w a ss t u d i e db ys i n g l e - f a c t o rt e s t t h ef r a c t i o n a lf a c t o r i a ld e s i g nw a s e m p l o y e dt os c r e e no nf a c t o r sw h i c hs i g n i f i c a n tv a r i a b l e st oi m p r o v et h ey i e l do fe p s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ea d d i t i o no fg l u c o s e ，p ha n df e r m e n t a t i o nt i m ew e r e s i g n i f i c a n tv a r i a b l e st oi m p r o v et h ey i e l do fe p s at h r e e - l e v e lb o x b e h n k e nf a c t o r i a l d e s i g n w a se m p l o y e df o r m a x i m i z i n g t h ee p s t h e o p t i m a lc o n d i t i o n s w a s g l u c o s e 4 6 8 ，m n s 0 4 0 0 0 6 ，p e p t o n e l ，i n o c u l u mc o n c e n t r a t i o n 3 ，p h 6 3 2 ， f e r m e n t a t i o nt i m e 2 7 51 h ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e3 0 c t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a te p s w a s1 5t i m e sh i g h e ri nt h i sc o n d i t i o nt h a nb e f o r e i no r d e rt oi m p r o v et h ee x t r a c t i o nr a t eo fe p s ，t h ea b s t r a c t i o nc o n d i t i o n sw e r e o p t i m i z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eb e s to p t i m i z a t i o nc o n d i t i o nw a s ：i ts h o u l da d o p t 3 t i m e st h ev o l u m e o fe t h a n o lt os e t t l ed o w nt h ee p s r e m o v a lr a t eo fp r o t e i nr e a c h 8 9 5 1 1 0 s sr a t eo fe p sw a s1 8 1 2 d e a e 5 2w a se s t a b l i s h e dt oi s o l a t ea n dp u r i f y t h ee p s t h er e s u l to fq u a l i t a t i v ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ee p sw a s c o m p o s e do fr h a m n o s e ， m a n n o s e ，g l u c o s eb yt h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y i n f r a r e ds p e c t r u ms h o w e dt h a tt h e s a m p l eh a dt h ec h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o np e a ko fp o l y s a c c h a r i d e s k e y w o r d s ：l a c t o b a c i l l u sp l a n t a r u m ；e x o p o l y s a c c h a r i d e ；i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ； i i a b s t r a c t c o m p o n e n ta n a l y s i s i i i 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉江盍堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名： ， m 霪k 签字日期：2 6 知年，月0 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨虚垄太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉迤太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名： 签字日期：功和年多月 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 态丧y 签字日期：知f o 年么月v 日 电话： 邮编： 第1 章绪论 1 1 多糖概述 第1 章绪论 核酸、蛋白质和多糖是最重要的三种生物大分子，核酸和蛋白质在生命现象 中的重要性已为世人所知，而糖的研究比蛋白质和核酸落后许多，其真正崛起只 是近2 0 年的事【。近2 0 年来，国内外有关活性多糖的研究非常的活跃，目前主要 从动植物组织及微生物发酵生产多糖。本世纪生命科学的焦点是对细胞生物多糖 高层次的生命现象解释，所以糖类作为生物体内细胞识别及调控信息分子其研究 是必不可少。 多糖是一类可再生资源，是指由二十个以上单糖组成的糖类化合物，根据来 源不同，可分为动物、植物和微生物多糖；根据其组成不同，可以分类为同多糖 或杂多糖；单糖的构型、糖基化方式、相邻单糖基糖苷的位置、糖中的氨基或酰 基等羟基是否被取代、有无支链都会影响到多糖的结构，使其结构各异，也因此 使多糖成为最具影响力的信息载体【2 1 。约有四十种单糖可以糖苷键的方式进行连 接，形成各种各样的多糖。 近年来随着糖类研究的逐深，许多试验表明，糖及其衍生物在生命活动中有 着极其重要的生物功能。如抗辐射、自身免疫等生物现象，只有用密布于细胞表 面的糖及其衍生物的糖链才能得到很好的解释【3 1 。 糖类既是生物活性物质的信息携带者，又是细胞间的识别分子，同时还可作 为延缓衰老、增强免疫等机能的调节分子1 4 1 。 自2 0 世纪4 0 年代成功开发由肠明串珠菌发酵产生的右旋糖酐以来，新的微 生物e p s 的研究与开发在世界范围内已成热点i 引。 1 2 乳酸菌e p s 的研究现状 乳酸菌e p s 是由乳酸菌在生长代谢过程中发酵产生并分泌到细胞外的粘液或 黑龙江大学硕士学1 立论文 荚膜多糖，是常渗入培养基中的种糖类化合物。根据其所在的位置可分为荚膜 多糖和粘液多糖。 按照伯杰氏系统细菌学手册的分类，乳酸菌分为1 8 个属。目前对其中几个属 包括德式乳杆菌保加利亚亚种( l b d e l b r u e c c k i is s p b u l g a r i c u s ) 【6 1 、瑞士乳杆菌 伍6 h e l v e t i c u s ) 1 7 1 、干酪乳杆菌干酪亚种( l b c a s e is s p c a s e ) i s l 、嗜酸乳杆菌 ( l b a c i d o p h i l u s ) 、嗜热链球菌( s t h e r m o p h i l u s ) 【9 1 、乳酸乳球乳脂亚种( l c l a c t i s s s p c r e m o r i s ) 1 0 】、肠膜明串珠菌( l e u c m e s e n t e r o i d e s ) 1 1 1 】等乳酸菌的e p s 研究较 多。 由肠膜明串珠菌的葡聚糖蔗糖酶通过生物合成产生的右旋糖酐是最早被开发 利用的乳酸菌e p s ，它具有较高的粘度，可作为增稠剂、填充剂、保湿剂等用于 饮料、糕点、调味料、糖果、冰淇淋等的加工，是f d a 批准的第一种可用于食品 的微生物多糖【1 2 1 。 1 3e p s 的分离纯化 目前对e p s 分离纯化条件研究报道越来越多。e p s 的分离纯化根据多糖的性 质和组成成分来决定。 1 3 1e p s 纯化时蛋白的去除 分离乳酸菌e p s 时，通常先通过离心去除菌体和蛋白质，但此时仍然有蛋白 质与多糖相结合，这部分蛋白质很难去除，常用的方法有三种，分别是s e v a g e 法、 三氯乙酸法和盐酸法。s e v a g e 法是应用最广泛的一种。其方法和原理是将粗多糖 与s e v a g e 液( 氯仿与正丁醇的混合液) 混合，剧烈震荡一段时间，蛋白质变性后 与多糖分离，并悬浮于水和有机相的接触面上。通常一次是不够的，要反复操作 几次才能较彻底去除蛋白质。 1 3 2 凝胶层析法分离纯化e p s 将用乙醇分级沉淀并通过透析去除还原糖和残留的小分子无机盐的乳酸菌粗 多糖用凝胶层析法进一步纯化。凝胶层析法又称分子筛层析。 2 第1 章绪论 它是指样品随着流动相流经层析柱时，样品各组分按其分子量大小而分别析 出的一种方法。其原理是分子量不同的组分流出层析柱的时间有差异，因而能将 不同组分区分开。因为其方便高效、回收率高而被广泛应用于多糖等大分子样品 的分离。 1 9 9 8 年w h m v a nc a s t e r e n 等【1 3 】采用琼脂糖凝胶对乳酸乳球菌亚种c r e m o r i s b 4 0 产生的e p s 进行了分离纯化，得到了单一的e p s 。 李全阳等【1 4 】( 2 0 0 5 ) 对酸奶中的乳酸菌e p s 采用蛋白酶水解、离心、乙醇沉 淀进行初步分离提取，进一步采用三氯乙酸法去除蛋白，再经过透析、超滤、 s e p h a r o s ec l 2 2 b 凝胶柱层析使多糖得到纯化。 艾连中等【1 5 】( 2 0 0 7 ) 将干酪乳杆菌e p s 通过s e p h a r o s ec l - 6 b 凝胶柱，分离 得到l c p l 、l c p 2 、l c p 3 三个组分，结合紫外2 8 0 n m 检测分析，可初步确定为多 糖。采用h p l c 得到l c p l 、l c p 2 、l c p 3 平均相对分子量分别为3 2 7 x 1 0 6 , 2 1 4 x 1 0 4 、 1 7 4 x 1 0 4 。 王静颖等凹( 2 0 0 7 ) 将保加利亚乳杆菌e p s 通过s e p h a d e x g 2 0 0 凝胶柱层析， 为单一洗脱高峰，蛋白质含量测定，纯度为9 8 6 。嗜热乳链球菌胞外多糖经 s e p h a d e x g 2 0 0 凝胶柱层析，为单一洗脱高峰，通过蛋白质含量测定，纯度为9 8 6 。 2 0 0 9 年y o u s s r im o h a m e da h m e d 掣1 7 】用s e p h a c r y ls - 2 0 0 对m i c r o b a c t e r i u m t e r r e g e n s 需土微杆菌产生的e p s 进行分理纯化，得到e p sl 和e p si i 两种多糖， 高效液相色谱法测得其分子量为1 5 x 1 0 5 。 2 0 1 0 年d a o d o n gp a n 等【1 8 】采用s e p h a r o s ec l - 6 b 和s e p h a c r y lh r3 0 0 凝胶柱层 析，将乳酸乳球菌亚种l a c t i s l 2 产生的e p s 进行了分离纯化，得到单一多糖，测 得分子量为6 9 1 0 5 。 1 4e p $ 的检测技术 1 4 1 薄层层析法测定e p s 的单糖组成 薄层层析是在支持剂涂布均匀的硅胶板上进行的。糖在硅胶板上的迁移速度 黑龙江大学硕士学位论文 与其的分子量以及羟基数有关，其中戊糖最快，已糖最慢，双糖和三糖次之。分 离多糖大多采用硅胶g 2 5 4 薄层板，以正丁醇、乙酸乙酯、吡啶、异丙醇、冰乙酸 和水其中的几种或全部按不同比例混合液作为展开体系。薄层层析的优点显而易 见，不仅样品用量是微克级，而且灵敏度非常高，约为纸层析的几十倍。 2 0 0 3 年徐旭东等【1 9 】以正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：醋酸：水：吡啶：3 5 ：1 0 0 ： 6 0 ：3 5 ：3 0 ：3 0 为展开剂，苯胺邻苯二甲酸为显色剂，测得红栓菌胞外多糖组成 为葡萄糖、甘露糖、木糖、半乳糖。 2 0 0 6 年g u i l l a u m et y v a e r t 掣冽对嗜热链球菌i p 6 7 5 6 产生的多糖进行了分离纯 化，采用薄层层析法对胞外多糖水解液进行了分析，得到其单糖组成为：葡萄糖 醛酸、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖。 2 0 0 7 年赵风春等【2 1 】用硅胶g 板，以正丁醇：乙酸：水：9 ：4 ：2 为展开剂，1 0 硫酸乙醇为显色剂对水解液进行薄层层析，最终确定该多糖由4 种单糖组成：葡 萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和木糖。 2 0 0 8 年张艳芳等【2 2 1 利用乙醇沉淀法提取葡萄酒中的粗多糖，用s e v a g e 法除去 蛋白，用乙酸乙酯：正丁醇：异丙醇：吡啶：醋酸：水= 3 4 ：1 2 ：2 1 ：1 0 ：1 2 ：1 0 为展开剂，确定葡萄酒中的多糖组成为葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖。 2 0 1 0 年k e n j if u k u d a 等【2 3 j 对发酵乳杆菌t d s 0 3 0 6 0 3 产生的胞外多糖进行了 研究，首先对m r s 发酵培养基进行了优化，使其产量达到最高。然后通过薄层层 析法测得其单糖组成为：葡萄糖、半乳糖、乳糖和蔗糖。 1 4 2 高效液相色谱法测定f p $ 的分子量 e p s 的分子量可以通过高效液相色谱法和超速离心法来测定。最常见的是高 效液相色谱法，结果也最准确可靠。高效液相色谱法是克服了气相色谱法受分析 样品挥发性及热稳定性限制的一种可以测定样品分子量的一种全新方法。 2 0 0 5 年郭辉等【2 4 l 研究红毛五加多糖，用s e p h a d e x g 1 0 0 层析柱分离纯化后得 到三种多糖，经过高效液相色谱柱后峰形均呈单一对称峰，以右旋糖酐为对照， 绘制标准曲线，测定三种多糖相对分子量分别为：9 1 x 1 0 4 、8 5 x 1 0 4 和4 5 x 1 0 4 。 第1 章绪论 2 0 0 9 年刘丽波等【2 5 】将嗜热链球菌胞外多糖经过s e p h a r o s ec l - 6 b 凝胶柱分离 后得到的两种多糖，采用高效液相色谱法测得两种多糖的平均分子量分别为 8 1 5 x 1 0 4 和1 9 9 x 1 0 6 。 2 0 0 9 年董焱掣2 6 】将柱层析分离纯化得到的沙漠嘎多糖采用高效液相色谱法测 定重均相对分子质量为8 5 x 1 0 4 。 2 0 1 0 年刘翠平等【2 7 l 经s e p h a r o s ec l - 6 b 凝胶柱分离后得到的两种多糖，经过 高效液相色谱柱后峰形均呈单一对称峰，根据标准曲线计算得到两种多糖的平均 相对分子量分别为6 6 5 x 1 0 5 、1 0 1 x 1 0 4 。 2 0 1 0 年c h u n h u iu u 等【冽用凝胶色谱法对藓样芽胞杆菌8 3 7 0 1 产生的e p s 进行了分离纯化，并且用高效液相色谱法测得分子量为2 8 2 6x1 0 4 。 1 5 影响乳酸菌e p s 生物合成的因素 除受遗传因素控制外，很多外因对乳酸菌e p s 生物合成也有很大影响，如培 养基组成、发酵温度、p h 值等。 1 5 1 培养基的组成 培养基组分是影响e p s 产量重要的因素，其中碳源尤为重要。 g a n c e l 等【2 9 】( 1 9 9 4 ) 通过比较葡萄糖、乳糖、蔗糖及果糖分别作为碳源时， 对唾液链球菌嗜热亚种发酵生产e p s 的影响，发现用乳糖做碳源e p s 产量最多。 顾笑梅等【刈( 2 0 0 3 ) 考查了含不同碳源的培养基对菌株z 2 2 2 产e p s 产量的影响， 结果表明不同碳源对z 2 2 2 菌株产e p s 量有不同的影响，其中葡萄糖为碳源的菌株 的e p s 产量较高，这结果与国外m a c e d o 等【3 1 】( 2 0 0 2 ) 的有关研究报道一致。m o z z i 等【3 2 】( 1 9 9 7 ) 研究表明乳酸菌以1 0 2 0 9 l 葡萄糖为碳源可得到最高的e p s 产量。 乳杆菌培养基中氮源对e p s 产量也有很大影响。半合成培养基中添加蛋白胨 和酵母氮源能提高乳杆菌e p s 的产量。不同氮源对e p s 产量影响比较小，但不同 的碳氮比会影响到菌株e p s 的产型3 3 1 。 氨基酸、矿物质及维生素也是影响乳杆菌e p s 产量的因素。张天琪等【3 4 1 黑龙江大学硕士学位论文 ( 2 0 0 8 ) 干酪乳杆菌干酪亚种n c b l 4 1 1 4 在脱脂乳培养基中e p s 产量为5 5 m g l , 而 在超滤后的脱脂乳中添加1 的酪氨酸e p s 的产量明显提高，继续向脱脂乳培养基 中添加5 的葡萄糖其e p s 产量可达到1 5 5 m g l 。 1 5 2 温度 有利于形成e p s 的培养条件，不一定是最佳的乳酸菌生长所需条件f 3 5 l 。研究 表明乳酸菌在略低于最适生长温度下接种，可以促进e p s 产量增加。 k o j i c 等【3 6 】( 1 9 9 2 ) 证实，干酪乳杆菌c g l l 在2 5 。c 下产生的e p s 产量比3 0 条件下提高了5 0 左右。g a s s e m 等1 3 7 1 ( 1 9 9 7 ) 人认为接种温度低使得活菌数量 缓慢增加，能够延长对数期和稳定期，从而有利于e p s 的形成。德式保加利亚乳 杆菌r r 在3 0 。c 的条件下能够形成较高产量的e p s 聚合物，但其最适生长温度为 4 0 c 。1 9 9 8 年g a m a r 等【3 8 】证实当培养温度从最适合生长的3 7 。c 降到2 5 。c ，鼠李 糖乳杆菌c 8 3 的e p s 产量增加。但过度降低培养温度乳酸菌的生长速度会减慢， 导致细胞生物总量降低，因此e p s 产量也会降低。 但是，m a r s h a l l 等【3 9 】( 1 9 9 1 ) 发现德式保加利亚乳杆菌亚种n c f b 2 7 7 2 在略 高于最适生长温度的条件下( 4 8 时) 能产生更多的e p s 。 1 5 3 发酵时间 乳酸菌的生长阶段不同e p s 的产量也不等。e p s 是次级代谢产物，在乳酸菌 对数生长末期及稳定期产生。在稳定期德式保加利亚乳杆菌c n r z 4 1 6 和 c n r z l l 8 7 能够产生比对数生长期更多的e p s 4 0 1 。在4 8 h 后接种的干酪乳杆菌干 酪亚种n c b l 4 1 1 4 的e p s 的产量为5 5 m g l ，在1 2 0 h 后接种e p s 产量为1 0 5 m g l 4 。 1 5 4 培养基p h 值 培养基的起始p h 值以及在培养中对p h 值的调控都会影响到e p s 的最终产量。 m o z z i 等【4 2 l ( 1 9 9 5 ) 研究发现在p h 6 0 时，l i c a s e ic r l 8 7 产e p s 产量最大。 德式保加利亚乳杆菌n c f b 2 7 7 2 和干酪乳杆菌c r l 8 7 的最佳产生e p s 的培养基起 始p h 值为6 0 【4 3 】。在培养过程中维持较高的p h 值，德式保加利亚乳杆菌e p s 产 量增加。在德式保加利亚乳杆菌g n r z l l 8 7 菌株生长过程中维持p h 6 0 其e p s 产 6 第1 章绪论 量为1 0 7 m g l ，是p h 值未受控制时的3 倍，而德式保加利亚乳杆菌g n r z 4 1 6 菌 株e p s 产量为1 7 4 m g l ，是p h 值未受控制时的4 倍【删。 1 6 乳酸菌e p $ 的生理活性 自1 9 8 2 年日本学者s h i o m i 掣4 5 】人报道乳酸菌e p s 具有抗肿瘤作用以来，引 起了许多学者的注意。 1 6 1 对菌体的保护作用 荚膜及粘液多糖生理功能主要是保护菌体。既能保持菌体的适当水分，还能 抑制溶菌酶的防御噬菌体作用等。 1 6 2 抗肿瘤作用 p a t r i c i a 掣4 6 】( 2 0 0 2 ) 报道，向荷肉瘤5 1 8 0 小鼠腹腔中注入乳酸乳杆菌乳油 亚种k v s 2 0 含有e p s 的菌体冻干物后，产生了抗癌效果，而注射仅含菌体的荷肉 瘤s 1 8 0 小鼠没有此效果。 药理及临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，能激活免疫功能。 在用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小，安全性高，抑瘤效果好等优剧4 7 1 。 1 6 3 免疫调节作用 v i n d e r o l a 掣4 8 】( 2 0 0 6 ) 报道，由马乳酒乳杆菌生产的e p s 通过细胞因子释放 到循环血液中来诱导消化道粘膜的相应、调节保护性免疫、维持肠道内环境的稳 定、提高大肠和小肠的i r a 水平以及影响身体组织的免疫。 a m r o u c h e 掣4 9 】( 2 0 0 6 ) 报道，从新生儿粪便分离得到的三株双歧杆菌r b l 6 4 、 r b l 8 1 和r b l 8 2 培养物的上清液中分离得到的胞外物质能增强鼠脾淋巴细胞活 性，从胞外物质中分离得到的e p s 显示出较高的淋巴细胞增殖作用和促进i f n y 和i l - 1 0 生成作用。 由乳酸菌产生的e p s 还能增加其他免疫功能，比如诱导细胞生长抑制素产生 和巨噬细胞吞噬活性等。 黑龙江大学硕士学位论文 1 7 乳酸菌e p s 的应用 1 7 1 乳酸菌e p s 对酸乳粘度的影响 乳酸菌产生的e p s 有助于提高物体的流变能力和发酵乳制品的质构【5 。新型 天然食品添加剂乳酸菌e p s 在增强酸乳以及低脂干酪等发酵乳制品的组织方面起 着重要的作用【5 1 1 。乳酸菌e p s 在食品工业中作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、凝胶 剂和起泡剂来取代一些工业稳定荆5 2 1 。 b o u z a r 等【5 3 】( 1 9 9 7 ) 研究表明，在牛乳中加入产e p s 的乳酸菌可以改善乳制 品的均一性。m a r s h a l l 掣5 4 1 ( 2 0 0 1 ) 研究发现，结合使用产e p s 德式乳杆菌保加 利亚亚种和不产e p s 的嗜热链球菌所产生的酸乳经破坏性测试后仍能恢复粘度， 而使用两株产e p s 菌株所生产的产品粘度损失很快，且不能恢复。结合水能力越 强越能防止酸奶脱水收缩，菌株只要产e p s 就可以结合更多的水来保持酸奶的构 型。为了使搅拌型酸奶细滑，发酵后的酸奶的凝块要搅拌，e p s 可以减少因为搅 拌、泵入和罐装而受到的破坏。e p s 在其它低乳固形物酸奶和奶油化酸奶这些需 要稠厚感的产品中也起到重要的作用，使用产胞外多糖的发酵剂是非常必要的【5 5 1 。 e p s 糖对酸乳粘度的影响与其分子量和刚度及亚结构单位有关。e p s 分子量 越大，粘度越大。f a b e r 掣5 6 】( 1 9 9 8 ) 阐明了e p s 的分子量对酸乳质地和粘度的影 响。以两种嗜热链球菌s t s 和r s 发酵的酸乳，虽然酸乳凝胶的渗透系数、所产e p s 数量以及两种生物多聚体的重复单元都一样，但两种发酵乳的粘度是不同的，s t s 发酵的酸乳粘度大。它们唯一的区别在于e p s 的分子量不同，其中s t s 所产的分子 量( 3 7 x 1 0 6 d a ) 比r s 所产的分子量( 2 6 x 1 0 6 d a ) 大。 v a nd e n gb e r g 掣5 7 1 ( 1 9 9 5 ) 指出e p s 的刚度能增强粘性。由清酒乳杆菌0 1 所产e p s 的平均分子量和黄原胶一样大，但它的粘度比黄原胶要高得多。尽管多 糖化学键的刚度之间的关系非常复杂，但也已经探索出了一些通常的特征。由b 1 ，4 键连接而成的单糖的链的刚度比b - 1 ，3 键连接形成的单糖的刚度要大。同时分支和 侧链基团对链的刚度也起重要作用。去除乳酸乳球菌乳脂亚种b 3 9 、b 8 1 所产e p s 的半乳糖残基会使键的刚度下降，同时粘度效力也下降。 第1 章绪论 1 7 2 乳酸菌e p s 对酸乳保水性的影响 e p s 能增强酸乳的持水能力，有利于防止乳清的析出，从而能更长地保持酸 乳的品质。e p s 对酸乳的保水性作用与其具有阻水特征和湿度保持特征有关。从 微结构上分析，不含e p s 的酸乳形成相对较薄的蛋白质凝胶通道，而产e p s 的酸 乳能形成更厚的蛋白质凝胶通道。产e p s 的酸乳的这种结构更有利于防止脱水。 很多实验也证实了e p s 的保水性功能。h a s s e n 等【5 8 】( 2 0 0 3 ) 研究发现在搅拌的情 况下产e p s 的酸乳不会立即脱水和析出乳清。张秀丽【5 9 ( 2 0 0 9 ) 对戊糖乳杆菌i n d 1 、 i n d 3 的e p s 的保水性进行了研究，比较试验结果发现，菌株i n d 1 在1 2 乳含量 的酸乳中保水能力显著，菌株i n d 3 在6 1 2 各浓度脱脂乳中的保水能力都显著。 1 7 3 乳酸菌e p s 在干酪中的应用 p e r r y 等【6 0 】( 1 9 9 7 ) 用产e p s 的嗜热链球菌m r 1 c 和保加利亚乳杆菌m r 1 r 作为发酵剂，研究了乳酸菌e p s 对低脂干酪的湿度和溶解性能的影响。这种发酵 剂生产的干酪的湿度和溶解性比用不产e p s 的发酵剂生产的干酪质地显著提高。 m r 1 c 的作用尤为明显，对水的结合性质来自于该菌产生的大分子e p s 。 乳酸菌e p s 发酵剂能提高干酪的保水性。p e t e r s e n 等【6 1 1 ( 2 0 0 1 ) 研究产e p s 的发酵剂对半脱脂干酪湿度的影响，结果表明，用产e p s 的发酵剂生产的干酪的 湿度比用不产e p s 的链球菌发酵的干酪明显提高。 1 8 本课题研究的目的与意义 乳酸菌一直被认为是食品级的生产e p s 的优良菌株，在国外其代谢产物e p s 被广泛用作稳定剂、凝胶剂和增稠剂。在食品发酵过程中，由乳酸菌生产的e p s 能提高g l n 品的粘度和组织状态。乳酸菌生产的e p s 潜在的应用特性已经被许多 学者注意，e p s 能提高酸乳制品口感和组织状态，已成为发酵乳制品中的新型添 加剂。 目前国内e p s 的研究还停留在试验阶段，因此研究乳酸菌e p s 的工作是十分 必要的。本文对植物乳杆菌产e p s 的条件进行优化，通过单因素试验、部分因子 试验及响应面确定e p s 生产的最佳条件，并对植物乳杆菌产生的e p s 进行了分离 黑龙江大学硕士学位论文 纯化。然后利用红外光谱检测，确定样品为典型的多糖，并采用薄层层析法测定 了e p s 的单糖组成。为植物乳杆菌e p s 的进一步研究和应用奠定基础。 第2 章植物乳杆菌产e p s 条件的优化 第2 章植物乳杆菌产e p s 条件的优化 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 1 1 1 仪器 d n p 9 0 8 2 型电热恒温培养箱( 上海精宏试验设备有限公司) z d x 3 5 b 型座式自控电热压力蒸汽灭菌器( 上海申安医疗器械厂) 常温离心机l g l 旺2 4 a ( 北京医用离心机厂) u v 7 5 5 b 紫外分光光度计( 上海精密科学仪器有限公司) 旋转蒸发仪( 上海精科实业有限公司) 9 0 1 恒温磁力搅拌器( 上海精科有限公司) a b l 0 4 n 电子分析天平( 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司) 双人超净工作台( 苏净集团安泰公司) 截留相对分子量1 4 0 0 0 透析袋( p a r m a c i a 公司) 2 1 1 2 药品 葡萄糖、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨、n a c l 、琼脂粉、k 2 h p 0 4 、吐温8 0 、柠 檬酸铵、m g s 0 4 7 h 2 0 、m n s 0 4 、无水乙醇、苯酚、浓硫酸等。 2 1 1 3 菌种 植物乳杆菌( l a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ) ：黑龙江大学微生物重点实验室保存 2 1 1 4 培养基 m r s 培养基：蛋白胨1 、酵母粉o 2 、牛肉膏1 、葡萄糖2 、m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 2 、k 2 h p 0 40 2 、吐温8 00 1 、m n s 0 40 0 0 5 、乙酸钠0 5 、柠檬酸铵 0 2 ，p h6 5 7 0 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 种子培养基：蛋白胨1 、酵母粉0 2 、牛肉膏1 、葡萄糖2 、m g s 0 4 7 h 2 0 0 0 2 、k 2 h p 0 40 2 、吐温8 00 1 、m n s 0 40 0 0 5 、乙酸钠0 5 、柠檬酸铵 黑龙江大学硕士学位论文 0 2 ，p h6 5 7 0 ，1 2 1 灭菌1 5 m i n 。 2 1 2 方法 2 1 2 1 菌株的活化 将低温保存的供试菌株接入m r s 培养基中，置3 7 。c 恒温培养箱中培养，后于 m r s 琼脂平板上划线培养，挑取单个菌落进行纯培养。纯化后的菌株再次接入 m r s 半固体培养基中，3 7 。c 培养2 4 h 后，转移至冰箱4 。c 保存。保存的菌试验前 在m r s 液体培养基中连续传代2 次，以使菌株活力得以充分恢复。 2 1 2 2 发酵培养基的制备 取两管长势良好的植物乳杆菌接种于装有5 0 m l 灭菌m r s 液体培养基的 1 5 0 m l 三角瓶中，3 7 恒温静止培养2 4 h ，5 0 0 0 r m i n 离心1 0 m i n ，取菌体洗涤三遍， 生理盐水悬浮，以2 的接种量接入1 0 0 m l 灭菌后的m r s 液体培养基。 2 1 2 3 苯酚一硫酸法测定多糖标准曲线 采用苯酚硫酸法测定多糖的含量，以葡萄糖为标准制作标准曲线。葡萄糖 9 6 。c 烘干至恒重，精确称量0 1 0 0 0 9 定容至1 l 。准确吸取葡萄糖标准溶液0 0 ，o 2 ， o 4 ，0 6 ，0 8 ，1 0 m l ，及各样品备用液0 5 m l 置于1 5 m l 比色管中，用蒸馏水补 足1 0 m l ，然后分别加入1 0 m l 5 0 苯酚溶液，摇匀后静止2 m i n ，迅速加入5 m l 浓硫酸，静止2 0 m i n 。以空白管为对照，在波长4 9 0 n m 处测定光密度。以葡萄糖 含量为横坐标，4 9 0 n m 处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。 2 1 2 4 植物乳杆菌产f p 8 单因素条件的确定 ( 1 ) 不同的碳源对植物乳杆菌e p 8 产量的影响 在m r s 培养基中分别添加2 的葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖，发酵培养植物 乳杆菌。采用旋转蒸发仪将发酵上清液浓缩到1 3 体积，经截留1 4 0 0 0 分子量的透 析袋透析1 0 小时后，加入发酵上清液3 倍体积的乙醇4 。c 冰箱中过夜，将沉淀得 到的粗多糖加1 0 0 m l 蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在4 9 0 n m 处测定e p s 产量。 ( 2 ) 不同的氮源对植物乳杆菌f p $ 产量的影响 在m r s 培养基中分别添加l 的大豆蛋白胨、胰蛋白胨、鱼蛋白胨、酪蛋白 第2 章植物乳杆菌产e p $ 条件的优化 胨，发酵培养植物乳杆菌。采用旋转蒸发仪将发酵上清液浓缩到1 3 体积，经截留 1 4 0 0 0 分子量的透析袋透析1 0 小时后，加入发酵上清液3 倍体积的乙醇4 。c 冰箱 中过夜，将沉淀得到的粗多糖加1 0 0 m l 蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在4 9 0 n m 处测定e p s 产量。 ( 3 ) 葡萄糖添加量对植物乳杆菌e p s 产量的影响 在m r s 培养基中分别选取1 、2 、3 、4 、5 、6 和7 的葡萄糖添加 量，发酵培养植物乳杆菌。采用旋转蒸发仪将发酵上清液浓缩到1 乃体积，经截留 1 4 0 0 0 分子量的透析袋透析1 0 小时后，加入发酵上清液3 倍体积的乙醇4 。c 冰箱 中过夜，将沉淀得到的粗多糖加1 0 0 m l 蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在4 9 0 n m 处测定e p s 产量。 ( 4 ) 蛋白胨添加量对植物乳杆菌e p s 产量的影响 在m r s 培养基中分别选取o 5 、1 o 、1 5 、2 0 和2 5 的蛋白胨添加量， 发酵培养植物乳杆菌。采用旋转蒸发仪将发酵上清液浓缩到1 乃体积，经截留1 4 0 0 0 分子量的透析袋透析1 0 小时后，加入发酵上清液3 倍体积的乙醇4 。c 冰箱中过夜， 将沉淀得到的粗多糖加1 0 0 m l 蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在4 9 0 n m 处测定e p s 产量。 ( 5 ) 硫酸锰浓度对植物乳杆菌e p s 产量的影响 在m r s 培养基中分别选取0 0 0 2 、0 0 0 4 、0 0 0 6 、0 0 0 8 和0 0 1 的m n s 0 4 发酵培养植物乳杆菌。采用旋转蒸发仪将发酵上清液浓缩到1 3 体积，经截留1 4 0 0 0 分子量的透析袋透析1 0 小时后，加入发酵上清液3 倍体积的乙醇4 。c 冰箱中过夜， 将沉淀得到的粗多糖加1 0 0 m l 蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在4 9 0 n m 处测定e p s 产量。 ( 6 ) 发酵时间对植物乳杆菌e p s 产量的影响 在m r s 培养基中设发酵时间分别为2 0 h 、2 4 h 、2 8 h 、3 2 h 、3 6 h 、4 0 h ，发酵培 养植物乳杆菌。采用旋转蒸发仪将发酵上清液浓缩到1 3 体积，经截留1 4 0 0 0 分子 量的透析袋透析l o 小时后，加入发酵上清液3 倍体积的乙醇4 。c 冰箱中过夜，将 沉淀得到的粗多糖加1 0 0 m l 蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在4 9 0 n m 处测定e p s 黑龙江大学硕士学位论文 产量。 ( 7 ) 接种量对植物乳杆菌e p s 产量的影响 分别将种子液以1 、2 、3 、4 、5 的体积比接入m r s 培养基中，发酵 培养植物乳杆菌。采用旋转蒸发仪将发酵上清液浓缩到1 3 体积，经截留1 4 0 0 0 分 子量的透析袋透析1 0 小时后，加入发酵上清液3 倍体积的乙醇4 。c 冰箱中过夜， 将沉淀得到的粗多糖加1 0 0 m l 蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在4 9 0 n r n 处测定e p s 产量。 ( 8 ) 发酵温度对植物乳杆菌e p s 产量的影响 在m r s 培养基中设发酵温度分别为2 2 、2 6 、3 0 、3 4 、3 8 、4 2 ， 发酵培养植物乳杆菌。采用旋转蒸发仪将发酵上清液浓缩到1 3 体积，经截留1 4 0 0 0 分子量的透析袋透析1 0 小时后，加入发酵上清液3 倍体积的乙醇4 。c 冰箱中过夜， 将沉淀得到的粗多糖加1 0 0 m l 蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在4 9 0 n m 处测定e p s 产量。 ( 9 ) 发酵起始p h 值对植物乳杆菌e p $ 产量的影响 在m r s 培养基中设发酵起始p h 值分别为4 、5 、6 、7 、8 ，发酵培养植物乳杆 菌。采用旋转蒸发仪将发酵上清液浓缩到1 3 体积，经截留1 4 0 0 0 分子量的透析袋 透析1 0 小时后，加入发酵上清液3 倍体积的乙醇4 。c 冰箱中过夜，将沉淀得到的 粗多糖加1 0 0 m l 蒸馏水溶解，采用苯酚硫酸法在4 9 0 n m 处测定e p s 产量。 2 1 2 5 发酵条件显著因子的筛选 以葡萄糖含量、硫酸锰含量、蛋白胨含量、p h 值、发酵时间、接种量和发酵 温度为因子，采用7 因素2 水平的p l a c k e t b u r m a n 的实验设计，筛选对胞外多糖 产量影响显著的因素。试验设计见表2 - 1 。 第2 章植物乳杆菌产e p