（有机化学专业论文）ace抑制剂合成新路线及其类似物的计算机辅助设计.pdf

郑州大学硕士学位论文 前言 心血管疾病已成为严重危害人类健康的主要疾病之一。因此，研究开发心 脑血管疾病的预防和治疗药物显得十分重要，开发上市的品种逐年增多，在全 世界医药市场的销售中，心脑血管类药物已占到销售总量的1 8 。 治疗心脑血管疾病的药物主要有以下几种类型：p 受体一阻断剂，c 【受体- 阻断剂，血脂调节剂，抗血栓形成和溶血栓剂，利尿剂，钙拮抗剂和血管紧张 索转化酶抑制剂等。其中血管紧张素转化酶抑制剂( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n g e n z y m ei n h i b i t o r , a c e i ) 虽然问世时间不长，但发展非常迅速，现已有2 2 种 a c e l 上市( 表t ) 。近来研究发现，a c e 不但能有效降低血压，而且还可改 善认知功能，对并发性糖尿病、心绞痛、充血性心力衰竭和肾性高血压都有显 著的疗效。为了进一步开发疗效更好的新a c e i ，人们对于a c e 和a c e i 本 身和它们的相互作用进行了大量的研究。 表1 已上市的a c e i 序号名称上市时间 1 c 5 0 ( n m ) 第3 页 曲心8啪”加牝嘲们9 3 1曼“拍一徘愀稀袢嘲嗍|蓦群嗍群蜘群州群一 郑州大学硕士学位论文 一。一 一、a c es a c e i 血管紧张素转化酶( a c e ) 能催化水解血管紧张素i ( a n g i o t e n s i n i ，a n g i ) 雨3 a c e i 。a c e 还有降解神经激酞和p 物质的作用，它存在于许多组织，以肺循 环最为丰富伫1 。 对于心血管疾病，目前普遍认为主要的机制是前肾素一血管紧张素以及激 肽原在体内的转变过程f 3 1 。肾素( 血管紧张肽原酶) 刺激血管紧张素原释放一 种非活性的10 肽，血管紧张素i 。在血管紧张素转化酶的作用下，通过脱去c 端h i s l e u 二肽，由a n g i 转化成为有生物活性的血管紧张素i i ( a n g i o t e n s i ni i ， a n g i i ) ，后者是已知最强的收缩血管物质之一。a c e i 是通过与a c e 作用而使 a n g i l 的生物合成得到抑制，从而达到降压的效果。同时，由于a c e i 对肾素 血管紧张素系统( r e n i n a n g i o t e n s i n s y s t e m ，r a s ) 的作用，a c e i 在临床上的应 用十分广泛。 二、a c e i 的临涑应甬懈s l 1 9 7 7 年第一种a c e i 卡托普利( c a p t o p r i l ，1 ) 间世以来，a c e i 广泛地应用 于临床，取得了良好的疗效。a c e i 按化学结构可分为含巯基、羧基和磷酰基 三类，按其药代动力学则可分为长效、中效和短效，含羧基和磷酰基药物除培 托普利( p e n t o p r i l ，1 2 ) 为中效外，均属长效制剂；前体药因需在体内代谢后才 逐渐达到高峰血浓度，半衰期长，亦为长效药，含羧基的a c e i 除赖诺普利 ( 1 i s i n o p r i l ，8 ) 外均为前体药。依那普利( e n a l a p r i l ，6 ) 是长效药的常用者，口服 后主要在肝内转变为e n l a p r i l a t e 才具活性，显示药效约需4 小时，每目服用1 2 次即可，仅经肾排泄，故在肾功能不全病人应用时应减量，既经肾又经肝排 泄的a c e i 均为长效制剂，用于肾功能不全的病人比较安全，含羧基的雷米普利 ( r a m i p r i l ，1 1 ) 、含巯基的佐芬普利( z o f e n o p r i l ，4 ) 和含磷酰基的福辛普利 ( f o s i n o p r i l ，2 1 1 均属此类。 a c e i 最早被用于治疗各种高血压，尤其适用于治疗并发充血性心力衰竭 和糖尿病肾病的高血压。最近来自英国g l a s g o w 大学的一项为期1 6 年共有5 0 0 0 多名高血压患者和两组对照人群参加的血压临床研究指出，a c e i 在高血压的 治疗上能够提高患者的存活率，可减少2 5 的全原因死亡率，对于冠脉疾病和 所有的脉管病的死亡率a c e l 分别减少了3 5 _ ；f u1 6 。a c e i 可扩张血管，降 低其阻力，不论是原发性或继发性高血压均可作为一线药物应用，可取得良好 的降压效果。 原发性高血压不论血压升高程度和血浆肾素活性( p r a ) 水平，应用a c e i 均 有降压作用，单独应用可使5 0 6 0 高血压病人转为正常，加用利尿药则增 高至8 0 9 0 ，少数顽回病人加用钙通道或p 受体阻滞剂也能奏效，长期用 药可使血管与左室肥厚逆转，壁腔比值降低，减少日后心衰及其他并发症的发 生，且不影响左室功能，亦不增加心脏负荷和心肌氧耗，这是优于其他血管扩 张药物之处，a c e i 和p 阻滞剂均可减慢心率，两药合用时宣减量。a c e i 降低 收缩压的作用大于降低舒张压，故既适用于青年，也适用于老年，尤其是收缩 第4 页 郑州大学硕士学位论文 _ 一 期高压的患者。 继发性高血压中的肾血管性高血压( r v h ) 可分为急性型和慢性型，肾动脉栓 塞属急性型，较少见，这种病人像g o l d b l a t t 的动物模型一样，患肾和其他器 官中的r a s 都被激活，血压升高等病理生理改变依赖于显著升高的肾素和 a n g i i ，用a c e i 有很好的降压作用，常见的。肾动脉硬化、大动脉炎和纤维肌性 增生所致的r v h 发展徐缓，确诊时已属慢性型，p r a 可降至正常，a n g l i 亦 明显降低，高血压的维持则与继发性改变，如水钠潴留、血容量增加、对侧肾 硬化、心血管增生肥厚和交感神经张力增强有关，这种病人的内科治疗不能仅 用a c e i ，而应综合应用限钠利尿、b 或a 受体阻滞剂和钙通道阻滞剂，即能 收到降压效果。a c e i 与其他类降压药联合应用还可明显降低剂量依赖性的不 良反应。孤肾和双侧肾动脉狭窄由于缺少“正常肾”的代偿与调节，a c e i 可 使肾小球滤过率( g f r ) 降低，肾功能恶化，故禁忌使用。肾实质性高血压病人 服用a c e i 可降低血压并减轻肾小球的进行性损伤，但易引起低血压，故宜减 少剂量，并选用经肝肾排泄的a c e i 。 近期由欧洲4 9 家医疗中心进行的a i p r i ( t h ea c e ip r o g r e s s i v e r e n a l i n s u f f i c i e n c y ) 试验显示：贝那普利与安慰剂相比，贝那普利组血肌酐翻倍的危 险性总体上降低5 3 ，其中轻度肾功能不全亚组降低了7 1 ，中度肾功能不全 亚组降低了4 6 。组成r a s 的所有基因都具有多态性，由于各人的基因组成 不同，因此对acei 的反应也有所不同。其中最常见的就是a c e 基因的缺 失或插入型( d d 型、l d 型、1 1 型) 。h a s k 等人报道，a c e i 对非胰岛素依赖型 a c e d d 基因型糖尿病患者比对a c e i i 和i d 基因型患者的抗蛋白尿作用更加 敏感。a c e i 可扩张肾动脉及其肾内分支，降低阻力，增加供血，消除肾小球 内高压力、高滤过，抑制肾小球系膜和基底膜增生肥厚，用于肾脏疾病可降低 血压，减少蛋白尿和延缓肾硬化发展，有时还能改善肾功能，曾用于治疗急性 肾炎，慢性肾衰、原发性肾病综合征，都取得一定效果。它还能预防流行性出 血热和硬皮病所致的急性肾衰。糖尿病性肾病不论有无高血压，应用a c e l 后 能增加胰岛素的敏感性，降低血糖，保护肾功能，推迟并发症的发生。由此可 见a c e i 是治疗肾实质性疾病的重要药物。 充血性心力衰竭( c h f ) 的治疗第一线药物为洋地黄类和利尿剂，但在c h f 时肾血流量( r b f ) 降低，交感活性增高、利尿、低钠等均可使r a s 激活，a n g i i 和醛固酮增加，致血管收缩，血容量增多，左室排空受阻，心排血量降低，加 用a c e i 必然有益，尤其在左室肥厚舒张功能不全时更宜早期应用。a c e i 治 疗c h f 可在1 3 月内改善心功能，表现为心率减慢、心脏指数( c i ) 、心搏指 数( s i ) 、心搏作功指数( s w i ) 增加，前后负荷降低，心室充盈压降低，症状改 善，疗效维持时间长，在1 5 年以上，且可减少心率失常的发生，缩短住院期， 延长寿命，降低死亡率，疗效为7 0 8 0 ，停药后不产生血液动力学的反 跳。心衰患者临床研究表明，a c e i 可延长c h f 患者寿命及降低病死率，a c e i 组较对照组左心功能明显改善，运动耐力较长。许多试验都证实了a c e l 可以 第5 页 郑州大学硕士学位论文 在很广的范围内降低心力衰竭患者的死亡率。 急性心肌梗死( a m i ) 病人有明显的r a s 激活，a n g i i 水平可增高达8 倍， 在治疗时应用a c e i 非常必要。a c e i 治疗a m i 的作用与下列因素有关：能防 止冠状动脉痉挛，改善心肌供血；能增加冠状动脉血流量，减轻心脏负荷而降 低氧耗，呈现明显心肌保护作用，能抑制血小板聚集，促进前列腺环素( p h i z ) 之合成，强化内皮舒张因子的作用，从而减轻心肌缺血；可清除氧自由基，防 止脂质过氧化的作用：可减少再灌注诱发的心功能障碍与室性心律失常；可防 止心肌梗塞后梗死膨展和左室重构的发生，降低急性期的病死率、心力衰竭、 心率失常的发生率和再梗死率，a c e i 为a m i 的治疗开辟了前景看好的新途径。 左心肥厚( l v h ) 是心血管疾病病死率增加的独立危险因素，a n g l l 通过直 接作用于心肌和增强交感神经活性而促进l v h ，a c e i 能降低压力负荷，拮抗 a n g i i 刺激生长的作用；延迟左室肥厚发生或使左室肥厚逆转。 肾小球傍器增生( b a r t t e r 综合征) ，血管性头痛、周期性水肿、类风湿性 关节炎用a c e i 治疗均有效，肾素分泌瘤手术前要用a c e i 进行准备以降低术 中风险，a c e i 还是一种治疗肾移植后红细胞增多症的安全而有效的药物。 三、a c e i 的副作驴、7 1 a c e i 作为一线心血管疾病类药物应用于临床后，不良反应的报道不断增 力订。 呼吸系统最常见的a c e i 不良反应是持续性干咳，甚至有时患者因不能忍 受，不得不停药。通过更换不同的a c e i 可消除药源性咳嗽。干咳发生率不同的 a c e i 各有差异但与剂量、疗程以及原有疾病密切相关。如l 干咳发生率为 2 6 、6 为2 9 、8 为3 5 、为4 o 、15 为2 o 、1 6 为1 4 、18 为3 5 、 1 9 为1 2 、2 1 为2 2 。亦有报道6 等会引起肺浸润，可致喘息和呼吸困难， 加重或诱发哮喘。服用a c e i 时，还有恶心、呕吐、口干、腹痛、腹泻等消化 系统副作用时有发生。卡托普利的味觉障碍发生率非常高。 上述a c e i 的不良反应，经过长期临床实践并改善给药方案已明显减少， 目前临床上主要的不良反应是干咳。干咳的特点是持续性和停药后易恢复性， 目前没有好的办法加以解决。 四、a c e i 劈绣厢劳席【8 l a c e i 可降胆固醇、甘油三酯，升高血高密度脂蛋白，有抗血管硬化作用， 对糖尿病也有良性影响。第二、第三代a c e i 无中枢神经系统不良反应，不引 起低血钾，反射性心动过速，高血压反跳，剂量适当时长期应用并无毒性，老 年人也能耐受，是治疗心血管和肾脏疾病的好药。a c e i 的应用应从小剂量开 始，逐渐增加以确定最低有效量，增量达到一定程度后效果并不增加，毒性却 明显增加a 过去a c e i 所出现的毒副反应多由于剂量过大所致，心肾功能不全 病人用药剂量宜小于高血压病人，联合用药可增强疗效、减少剂量、降低不良 反应。 第6 页 郑州大学硕士学位论文 五、计算枧在薪药设计中豹应爝”。嘶 计算机辅助药物设计( c o m p u t e r a i d e dd r u gd e s i g n ，c a d d ) ，是以计算机作 为工具，采用各种理论计算方法和分子图形模拟技术，根据积累的大量有关结 构和功能的资料，设计具有一定药效的新分子。由于分子图形学的发展以及三 维图形工作站的出现，计算机辅助分子设计的技术日益便利。现在已经有许多 可用于分子模型及分子设计的软件包，使药物发现过程缩短，效率提高。 c a d d 可分为直接和间接两种方法。如果受体的三维结构已经揭晓，或可 根据同源蛋白建模，则可根据受点的三维要求直接设计新药的结构。配基对接、 3 d 数据库搜寻和从头设计是直接药物设计几种主要的策略。由于大部分受体 结构尚未阐明，只好在一系列配基结构的基础上，通过活性类似物方法( a c t i v e a n a l o ga p p r o a c h ) 进行构象研究。计算机辅助药物设计的专家系统是一种常用 的方法。首先搜索各个化合物的低能构象( 目前越来越注重活性构象) ，然后 按照一定的规则进行构象重叠，以求得在这一系列化合物中可以重叠的构象， 或者运用比较分子场( c o m f a ) 方法模建药效基团模型用于虚拟受体图像再进 行分子设计，因此称为间接药物设计。 本文主要是间接药物设计。通过对致咳机制与a c e i 的作用机制的研究， 用活性类似物法建立了激肽酶模型，在计算机地帮助下设计了四种具有a c e 抑制效应，干咳副作用较小的新化合物。 六、a c e l 的台戒 早期a c e i 来自于蛇毒分离的酞。1 9 6 5 年f e r r e i a 等从蛇毒中分离到九酞替 普罗酞对a c e 有特异性抑制作用，曾以注射剂形式应用于高血压治疗。它口 服无效，且价格昂贵。o n d e t t i 合成了口服有效的非多肽类酶抑制剂巯甲丙脯 酸( 1 ) 。p a t c h e t t 等继巯甲丙脯酸开发后致力于合成比它稳定且无与巯基有关的 副作用的a c e i 。本文认为在所有的已上市的2 2 种a c e i 中，n 羧烷基二肽型 a c e i 较有发展前景( 下文将有论述) 。所以，它们是本文的研究重点，巯基， 磷酰基a c e i 的合成这里不再做讨论。 n 羧烷基= 肚 研断法a 卜1 一 切断法b 卜一 高暮丙氮馥 圈1 n 一羧烷基二肽型a c e i 都是光学纯的多手性中心化合物，1 扪，其中n 一羧 烷基部分中的手性中心都是s 构型。除赖诺普利外，其余这类药物都是乙酯前 第7 页 厂 郑州大学硕士学位论文 药。除培哚普利含2 氨基戊酸外，其余这类药物都含有高苯丙氨酸( 2 一氨基一4 - 苯丁酸) 结构部分。根据它们的结构特征，以新手性中心的构建方法为合成策 略的核心，对n 一羧烷基二肽有两种基本的逆合成分析切断法( 图1 ) 。按切断法 a 可得到n 羧烷基和二肽两部分，该法的核心反应是构建n 一羧烷基中s 构型 的手性中心。按切断法b 可得到高苯丙氨酸等两部分，该法的核心反应是构建 氨基酸残基中s 构型的手性中心。在此以依那普利为例，围绕新手性中心的构 建方法，按切断法分类，综述n - 羧烷基二肽型a c e i 的合成。 l 以构建n 羧烷基部分中s 构塑钓手性中心为核心的合戏法( 切甄法a 1 1 1 非对映选择性m i c h a e l 加溅反瘦合成法 在乙醇中反式化合物a 和s 一丙氨酸苄酯，于室温和三乙胺催化下定量地进 行非对映选择性m i c h a e l 加成反应，得到占优势的( s s ) 构型的b 1 及少量的( r s ) 构型的非对映异构体b 2 。由于它们在乙醇中的溶解度不同，b l 结晶析出而与 b 2 分离，收率约6 0 ；母液经处理又得b 1 ，总收率达7 7 。b l 于室温下在冰 乙酸一浓硫酸体系中经过钯炭催化氢化转化为c ，收率9 1 。使用光气通过n 一 羧酸酐( n c a ) 法使c 与s 一脯氨酸缩合，即得6 ( 图2 ) 。c 是重要的通用中间体， 通过c 与其他相应的氨基酸缩合还可分别合成1 1 、盐酸喹那普利( q u i n a p r i l ，15 1 、 盐酸莫昔普利( m o e x i p r i l ，1 6 ) 、盐酸螺普利( s p r i r a p r i l ，9 ) 和群多普利f t r a d o l a p r i l ， 1 3 ) 等一系列n - 羧烷基二肽型a c e 抑制剂。 o 一八 p d g y , h 2 0 p h 。1 。+ 一 h o a e - h i s0 o p h e i o h 目，n 口蚰 ! ! ! l 皇! ! 竺苎苎竺弓来酝侬目睹利 6 由2 缺点：羧基需要加保护基，脱保护基。氢化还原要在强酸条件下进行，不 易处理且对设备腐蚀较大。 1 2 菲对映选择性还曝胺化台戏法 2 氧代- 4 - 苯丁酸乙酯和光学纯二肽，在3 a 分子筛和催化剂存在下，在 o 2 8 m p a 氢气下，于2 5 。c 经s c h i f f 碱进行还原胺化制备( s s s ) 构型的依那普利 ( 图3 ) 。 运用本方法合成的n 一羧烷基二肽型a c e i 有盐酸贝那普利( b e n a z e d r i l ， 1 9 ) n a b h 3 c n ，( s s ) ：( r s ) 2 7 0 ：3 0 ，( s s ) 收率2 5 ，地拉普利( d e l a d r i l ， 1 0 ) r a n e y 镍，( s s ) ：( r s ) = 8 ：l ，( s s ) 收率6 1 】和培哚普利( p e r i n d o p r i l ， 1 4 ) n a b i - t 3 c n ，收率g o ，( s s ) ：( r s ) = 6 5 ：3 5 1 等品种。 第8 页 邦州大学硕士学位论文 f “c i o o hh 催化剂 l v ，+ c s ，a l ”，“s p m “n e _ ：；。：；：； 缺点：光学异构体需要进行拆分。还原时需要使用毒性较大的n a b h 3 c n 。 1 3 立体特异性s n z n - 雳忧反悫合成法 光学纯的r 构型的三氟甲磺酸酯d 和( s s ) 构型的二肽，在三乙胺存在下进 行立体特异性s n 2 n - 烷化反应，翻转d 中r 构型的手性中心，再经氯化氢脱叔 丁基得t l ( s s s ) 构型的6 ( 图4 ) 。 本合成法利用三氟甲磺酸酯作为离去基团，对两个光学纯化合物间进行的 s n 2 n 烷化反应进行手性控制，以实现基本完全的构型翻转，构建n 一羧烷基中 手性中心所需的s 构型。运用此方法合成的n 羧烷基二肽型a c e i 尚有西拉普 利( c i l a z a p r i l ，1 7 ) 、替莫普利( t e m o c a p r i l ，2 0 ) 暑u8 等。 一 + ( s ) a 1 姐y _ ( s ) 轧l 。兰! ! ! 6 。人。航 缺点：本法的关键中间体光学纯d 有多种合成方法，但它们的共同缺点是 反应步骤多，并且需要拆分。 1 4 通过分离等量非对映异构体获褥所需手性结构的合成法 消旋的a 溴苯丁酸乙酯和l 丙氨酸叔丁酯，在乙腈中于三乙胺存在下缩 合得到等量非对映异构体混合物e 。e 在饱和的氯化氢的二氯甲烷溶液中被转 化为盐酸盐f 。利用溶解度的差异分离出所需( s s ) 构型的f 1 ，再经中和、重结 晶得到前面1 1 中所述的光学纯的重要中间体c ( 图5 ) 。以苯甲醛、s 丙氨酸和 氰化钠为原料，按相同的合成方法得到了类似的结果，制备了6 。 缺点：本合成法构建新手性中心的反应没有立体选择性，只有一半物料被 利用，不利于工业化生产。 li 风w 、+ 。州人。啪。丽 e 1 0 2 。人。 p h e 警。仉爻人 一。旦。 第9 页 郑州大学硕士学位论文 2 | ； 构建氨基酸残基中的手性中心为核心的合成法i 切颤法b ) 将通过酶促转氨基反应得到的光学纯的g 与r 构型的光学纯的h ，于7 5 在二甲亚砜中于三乙胺存在下进行s n 2 n 烷化反应，得蛰( s s s ) 构型的6 的前体 i ，收率7 6 ( 图6 ) 。通过这步立体特异性反应构建丙氨酸残基中s 构型的手性 中心，是本法的关键所在。运用本策略合成了咪达普利( i m i d a p r i l ，7 ) 。 p h 。，。l 、 丐i i i e c o c c n h 0 图6 综上所述，a c e i 的合成方法绝大多数采用逆合成分析切断法a ，这是由 于它可以利用天然氨基酸引入所需手性中心，利用可靠的立体选择性反应构建 新手性中心，但脱保护基、拆分和毒性f = 3 题却一直困绕着这些方法，而b 切断 法则涉及特殊原料和专属性酶促反应。本文采用a 切断法，重新设计了合成路 线，解决了此方法面临的大多数主要问题，使这类化合物合成变得十分简单、 便利。 第1 0 页 d ：；吖 。 l ；八 一 郑州大学硕士学位论文 一 新化合物设计 a c e i 主要不良反应干咳影响了其在临床上的应用，也影响了新药的开发。 为解决这一问题，首先要对a c e i 与其受体a c e 结构及它们的相互作用关系有 一个较深入认识，同时干咳发生机制的研究也是必不可少的，只有这样才能设 计开发出疗效确切、副作用较少的a c e i 。 一研究现状 1 9 3 4 年g o l d b l a t t 将实验动物一侧肾动脉缩窄即可引起高血压，19 4 0 年 p a g e 等发现了血管紧张素系统，初步阐明了r v h 和许多心血管和肾脏疾病的 发病机制，半个多世纪过去了，这方面的研究有很大的进展，有些是认识和观 念上的更新，在这些新理论指导下，新药不断涌现，治疗方法也更加丰富而合 理，从而使相关疾病的疗效得以明显提高。这其中对r a s 的认识显得尤为突 出。r a s 包括肾素( r e n n i n ) ，血管紧张素原( a t o ) ，a c e ，a n g 口、a n g 口。r a s 是细胞外液量和血压的调节系统，在调节肾小球血流动力学中起关键作用。通 过干扰r a s 来治疗高血压等疾病是本文新化合物设计的基点。 1 r a s 简介 j j a t o l l 3 l a t o 是存在于血清中的较为丰富的球状糖蛋白，由4 5 2 个氨基酸组成。从 a t o c d n a 序推知a t o 含有两种信号肽，分别由2 4 个及3 3 个氨基酸组成。体 内a t o 以两种形式存在，即高分子量a t o ( h m r a ) 和低分子量a t o ( l m r a l 。 h m r a 存在于血浆及羊水中，约占a t o 总量的3 7 ，但在孕期妇女含量明 显升高，约1 2 6 1 ，所以妊娠期易并发高血压。a t o 与c c 抗胰蛋白酶具有 同源性，均属于血清蛋白酶抑制物超级家族。 j 2 绔荣肛1 又称血管紧张素原酶，是种蛋白水解酶。a t o 是肾素唯一底物，在肾素 作用下，其n 端l e u l 0 与v 引1 1 之间肽键断裂，裂解出无生理活性1 0 肽的a n g i 。肾素的具体化学结构还不清楚。 j 3a c e i t 4 i 图7 t a t i v ea c t i v e e 第1 1 页 郑州大学硕士学位论文 一一一 a c e 是一种膜固定的金属蛋白酶，它能催化水解a n gi 。a c e 还有降解 神经酞和p 物质的作用，它存在于许多组织，以肺循环最为丰富。由于它是一 个脂蛋白酶，因而使得它的结构和氨基酸组成难以测定。近年利用c d n a 克隆 技术已经测出人体a c e 的全部氨基酸序列，它含有1 3 0 6 个氨基酸。从图7 我 们可见a c e 的羧基端贯穿双磷脂膜而被束缚。 a n gi 与a n g i i 作用与结构都相对简单，这里不再论述。系统图解如下( 图 8 ) 。 i 2 3 4 567 891 0 1 11 2 1 3 a t o a s p a r 9 一v a i r y r 一e h i s p r o p h e h s l e u v a i l i e 一s 一蛋白质 肾素 a n g l a s p a r g v a i _ _ t y r 一e h i s p r o p h e j - h i s - - l e u a n g l la s p a r g v a i ly r l i e h l s - - p r o - - p h e 图8 2 a c e i 豹结构特意u m 干扰r a s 可从多方面入手，如抑制肾素、a c e ，拮抗a n g i i 受体。由于 肾素与a t o 作用的结构部分比较复杂，所以对其三维结构的研究就目前来说 几乎是不可能的。抑制肾素必将是未来之路。拮抗a n 9 1 i 受体的研究已经开始， 并有制剂上市，但从结构上讲还不具备真正的规律性，因为其受体的研究还是 初级阶段。a c e 结构虽不十分明确，但10 肽的a n gi 结构却已确定，而且a n g i 与a c e 的作用部分主要是一个c 段二肽残基，研究相对简单。所以抑制a c e 仍是治疗高血压等心血管疾病一条不错的可行之路。 2 1a c e i 的作用枫铡 自从o n d e t t i 报道从蛇毒提取出第一个a c e i 以来，有关a c e i 的研究得到 了飞速的发展。a c e i 能够抑制a c e 活性使a n gi 无法转化为a n g i i ，进而抑 制醛固酮的合成，并能够抑制舒缓激肽的水解作用，从而可以从两个方面降低 血压。市售a c e i 几乎全是乙酯化前体药，在体内水解后，释放出活性成分二 羧体，与a c e 结合发挥抑制作用。 2 。2 a c e i 的结构特点 a c e i 从结构上可以分为三类( 图9 ，1 0 ) 。他们结构上的区别，也是它们 药效基团的区别。 虽然这三类a c e i 都有良好的疗效，但也有明显的副作用。其中以第一种 和第三种各自特有的副作用较为严重( 味觉障碍与血管性水肿) 。三者共同的 不良反应即是干咳。昧觉障碍是由于含硫巯基对味蕾影响造成的，巯基是功能 基团，所以此问题无法解决。而血管性水肿原因尚不清楚。 第1 2 页 邦州大学硕士学位论文 第一代a c e f ”七n q 。 4 第二代a c e i b 0 0 c 2 0 0 h 5 3 8 图9 第】3 页 啦 峙 川q 吖 溆。 夕l qq 双 吝- k (， 9 郑州大学硕士学位论文 一 第三代a c e i 图1 0 3 f 咳成哥“i 现在己认识到，干咳的发生机制是a c e i 抑制了激肽酶活性，使神经激肽 ( n e u r o k i n i n s ，n k ) 无法水解失活，造成激肽、p 物质、前列腺素在体内的聚积 ( 尤其是在肺部) ，从而增强了咳嗽反射，使药物所致咳嗽增多。激肽( 在哺 乳动物体内称为神经激肽) 是一类生物神经肽，主要作用是内脏平滑肌收缩、 刺激性干咳、痛觉传导炎症、交感及副交感兴奋等。 本文认为对a c e i 结构的特定改造是可以消除这一不良反应的。通过第二 类a c e i ( 即n 羧烷基二肽型a c e i ) 结构的改造加强其选择特异性，即只阻 止a n gi 到a n g i i 的转变，而不影响激肽的水解，从而达到既实现a c e 抑制 效应，又不产生干咳副作用的目的。 为了避免改造的盲目性，必须为底物与其受体相互作用建立模型，并依据 由对a c e i 与其受体的研究推导出的定量构效关系( q u a n t i t a t i v e s t r u c t u r e a c t i v i t yr e l a t i o n s h i pf o r m u l a ，q s a r ) 1 对所设计的新化台物生物活 第j 4 页 郑州大学硕士学位论文 性进行了预测。 = 、耨纯食物设计 综前所述，新化合物首先是一个a c e i 类似物，通过提高对a c e 的选择性， 避免抑制激肽酶从而达到降低副作用同时保持疗效的目的。 事实上，催化缓激肽降解的激肽酶与a c e 是同一种酶。a c e 有两个同源 性的活性区域，分别被称为c 区和n 区f ”，伸j 。c 区负责催化a g i 转化为a g i ， n 区承担催化缓激肽的水解。a c e i 对a c e 的c 区和n 区的亲和力不同，有 的a c e i 选择性抑制c 区，而对n 区影响较小，致使缓激肽水平降低，干咳的 反应也相应减少。c 区和n 区虽为同源性，但它们的空间相对位置关系尚不清 楚。不过这并不影响对二者的区分。 1 c 区和n 区的差异 a c ec 区的研究由于发展a c e i 的需要而比较快，已有的研究结果表明c 区活性中心中含有一个金属z n ”、质子化的精氨酸和疏水空腔。活性中心是酶 对底物或抑制剂发生特异性作用的必需部位，同时还有些辅助部位可增加其 作用强度。a c e i 与a c e 作用的模型见下图( 图1 1 ，图中a c e i 为9 ) 。三维受 体模型也已建立( 图1 2 ) 。而且在此基础上导出了表征a c e i 生物活性与本身 结构特征之间相互关系的q s a r f ，如下： i 0 9 1 c = 4 7 0 6 0 0 4 0 e t l 7 1 ( c 为化合物产生指定生物效应的物质的量浓度，e 为a c e i 与受体模型之间 的相互作用能) s 为活性中心藏水空腔s is ；为辅助部位 豳1 1 a c e n 区的研究相对还是较落后，本文在此仅对其作了初步的研究。 n 区底物为激肽，是类末端有共同活性基团p h e x g 1 y l e u m e t n h 2 的 生物神经肽。n 区将激肽活性基团的某个肽键切断后，使其失活f - 们。作为c 区的同源活性区域，n 区活性中心切断肽键的任务，应也是由z n 2 + 来完成。 第1 5 页 郑州大学硕士学位论文 对临床上不同a c e i 干咳发生率与结构对比，发现干咳率较高的a c e i 都 含有c 端脯氨酸5 元环结构，如下所示：( 表2 ，图1 3 ) pi j ”州。 6 8 1 6 1 8 图1 3 1 9 第1 6 页 过 _ 射。 郑州大学硕士学位论文 但由于临床报告还不完备，不能对所有的a c e i 进行横向比较。但有几种 疗效特别好的a c e i 也有与干咳率高的a c e i 相似的结构特征，如7 、9 、】2 。 据此分析，造成这种疗效的突出的原因主要是这些a c e i 选择性差，都是既抑 制了a c e ，又抑制了激肽酶，使激肽无法水解从而使血管舒张，但却使激肽在 体内聚集。干咳率低的a c e l 分两种，c 端为6 元环状氨基酸和非环氨基酸。 现有的2 2 种a c e l 中c 端为非环氨基酸的( 2 ，1 0 ，1 9 ，2 0 ) 疗效都不理想，而 c 端为6 元环状氨基酸的( 15 ，1 6 ，1 7 ) 情况却正好相反。说明c 端为非环氨基 酸的a c e i 不仅与a c en 区结合力差，而且与a c ec 区的结合力也差。这应 是一种该淘汰的结构。而c 端为6 元环状氨基酸的a c e i 疗效好、副作用小， 这可能主要是由于它们的环更适于结合a c ec 区的辅助空腔s2 ，且极性越大 选择性越好。1 5 ，1 6 ，17 三种a c e i 极性大小顺序是1 6 i7 l5 ，疗效顺序为 1 6 17 1 5 。另外c 端为非环氨基酸的2 0 疗效明显高于其它三种，而起氨基酸 侧链却是一极性环这更说明了s2 应是一个极性的辅助部位。由此可以判定n 区活性中心至少具有一个大小、空间特异的疏水空腔。 在与激肽生物活性段的比较中，发现8 的二肽部分结构与激肽生物活性末 端极其相似( 图1 4 ) ，同时在其它部位结构相同的情况下8 比6 的致咳率由高 出了o 6 个百分点。所以，分析a c e n 区( 激肽酶) 很可能还有一疏水空腔与 激肽n 端第二序列氨基酸的异丁基支链对应。 通过将8 ，1 l 的二肽部分与激肽活性末端二肽最优构象的三维模型加以比 较，可以直观地理解上述对比推论( 图15 ) 。 r r r 图1 4 ，一一 一。 卜r l 。 于 i ：= 。 l 在第一代a c e i 中1 虽然只个疏水基团，却也表现了相当高的致咳率， 推测是因为1 与z n 2 + 发生了作用。若是z n 2 + 与巯基作用，则其所处位置无法完 成切断肽键的任务，这样就反向指明了z n 2 + 的位置是与羧基对应的。据此，可 以初步建立底物与a c en 区的相互作用示意图( 图16 ) 。 第1 7 页 邦州大学硕士学位论文 一一一。一 图1 6 综上所述，可知a c e n 区至少包含了两个邻近的空间不是太大的疏水空腔 和一个主要作用是切断肽键的z n “。据此，本文以激肽活性末端二肽最优构象 为参照为a c en 区建立了3 d 模型( 图1 7 ，右侧黑点为z n 2 + ) 及a c e i 与n 区作用的二维拓扑图( 图18 ，图中为l i s i n o p r i l ) 。 图1 8 图1 9 2 a c e i 的改造方向 提高a c e i 的选择性，须从两方面入手：增强a c e i 与a c ec 区的结合力， 减弱或消除其与n 区结合力，同时不能改变与c 区活性中心相作用的三个药 第1 8 页 一 1 c 一 1r 。li一-一i一1一 一 ， l r 郑州大学硕士学位论文 一 效基团( n 烷基疏水基团、n 羧基、二肽c 端氨基酸的羧基) 。 a c ec 区与n 区的主要区别在于z n 2 + 的作用位置，z n ”在n 区作用于底 物的c 端肽键，z n 2 + 在c 区作用于n 端肽键。如果加大a c e ic 端氨基酸残基 中氨基与羧基的距离，则必然可以减弱它与a c e n 区的亲和力( 图1 9 ) 。本文 认为可通过加大a c e ic 端氨基酸残基中氨基与羧基的距离而不改变a c e i 的 骨架来实现设计目的。 3 改造要求 若仅加大a c e i 的c 端氨基与羧基的距离，则改造相应变得简单，只需找 到合适的氨基酸换掉a c e i 的c 端氨基酸即可。 当然官能团移动后，必然对分子性质造成影响。为了消弭这种影响，根据 对现有a c e i 的比较研究，氨基与羧基的距离加大后的新c 端氨基酸应符合以 下条件已保持新化合物与a c ec 区的结合力。 移动距离尽量小。无论从现有a c e i 的结构来看，还是从构成人体的所有 氨基酸的结构来看，程氨基酸的生物活性都是最好的。所以，避免过大的移动。 环最好为6 、7 元多环。5 元环多是脯氨酸环的环类似物，具有相似的生物 活性，不宜使用。环也不宣过大，否则疗效反而下降，如1 9 i c s o ( n m ) = 2 4 1 。 加大苯环极性。加大苯环极性可以增加疗效。这种疗效的增加，不会带来 副作用，因为这里极性的增加只会提高对a c ec 区的选择性，如1 6 【i c 5 0 ( n m ) = 1 8 5 ) 】。同时，研究结果表明a c e 主要分布于细胞表面，它与底物 的相互作用是发生在外体液中的。底物极性的增加可以减弱对细胞膜的穿透 性，可使其更多的存在于外体液中增强其疗效，还可降低对细胞内部的干扰， 减少发生其他副作用的可能性。 限定羧基a 碳构象。a c e 对底物构型有特定要求，现有a c e i 的手性中心 都是s 构型饱和碳原子，且结构中包含环状氨基酸的疗效好于仅有非环状氨基 酸的。 按照以上条件，并加大氨基与羧基的距离最终得到目标氨基酸的基本结 构，如下图( 图2 0 ) 。 。 o r 为大体积基团。p 为极性基团 图2 0 p o r k ，r 3 ，轧= c i ，f 图2 l 0 第1 9 页 郑州大学硕士学位论文 三新他舍物实际结构的选定 1 g 标氨基酸实际结构的选定 目标氨基酸的实际结构可全新设计，也可从现存的化合物寻找。本文采取 了后者。通过筛选，最终确定了喹诺酮类化合物氟代或氯代4 一氧代一1 ，4 - 二氢 喹啉3 一羧酸2 0 2 1 ，2 2 ，2 3 】( 图2 1 ) 。 氟代或氯代4 氧代一1 ，4 二氢喹啉一3 一羧酸是非经典的b 一氨基酸，氨基与羧 基的距离较0 【氨基酸为大，同时又满足了四条改造要求。 氨基与羧基的距离仅加大了个双键。 环为6 元苯并环。 f 、c 1 原子使苯环极性加大，同时又是h 的生物电子等排体，尤其是f 原 子，半径与h 近似，除改变极性外，对环的生物活性影响极小。 双键与羰基的导入，使6 元环成为了刚性环，羧基的伸展方向被固定了。 2 薪化合物绩构 为给环赋予一定的极性，又不对环造成太大的影响，2 3 卤素原子的加入 较宜。所以本文最终选择了三种喹啉羧酸，并以它们作为二肽c 端氨基酸通过 计算机模拟出了目标新化合物i 、i i 、i i i ( n e wi ，n e w i i ，n e w i i i ) v j 结构及最 优构象3 d 模型( 图2 2 ) 。目标新化合物结构中二肽骨架比致咳率最高的1 1 长 了1 4 7 0 4 1 0 m 米，是1 1 的1 2 8 6 倍。 新化合物的设计以消除干咳为主要目标，虽然为保持其对a c ec 区的生 物活性也采取了相应措施，但是否有效尚需检验。另外，目标新化合物分子的 极性较大，为了利于人体吸收，提高生物利用度本文还设计了新化合物i v ( n e w ) ，即n e wi 的喹啉羧酸乙酯。 第2 0 页 郑州大学硕士学位论文 一 四、? 黧焉器通过3 d 模型对新化合物与现有a c e i 加以比 本节先是在计算机的帮助下通过 模型对新化台韧与批伺a l 乜1 u 以儿 较，以得到新化合物最直观的分子信息。再用q s a r f 来检验新化合物的理论 生物活性。 1 3 d 对比 这里在现有a c e i 中选取了疗效好，副作用小的15 i c 5 0 ( n m ) 5 3 ，致咳率 ( ) ：2 0 、1 6 i c 5 0 ( n m ) = 1 8 5 ，致咳率( ) = 1 4 】、1 7 i e5 0 ( n m ) 2 1 8 3 做为代表。 各化合物分子的3 d 优化是由m o p a c 7 0 应用p m 3 方法进行的半经验量子力学 优化( 图2 3 ) 。n e w l v 与n e wi 活性形式相同，不再单独讨论。 a c e in e w c o m p 通过对比，可以发现新化合物分子与现有的a c e l 分子的空间体积、形状 都非常相似。可以判断在与a c e 发生作用时，它们应有相似性。 2 q s a r fp - 算 本文选用文献【1 7 】中的受体模型， 新化合物分子与a c e 的相互作用能。 在u n i x 系统上采用p a k m 算法，算出 代入上文中的q s a r 方程式中，得出它 第2 1 页 郑州大学硕士学位论文 们的理论生物活性，并与现有的几种a c e i 加以对比( 表3 ) 。 计算结果表明，b 一氨基酸的引入并未导致活性下降，说明( 三) 1 中的限 制条件是成立的。另一方面，c 区活性中心与底物二肽c 端羧基对应的精氨酸 侧链的柔性较大，可能对c 端羧基的位置有一定的自适应性。 总的来说，新化合物的设计从理论上讲是成功的，具有相当的理论生物活 性。 表3 新化合物理论生物活性及其与几种a c e i 的活性对比 化合物专黧篙蚴篙泔算。篡m 雕0 1 2 - t 、i c 5 0 ( n m ) 一一! 竖! ! ! ! 笪!唑! ! ! ! ：! n e w l? 5 3 1 1 3 1 5 13 27 n e w l i? 5 2 9 9 0 n e w i i i 1 0 1 6 5 2 8 4 0 4 3 9 7 9 5 8 2 3 9 5 4 0 8 3 5 3 5 9 4 47 1 6 3 1 4 8 2 4 - 17 5 5 7 - 1 64 16 7 7 5 2 - 0 2 6 54 0 s 7 0 1 3 2 5 0 0 1 1 8 5 第2 2 页 郑州大学硕士学位论文 一一 新合成路线及新化合物的合成 、n 羧烷基= 歇型a c e l 的薪合成路线氆1 r 1 斟 k 0 c o o 一鬻9 k 0 o 本方法特点：反一4 一苯基- 4 - 氧代一2 一丁烯酸乙酯与s 丙氨酸的m i c h a e l 加 成不需要保护基的介入，也就省却了脱保护步骤。n ( s ) 1 一乙氧羰基3 苯基3 氧代一丙基卜( s ) - 丙氨酸