（动物学专业论文）肠致病性大肠杆菌045+ler基因缺失突变菌株的构建及其特性的研究.pdf

河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 中文摘要 肠致病性大肠杆菌是能引起动物体内出血性和非出血性腹泻、出血性结肠炎 和溶血性尿毒症的主要病原菌。最常见的菌株是0 4 5 ，而0 4 5 的一个重要毒力特 征是引起肠黏膜粘附和脱落损伤( a e ) ，e p e c 的主要毒力因子定位于致病岛 ( p a t h o g e n i c i t yi s l a n d ，p a l s ) 和肠细胞脱落位点( t h el o c u so fe n t e r o c y t e e f f a c e m e n t ，l e e ) 上，其d n a 长度为4 3 k p ，分l e e l ，l e e 2 ，l e e 3 ，和l e e 4 四个 基因区，l e e l 包含l e r ( 中心调节基因，l e e e n c o d e dr e g u l a t o r ) ，l e r 对l e e 毒力基因群( l e e 2 、l e e 3 和l e e 4 ) 的表达起正调控作用，因此认为l e t 是e p e c 毒力因子表达重要的中心调节基因。 在本研究中，构建了0 4 5 的l e r 基因缺失突变菌株并对其特性进行了研究： 首先用p c r 的方法扩增出缺失2 7 9 b pl e r 的基因片段，将其克隆到自杀性载体 p c v d 4 4 2 中，构建了重组质粒p c v d 4 4 2 ：al e r ，转化到宿主菌s m l o p i r ，然后通 过接合性转导的方法将自杀质粒p c v d 4 4 2 ：l e r 从s m l o p i r 转到0 1 5 7 ：h 7 中， 转导子过夜培养后铺平板，通过蔗糖筛选氨苄敏感的l e r 基因缺失突变菌株，并 用p c r 进行鉴定。用0 4 5 ( l e t ) 细菌培养上清进行v e r o 细胞毒性实验，结果 表明0 4 5 l e r 基因缺失突变菌株对v e t o 细胞没有毒性作用，而野生型0 4 5 对v e r o 细胞具有较强的毒性作用。为了评价0 4 5 ( l e r ) 突变菌株的安全性，建立了 0 4 5 感染的小鼠动物模型，对第一组小鼠口服接种0 4 5 ( l e r ) ，同时对第二组 同龄小鼠口服接种野生型0 4 5 。第二组小鼠体重减轻，并于4 天内全部死亡，割 检及病理切片检查肾脏、肝脏、肺脏和肠均出现明显病理变化。第一组小鼠生长 正常，体重与阴性对照组小鼠相似，没有出现任何临床症状，1 4 ，天后剖检，各 器官均未见病理变化。结果证实所构建的e p e c0 4 5 l e t 基因缺失突变菌株无致细 胞病变作用，并丧失了对小鼠动物模型的致病性，该菌株有可能成为预防猪e p e c 0 4 5 感染的基因工程弱毒菌苗候选株。 关键词：肠出血性大肠杆菌0 4 5l e r 基因缺失突变 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 a b s t r a c t e n t e r o p a t h o g e n i ce s c h c r i c h i ac o t i ( e p e c ) a r ei m p o r t a n ta n i m a lp a t h o g e n s w h i c ha r ec a p a b l eo f c a u s i n gb l o o d ya n dn o n b l o o d yd i a r r h e a , h e r n o r r h a g i cc o l i t i s ( h c ) a n dp o t e n t i a l l yf a t a lh e r n o l y t i cu e m i cs y n d r o m e ( h u s ) t h em o s tc o m m o ns e r o t y p e o fe p e ci s0 4 5 o n eo ft h ei m p o r t a n tv i r u l e n c et r a i to fe p e c0 4 5i st h ec a p a c i t yt o p r o d u c ea t t a c h i n ga n de f f a c i n g ( a e ) l e s i o n so ne n t e r o c y t e t h i sp r o p e r t ye n c o d e db y a4 3 k bp a t h o g e n i c i t yi s l a n doa r ) t e r m e dt h el o c u so fe n t e r o c y t ee f f a c e m e n t ( l e e ) n eg e n e so f l e ea r eo r g a n i z e di n t of o u rp o l y c i s t r o n i co p o r o n s ：l e e l ，l e e 2 ，l e e 3 a n dl e e 4 l e e lc o n t a i n sl e r ( l e e - e n c o d e dr e g u l a t o r ) g e n e ( p r e v i o u s l yk n o w n 签 o r n ) 1 e ri st h ef i r s to p e nr e a d i n gf r a m eo fl e e t h ep r o d u c to fl e rt r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v a t e sl e e 2 l e e 3a n dl e e 4 t h el e rg e n ep r o d u c ti sac e n t r a lu p e g u l a t o ro f m a n y o f t h ev i r u l e n c eg e n e so f t h el e e i nt h i ss t u d y , i no r d e rt oo b t a i na na t t e n u a t e dv a c c i n ec a n d i d a t e al e td e l e t i o n m u t a n to f0 4 5w a sc o n s t r u c t e d mf r a g m e n to fi n t e r n a l2 7 9 b pd e l e t i o nm u t a t i o no f l e rw a sa m p l i f i e db yp c r , a n dc l o n e di n t oas u i c i d ev e c t o rp c v d 4 4 2 ，w h i c h c o n t a i n i n gt h ep i t - d e p e n d e n tr 6 kr e p h c o na n ds a c bg e n e t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d p c v d 4 4 2 ：l e rw a st r a n s f o r m e d i n t oah o s tc e l ls m l o p i n p c v d 4 4 2 ：al e rw a st h e n t r a n s f e r e df r o ms m l 0 ( r c v d 4 4 2 ：al e r ) i n t oe p e c0 4 5b yc o n j u g a t i o n w i m s e l e c t i o nf o rn a l i d i x i ca c i da n da m p i c i l l i nr e s i s t a n c e r e s u l t i n gc o n j u g a n t sw e r e p l a t e do n t ol ba g a r ( s u p p l e m e n t e dw i 吐l5 s u c r o s e b u tw i t h o u tn a c l ) a n di n c u b a t e d o v e r n i g h ta t2 9 s u c r o s e - r e s i s t a n ta n da m p i c i l l i n s e n s i t i v ec o l o n i e sw e r es e l e c t e d a n ds c r e e n e db yp c r i nt h er e s u l t a n ll e rg e n eo fc h r o m o s o m ee x c h a n g e dw i t ht h e d e l e t i o nl e rg e n eo fs u i c i d ev e c t o rb yh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，a n de p e c0 4 5l e r d e l e t i o nm u t a n tw a sc o n s t r u c t e d g r o u pia n dg r o u pi io fm i c ew e r eo r o g s t r i c a l l yi n o c u l a t e dr e s p e c t i v e l yw i t ht h e l e rd e l e t i o nm u t a n ta n dt h ev i r u l e n tp a r e n ts t r a i n m i c ew e r eo b s e r v e dd a i l yf o r c l i n i c a ls i g n so fd i s e a s ei n c l u d i n gw e i g h tc h a n g e a f t e ri n o c u l a t i o no ft h ed e l e t i o n m u t a n t ，g r o u pio fm i c eg a i n e dw e i g h tn o r m a l l ya n de x p e r i e n c e dn oc l i n i c a ls i g n s i n c o n t r a s t g r o u pu o fm i c ee x h i b i t e dw e i g h tl o s sa n da l id e a di nf o u rd a y s t 1 1 i ss t u d y d e m o n s t r a t e st h a t0 4 5l e rd e l e t i o nm u t a n tm i g h tb ea l la t t e n u a t e dv a c c i n ec a n d i d a t e k e y w o r d s ：e p e c 0 4 5 ；l e rg e n e ；d e l e t i o nm u t a n t 2 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 e p e c l e e l c r a e l a l t p c r t i r k d a b p k b e a f n a l r 英文缩写词表 e n t e r o p a t h o g e n i ce c o li l o c u so fe n t e r o c y t ee f f a c e m e n t l e e e n c o d e dr e g u l a t o r a t t a c h i n ga n de f f a c i n gl e s i o n l o c a liz e da d h e r e n c e h e a t l a b i l ee n t c r o t o x i n p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o d t r a n s l o c a t e li n t i m l nr e c e p t o r k i l o d a l t o n b a s ep a i r k i l o b a s e e p e c a d h 蝴c ef a c t o r s n a l i d i x i ca c i d 3 肠致病性大肠杆菌 肠细胞脱落位点 l e e 中心调节基因 粘附和脱落损伤 局灶性粘附 不耐热性肠毒素 聚合酶链式反应 紧密素易受位体 千道尔顿 碱基对 千碱基对 粘附因子 奈啶酮酸 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 前言 大肠杆菌是人和动物体内典型的正常肠道菌群，通常情况下并不能引起疾 病。但是由于一些大肠杆菌在漫长的进化过程中获得了编码毒力因子的特定基 因，因此也具有引起人或动物患病的能力，肠致病性大肠杆菌( e n t e r o p a t h o g e n i ee c o l i ，e p e c ) 就是其中的一种。 国内外许多猪厂均有不同程度腹泻的爆发流行，并己在世界各地造成了严重 的经济损失。国内主要集中研究了p e p e c 的常规疫苗和基因工程亚单位疫苗，并 取得了一定的成果，但单独使用该疫苗效果不理想。对p e p e c 致病作用研究甚少。 对其分子遗传学和基因工程疫苗研究更是没有开展。国外加拿大研究较多，其致 病机理已基本清楚，确定了其致病岛的基因序列及其致病性和免疫作用的关系。 特别是近1 0 年来，国内外学者致力于e p e c 分子遗传学、致病机理和免疫预防研 究，其研究结果达到世界领先水平。他们在e p e c 毒力基因结构、功能及其调节 基因的作用方面取得了突破性进展，已经证实e p e c 在致病作用上引起典型的a e 病变，从而导致仔猪的腹泻，e p e c 的主要毒力因子定位于致病岛( p a t h o g e n i c i t y i s l a n d ，p a i s ) 和肠细胞脱落位点( t h el o c u so fe n t e r o c y t ee f f a c e m e n t ，l e e ) 上，其d n a 长度为4 3 3 5 9 b p ，分l e e l ，l e e 2 ，l e e 3 ，t i r e a e 和l e e 4 五个基因区， 有4 1 个阅读框，编码i i i 型分泌系统的功能蛋白及其相关蛋白，并且发现了l e e 中心调节基因l e r ( l e e e n c o d e dr e g u l a t o r ) 对l e e 毒力基因群( l e e l 、l e e 2 、 l e e 3 、t i r e a e 和l e e 4 ) 的表达起正调控作用，l e r 基因对e p e c 的致病性具有 重要作用，l e r 基因缺失可使e p e c 的毒力丧失但仍具有很强的抗原性，如2 0 0 1 年初冯书章等研究发现1 e r 基因缺失突变消除了兔致病性大肠杆菌r d e c i 和 r e p e c0 1 0 3 的a e 损伤作用，该l e r 基因缺失突变株毒力完全丧失，不具有致 病性，但仍具有很强的免疫原性，这为e p e c 疫苗的研制提供了理论依据和技术 支持。最近冯书章在美国马里兰大学完成了a e 大肠杆菌疫苗，也为p e p e c 弱毒 基因工程疫苗的构建提供了切实可行的技术路线。 研究基因工程弱毒疫苗的原则是使该疫苗具有安全性，缺乏致病性且保留完 全的免疫原性。本研究的总体设想是以野生型0 4 5 为始发菌株，利用自杀性载体 ( s u i c i d ev e c t o r ) ，根据同源重组的原理，敲除l e e 致病岛的正调控基因l e r 基因，目的是构建e p e c0 4 5 的l e r 基因缺失突变菌株，研究在基因水平上对l e e 致病岛的调节作用以及对e p e c0 4 5 致病性的影响，探讨这种突变菌株作为疫苗 的可能性，为最终研究制出0 4 5 的基因工程疫苗提供研究方案和技术路线。本研 究的目的是在前人的工作基础上，以p e p e c0 4 5 为出发菌株，研究其主要毒力因 4 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 子、表达产物及其致病机理：利用基因工程技术，研制p e p e c0 4 5 弱毒疫苗，用 于预防p e p e c 的感染。该项目研制成功后，用于我国仔猪大肠杆菌腹泻病的防治， 将有利于我国养猪业的发展，并将取得可观的经济效益和社会效益。而且还为其 他动物疫苗的研制提供新的方法和技术路线。 5 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 综述 肠致病性大肠杆菌的致病机制和致病因子的研究进展 大肠杆菌是动物肠道中的正常菌群之一，可以分为致病性和非致病性两大 类。在通常情况下，大肠杆菌并不引起疾病，因此人们最初认为大肠杆菌是动物 肠道中的正常菌群。直到1 8 8 5 年e s c h e r i c h 首次从婴儿腹泻物中分离出大肠杆 菌后，才开始认识到其致病性。致泻性大肠杆菌是引起人畜腹泻的致病性大肠杆 菌的通称，主要包括肠致病性大肠杆菌( e p e c ) ，肠出血性大肠杆菌( e h e c ) ，肠 侵袭性大肠杆菌( e i e c ) 和肠产毒性大肠杆菌( e t e c ) 。 致病性大肠埃希菌属在人的小肠上段寄居并生长繁殖，紧密粘附在肠上皮细 胞表面或嵌入肠上皮细胞表面的凹陷中，使粘膜呈特征性损伤，局部微绒毛萎缩， 肠粘膜坏死，溃疡形成。早在1 9 4 5 年e p e c 就被认为是一类致泻性大肠杆菌，是 引起全球婴幼儿急慢性腹泻和成人散发腹泻的一类重要病原菌。而且还可以导致 幼儿营养不良。然而迄今对e p e c 致腹泻的确切机制却不完全清楚。与正常人群 相比，e p e c 更易于感染2 岁以下尤其是0 - 6 个月的婴幼儿。2 0 世纪中期美国和 英国的e p e c 暴发流行的死亡率达到2 5 - 5 0 ，在8 0 年代末发展中国家e p e c 暴发 流行的死亡率达到3 0 。目前发达国家先进的诊断方法和治疗手段使死亡率大 大降低，但仍有死亡病例的报道。e p e c 的毒力因子和致泻机制的研究一直落后于 其它几类致泻性大肠杆菌。自1 9 9 2 年d o n n e n b e r g 和k a p e r 等提出了e p e c 致病 机制的三阶段作用模型，尤其是1 9 9 8 年k a p e r 再次提出e p e c 致病模型以来，e p e c 致病机制的研究得到了发展，现就其致病因子和致病致腹泻机制作一综述。 1e p e c 的两个特征性组织病理变化m 和a e 损伤 1 9 9 2 年，d o n n e n b e r g 等提出了e p e c 致病机制的三阶段作用模型，即：( 1 ) 局灶性粘附：( 2 ) 信号转导：( 3 ) 紧密粘附。这种区分并无严格的时间界定，不同的 致病阶段可同时发生。在上述致病过程中，发生了两个特征性组织病理变化；局 灶性粘附( l o c a l i z e da d h e r e n c e ，l a ) 及粘附和脱落损伤( a t t a c h i n ga n d e f f a c i n gl e s i o n ，a e ) 。 1 1 局灶性粘附 局灶性粘附( 1 0 c a t e da d h e r e n c e ，l a ) 是指细菌成块状粘附于细胞表面几个 部位形成结节和微小菌落。c r a v i o t o 等首次描述了e p e c 粘附少量培养的h e p 一2 或h e l a 细胞上：b a l d i n i 等。也进一步指出e p e ce 2 3 4 8 6 9 ( 0 1 2 7 ：h 6 ) 的局灶性 粘附是依赖6 0 m d a 的质粒来实现的。质粒的丧失导致l a 的损失，通过这种质粒传 递使非粘附性h t 3 1 0 1 菌株粘附少量h e p - 2 细胞上。关于局灶性粘附的因素是 6 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 g i r o n 等1 9 9 1 年报道的，他建议将e p e c 产生的成束状聚集、直径为7 n m 的菌毛 命名为“束状菌毛”，”( b f p ) ，并得到大家认可，因此前的调查研究中无b f p 的说法。目前普遍认为细菌的局灶性粘附主要是由b f p 介导，表现为细菌之间的 粘附，细菌与肠道上皮细胞之间尚有一定的距离。目前没有明确的关于b f p 粘附 上皮细胞的证据。d o n n e n b e r g 等使用不再参与局灶性粘附的e p e ce 2 3 4 s 6 9 的 t n p h oa 突变株确定了结构上的b f p a 的基因编码。基因序列研究发现位于e p e c 粘附因子( e p e ca d h e r e n c ef a c t o r s ，e a f ) e a f 质粒上的b f p 的功能性表达至 少需要1 4 个连续基因，总长1 1 6k b 。k a p e s 等发现e p e c 的l a 表型依赖于e a f 质粒的存在，e a f 质粒大小为6 0 m d a ，携带编码b f p 和正向转录激活子p e r 的基 因，除去该质粒的e p e c 菌株，即成为丢失l a 表型的突变株。目前，从这些质粒 克隆出i k b 的d n a 探针己经用于e p e c 的检测，这种探针被证明在诊断e p e c 和 e p e c 引起的疾病暴发中最具有价值，局灶性粘附可用h e p - 2 或h e l a 中一层培养 细胞进行检验，但操作烦琐不易推行。 1 2a e 损伤 a e 损伤的特征为：肠粘膜细胞刷状缘微绒毛的局部破坏( 脱落) ，细菌紧密粘 附于宿主细胞膜，细胞骨架重排。这种损伤在e p e c 患者、志愿者和感染动物肠 道中均可见到，且可在组织细胞表面复制。用于制作a e 损伤的主要动物模型有 兔、猪、鼠、狗和牛，细胞学实验中则常采用h e p 一2 和c a c o 一2 细胞。a e 损伤可 用荧光素标记的环肽进行荧光纤维蛋白染色实验( f l u o r e s c e n ta c tins t a i n i n g ， f a s ) 检测，有人提出该实验可作为鉴定e p e c 的诊断方法。 1 2 1a e 损伤的组织病理学结构及受损机制 a e 的病理学变化特征是细菌与肠上皮细胞紧密粘附。细菌由其紧密素与宿 主细胞膜上的相应受体结合介导紧密粘附于宿主细胞上，激活宿主细胞的信号转 导途径，宿主细胞内的酪氨酸激酶被激活，t i t 酪氨酸磷酸化，细胞内的钙离 子浓度上升，细胞骨架重排，细菌粘附形成致密纤维样肌动蛋白踏板，上皮细j j 色 杯状凹陷包绕细菌，被感染细胞刷状缘脱落、微绒毛消失。这种典型的病理损伤 过程就是a e 损伤。m o o n 等在早期的研究中报道过这种组织病理学特点，而e p e c 显型与a e 损伤的联系最早是由k n u t t o n 等观察到的。a e 损伤在e p e c 患者、自 愿口服e p e c 的志愿者及感染动物中均可见到。且可在组织细胞表而进行复制。 而且a e 损伤与粘附于肠道而没有导致微绒毛消失的e t e c 和霍乱所造成的组织病 理学改变有很大不同。早期，通过电子显微镜观察完整的动物新鲜的肠上皮细胞 看到a e 组织病理学改变。a e 损伤的成分包含有丝状肌动蛋白的聚集等。引导了 荧光素标记的环肽进行荧光纤维蛋白染色试验( f a s ) 的检测。在这种测试中，异 硫氰酸荧光素对培养的上皮细胞的丝状肌动蛋白与细菌直接粘附。目前， f a s 7 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 不仅可以对e p e c 所造成组织病理学损伤进行测试，还能够区分和显示克隆与突 变从而区别包括产生这些特有损伤的细菌基因。动物的a e 损伤与e h e c 的细胞骨 架模型及致儿童腹泻的蜂房哈夫尼菌属所致损伤相似，然而只有为数很少的蜂房 哈夫尼菌株能够产生a e 损伤。详细的分类学研究表明：a e 损伤阳性的蜂房哈夫 尼菌与a e 损伤阴性的蜂房哈夫尼菌不能同时存在于同一宿主体内。另外，引起 鼠科动物结肠增生过盛的腐蚀柠檬酸菌属同样能产生a e 损伤因此，在整个e p e c 的家族中，有1 5 5 种标准型可导致肠上皮细胞的a e 损伤。 e p e c 感染能使宿主细胞发生a e 损伤，其中最显著的改变是肌动蛋白踏板形 成，肌动蛋白积聚于此，e p e c 感染体外诊断试验就基于此，无论是体内还是体 外，踏板形成开始于e p e c 粘附上皮细胞，并与细胞微绒毛消失有关，e p e c 感染 组织细胞培养后3 h 内踏板开始在细菌下形成，感染菌下的上皮细胞膜突起形成 踏板样且能从细胞向上延伸1 0 微米的伪足样结构，踏板的具体作用尚不清楚。 据推测，当宿主细胞发生液体流失时，踏板可能是e p e c 粘附于细胞表面的结构， 能防止e p e c 被清除，踏板还可能起到使e p e c 停留在宿主细胞外，防止吞噬细胞 吞噬的作用。 免疫荧光研究显示：除了细胞膜边缘的ti t ，踏板主要包括f ( 丝状) 一肌动 蛋白，辅肌动蛋白、埃兹蛋白、纤毛蛋白等也沿纵线积聚在此，所起作用就像这 些成分在交叉连接的肌动蛋白微丝中的作用一样，也能见到非肌肉肌浆球蛋白 i i 和原肌球蛋白，但仅存在于踏板的底部，基于t i r 位于踏板的顶端及其生物 学特性，t i r 很可能是e p e c 连接宿主细胞的候选点，也很可能引起肌动蛋白积 聚及与踏板形成有关，为实现该功能，t i r 可能利用肌动蛋白动力学调节子启动 肌动蛋白的积聚，起初小g t f 结合蛋白r h o 家族成员被认为担当此角色，但是 研究发现r a c ，r h o 和c d c 4 2 一依赖通路与踏板形成无关，近期的研究代以a r p 2 3 七聚体复合体一肌动蛋白成核因子，也是w a 综合征蛋白家族( w a s p ) 的复杂成 员，这些因子补充到踏板的顶端，而且w a s p 的g t p 酶结合区突变可阻止a r p 2 3 复合体更新和踏板形成，虽然踏板形成有赖于细胞骨架重排，而且微绒毛消失也 可能有赖于细胞骨架重排，细菌激发的微绒毛肌动蛋白解聚作用导致微绒毛消 失，解聚的肌动蛋白用于形成踏板，有待进一步证明，然而，踏板中的某些蛋白 并不是来源于微绒毛，提示细菌粘附导致一个更复杂的过程而不仅仅是简单的微 绒毛的病理学改变，现在仍不清楚踏板的蛋白成分是否与细胞骨架蛋白相同，这 也许对踏板的形成至关重要。 1 2 2 宿主细胞信号转导通路的激活 激活宿主细胞信号转导通路是e p e c 产生a e 损伤的重要机制。当e p e c 粘附 于上皮细胞后，其分泌的蛋白通过m 型分泌系统直接转位于被粘附的上皮细胞， 8 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 从而诱导宿主细胞一系列的信号转导途径。磷酸肌醇第二信使的产生和钙的释 放，导致另一第二信使d a g ( 二酞基甘油) 的伴随产生及磷脂酶c 对p i p 2 ( 磷脂酞 肌醇4 ，5 一二磷酸) 的活化，继而导致磷脂依赖性p k c ( 蛋白激酶) 被d a g 的激活 及m l c k ( 肌球蛋白轻链激酶) 等蛋白酶的钙依赖性激活，并最终导致一些宿主蛋 白磷酸化。这些靶蛋白的磷酸化对肠细胞的电解质分泌和细胞骨架的重排有深远 的影响，其中一个重要蛋自是m l c ( 肌球蛋白轻链) 和核转录因子n f - k b 。其他宿 主蛋白还有待于定论。磷酸肽谱分析表明，p k c 和m l c k 分别参与感染前、后期 的m l c 磷酸化。感染前期，m l c 以苏氨酸磷酸化为主，结果m l c 从多聚肌纤蛋白 上解离，进入溶解的细胞碎片中，而微绒毛中肌纤蛋白结构的破坏最终导致微绒 毛的脱落，此后，随着病变的发展进人感染后期，此时m l c 以丝氨酸磷酸化为主， 结果是肌纤蛋白聚集于细菌粘附处的细胞下方，形成踏板或垫状( p e d e s t a l ) 结 构。从e p e c 感染所引起的严重水样腹泻来看，与微绒毛脱落有关的细胞骨架变 化和吸收减少不是惟一的致泻因素，肠上皮细胞分泌成分的破坏可能是更加重要 的因素。p k c 的激活，使微绒毛的氯化物运输蛋白磷酸化，肠上皮细胞的c l 一分 泌增加。体外试验提示，p k c 活性控制着肠上皮细胞的紧密连接结构，一旦被激 活，可导致单层细胞间通透性增加。核转录因子n f k b 可被尚未识别的激酶激 活并转位至细胞核，刺激i l - 8 的转录。后者作用于网状多形核细胞( ( p 删s ) ，使 其游走并释放5 a m p o5 a m p 被转变为腺苷，与腺苷受体结合，从而促进c l 。分泌 此外，在e p e c 诱导的信号转导途径中，c a2 + 亦扮演重要角色。实验证明， e p e c 感染培养的上皮细胞，可诱导被粘附的细胞内c a 2 + 水平升高，这些c 扩是 从1 ，4 ，5 一磷酸肌醇敏感池内释放出来的。目前认为，c a 2 十水平升高可激活钙 依赖性肌动蛋白裂解蛋白，后者分解微绒毛内的肌动蛋白，导致细胞骨架改变： 还可抑制n a t 和c l 一吸收，刺激肠上皮细胞c 1 一分泌。 2 与l a 和h e 损伤有关的两个重要位点e f 质粒和l e e 通过电镜和负染法观察e p e c ，发现有一种成束状菌毛( b u n d l e - f o r m i n g p i l u s ，b f p ) 与l a 表型有关，该菌毛直径7 n m ，常聚集成束状。一般认为，细菌 的局部粘附主要由b f p 介导，表现为细菌与细菌之间的粘附( 细菌与肠道细胞间 尚有一定的距离) 。这种粘附发生在感染早期。b f p 是否介导了细菌与上皮细胞 的粘附至今尚未得到证实，b f p 的功能性表达至少需要1 4 个连续基因，总长1 1 6 k b ，位子e p e c 粘附因子 e s p s ，至少包括4 种蛋白e s p a ( 2 5 k d a ) ，e s p e ( 3 8 k d a ) 。 e s p d ( 4 0 k d a ) 及t i r ( t r a n s l o c a r e di n t i m i nr e c e p t o r ，9 0 k d a ) 蛋白，由e s p s 基因编码。它们由e p e c 通过型分泌系统直接转位于被粘附的上皮细胞，并连 同e s p c ( 1 1 0 k d a ，l e e 以外的基因转录合成) 一起诱导宿主细胞的信号转导，而 t i r 则作为i n t i m i n 在宿主细胞表面的受体：( 3 ) s e p s ，至少包括9 种蛋白：s e p a j ，它们共同组成e p e c 的1 型分泌系统，主导e s p s 等的分泌，在耶尔森菌、志 贺菌及沙门菌中也发现类似的分泌系统。对该系统的研究正成为当今致病菌领域 的一个热点。 1 9 9 7 年，m c d a n i e l 等c a n 构建了e 2 3 4 8 6 9 的d n a 文库，并筛选出含整个l e e 的重组质粒。将此质粒转化无毒的大肠杆菌，实验证明所获重组茵能分泌毒力蛋 白，诱导宿主细胞信号转导通路，并导致培养的上皮细胞出现a e 损伤。同年， k a r a o l i 等。发现r d e c 一1 的l e e ，在结构和功能上均与e 2 3 4 8 6 9 的l e e 相似，细 胞实验表明其l e e 能够产生用荧光纤维蛋白染色实验检测的病理变化，提示l e e 足以产生a e 损伤。而l e e 内基因的表达受e a f 质粒上p e r ( p l a s m i de n c o d e d r e g u l a t o r ) 基因的调节。虽然e a f 质粒不是a e 表型所必需的因子，因为除去该 质粒的e 2 3 4 8 6 9 仍能致a e 损伤，只是效率有所降低，但p e r 基因的发现引进了 e p e c 毒力调节子的概念，使人们对e p e c 毒力调节的理解进人一个崭新而又复杂 的水平。总之，a e 损伤是多基因综合作用的产物，这些基因可能不仅仅局限于 染色体上的单个区域，新的与a e 损伤相关的基因还有待于发现。 2 2e p e c 介导腹泻的机制 e p e c 感染的主要临床症状是腹泻，尽管从基因和细胞水平对e p e c 致病机制 的了解取得了进步，但腹泻是被e p e c 毒力因子激发的宿主细胞的特殊反应，还 是宿主细胞对细菌粘附的固有反应，e p e c 仅仅是个承受者吗? 这些尚不清楚，无 论是哪一种情况，腹泻都有利于引起a e 损伤的细菌和特异地定居于大肠的细菌 的生长，由于它们要定居小肠，这些细菌不仅需要与宿主细胞相互作用，而且需 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 要与小肠的正常菌群甚至其它致病菌竞争，腹泻打破了宿主与原核生物之间的正 常平衡可能使e p e c 在与其它菌群的竞争中处于优势，可引起a e 损伤的细菌和特 异地定居于大肠的细菌通过紧密粘附在宿主的肠细胞上，以免被肠蠕动和肠分泌 液所清除。 e p e c 感染时发生腹泻可能是因为a e 损伤引起吸收性微绒毛的急剧减少，研 究显示e p e c 感染降低上皮细胞单层紧密连接的完整性，基础是改变了紧密连接 蛋白的分布，这个结果引起争论，因为其他研究显示感染期间这些蛋白没有变化， 而而志愿者试验表明：从e p e c 摄取到腹泻发作不到4 h ，提示一个更活跃的分泌 反应参与其闻，其它腹泻致病菌具有相同改变，氯离子分泌是最常见的引起分泌 性腹泻的机制，有研究表明e p e c 能活跃地改变离子转运，使其上皮细胞层产生 一个快速、瞬时的短回路电流( t s c ) ，氯离子分泌与其有关，而e s p b ( 不是编码 i n t i t n i n 的基因) 突变没有这些离子的改变，这与成人志愿者e p e c 感染实验研 究结果一致，虽然e p e ci n t i t n i n 突变体毒力减小，但1 1 位服i n t i t n i n 突变体 志愿者中仍有4 位发生腹泻，提示e p e c 的其它毒力因子参与致腹泻。值得注意 的是，不是所有的研究都支持氯离子分泌在腹泻中的作用，h e c h t 和k o u t s o u 研 究认为在e p e c 介导的肠内离子转运改变中起主导作用的是h c 0 3 一而不是氯离 子。 另外，宿主因素也可能引起腹泻，如中性粒细胞和网状多形核细胞( p 心s ) 聚集在感染部位，炎症反应可能有助于细菌激发感染细胞的信号，因为e p e c 激 发n f k b 和i l 一8 在组织培养细胞中表达，这些信号与p m n 穿过上皮细胞层的迁 移有关，细胞通透性增加、氯离子分泌激发可能是e p e c 诱导p m n 侵润的结果， 体内炎症反应持续超过3 h 才发展，提示它不是启动e p e c 引起的腹泻的机制，然 而炎症可导致腹泻的持续和加重，合理解释这些现象必须注意到，像沙门菌等肠 致病菌仅仅粘附到宿主细胞表而也激发n 卜l ( b 和i l 一8 的表达这些反应可能是致 病菌引起腹泻的共同机制，也可能是宿主细胞对细菌粘附的固有反应，不论是什 么原因，p m n 和其它炎症细胞聚集在感染的肠道，释放有毒的炎症因子引起相当 大的组织损伤，虽然这些病理改变有利于上皮细胞的功能改变，但是a e 损伤性 细菌感染引起的许多细胞因子r i f n ，t n f a ，的表达在组织培养中一直是直接 改变上皮细胞功能的因素。 有人认为e p e c 的某些菌株可产生一种对v e r o 细胞有毒去作用的毒素 v t ( 非洲绿猴肾细胞毒素) ，毒素作用也可引起e p e c 感染。 2 3 介导e p e c 腹泻的主要毒力因子粘附因子 目前认为，由e a e 基因编码的粘附因子i n t i m i n 是e p e c 致泻的重要因子。 其证据有：( 1 ) i n t i m i n 介导e p e c 紧密粘附于上皮细胞，从而产生a e 损伤：( 2 ) 1 3 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 所有致a e 损伤的细菌如e p e c e h e c ，c r o d e n t i u m ，h a l v e i 及r d e c 一1 均含有 该基因：而正常大肠杆菌、e t e c 和其他不能致a e 损伤的细菌则缺乏此基因：( 3 ) e p e ce a e 突变株不能对培养细胞产生a e 损伤： 5 0 b p ， 被镶嵌在一个保存的3 9 m b 的脊椎序列中，这个c f t 0 7 3 特别的岛总共1 3 0 m b ， 编码1 5 8 1 1 个蛋白基因，许多基因明显与致病力相联系，这个致病的大肠杆菌与 一般的大肠杆菌在染色体位点，基因排序，自动传递和蛋自粘附等方面不同，目 前正在对一些罕见的，但能导致腹泻病的片段进行研究。英国科学家认为，因 e p e c 研究已经显示肠道上皮细胞感染和导致上皮粘膜丢失和细菌的粘附，这个 疾病过程联系着e p e c 有效蛋白的转移，例如细胞特别受体t i r 进入h o s t 细胞， 经过一个i i i 型装置和传递，他们已确认了一个新的e p e ci i i 型蛋白分泌系， 即靶对宿主的作用，在那里干扰他们的蛋白膜，这些装置起一个重要的作用在调。 节细胞调谢和a t p 系统方面对于b i p a ( 一个基因) 被认为能广泛控制细菌与毒力 的连接，并有调节作用，包括对沙门氏菌的调节，科学家己利用该基因体外表达， 去认识感染病原菌与宿主细胞之间的相万作用 0 1 5 7 ：h 7 大肠菌作为一个导致人严重疾病的病原已被世界公认，一些e p e c 与0 1 5 7 含志贺氏毒素的大肠菌有密切联系，它们有一些共同的致病特点，e p e c 和e h e c 的致病作用和基因序列的研究已悄然开始，例如法国科学家在研究非 0 1 5 7 ：h 7 大肠菌时认为，一个关键的事情是致病力将诱导出一个炎症反应，通 过肠上皮细胞，导致白细胞表达毒素接受g h 3 恢复，这些免疫细胞可能能够传递 t o x i n 到有效位点，他们显示毒素、l p s 和鞭毛，能够诱导，激活基因的表达靠 他们自己，一些非0 1 5 7 不拥有l e e 位点去诱导一个h o s t 细胞c c l - 2 0 基因表达， 1 5 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 0 1 5 7 与非0 1 5 7 不同的h o s t 细菌相互作用有不同型的信号传递。 4 基因敲除技术 冯书章等( 2 0 0 0 ) 在美国马里兰大学通过敲除e p e c0 1 0 3 和r d e c - 1 菌株的 l e r 基因，成功构建了兔致病性大肠杆菌基因工程疫苗，并对此l e t 基因缺失突 变菌株的生长状态，致病性和免疫原性等进行了研究，结果表明l e r 基因缺失突 变消除了对l e e 毒力基因的正调节作用，导致该菌株毒力丧失。该l e r 基因缺失 突变株不具有致病性但保留了免疫原性。动物免疫攻毒试验证实，该突变菌株安 全性好，单剂量免疫即可提供完全的保护作用 基因敲除( g e n ek n o c k o u t ) 是在8 0 年代后半期应用d n a 同源重组原理发展 起来的一门新技术。基因敲除是指对一个已知的基因，从分子水平上设计实验， 将该基因去除，或用其它基因取代，然后对敲除后的个体进行研究，通过其性状 的变化而研究被敲除基因的功能。基因敲除的技术路线包括：( 1 ) 首先构建重组 基因载体；( 2 ) 把重组的质粒d n a 转入受体细胞中，在受体细胞中，载体上的 d n a 与宿主细胞染色体上的同源d n a 发生重组交换；( 3 ) 筛选出发生了重组并丢 失了载体的细胞。 5 未来的工作 近十年来，欧美国家对该病原的研究已进入分子生物学、细胞生物学阶段， 一些阶段性的成果将进入产品、疫苗的研制开发阶段，而我们还处于原始的血 清凝集初筛时期，菌株变异、血一清不全、吸收不好，交叉反应已不能满足1 临床 需要，同时也制约着科技发展，临床有大批的婴幼儿因不能确认病原而成为持续 性腹泻者，影响幼儿生长发育随着一些病原基因的序列，遗传变异的认识，微生 物界生物的进化和演变越来越清晰，毒力岛的水平转移，跳跃的基因这些自然现 象使我们与致病微生物的斗争难度将继续增大，越来越多的食源性病原菌被证实 能导致人的严重疾病，例如各种致病性大肠杆菌( e p e c ) 的正确诊断仍是一个问 题发达国家科学家对e p e c 和e h e c 研究己非常专业化了，人家认为这一领域要研 究的内容仍然很多如：确认和特点一些新的毒力基因和细菌在产生a i ：病变的 新的路径信号：能够产生a e 病变的大肠菌分子基本嗜性和宿主特点：导致a e 病变的分子基础和家禽携带等：为预防h e ：病变的预防措施和疫苗，特别强 调动物储存人的病原菌导致a e 病变感染的流行病学调查：在e p e c 致病力进 展方面流动的d n a 的作用：发展敏感、特异的e p e c 诊断方法。 日前，由e p e c 污染食品而导致食源性疾病的暴发和流行里日益上升趋势， 然而我国对e p e c 的诊断和流行病学调查主要仍依靠菌株血清型的菌体抗原进行 鉴定，其检测周期长并易受人为因素干扰，而大肠埃希菌的致泻性主要取决于是 否携有相应的毒力因子，菌株血清型的鉴定不是e p e c 的诊断和流行病学调查的 理想方法。因此，越来越多的科研工作者开始致力于e p e c 基因型的检测，使用 1 6 河北师范大学高校教师申请硕士学位论文 菌落原位杂交、聚合酶链反应、限制性内切酶分析、核苷酸酸序列测定等分子生 物学技术手段，对不同来源的致泻性大肠埃希菌进行研究，并取得了一定的成效， 随着对这些肠致病性大肠埃希菌的各种毒力因子结构、功能、作用机制的研究， 有利于