（微生物学专业论文）少根根霉Δ6脂肪酸脱氢酶基因的克隆、表达及其功能分析.pdf

圭茎苎兰竖主堕奎生璺兰! 兰垒! 垒墨! 壅墨 中文摘要 y 亚麻酸( y l i n o l e l l i ca c i d ，g l a ) 由于在食品，医药，保健品等领域的重要 作用以及传统来源的局限性，近年来逐渐受到国内外学者的广泛关注。诸如接合菌 等丝状真菌被认为是生产y 亚麻酸潜在重要的商业来源，但仍需了解和掌握其多 不饱和脂肪酸的生物合成机制，才能获得产量更高和质量更好的产品。从少根根霉 中克隆与g l a g e 物合成相关的基因，有助于阐明其体内脂肪酸的生物合成途径，并 可作为遗传工具进行丝状真菌p u f a s t 物合成途径的全面综合研究，为研究真核生 物多不饱和脂肪酸代谢提供一个简单模型。与此同时，借助于现代生物工程技术构 建g l a 高产量性状的基因工程菌株或植株，为大规模的生产应用建立基础。 参照真菌来源的6 脂肪酸脱氢酶保守的氨基酸序列设计简并引物进行 r t - p c r ，从少根根霉的总r n a 中获得一个5 9 3b p 的e d n a 片段，编码1 9 7 个氨 基酸。通过其编码的氨基酸序列的相似性搜索，表明所扩增片段为新的潜在的6 一 脂肪酸脱氢酶基因的部分c d n a 序列。根据获得的部分序列设计基因特异性引物， 通过e d n a 末端扩增技术( r a c e ) 获得该c d n a 的3 和5 两端序列，从而获得 全长为1 4 8 2b p 的e d n a 序列。序列分析结果表明其具有一个长度为1 3 7 7b p 、编 码4 5 8 个氨基酸的开放阅读框，所编码蛋白质的分子量为5 2 3 k d a 。与报道的6 脂肪酸脱氢酶一样，推测的氨基酸序列具有膜整合脂肪酸脱氢酶特异性的3 个保守 的组氨酸富集区和2 个长的疏水结构，在其氨基酸序列的n 末端具有细胞色素b 5 区，表明该序列为一个新的潜在编码6 脂肪酸脱氢酶的基因。将所有已报道的a 6 脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列进行系统进化分析，所有的6 一脂肪酸脱氢酶可以分 为原核、动物、高等植物和低等真核四个类型。可以推测原核类型的6 脂肪酸脱 氢酶是所有6 一脂肪酸脱氢酶的共同祖先，真核类型的6 脂肪酸脱氢酶在后来的 进化中形成更具选择优势的细胞色素b 5 融合蛋白。动物类型的6 脂肪酸脱氢酶处 于真核类6 一脂肪酸脱氢酶的最基础分枝，其中鱼类的6 。脂肪酸脱氢酶可能是动 物类型的6 - 月旨肪酸脱氢酶通过序列改变向5 脂肪酸脱氢酶进化的中间过度形 式。商等植物和真菌类型的6 。脂肪酸脱氢酶存在着共同起源，藻类和苔藓可能在 高等植物和真菌类6 一脂肪酸脱氯酶的进化关系上扮演着重要的角色。线虫的6 脂肪酸脱氢酶作为一个独立而且最基础的分枝位于低等真核单系组中，它可能是一 种趋同进化的结果。此外，基因组结构分析表明，少根根霉的6 一脂肪酸脱氢酶基 因炅有三个典型的三类内含予，但目前无法从分布位置、长度和序列特征上看出少 根根霉6 脂肪酸脱氢酶基因和其它同源基因在系统进化上的关系。 为了验证所获得序列的功能，把潜在的编码序列r a d 6 亚克隆到表达载体 p y e s 2 0 ，构建重组表达质粒p y r a d 6 ，并转化酿酒酵母的缺陷型菌株i n v s c l 进 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 行表达。通过气相色谱( g c ) 和气相色谱质谱( g c m s ) 分析表明，该序列在酿酒酵母 中获得表达。所编码的蛋白具有6 脂肪酸脱氢酶活性，能催化外源性底物亚 油酸转化成g l a ，g l a 的含量占酵母总脂肪酸的3 8 5 。同时，酿酒酵母中的功 能分析结果表明r a d 6 两端的非转译区序列对少根根霉的6 胡旨肪酸脱氢酶基因的 表达没有调节作用。但是，根据k o z a k 提出的真核生物偏好的起始密码子的周边序 列特点，将i l 4 d 6 的起始密码子周边序列作适当的修改，并用修改后的片段( e m d 6 - 1 ) 构建重组表达载体p y r a d 6 一i ，再转化酿酒酵母进行表达分析。结果显示，改变转 译起始密码予的周边序列提高了少根根霉6 脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表 达水平，g l a 含量增加到总脂肪酸含量的6 0 3 ，是对照样品的近两倍。 以酿酒酵母基因工程菌y r a d 6 和y r a d 6 1 出发，添加亚麻酸( q l i n o l e r i l e a c i d ，a l a ) 作为底物，经半乳糖诱导，在含有少根根霉a6 胡旨肪酸脱氢酶基因( 删d 国 的酿酒酵母总脂肪酸中检测到十八碳四烯酸( o c t a d e c a t e t r a e n o i ca c i d ，o t a ) 的合成； 同时添加亚油酸和a l a 时，检测到g l a 和o t a 的合成，而且o t a 的含量是o l a 含量的3 8 1 倍，表明在酿酒酵母中少根根霉6 脂肪酸脱氢酶不仅能催化a l a 生 成o t a ，而且偏好n - 3 途径中的底物a l a 。同样，用改变转译起始密码子的周边 序列后的少根根霉6 脂肪酸脱氢酶基因( r a d 6 。j ) 所构建的转基因酵母分析也得 到相同的结果，而且各种目的脂肪酸的含量均有明显提高。 通过农杆菌介导的遗传转化法，将少根根霉6 脂肪酸脱氢酶基因转入甘蓝型 油菜，并处于c a m v 3 5 s 启动子的调控。经p c r 检测、g u s 染色、斑点杂交和s o u t h e r n 杂交分析证明，少根根霉6 胡旨肪酸脱氢酶基因已经整合到转基因油菜的基因组中， n o r t h e m 杂交分析表明目的基因在m r n a 水平上获得表达。对转基因油菜幼苗叶 片进行脂肪酸分析，结果显示叶片中累积了g l a 和o t a 。 将r a d 6 和r a d 6 一导入巴斯德毕赤酵母g s l l 5 ，用甲醇对转基因酵母进行诱 导表达，脂肪酸分析结果表明在两种转基因酵母细胞p i c r a d 6 和p i c r a d 6 1 中 均产生g l a 和o t a 。而且p i c r a d 6 1 中的含量均比p i c r a d 6 中的高，分别从 6 5 1 和3 0 提高到l o 2 和4 7 ，说明在毕赤酵母中的表达也能反映出转译起始 密码子周边序列的改变对少根根霉6 脂肪酸脱氢酶基因表达所起的增强作用。与 此同时，转基因酵母细胞中还检测到c 1 6 ：2a 6 , 9 c 1 7 ：2a 6 , 9 c 1 8 ：2a6 , 9 的合成， 说明少根根霉6 脂肪酸脱氢酶的催化功能没有链长的特异性，而只有键位特异性。 但从脂肪酸的合成量来说，少根根霉6 。脂肪酸脱氢酶偏好于亚油酸和a l a ，而且 更偏好于a l a 。综上所述，本文首次提出将巴斯德毕赤酵母作为一个常规模式表 达系统，进行6 脂肪酸脱氢酶基因的综合功能分析。 关键词：少根根霉，6 脂肪酸脱氢酶，酿酒酵母，毕赤酵母，转基因油菜，y 一 亚麻酸，十八碳四烯酸，转译起始密码子，偏好，克隆和表达 i i 壹茎垄兰堡主塑壅生兰些! 芏堡! 笙查 塑墨 a b s t r a c t y ，l i n o l e n i ca c i d ( g l a ) i sav a l u a b l ep r o d u c t b e c a u s eo fi t si n v o l v e m e n ti ns e v e r a l a s p e c t so f h u m a nh e a l t hc a r ei n c l u d i n gf o o d ，p h a r m a c e u t i c sa n ds oo n m a r k e td e m a n d f o rg l ai s g r o w i n gc o n t i n u o u s l yb u tc u r r e n t s o u r c e sa r ei n s u f f i c i e n tt os a t i s f yt h i s d e m a n d ，t h e r e f o r e ，s e e k i n gf o ra l t e r n a t i v es o u r c e si sd e m a n d i n g f i l a m e n t o u sf u n g i ， s u c ha sz y g o m y c e t e s ，a r ec o n s i d e r e dt ob ep o t e n t i a l l ya l li m p o r t a n te c o n o m i c a ls o u r c e f o rt h e p r o d u c t i o n o fg l a h o w e v e r , s o m ef u n d a m e n t a lm e c h a n i s m sr e l a t e dt o b i o s y n t h e s i so fp o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ( p u f a s ) i ns u c ho r g a n i s m sm u s t b eo b t a i n e d t oa c h i e v eh i g h e r y i e l da n dq u a l i t y o ft h ed e s i r e dp r o d u c t s i d e n t i f y i n gt h eg e n e s a s s o c i a t e dw i t ht h es y n t h e s i so fg l a ，a sg e n e t i ct o o l sf o rac o m p r e h e n s i v es t u d y , w i l l c o n t r i b u t et o c h a r a c t e r i z i n g t h ed e s a l l l r a s e g e n e s a n de l u c i d a t i n gt h e b i o s y n t h e s i s p a t h w a yo fp u f a si nr h i z o p u sa r r h i z u s ，e s t a b l i s h i n g as i m p l em o d e lf o r s t u d y i n g m e t a b o l i cp a t h w a y so fp u f a si ne u k a r y o t e sa n dp r o v i d i n gp r i m a r yb a s i sf o rt h ef u t u r e a p p l i c a t i o no fg e n ee n g i n e e r i n g a b o u tg l a p r o d u c t i o n a5 9 3b pd n a f r a g m e n te n c o d i n g1 9 7a m i n oa c i d sw a sa m p l i f i e df r o mr h i z o p u s a r r h i z u sn k 0 3 0 0 3 7b yr t - p c r 、i t l ld e g e n e r a t eo l i g o n u c l e o t i d ep r i m e r sd e s i g n e df r o m t h es e q u e n c e si n f o r m a t i o no ff u n g a l 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s e s 1 h er e s u l to fb l a s t s e a r c hw i t ht h ee n c o d e da m i n oa c i d ss e q u e n c ei n d i c a t e dt h a tt h i sf r a g m e n tw a sa p a r t i a l s e q u e n c eo f ap o t e n t i a l o f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n e g e n es p e c i f i cp r i m e r sd e r i v e d f r o mt h i sp a r t i a ls e q u e n c ew e r eu s e df o rt h ea m p l i f i c a t i o no f t l l e3 - a n d5 - e n d so ft h i s e d n ab yr a c em e t h o d a n dt h i sl e a dt ot h e a m p l i f i c a t i o no fa 1 4 8 2b pe d n a s e q u e n c e s e q u e n c ea n a l y s i ss h o w e dt h i se d n af r a g m e n th a da no p e nr e a d i n gf r a m e ( o p t ) o f1 3 7 7b pe n c o d i n g4 5 8a m i n oa c i d so f5 2 3k d a t h ed e d u c e da m i n o a c i d s e q u e n c eo ft h eo r fs h o w e dh i g hs i m i l a r i t yt ot h o s eo ft h ea b o v e 6 - f a t t ya c i d d e s a t u r a s e sw h i c hh a dc h a r a c t e r i s t i c so fm e m b r a n e b o u n dd e s a t u r a s e si n c l u d i n gt h r e e c o n s e r v e dh i s t i d i n e - r i c hb o x e sa n dt w ol o n gh y d r o p a t h yp r o f i l e ac y t o c h r o m e b s - 1 i k e d o m a i nw a so b s e r v e da tt h en - t e r m i n u s t h c m l l l e n g t he d n as e q u e n c ei sap u t a t i v e l y n o v e l 6 f a t t y a c i dd e s a t u r a s eg e n e t h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo ft h er e p o r t e da 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n e s w e r ec o m p a r e di no r d e rt oi n f e rt h e i rp h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p t h er e s u l t ss h o w e d t h a t a n t 1 1 e o f a t t ya c i dd e s a t u r a s e sc o u l db ed i v i d e di n t of o u rg r o u p s ：p r o k a r y o t i c a n i m a l h i g h e rp l a n ta n de u k a r y o t i c 6 f a t t ya c i d d e s a t u r a s e s i n d e p e n d e n t l ya c q u i r i n g a c y t o c h r o m eb 5d o m a i nt h a tm a yh a v ep r o v i d e das e l e c t i v ea d v a n t a g eb y i n c r e a s i n gt h e e f f i c i e n c yo f t h ee l e c t r o nt r a n s p o r tr e q u i r e dd u r i n gt h eu n s a t u r a t i o nr e a c t i o i n ，e u k a r y o t i c 。- f a t t ya c i dd e s a t u r a s e sa r eo r i g i n a t e df r o mp r o k a r y o t i c 6 f a t t ya c i d d e s a t u r a s e s i n 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文摘要 w h i c ha r ea n c e s t r a it oa l lt h e 。f a t t ya c i dd e s a t u r a s e s a 。一f a t t ya c i dd e s a t u r a s e sf r o m a n i m a l sa r e 也em o s tb a s a lc l a d eo fe u k a r y o t i c 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s e s a n dt h e e n z y m e sf r o mf i s h e s a r et h ei n t e r m e d i a t es t a t ei nt h ec o n y e r s i o n o f 6 一f a t t ya c i d d e s a t u r a s et o 5 f a t t ya c i dd e s a t u r a s eb yf e ws t r u c t u r ec h a n g e s t h el o w e r e u k a r y o t i c a n d h i g h e rp l a n t a o f a t t ya c i dd e s a t u r a s e sc l u s t e rs e p e r a t e l y ，t h u si n d i c a t i n gac a r o m o n o r i g i n 。一f a t t ya c i dd e s a t u r a s e sf r o mm o s sa n da l g a em a yp l a yar o l ei nt h ee v o l a t i o n b e t w e e nt h el o w e re u k a r y o t i ca n dh i g h e rp l a n t 。f a t t ya c i dd e s a t u r a s e s t h es e p a r a t e a n db a s a lp o s i t i o ni nt h el o w e re u k a r y o t i ce n z y m e si st h e a 6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ef r o m c a e n o r h a b d i t s e l e g a n s ，w h i c hm i g h tb e t h er e s u l to fa c o n v e r g e n t e v o l u t i o n f u r t h e r m o r e a n a l y s i so fg e n o m i cs e q u e n c es h o w e dt h a tr h i z o p u sa r r h & u s 6 - f a t t y a c i dd e s a t u r a s eg e n eh a dt h r e ei n t r o n s ，w h o s el o c a t i o n ，l e n g t ha n db a s ec o m p o s i t i o n c o u l dn o tp r o v i d ea n yi n f o r m a t i o nf o rt h ee v o l u t i o nb e t w e e nr h i z o p u sa r r h i z u s 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s ea n d o t h e r a 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s e s t oe l u c i d a t et h ef u n c t i o no ft h i sn o v e lp u t a t i v ed e s a t u r a s e ，t h ec o d i n gs e q u e n c e r a d 6w a sa m p l i f i e da n ds u b c l o n e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp y e s 2 0t og e n e r a t ea r e c o m b i n a n t p l a s m i dp y r a d 6 ，w h i c h w a s s u b s e q u e n t l y t r a n s f o r m e di n t o s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e s t r a i ni n v s c lb yl i t h i u ma c e t a t em e t h o df o rh e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n t o t a lf a t t y a c i d so ft h e t r a n s g e n i cy e a s t w e r e a n a l y z e db yg a s c h r o m a t o g r a p h y ( g c ) a n o v e lp e a kc o r r e s p o n d i n gt og l a m e t h y le s t e rs t a n d a r dw a g d e t e c t e dw i t ht h es a m er e t e n t i o nt i m e ，w h i c hw a sf u r t h e rd e m o n s t r a t e dq u a l i t a t i v e l yb y g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) a n a l y s i s t h ep e r c e n t a g eo fg l a t o t o t a lf a t t ya c i d sw a s3 ，8 5 t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a tt h ec o d i n gp r o d u c to f t h i ss e q u e n c e e x h i b i t e d o ，f a t t ya c i dd e s a t u r a s ea c t i v i t y f u n c t i o n a la n a l y s i sf u r t h e rd o m e n s t r a t e d t h a t3 a n d5 u n t r a n s l a t i o n a ir e g i o no fr h i z o p u sa r r h i z u s a 。一f a t t y a c i dd e s a t u m s e g e n e ( r a d 6 ) h a d n o r e g u l a t o r y r o l ef o rt h eg e n ee s p r e s s i o ni ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e h o w e v e r ，w i t hm o d i f i c a t i o no fs e q u e n c e sf l a n k i n ga u g c o d o na c c o r d i n gt ot h ek o z a k s e q u e n c e ，an o v e lf r a g m e n t ( r a d 6 - 1 ) o fr h 扬o p u sa r r h i z u s 。一f a t t y a c i dd e s a t u r a s e g e n ew a so b t a i n e da n dt h e nt r a n s f o r m e di n t os a c c h a r o m y e e sc e r e v i s i a es t r a i ni n v s c l f o re x p r e s s i o n a sar e s u l t ，c o m p a r e dw i t ht h et r a n s g e n i cy e a s ty r a d 6c o n t a i n i n g r a d 6 t h e e x p r e s s i o nl e v e lo f a 。一f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ew a s i n c r e a s e dt o6 0 5 t h et r a n s g e n i c s a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a ey r a d 6w a si n d u c e db yg a l a c t o s e , s u p p l e m e n t e dw i t ho 5 m m o l l a l i n o l e n i ca c i da ss u b s t r a t e t o t a lf a t t ya c i d sa n a l y s i s s h o w e dt h ea c c u m u l a t i o no fo c t a d e c a t e t r a e n o i ea c i d ( o t a ) i nt h et r a n s g e n i cy e a s t t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a tr h i z o p u sa r r h & u s 。一f a t t ya c i dd e s a t u r a s ei nt h et r a n s g e n i cy e a s t c a t a l y z e dt h ec o n v e r s i o no f a l at oo t a w i t ht h es a m em e t h o d g l aa n do t aw e r e d e t e c t e di nt h et o t a lf a t t ya c i d so ft h ey e a s ta f t e rs u p p l e m e n t i n gl i n o l e i ca c i da n d o 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 摘要 1 i n o l e n i ca c i da st h es u b s t r a t e sa tt h es a m et i m e t h ec o n t e n to fo t a w a s3 g lt i m e s h i g h e rt h a nt h a to fo l a t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tr h i z o p u sa r r h i z u sa 。- f a t t y a c i d d e s a t u r a s ei ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a en o to n l yc a t a l y z e dt h ec o n v e r s i o no fl aa n d a l at og l aa n do t a ，b u ta l s oh a ds t r o n gp r e f e r e n c ef o rn 3s u b s t r a t ea l a s i m i l a r r e s u l t sw e r eo b t a i n e du s i n gt h et r a n s g e n i cy e a s ty r a d 6 - 1c o n t a l n i gr a d 6 - 1 ，a n dt h e c o n t e n to fg l aa n do t aw a si n c r e a s e df r o m1 4 5 a n d5 5 3 t o2 1 5 a n d8 4 8 a c c o r d i n g l y r h i z o p u sa r r h i z u s a 6 一f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n er a d 6 r a d 6 - 1w e r ei n t r o d u c e d i n t ob r a s s i c un a p u sh 16 5b yt h e a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ，u n d e r t h ec o n t r o lo fc a m v 3 5 sp r o m o t e r p c r , g u ss t a i n i n g ，d n ad o ta n ds o u t h e r nb l o t a n a l y s i ss h o w e d t h a tt h et a r g e tg e n eh a sb e e n i n t e g r a t e di n t or a p eg e n o m e n o r t h e mb l o t a n dg ca n a l y s i si n d i c a t e dr a d 6 r a d 6 - 1 e x p r e s s e di nt r a n s g e n i cr a p e s w i t i lt h e a c c u m u l a t i o no f g l aa n do t a r d d 6a n dr a d 6 - 1w e r et r a n s f o r m e di n t op i c h i a p a s t o r i ss t r a i ng s l 1 5a n di n d u c e d b ym e t h a n 0 1 f a t t ya c i d sa n a l y s i so ft h er e c o m b i n a n ty e a s t ss h o w e dt h a tt h ec o d i n g p r o d u c t si n t r o d u c e dan e w d o u b l eb o n di n t oa p p r o p r i a t ef a t t ya c i ds u b s t r a t e si n c l u d i n g c 1 6 ：la 9 ，c 1 7 ：1a9 ，c 1 8 ：1a9 ，l aa n da l aa ta 6p o s i t i o nw i t h o u tc h a i nl e n g t l l s p e c i f i c i t yo ff a t t ya c i d s ，b u th a ds u b s t r a t ep r e f e r e n c ef o rl aa n da l a e s p e c i a l l yf o r a l a f u r t h e r m o r e ，m o d i f i c a t i o no fs e q u e n c ef l a n k i n ga u gc o d o no f t h i sa 6 f a t t ya c i d d e s a t u r a s eg e n ei n c r e a s e dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f t a r g e tg e n ei np p a s t o r i s a l lo ft h e s e r e s u l t ss u g g e s tt h a tp p a s t o r i si sa n o p t i m a le x p r e s s i o ns y s t e mf o rt h ef u n c t i o n a la n a l y s i s o fa 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n e s k e yw o r d s ：r h i z o p u sa r r h i z u s ，l x6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e ，s a c e h a r o m y c e s 钟，v 括f 胛 尸枷胁p a s t o r i s ，t r a n s g e n i cr a p e ， t - l i n o l e n i c a c i d ，o c t a d e c a l e t r a e n o i c a c i d ，i n i t i a t i o n e o d o n ，p r e f e r e n c e ，c l o n i n ga n de x p r e s s i o n v 鱼茎垄鲎量主堕壅圭兰些! 芏些! 堡墨一 ! ! 鱼 第一章绪论 第一节多不饱和脂肪酸的研究进展 多不饱和脂肪酸( p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，p u f a ) 是指含有两个或两个以上 双键、碳原子数为1 6 至2 2 的直链脂肪酸| ：1 _ i 。一般采用x ：y an z 表示，其中，x 代表脂肪酸碳链中碳原子的数目，y 表示双键的个数：a 后的数字表示从脂肪酸 链羧基端计数时引入双键的位置，从甲基端计数则为；n z 表示脂肪酸在p u f a s 中的类别或者合成途径。如亚油酸( l i n o l e i c a c i d ，i 。a ) 表示为1 8 ：2 毫1 勺一6 。在生物 体中存在的主要不饱和脂肪酸如表l - l 所示。 表1 1 主要的多不饱和脂肪酸 t a b l e1 - 1 ，t h e m a i np o l y u n s a t u r a t e d f a t r y a c i d s + o c t a d e a c a t e t r a e n o i ca c i d = s t e a r i d o n i ca c i d 一、多不饱和脂肪酸的生物合成途径 p u f a s 的生物合成是在饱和脂肪酸合成途径上扩展的，由两个主要反应组成， 即碳链的延长和脱氢。硬脂酸( s t e a r i ca c i d ，c 1 8 ：0 ) 脱饱和成为油酸( o l e i ca c i d ，o a 1 8 ：1a 9n 9 ) ，然后转化成亚油酸( l i n o l e i c a c i d ，l a ：1 8 ：2 9 , 1 2n 一6 ) ，l a 的碳链延 长和脱氢则有两个不同的代谢方向：n 一6 和n - 3 。l a 足n 6 和n 一3 系列不饱和脂肪 酸的共同前体，并在此基础上经一系列的碳链延长和脱氢反应合成花生四烯酸 ( a r a c h i d o n i ca c i d ，a a 2 0 ：4a t e “”4 n - 6 ) 、二十碳五烯酸( e i c o s a p e n t a e n o i c a c i d ， e p a 2 0 ：5 5 , 8 , 1 1 , 1 4 , 17 n 一3 ) 和二十二碳六烯酸( d o c o s a h e x a e n o i ca c i d ，d h a 2 2 ：6 a t “心”n 3 ) 等有生物活性的长链多不饱和脂肪酸( b n g - c h a i n p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y 南开大学博士研究生毕业( 学位) 论文 绪论 a c i d s l c p u f a s ) 。尽管p u f a s 生物合成的总体途径对大多数生物来说是相同的， 但是不同生物为了适应它们生存环境衍生出不同的p u f a 生物合成机制，典型的例 子就是斑马鱼中双功能酶5 6 一脂肪酸脱氢酶基因，以及发现两条不同的d h a 合 成途径共存于d h a 高产的生物中【2 】口 ( 一) 蓝细菌和植物中的p u f a s 的生物合成 蓝细菌，也就是熟知的单细胞蓝藻。以前，蓝细菌因为能进行光合作用，在分 类上认为属于植物，但是根据其具有的一些基本的原核生物的特征，如没有明确的 细胞核，现在分类学上将其划分为一类独特的细菌，并取名为蓝细菌 ( c y a n o b a c t e r i a ) 。蓝细菌是一个研究高等植物中脂肪酸代谢的极好模型，因为蓝 细菌的结构和脂类组成与叶绿体中类囊体上的很相似，反而和大多数原核生物中的 不同。因此，蓝细菌和植物中脂肪酸代谢很相似，蓝细菌和高等植物都是需要氧气 进行脂肪酸的脱氢。所有蓝细菌中都能合成o a ，表明有9 脂肪酸脱氢酶3 1 。但是 不同类型的蓝细菌中由于脂肪酸脱氢酶的不同，合成不同的p u f a s ( 图i - 1 ) 。 c 1 8 ：0s t e a r i c p 9 c 1 8 ：i n - 9o l e i c 1 2 1 5 u3 c 1 8 ：2 n 一6l i n o l e l c + ( ：1 8 ：3 n 一3 n - l i n o l e i c r 6 r 6 c 1 8 ：3 n 6y 1 i n o l e i cc 1 8 ：4 n - 3o c t a d e a c a t e t r a e n o i c 图1 - i 蓝细菌和植物中的多不饱和脂肪酸合成途径 f i g 1 1b i o s y n t h e s i sp a t h w a y o f p u f a si nc y a n o b a c t e r i aa n dp l a n t s 植物中硬脂酸和c 1 6 ：0 主要在叶绿体和其它质体中合成，而植物脂肪酸的脱氢 过程是通过两种途径配合完成。一种称之为“原核途径”( p r o k a r y o t i cp a t h w a y ) ， c 1 8 ：0 a c p 在叶绿体中脱氢成脂形式的o a 和c 1 6 ：1 a 9 然后可在叶绿体中再次脱 氢合成a 一亚麻酸( a l i n o l e n i ca c i d ，a l a 1 8 ：3 9 , 1 2 , 1 5 n 一3 ) 和c 1 6 ：3 7 1 m1 3 4 1 。另 外一种途径是“真核途径”( e u k a r y o t i c p a t h w a y ) ，指的是在叶绿体中合成的o a 被运送到内质网中酯化，在脂肪酸脱氢酶催化下转化成l a 【5 j 。光合组织中都有这 两条途径，而非光合组织如含油种子中只有真核途径。除了少数几种植物由于具有 6 一和可能的5 一脂肪酸脱氢酶而能合成丫_ 亚麻酸( 7 一l i n o l e n i ca c i d ，g l a , 1 8 ：3 6 , 9 j z n 一6 ) 和十八碳四烯酸( o c t a d e c a t e t r a e n o i ca c i d ，o t a ，1 8 ：4 a 8 , 1 1 , 1 4 , 17 n _ 3 ) ，尽管一 塑垄垄兰堡主堑垄兰兰些! 兰堡! 垒墨堂 些高等植物能合成诸如芥酸( c 2 2 ：1 ) 的长链脂肪酸，但是不能合成超长链的p u f a s ， 如a a 、e p a 和d h a ，甚至g l a 和a l a