（动物学专业论文）牛孤雌多倍体胚与克隆多倍体胚胎的研究.pdf

原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除本文已 经注明引用的内容外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得凼墓直太堂及 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 日期： 在学期间研究成果使用承诺书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：内蒙古大学有权将学位论文的全 部内容或部分保留并向国家有关机构、部门送交学位论文的复印件和磁盘，允许编入有关数据库进行检索， 也可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编学位论文。为保护学院和导师的知识产权，作者在学期 间取得的研究成果属于内蒙古大学。作者今后使用涉及在学期间主要研究内容或研究成果，须征得内蒙古 大学就读期间导师的同意；若用于发表论文，版权单位必须署名为内蒙古大学方可投稿或公开发表。 学位论文作者签名：鱼盔缝 指导教师签名： 日期：丛丛：笸：篮 日期：塑丝笸：丝 内蒙古大学博士学位论文 牛孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的研究 摘要 在哺乳动物中，体细胞克隆胚胎能够发育成个体的成功率一直很低。即使 能够发育到妊娠后期，也往往出现胎儿巨大、胎盘异常等现象，从而影响克隆 动物生产效率。多倍体细胞主要参与胎盘等胚外组织的形成，将多倍体胚胎与 克隆胚胎聚合为一体进行移植，可以改善胎盘异常等引起的效率底下现象。因 此，多倍体胚胎的研究对于进一步了解克隆动物发育机理具有重要意义。本研 究采用免疫荧光染色、药物处理、孤雌激活、反向核移植等技术，研究了获得 孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的技术途径、分析了卵母细胞核的存在对体 细胞核重编程的影响，以便为进一步完善体细胞克隆技术提供实验依据。 1 、牛、山羊、绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞核和细胞骨架的动态学变化 在牛、山羊、绵羊卵母细胞体外成熟过程中，收集成熟不同时间的细胞， 通过对纺锤体微管、微丝和染色体的免疫荧光染色，分析了在整个体外成熟过 程中细胞核的成熟进程以及细胞骨架和染色体的动态变化。结果显示：牛和山 羊卵母细胞在成熟培养后的4 h 开始发生g v b d ，1 2 h 即有5 0 6 0 的卵母细 胞到达m i 期，1 6 h 到达a i t i 期峰值( 4 2 ) ，2 0 h 后牛和山羊分别有6 6 和 8 4 的卵母细胞进入m i i 期；绵羊卵母细胞核成熟进程略慢于牛和山羊，g v b d 发生的时间也是成熟培养后的4 h ，但达a i t i 期峰值的时间和发育为m i i 期的， 时间分别为2 0 h ( 5 0 ) 和2 4 h ( 7 6 5 ) ，均晚于牛和山羊；卵母细胞在体外 ”、 成熟过程中，其细胞骨架和染色体动态变化在三种动物基本相似，在部分绵羊 卵母细胞出现三级纺锤体等异常结构。 一 鱼壹坠生亟些童堡堡墅堕：皇壅堕兰堡堡墅堕塑婴壅 2 、细胞松弛素b ( c b ) 对牛卵母细胞减数分裂和二倍染色体卵母细胞形成的 影响 将牛卵母细胞置入含有c b 的培养液中培养后，分别观察了c b 的浓度和 处理方法对卵母细胞发育的影响，其结果是：( 1 ) 培养时间2 4 h ( 全程处理) ， c b 浓度2 0p g m l 时，卵母细胞的成熟率4 4 8 ，成熟卵母细胞的染色体 单倍性组成比例7 3 9 ，两者均显著低于对照组的8 3 1 和9 3 8 ；处理组 有5 0 以上的卵母细胞未排出第一极体( p b l ) ，其中的5 0 6 5 染色体为6 0 条，呈二倍性；处理的卵母细胞中出现纺锤体形态异常、两个纺锤体、6 0 条 染色体组成超大纺锤体等现象。( 2 ) 在培养时间6 8 h 分别添加7 5 肛咖l 和1 5 x g m l 的c b 预处理，然后移到无c b 的培养液中继续培养至2 4 h ，其结果卵母 细胞的成熟率约为8 0 ，与对照组的8 3 没有显著性差异，将预处理时间延 长到1 0 h 使成熟率显著降低( 6 0 ) 。( 3 ) 在未处理培养液中培养1 0 h ，然后转 移至含有3 0 7 5 t g m lc b 的培养液中继续培养到2 4 h ( 后处理) ，结果只有 4 1 5 7 2 的卵母细胞排出p b l ，其余5 8 5 9 2 8 没有排除p b l 。( 4 ) 在无c b 的培养液中培养1 0 h ，然后移至含有7 5g g m lc b 的培养液中分别培养至2 4 h 、 3 0 h 、3 6 h 、4 8 h ，进行免疫荧光染色，观察卵母细胞所处核相，结果是3 0 h 以 上处理组a i t i 期卵的比例为1 9 6 4 ，显著低于2 4 h 处理组的1 5 3 ，而多 数为由6 0 条染色体组成的巨大纺锤体细胞。 以上结果表明，c b 可能破坏纺锤体结构，从而抑制p b l 排出，降低卵母 细胞成熟率，导致二倍染色体( 2 n 或4 c ) 卵母细胞的形成。 3 、细胞松弛素b ( c b ) 对牛四倍体孤雌胚胎发育的影响 将卵母细胞分为三个处理组：一是c b 浓度为o 1 1 0 0 t g m l ，培养时间2 4 h 的处理组( 全程处理组) ；二是在含有7 5 和1 5 肛鲋 1 1 1c b 的培养液中预培养 6 1 0 h 后移至不加c b 的培养液培养至2 4 h ( 预处理组) ；三是用不加c b 的培 养液培养1 0 h 后转到含有c b 的培养液中继续培养至2 4 h ( 后处理组) 。然后对 堕鍪直奎堂堡主兰篁笙壅 三个处理组分别进行孤雌激活和发育培养，观察c b 对四倍体孤雌胚胎发育的 影响。结果是：( 1 ) 后处理组的四倍体孤雌胚囊胚发育率( 2 5 2 8 ) 明显高 于全处理组( 5 1 5 ) 、前处理组( 7 1 6 ) 和对照组( 1 2 一1 6 ) 。( 2 ) 对 后期处理组得到的孤雌胚胎进行染色体分析发现，来源于未排p b l 的卵母细 胞的胚胎中，有7 4 的l 一细胞胚胎、8 2 的2 细胞胚胎和7 5 的囊胚是四倍 体( 4 n = 1 2 0 ) 。( 3 ) 对激活后4 0 h 未卵裂的卵母细胞进行染色体分析发现，有 1 5 以上含有超多倍数染色体，这说明在4 0 h 内发生了多次d n a 复制。 以上结果表明，通过c b 处理形成的二倍染色体( 2 n 或4 c ) 牛卵母细胞， 能够发育为四倍体胚胎，且发育率很高。 4 、卵母细胞核的存在对克隆胚胎供体核重编程和多倍体胚胎发育的影响 以未去核的m i i 期卵母细胞为胞质受体构建重构胚胎，检测了卵母细胞核 的存在对供体细胞核重编程的影响，包括对早熟染色体凝集( p r e m a t u r e c h r o m o s o m ec o n d e n s a t i o n ，p c c ) 、染色体结构和重构胚发育的影响，在此基础 上探索了以未去核卵母细胞构建的重构细胞能够发育为多倍体的可能性。研究 结果显示：( 1 ) 受体细胞m i i 纺锤体的存在更容易诱发重构细胞中的供体细胞 发生p c c 。( 2 ) 供体细胞核与受体细胞m i i 纺锤体之间的位置关系对第二极 体( p b 2 ) 的排出有影响，当两者的纺锤体距离比较远时，9 4 4 的重构细胞 能够排出p b 2 ；当两者的纺锤体位置接近时，几乎所有重构细胞都没有排出 p b 2 ，大部分( 6 7 9 ) 形成超大纺锤体，受体卵母细胞和供体细胞的染色体 混为一体。( 3 ) 用去核卵母细胞构建的重构胚胎被激活后，其卵母细胞和供体 核显示出多种原核形态，并且发育不同步。( 4 ) 上述重构胚经过发育培养后， 以卵丘细胞为核供体时卵裂率和囊胚发育率分别为8 1 9 和2 2 3 ，与对照组 的8 4 9 和2 9 1 没有显著差异( p o 0 5 ) i 以成纤维细胞为核供体时卵裂率 和囊胚发育率分别为9 0 3 和2 2 7 ，与对照组的8 1 9 和3 1 1 也没有显著 差异( p o 0 5 ) ；而囊胚孵化率则以卵丘细胞为供体时0 ，以成纤维细胞为供 m 旦童整生翌些童堡竺墅堕兰塞堕堑堡竺墅堕箜堡壅 体时2 7 5 ，分别低于对照组的2 3 1 ( p o 0 5 ) 和7 2 3 ( p o 0 5 ) 。( 5 ) 以未去核卵母细胞为受体的重构囊胚其细胞由各种多倍体细胞混合而成，包括 2 n 4 n 、2 n 6 n 、2 n 8 n 和2 n 4 n 8 n ；并且这种来源的囊胚细胞数( 约6 0 个细 胞) 明显少于去核对照组的囊胚细胞数( 约9 0 个细胞) 。( 6 ) 通过反向核移植 ( r e v e r s en u c l e a rt r a n s f e r , r n t ) 的方法研究结果显示：重构胚融合后l h 去核 组的囊胚发育率为4 7 2 ，显著高于3 h 去核组的2 0 ，( p 2 0r t g m lc o n c e n t r a t i o n s f o r2 4h s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e do o c y t em a t u r a t i o na n dt h em a t u r e do o c y t e s h a p l o i d c o m p o s i t i o n o v e r5 0 o ft h ec b t r e a t e do o c y t e sd i dn o te x p e lp b1 ( n o n p b1 ) ， a n d5 0 - 6 5 o ft h en o n - p b1 o o c y t e s c o n t a i n e d2 n ( 6 0 ) c h r o m o s o m e s ( 2 ) p r e t r e a t m e n to fo o c y t e sw i t hc ba tc o n c e n t r a t i o n so f7 5a n d15 1 x g m lf o r6 8 h d i dn o ta f f e c tt h em a t u r a t i o nr a t e sc o m p a r e dt ot h ec o n t r o lo o c y t e s ( a b o u t8 0 v s 8 3 ) ，b u tp r o l o n g e dp r e t r e a t i n gt i m et o 10 hs i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e dt h eo o c y t e m a t u r a t i o n ( 6 0 ) ( 3 ) o o c y t e sw e r ec u l t u r e df o rt h ef i r s t10 ha n d t h e nt r a n s f e r r e dt o 3 o 一7 5p 舢c b c o n t a i n i n gm e d i u ma n dc u l t u r e dt o2 4 h ( p o s t - t r e a t m e n t ) t h e r e s u l t ss h o w e dt l l a t5 8 5 一9 2 8 o f t h e o o c y t e sc o u l dn o te x p e l p b 1 ( 4 ) p r o l o n g i n gt h ep o s t - t r e a t m e n to fo o c y t e si nc ba t7 5 t g m lt o3 0 h ，3 6 h ，a n d4 8 h ， r e s p e c t i v e l y r e s u l t e di n s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e da i t i o o c y t e st o 1 9 6 4 c o m p a r e dt o2 4 ht r e a t m e n tg r o u p ( 15 3 ) a n di n c r e a s e dt h en u m b e ro fo o c y t e s c o n t a i n i n gb i gs p i n d l e sc o m p r i s e d o f6 0c h r o m o s o m e s t h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tc bd i s f i g u r e s s p i n d l es t r u c t u r e ，i n h i b i t sp b 1 e x t r u s i o n ，d e c r e a s e so o c y t em a t u r a t i o n ，a n dr e s u l t si nf o r m a t i o no fd i p l o i d ( 2 no r4 c ) o o c y t e s 3 e f f e c to fc y t o c h a l a s i nbt r e a t m e n to fb o v i n eo o c y t e so nt e t r a p l o i d p a r t h e n o g e n e t i ce m b r y od e v e l o p m e n t t h i ss t u d yw a sd e s i g n e dt oi n d u c et h ef o r m a t i o no ft e t r a p l o i de m b r y o s t h e o o c y t e sw e r em a t u r e di nc b c o n t a i n i n gm e d i aa td i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sf o r2 4 h ， o rp r e t r e a t e dw i t hc bf o r6 - 10 ht h e ni n t on o r m a lc u l t u r em e d i au pt o2 4 h ，o r t l l er e s u l t ss h o w e dt h a t ：( 1 ) t h ep a r t h e n o g e n e t i cb l a s t o c y s t s ( 2 5 - 2 8 ) d e r i v e d 舶mt 1 1 en o n p b1o o c y t e so fp o s t t r e a t m e n tg r o u p w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nm a t 脚w h o l ep e r i o dt r e a t m e n t ( 5 1 5 ) ，p r e t r e a t m e n t ( 7 - 1 6 ) ，a n d t h ec o n 仃o l o o c v t e s ( 1 2 - 16 ) ( 2 ) c y t o g e n e t i c a n a l y s i s o ft h ee m b r y o sd e n v e dm m c b 仃e a t e dn o n p b 1o o c y t e sr e s u l t e di n7 4 o ft h eo n e c e l ls t a g ee m b r y o sb e m g 4 n ：12 0c o s o m e s ，8 2 o f t w o c e l ls t a g ee m b r y o sc o n t a i n e d4 nc h r o m o s o m e s i ne a c hb l a s t o m e r e ，a n d7 5 o f t h eb l a s t o c y s t sw e r et e t r a p l o i d y ( 4 n - 1 2 0 ) ( 3 ) t l 把 s t o p p e d 1 l n c l e a v e do n e c e l le m b r y o ss h o w e d a na m a z i n gp h e n o m e n o no fo v e r l 5 o ft h 锄c 锄i 1 1 i n ge x 仃ac h r o m o s o m e s ，w h i c h s u g g e s t e dm u l t i p l ed n a d u p l l c a t l o n o c c u r r e dw i t h i n4 0 ha f t e ra c t i v a t i o n i nc o n c l u s i o n ，c bt r e a t m e n tr e s u l t si nf o r m a t i o no f d i p l o i d ( 2 no r4 c ) o o c y t e s 1 1 1 ed i p l o i do o c y t e sr e s u l t e di nah i g h e rd e v e l o p m e n t o ft e t r a p l 0 1 d 唧b 驴s 4 e f f e c t so f t h ep r e s e n c eo fo o c y t en u c l e i o nt h ed o n o rc e l ln u c l e a rr e m o d e n g a n dp o l y p l o i de m b r y od e v e l o p m e n t i nt h i se x p e r i m e n t ，t h e n o n - e n u c l e a t e do o c y t e sw e r eu s e d 嬲r e c l p l e n tt 0 r e c o n s 眦te m b 驴sa n de x a m i n e d t h ee f f e c t so ft h ep r e s e n c eo fo o c y t en u c l e lo n t h ed o n o rc e l ln u c l e a rr e m o d e l i n g ，i n c l u d i n gp r e m a t u r ec h r o m o s o m e c o n d e n s a t l o n ( p c c ) a n dd n a c o n f i g u r a t i o n ，a n ds u b s e q u e n te m b r y od e v e l 删i h e 坞叭1 t s s h o w e dt h a t ：( 1 ) t h ep r e s e n c eo fo o c y t em i is p i n d l e sw a s m o r el i l 【e l yt om d u c e d o n o rc e l lp c c ( 2 ) t h ep o s i t i o n a lr e l a t i o n s h i pb e t w e e n t h ef u s e dd o n 凹c e l l 趾d t h eo o c y t em e t a p h a s es p i n d l eh a da ne f f e c to n f u s e d ( 1 0 n o rc e l l w a sw i d e l ys e p a r a t e df r o m r e c o n s t n l c t e do o c y t e se x p e l l e dap b 2 w h e n t h e o o c y t ep b 2e x t r u s i o n w h e nt h e t h em i is p i n d l e ，9 4 4 o ft h e d o n o rc e l lw a s f u s e da d ja c e n t l yt o 、 t h em i is p i n d l e ，a l m o s ta l l 。f t h er e c o n s t r u c t e do o c y t e sd i dn o te x p e lt h ep b 2 ；也e_ m a i o 衄( 6 7 9 哟f o m e d av e r yl a r g em p h a s es p i n d l ei nw h i c h t h eo o c y t e 舳dt k d o n o rc e l l 幽m o s o m e sm e r g e d ( 3 ) a f t e ra c t i v a t i o n ，t h eo o c y t e a n dd o 唧肌c l e l e ) 【l l i b i t e dav a r i e 哆。fp n u c l e a tp a t t e r n sa n d a s y n c h r o n o u sd e v e l o p m e n t ( 4 ) t h e v 自春玲午孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的研冗 e m b r y o sr e c o n s t i t u t e dw i t hn o n e n u c l e a t e do o c y t e sr e s u l t e di nas i m i l a rc l e a v a g e r a t ea so b s e r v e di nt h ec o n t r o le m b r y o sr e c o n s t i t u t e dw i t he n u c l e a t e do o c y t e s b l a s t o c y s td e v e l o p m e n t a l r a t e sw e r en od i f f e r e n tb e t w e e nn o n e n u c l e a t e da n d e n u c l e a t e dc l o n e de m b r y o s ；h o w e v e r , t h ed e v e l o p m e n tr a t e sf r o me a r l yt oh a t c h i n g b l a s t o c y s t ss i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di n t h en o n e n u c l e a t i o ng r o u p c o m p a r e dt o e n u c l e a t i o nc o n t r o l s ( ov s 2 3 1 ；2 7 5v s 6 7 8 ) ，r e g a r d l e s sw i t he i t h e rc u m u l u s c e l l so rf i b r o b l a s t sa sd o n o rc e l l s ( 5 ) a l ln o n e n u c l e a t e do o c y t e d e r i v e db l a s t o c y s t s c o n t a i n e dm i x e dp o l y p l o i d yw i t hav a r i e t yo fc o m p o s i t i o n st h a ti n c l u d e d2 n 4 n ， 2 n 6 n ，2 n 8 n ，a n d2 n 4 n 8 n ；t h eb l a s t o c y s tc e l ln u m b e ri nt h en o n n u c l e a t e dg r o u p s ( a b o u t6 0c e l l s ) w a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h ee n u c l e a t e dc o n t r o lg r o u p s ( a r o u n d 9 0c e l l s ) ( 6 ) t h ei nv i t r od e v e l o p m e n t a ld a t ao fe m b r y o sp r o d u c e db yt w or e v e r s e n u c l e a rt r a n s f e rp r o t o c o l ss h o w e dt h a td e v e l o p m e n to ft h er n t - l hg r o u pw a sm u c h h i g h e rt h a nt h er n t - 3 hg r o u p ( 4 7 2v s 2 0 ，p 山羊、绵羊：取屠宰母羊卵巢，置于2 5 3 0 。c 灭菌生理盐水中带回实验室，用生理盐水一 洗三遍，在加有采卵液的培养皿中用手术刀片切割取卵，光学显微镜下检卵。选择a 级( 有 数层致密卵丘细胞) 和b 级( 有数层较疏松卵丘细胞) 未成熟卵母细胞置于成熟培养液，在 5 3 白春玲 牛孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的研究 四孔板中培养，按5 0 枚0 5 m l 培养卵母细胞。培养条件为3 8 5 。c 、1 0 0 湿度和5 c 0 2 的 气相。 牛：取屠宰母牛卵巢，置于2 5 3 0 灭菌生理盐水中带回实验室，用生理盐水洗三遍， 用带1 2 妒针头的1 0 m l 注射器抽取卵巢表面2 8 m m 卵泡卵，捡卵，选择a 、b 级卵母细胞进 行成熟培养，培养浓度和条件同山羊、绵羊卵母细胞。 1 2 2 微管和微丝的免疫荧光染色 成熟培养o h 、2 h 、4 h 、6 h 、8 h 、1 0 h 、1 6 h 、2 0 h 、2 4 h 和2 6 h 后的卵母细胞分别在在含0 1 透明质酸酶的液体中振荡去掉卵丘细胞，p b s ( 卜0 3 b s a 洗一遍，在p b s + 4 多聚甲醛 + 0 2 t r i t o n x 一1 0 0 中室温固定通透l h ，p b s + 3 b s a 中洗三遍( 3 的b s a 起到封闭作用) ， 然后直接进入抗小鼠a t u b u l i n 单克隆抗体中室温l h 或4 。c 过夜，抗体用p b s ( ) + 0 3 b s a 按 1 ：5 0 0 稀释。一抗孵育完毕，p b s ( 舯3 b s a o ? 洗三遍，进入f i t c 标记的山羊抗鼠i g g 室温 1 h ，稀释比例为1 ：5 0 0 。p b s ( 一汁o 3 b s a 洗涤，用l o o g m l 的p l 染细胞核。最后，用甘油：p b s 按1 ：1 配制的封片液封片。激光共聚焦系统观察，拍照。 染微丝时卵母细胞的固定通透同微管的染色。固定后的卵母细胞直接进入按l ：3 0 0 稀释 的f i t c 鬼笔环肽，3 7 。cl h ，p b s ( 一) + o 3 b s a 洗涤，p i 染核，封片，激光共聚焦观察。 2 结果 2 1 卵母细胞成熟过程中的核成熟进程 分别在成熟培养o h 、2 h 、4 h 、6 h 、8 h 、1 2 h 、1 6 h 、2 0 h 、2 4 h 和2 6 h 时收集牛、山羊和绵 羊的卵母细胞，通过对纺锤体微管和染色体的染色分析了在整个体外成熟过程中细胞核的 成熟进程( 表2 1 ，图2 1 ) 。三种动物的卵母细胞在刚开始培养的一段时间内，9 0 以上的 卵母细胞都处于g v 期，随着进一步培养，各自显示出一定的特点( 图2 1a ，b ，c ) 。牛和 山羊卵母细胞在成熟培养4 h 后开始发生g v b d ，1 2 h l i l 有5 0 6 0 的卵母细胞到达m i 期，1 6 h 到达a i t i 期峰值( 4 2 ) ，2 0 h 后牛和山羊分别有6 6 和8 4 的卵母细胞进入m i i 期；绵羊卵 母细胞核成熟进程略慢于牛和山羊，g v b d 发生的时间也是成熟培养4 h 后开始发生，但达 a i t i 期峰值的时间和发育为m i i 期的时间分别为2 0 h ( 5 0 ) 和2 4 h ( 7 6 5 ) ，均晚于牛和 山羊。 内蒙古人学 博士学位论文 表2 1 牛、山羊、绵羊卵母细胞在体外成熟不同时间的核相 t a b l e2 - 1n u c l e a rs t a t eo fo o c y t e sf r o mb o v i n e ，g o a t , s h e e pa td i f f e r e n tt i m ed u r i n gi nv i t mm a t u r a t i o n 0 h 2 h 4 h 6 h 8 h l o h 1 2 h 1 6 h 2 0 h 2 4 h 2 4 ( 8 8 9 ) 1 6 ( 8 8 9 1 2 2 ( 8 1 5 1 8 ( 3 8 1 ) 8 ( 2 6 7 ) 2 ( 5 7 1 1 ( 3 0 1 o 2 ( 5 4 ) o o 1 ( 5 6 ) 4 ( 1 4 8 ) 1 3 ( 6 1 9 ) 2 2 ( 7 3 3 ) 1 6 ( 4 5 7 1 1 2 ( 3 6 4 ) o o o 1 ( 3 7 ) 1 ( 5 6 ) 1 ( 3 7 1 0 o 15 ( 4 2 9 ) 2 0 ( 6 0 6 ) 15 ( 3 4 9 ) 3 ( 8 1 ) 3 ( 1 3 6 ) 0 o o o o o o 1 8 ( 4 1 9 1 1 ( 2 7 ) o 2 ( 7 4 ) o o o o 2 ( 5 7 ) o 1 0 ( 2 3 2 ) 3 1 ( 8 3 8 ) 19 ( 8 6 4 ) 2 6 h 2 ( 3 1 ) 08 ( 1 2 5 ) 05 4 ( 8 4 4 ) 6 4 绵羊卵母细胞 5 5 坞俎如弱钉勉 白春玲 牛孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的研究 a 牛卵母细胞减数分裂进程 1 0 0 0 一飞 一 x 掣 一8 0 0 _ 入 囊篙 x 洽 l 皿2 0 0 弧 苍。窆k 。拿啦 u u - _-_r o w sm i r a- o h2 h 4 h 6 h 8 h 1 0 h1 2 h 1 6 h2 0 h2 4 h2 6 h b 山羊卵母细胞减数分裂进程 l o o 0 一8 0 o x 水义 6 0 o 、r 厂 纂4 k 、_ 八 陋2 0 0 、厂 y 之一2 u 、l 一一 一- u u -_-m i r a -o o h 2 h 4 h 6 h 8 h 1 0 h1 2 h1 6 h2 0 h2 4 h2 6 h c 绵羊卵母细胞减数分裂进程 1 0 0 o 。叫 一 主8 0 0 一一广咏 b 嗡 、_ 芒弋j 皿2 0 0 k 弋俐 o o 一f 。球。严。一 o h 2 h 4 h 6 h 8 hl o h1 2 h1 6 h2 0 h2 4 h2 6 h _ g v - - p z e k l ： m i - 一a 工 枷m 工i 图2 - l 体外成熟过程中牛、山羊、 绵羊卵母细胞的核成熟进 程 g v 生发泡期 p r e - m i ：前中期i m i ：中期i a i ：后期i 末期i m i i ：中期i i f i g 2 - ln u c l e a rm a t u r a t i o n p r o c e s s o fo o c y t e sf r o m b o v i n e , g o a t a n do v i n e d u r i n gi nv i t r om a t u r a t i o n g v ：g e r m i n a lv e s i c l es t a g e p r e - m i ：p r c m e t a p h a s cl m i ：m e t a p h a s ei a i ：a n a p h a s el t e l o p h a s ei m i i ：m c t a p h a s ei i 2 2 染色体和纺锤体的形态学变化 分别对三种动物的g v 期、前中期i ( p r e m i ) 、中期i ( m i ) 、后期i 末期i ( a f t i ) 、 第二次减数分裂中期( m ) 的卵母细胞进行了细胞核和细胞骨架的免疫荧光染色分析。三 种动物各时期的特征基本相似，但也存在一些区别。 共同点：在g v 期，卵母细胞中检测不到微管结构( 图2 2 a ，a ，a ”) 。发生g v b d 后， 在前中期i ，可观察到与凝集的染色体相关连的微管星体( 图2 2 b ，b ，b ”) 。m i 期，染色体 内蒙古大学博士学位论文 和微管组装成纺锤体，凝集的染色体整齐地排列在中期板上( 图2 2 c ，c ，c ”) 。后期刚刚开 始的时候，同源染色体分开，此时还可以分辨单个染色体，纺锤体呈对称的桶状( 图2 2 d ，d ， e d ”) 。随着进一步向后推移，纺锤体两极的单倍体染色体组各凝集成一团，单条染色体 不可分辨，纺锤体也逐渐由对称状态向不对称状态变化，中间体( m i d b o d y ) 向一端迁移( 图 2 2 e ，f ，e ”，f ，g ，f ”) 。等到末期，中间体两侧的微管与染色体的接触面一边宽、一边窄， 之后微管从接触面窄的一侧与染色体脱离( 图2 2 g ，g ”) 。紧接着卵母细胞完成成熟过程 到达m i i 期，排出第一极体，大量的微管分布于极体中( 图2 2 h ，h ，h ”) 。 除了上述相同的特征，牛、山羊和绵羊卵母细胞的核和纺锤体在成熟过程中也显示出 不同的特点。g v 期，绵羊卵母细胞呈现三种核型：( 1 ) 核较大，细丝状的染色质弥散在 整个生发泡内( 图2 3 a ) ；( 2 ) 弥散的丝状染色质分布在整个核区，核区有一个或两个核 仁( 图2 3 b ) ；( 3 ) 核相对较小，染色较深，弥散程度低( 图2 3 c ) 。a i t i 期，绵羊卵 母细胞有一部分出现三极纺锤体，染色体呈现三团，其中一团体积较大，另外两团体积小 且大小相当( 图2 3 d ，e ) 。m i i 期，部分绵羊f f g p b l 中的染色体分成两团、三团甚至几团， 有些由微管相互连接( 图2 3 f ) ，有些则没有微管相连，形成两个极体样结构( 图2 3 g ) ， 这可能就是a i t i 时期观察到的三极纺锤体的染色体相分离而来。m i i 期山羊大约有5 0 的卵 p b l 中的染色体不是里凝集状态，而是分散成单个染色体( 图2 3 h ) 。 2 3 微丝分布的变化 在牛、山羊、绵羊卵母细胞成熟过程中微丝的分布没有差别，与已经报道的结果一致【l8 】。 从g v 期到m i 期，微丝主要在皮质层分布，胞质中基本没有明显的微丝分布，也不在染色体 周围聚集( 图2 - 4 a ，b ，a ，b ，a ，b ”) 。a i 期开始，在染色体周围逐渐出现聚集的微丝，形成 纺锤体样结构( 图2 4 c ，c ，c ”) ，第一次减数分裂完成时染色体周围微丝随极体排出，m i i 期染色体周围也观察不到微丝分布( 图2 4 d ，d ，d ”) 。 5 7 黪 二 狰繁 戳 o k 口 q u 钢一姆 譬漤 0 也 ： 【d 叁睡 o e 懒 撕硎 嚯 ： - 墨 暑 _ 口 - 一 内蒙古大学博士学位论文 图2 - 3 山羊和绵羊卵母细胞体外成熟过程中染色体和纺锤体呈现的不同于牛卵母细胞的其他特点 a c ：g v 期绵羊卵母细胞：d e ：绵羊卵母细胞a i t i 期的三极纺锤体；f - g ：m i i 期绵羊卵母细胞：h ： m i i 期极体内染色体分散的山羊卵母细胞 红色：染色体；绿色：微管 f i g 2 - 3c h a r a c t e r i s t i c so fc h r o m o s o m e sa n ds p i n d l e so fg o a ta n do v i n eo o c y t e st h a td i f f e r e n tf r o m b o v i n eo o c y t e sd u r i n gi nv i t r om a t u r a t i o n a - c ：g vs t a g eo v i n eo o c y t c s ；d - e ：t r i p o l a ra f t i s p i n d l e so f o v i n eo o c y t e s ；f g ：m i is t a g eo v i n eo o c y t e s ；h ： m i io o c y t c so fg o a tw i t hd i s p e r s e dc h r o m o s o m e si np o l a rb o d y r e d ：c h r o m o s o m e ；g r e e n ：m i c r o t u b u l e 白春玲牛孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的研究 牛卵母细胞( b o v i n eo o c y t e ) 山羊卵母细胞( g o a to o c y t e ) 绵羊卵母细胞( o v i n eo o c y t e ) 图2 - 4 牛、山羊、绵羊卵母细胞体外成熟过程中微丝的分布变化 a - d ：g v m i i 期牛卵母细胞微丝分布；a d ： g v - m i i 期山羊卵母细胞微丝分布；a ”- d ”：g v - m i i 期 绵羊卵母细胞微丝分布。红色：染色体：绿色：微丝 f 喀2 - 4d y n a m i cc h a n g e so fm i c r o f d a m e n t so fo o c y t e sf r o mb o v i n e ，g o a ta n do v i n ed u r i n gi nv i t r o m a t u r a t i o n a - d ：m i c r o f i l a m e n td i s t r i b u t i o ni nb o v i n eo o c y t e sa tg v - m i is t a g e s ；a - d ：m i c r o f i l a m e n td i s t r i b u t i o ni ng o a t o o c y t e sa tg v m i is t a g e s ；a - d ：m i c r o f f l a m e n td i s t r i b u t i o ni no v i n eo o c y t e sa tg v - m i is t a g e s r e d ：c h r o m o s o m e ；g r e e n ：m i c r o m b u l e 3 讨论 随着家畜细胞核移植、转基因和胚胎干细胞等技术的发展，对卵子质量的要求越来越 高，卵子的来源和质量是体外常熟培养技术体系的关键因素之一。卵母细胞发育成熟是一 个极其复杂的过程，受卵泡内外环境许多因素的影响，而体外培养系统尚不完善，导致卵 母细胞的体外成熟质量不高，进而制约胚胎工程技术的研究与应用。了解实验条件下卵母 内蒙古大学博士学位论文 细胞减数分裂核发育进程能为更有效的开展核移植操作奠定基础。哺乳动物卵母细胞恢复 减数分裂后的核成熟进程研究在小鼠【2 4 】、人 2 5 1 、猪 2 0 3 、牛埔, 2 7 1 、绵羊2 8 1 、山掣2 9 1 、马p o 】 和猁3 1 】等动物中已经有报道。本实验对牛、山羊、绵羊在本实验室条件下体外成熟过程中 核成熟进程进行了分析对比，牛卵成熟进程与已报道结果相似。牛和山羊成熟进程基本相 似( 图2 1 a ，b ) ，而绵羊的核成熟似乎比牛和山羊的核成熟慢( 图2 i c ) 。已报道结果多将 卵泡按其直径大小分类后进行研究f 2 6 捌，但在通常的胚胎工程实验中，牛卵母细胞的回收 由于可用注射器抽取，可以区分不同大小卵泡，但是绵羊和山羊卵母细胞一般通过切剖法 回收卵母细胞，因此不容易区分不同大小卵泡，而且区分过程比较费时，体外暴露时间延 长必然影响体外成熟结果。因此在不按直径进行分类的情况下了解其体外成熟进程对于更 好的把握体细胞核移植的时间切点进而提高核移植效率具有重要意义。 哺乳动物卵母细胞的减数分裂成熟过程中，微管和微丝等细胞骨架的组织和结构发生 了一系列明显的变化，从而为染色体重组和细胞分裂提供了一个框架。微管和微丝的组装 与解聚的动态变化研究已在爪蟾